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Technischer Bereich
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Überwachen
des Wachstums von Zellen während
ihrer Kultivierung und insbesondere Verfahren, die einen elektrischen
Strom zum Überwachen
der Kultur verwenden.
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Hintergrundtechnik
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In
der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US-A-91-02320, eingereicht am 3. April
1991, veröffentlicht
am 17. Oktober 1991 mit dem Titel "An Electronic Technique of Identifying
an Effective Drug for Treating a Cancer Patient" wird ein System zum Überwachen
und Aufzeichnen von Zellkulturen beschrieben. Diese PCT-Anmeldung
beansprucht die Priorität
der US-Patentanmeldung
Nr. 07/503791, eingereicht am 3. April 1990 unter einem ähnlichen Titel,
in der ein ähnliches
Zellkulturüberwachungs- und
-aufzeichnungssystem beschrieben ist.
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Das
in diesen Patentanmeldungen beschriebene System überwacht in einer herkömmlichen
Laborschale kultivierte Zellen und zeichnet sie auf. Die Schale
weist mehrere getrennte Schächte
bzw. Kammern oder Wells auf, wobei jedes Well an einem Ende offen
ist. Dieses System weist einen Deckel auf, der auf der Oberseite
der Schale angeordnet ist, um die offenen Enden der Wells in der
Schale abzudecken. An der Oberseite des Deckels ist eine gedruckte
Schaltung oder Leiterplatte befestigt, und auf einer Oberfläche der
Leiterplatte sind mehrere einzelne elektrische Kontaktstreifen oder -spuren
angeordnet. Ein Ende jedes Kontaktstreifens ist so ausgebildet,
daß es
mit einem Leiterplattenverbinder paart und in Eingriff gebracht
werden kann. Außerdem
ist an jedem Kontaktstreifen ein nicht reaktionsfähiger rostfreier
Stahlstift oder -zapfen befestigt, der sich durch die Leiterplatte
und den Deckel erstreckt. Durch Anordnen der Kontaktstreifen auf
der Leiterplatte relativ zum Deckel werden die Stifte in Paaren angeordnet,
so daß,
wenn der Deckel auf der Schale angeordnet ist, jedes Stiftpaar durch
das offene Ende eines anderen Wells in der Schale eingeführt wird und
sich in das andere Well erstreckt.
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Dieses
System weist außerdem
einen Leiterplattenverbinder auf, der den Kontaktstreifen der Leiterplatte
angepaßt
ist und über
den ein Stift jedes Paars mit einem gemeinsamen Potential elektrisch verbunden
wird. Eine elektronische Datenerfassungsplatine ist mit dem Leiterplattenverbinder
elektrisch verbunden. Die elektronische Datenerfassungsplatine weist
eine Spannungsquelle zum Anlegen oder Zuführen einer elektrischen Spannung über ein
Stiftpaar auf. Durch mehrere Well-Schalter, die ebenfalls auf der
elektronischen Datenerfassungsplatine vorgesehen sind, wird ein
bestimmtes Stiftpaar ausgewählt,
dem die durch die Spannungsquelle bereitgestellte Spannung zugeführt wird.
Im Betrieb führt
die elektronische Datenerfassungsplatine vorzugsweise eine Wechselspannung
von ungefähr 10
mV Spitze-Spitze über
das Stiftpaar zu. Diese Wechselspannung hat vorzugsweise eine Frequenz von
etwa 400 Hz, die mit einer Frequenz von 60 Hz nicht harmonisch in
Beziehung steht. Ein ebenfalls in der elektronischen Datenerfassungsplatine
vorgesehener Verstärker
hat einen Eingang, dem die Spannung zugeführt wird, die über das
durch die Well-Schalter ausgewählte
Stiftpaar angelegt wird. Der Verstärker überträgt von seinem Ausgang ein Signal,
das auf eine am Verstärkereingang
vorhandene Span nung anspricht, zu einer Abtast-Halte-Schaltung.
Die Abtast-Halte-Schaltung
empfängt
das Ausgangssignal vom Verstärker
und überträgt ein auf dieses
Signal ansprechendes Signal.
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Das
Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungssystem weist außerdem ein Computersystem auf,
das eine Meßeingangs-/-ausgangsschaltung oder
-karte aufweist. Die Meßeingangs-/-ausgangsschaltung
weist eine Einrichtung zum Zuführen
von Signalen zur elektronischen Datenerfassungsplatine zum Spezifizieren
eines durch die Schalter ausgewählten
spezifischen Stiftpaars auf. Die Meßeingangs-/-ausgangsschaltung
weist außerdem
einen A/D-Wandler auf, der das Signal von der Abtast-Halte-Schaltung
bzw. vom Abtast-Halte-Verstärker
empfängt
und digitalisiert, um eine Digitalzahl zu erzeugen. Zum Verarbeiten
dieser Digitalzahlen weist das Computersystem eine Einrichtung zum
Speichern der Digitalzahlen als Rohdaten und eine Einrichtung zum
Analysieren der Rohdaten und zum grafischen Darstellen der Ergebnisse
einer derartigen Analyse auf.
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Obwohl
das in diesen Patentanmeldungen beschriebene System dazu geeignet
ist, Zellen während
der Kultur zu überwachen
und aufzuzeichnen, ist die in den Patentanmeldungen beschriebene
präzise
Ausführungsform
aufgrund bestimmter Einschränkungen
für eine
breite kommerzielle Anwendung ungeeignet. Beispielsweise wird durch
aus elektrisch leitfähigem,
nicht reaktionsfähigem
rostfreiem Stahl hergestellte Stifte nicht immer eine zuverlässige elektrische
Verbindung mit den Kontaktstreifen der Leiterplatte erhalten. Dadurch
könnten durch
ein oder mehrere Stiftpaare eines Deckels fehlerhafte oder möglicherweise überhaupt
keine Meßwerte
erhalten werden. Ein solcher intermittierender oder offener Schaltungszustand
könnte
bei einem Test zum Überwachen
und Aufzeichnen des Zellwachstums über mehrere Stunden oder Tage
auftreten und die Testergebnisse wesentlich beeinträchtigen
oder mög licherweise
völlig
unbrauchbar machen. Ähnlicherweise
führt eine
Trift der im System verwendeten elektronischen Komponenten über mehrere
Tage eines Tests zu einer Instabilität und/oder Ungenauigkeit der
durch das System aufgezeichneten Meßergebnisse. Außerdem können Zellen
während
der Kultur beschädigt
und/oder zerstört
werden, wenn ein Überwachungssystem
versehentlich eine Spannung zuführt,
die, obwohl sie sehr klein ist, im Vergleich zu biologischen elektrischen Potentialen
noch immer übermäßig groß ist. Außerdem wird
durch die in den vorstehend erwähnten
Patentanmeldungen dargestellte Datenanalysetechnik die volle Qualität der durch
das System erhaltenen Daten nicht auf die effektivste Weise bereitgestellt.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren
zum Überwachen und
Aufzeichnen von Zellkulturen bereitzustellen.
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Es
ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein stabileres
Zellkulturüberwachungs- und
-aufzeichnungsverfahren bereitzustellen.
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Es
ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungsverfahren bereitzustellen, das die elektrische
Leitfähigkeit
kultivierter Zellen präziser
mißt.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungsverfahren bereitzustellen, das Zellen während der
Kultur nicht beschädigt.
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Es
ist eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zellkulturüberwachungs-
und aufzeichnungsverfahren bereitzustellen, das Testergebnisse effektiver
darstellt.
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Diese
Aufgabe wird mit den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
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Dieses
Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungsverfahren ermöglicht
die Verwendung eines Deckels mit zuverlässigeren elektrischen Verbindungen
zwischen nicht reaktionsfähigen
Stiftpaaren des Deckels und elektrisch leitfähigen Kontaktstreifen auf einer
darin angeordneten Leiterplatte bereitzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung erlaubt die Verwendung eines verbesserten
Deckels mit mehreren einzelnen Stiftfassungen oder -sockeln, die
zwischen Kontaktstreifen auf der Leiterplatte angeordnet sind, und
elektrisch leitfähiger
Stifte, die sich im Betrieb in ein in Kammern oder Wells einer Standard-Laborschale
angeordnetes Zellwachstumsmedium erstrecken. Durch die Verwendung
solcher Stiftfassungen oder -sockel wird eine zuverlässigere
elektrische Verbindung zwischen den nicht reaktionsfähigen, elektrisch
leitfähigen
Stiften und den Kontaktstreifen auf der Leiterplatte bereitgestellt.
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Das
verbesserte Verfahren kann außerdem eine
Verzögerungszeit
bestimmen, die bei der Messung der elektrischen Leitfähigkeit
zwischen einem Stiftpaar verwendet wird, während ein elektrisches Wechselspannungspotential über das
Stiftpaar angelegt wird, um das Zellwachstum zu überwachen. Durch die Verwendung
der Verzögerungszeit
bei der Messung der elektrischen Leitfähigkeit wird die Meßstabilität erhöht.
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Aufgrund
des verbesserten Verfahrens kann außerdem anfangs eine niedrige,
sichere Spannung über
ein Stiftpaar zugeführt
werden, bevor das Zellwachstum überwacht
wird, und dann wird die Spannung allmählich erhöht, bis ein vorgegebener Spannungswert
erreicht ist. Durch dieses Verfahren zum Zuführen der vorgegebenen Spannung
wird vermieden, daß die Zellen
einem übermäßig großen elektrischen
Potential ausgesetzt werden.
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Bei
der Analyse aufgezeichneter Zellwachstumsdaten mit dem verbesserten
Verfahren wird die elektrische Leitfähigkeit, die für ein Referenz-Well
gemessen wird, das nur ein Zellwachstumsmedium ohne Zellen enthält, von
der elektrischen Leitfähigkeit subtrahiert,
die für
ein Well gemessen wird, das sowohl das Zellwachstumsmedium als auch
Zellen enthält.
Durch Subtrahieren der elektrischen Leitfähigkeit des Referenz-Wells
von der elektrischen Leitfähigkeit
anderer Wells können
die Ergebnisse der Überwachung
und Aufzeichnung der Zellkulturen effektiver dargestellt werden.
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Diese
und andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung
sind für
Fachleute anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsform
in Verbindung mit den beigefügten
Figuren ersichtlich.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
eine perspektivische Ansicht eines bei der Erfindung einsetzbaren
Deckels mit einer Abdeckung, Stiftpaaren, Stiftsockeln und einer
Leiterplatte;
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2 zeigt
eine perspektivische Ansicht des Deckels entlang der Linie 2-2 in 1 zum
Darstellen einer anderen Ansicht der Leiterplatte und einer Abdeckung
davon;
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3 zeigt
eine perspektivische Ansicht zum Darstellen der Positionierung des
Deckels von 2 auf einer Laborschale, die
mehrere Wells aufweist, wobei jedes Well dazu geeignet ist, eine
Menge eines Zellwachstumsmediums aufzunehmen, in dem Zellen kultivierbar
sind;
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4 zeigt
eine Querschnittansicht eines einzelnen Wells in der zusammengesetzten
Einheit aus dem Deckel und einer Laborschale entlang der Linie 4-4
in 3 zum Dar stellen eines Stiftpaars, wobei ein Ende
jedes Stifts in einen Stiftsockel eingesetzt ist und darin gehalten
wird;
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5 zeigt
ein Blockdiagramm zum Darstellen ausgewählter Abschnitte der Datenerfassungsplatine
und der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung zum
Einsatz bei der Erfindung; und
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6 zeigt
Wellenformen der Wechselspannung zum Zuführen eines Ausgangssignals,
das in Antwort auf die Wechselspannung durch einen Vergleicher erzeugt
wird, über
ein Stiftpaar und ein hypothetisches Ausgangssignal von einem Abtast-Halte-Verstärker.
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Bestes Verfahren zum Realisieren der Erfindung
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Die 1 und 2 zeigen
verschiedene Ansichten eines erfindungsgemäß einsetzbaren Deckels 10.
Der Deckel 10 weist eine Abdeckung 12 auf, die
dazu geeignet ist, auf die in 3 dargestellte
Weise auf einer Laborschale 14 angeordnet zu werden. Die
Laborschale 14 weist mehrere Wells 16 auf, wobei
jedes Well 16 ein offenes Ende 18 hat. Jedes der
Wells 16 ist dazu geeignet, eine Menge eines Zellwachstumsmediums
aufzunehmen, in dem Zellen kultivierbar sind. Wenn die Abdeckung 12 des
Deckels 10 auf der Laborschale 14 angeordnet ist,
verschließt
die Abdeckung 12 die offenen Enden 18 der Wells 16.
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Gemäß den 1 und 2 ist
im Deckel 10 eine Leiterplatte 22 angeordnet,
die an der Abdeckung 14 befestigt ist. Zum Befestigen der
Leiterplatte 22 an der Abdeckung 14 können verschiedene Verfahren
verwendet werden. Beispielsweise können (in den Figuren nicht
dargestellte) Maschinenschrauben durch entsprechende durch die Leiterplatte 22 und
die Abdeckung 14 ausgebildete Öffnungen durchgeführt werden,
wobei die Maschinenschrauben durch geeignete darauf aufgeschraubte
Muttern (in den Figuren nicht dargestellt) gesi chert werden. Alternativ
kann die Leiterplatte 22 an der Abdeckung 14 durch
einen zwischen gegenüberliegenden
Flächen
dieser Komponenten angeordneten Klebstoff befestigt werden.
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Die
Leiterplatte 22 weist mehrere einzelne elektrische Kontaktstreifen 24 auf,
die auf der Leiterplattenoberfläche
wie in den 1–4 dargestellt ausgebildet
sind. Wie in den 1–3 dargestellt ist,
ist ein Ende jedes Kontaktstreifens 24 dazu geeignet, mit
einem entsprechenden Leiterplattenverbinder (in den Figuren nicht
dargestellt) in Eingriff zu kommen. Eine Öffnung 26 zum Aufnehmen
eines ersten Endes einer Stiftfassung bzw. eines Stiftsockels 28 ist
in der Nähe
des anderen Endes jedes Kontaktstreifens 24 durch die Leiterplatte 22 ausgebildet.
Die Stiftsockel 28, vorzugsweise Stiftsockel des Modells
SC 5P1∙GG,
hergestellt durch Samtec, Inc., New Albany, Indiana, sind jeweils
durch ein Lötmittel 32 mit
den Kontaktstreifen 24 elektrisch verbunden und daran befestigt.
Eine durch die Abdeckung 12 hindurch und mit dem Stiftsockel 28 konzentrisch
ausgebildete kreisförmige Öffnung 34 nimmt
ein zweites Ende 36 jedes Stiftsockels 28 auf. Das
zweite Ende 36 jedes Stiftsockels 28 nimmt einen
länglichen
Stift 38 auf und hält
ihn, wobei der Stift vorzugsweise aus einem nicht reaktionsfähigen, elektrisch
leitfähigen
Material hergestellt ist, wie beispielsweise aus Gold- oder rostfreiem
Stahldraht mit einem Durchmesser von 0,508 mm (0,020 Zoll). Jeder
der im Deckel 10 angeordneten Stiftsockel 28 bildet
vorzugsweise eine gasdichte Abdichtung mit dem darin eingesetzten
Stift 38.
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Durch
die Position der Kontaktstreifen 24 auf der Leiterplatte 22 werden
die Stiftsockel 28 und die Stifte 38 paarweise
angeordnet. Die kombinierte Länge
jedes Stiftsockels 28 und des darin aufgenommenen Stifts
erstreckt sich sowohl über
die Leiterplatte 22 als auch über die Abdeckung 12,
wobei die vom Stiftsockel 28 am weitesten entfernten En den
jedes Stiftpaars 38 durch das offene Ende 18 eines
Wells 16 in der Laborschale 14 einsetzbar sind,
wenn der Deckel 10 wie in 4 dargestellt
darauf angeordnet ist. Durch derartiges Positionieren des Deckels 10 auf
der Laborschale 14 wird jedes Stiftpaar 38 so
angeordnet, daß die
Stifte sich in das im Well 16 angeordnete Zellwachstumsmedium
erstrecken. Das am weitesten von den Stiftsockeln 28 entfernte
Ende der Stifte 38 darf jedoch nicht mit dem Ende des Wells 16 in
Kontakt kommen, das am weitesten von seinem offenen Ende entfernt
ist, und die Menge des im Well 16 angeordneten Zellwachstumsmediums
muß ausreichend
gering sein, so daß das
Medium nicht mit den Stiftsockeln 28 in Kontakt kommt.
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Bevor
das System zum Überwachen
und Aufzeichnen kultivierter Zellen verwendet werden kann, muß der Deckel 10 sterilisiert
werden, damit er die Zellkultur nicht kontaminiert. Das Sterilisieren
des Deckels 10 muß jedoch
geeignet ausgeführt
werden, um zu vermeiden, daß die
elektrische Leitfähigkeit zwischen
den Stiften 38 und den Kontaktstreifen 24 insbesondere
an der gasdichten Kontaktstelle zwischen dem Stiftsockel 28 und
dem Stift 38 unterbrochen wird. Ein Verfahren, das zum
Sterilisieren der Deckel 10 erfolgreich angewendet worden
ist, besteht darin, den Deckel 10 in 70%-igen Isopropylalkohol
oder in Ethanol einzutauchen und dann den Deckel 10 in
einer laminaren Schutzströmung
zu trocknen, während
er Ultraviolettlicht ausgesetzt wird.
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Zellkulturüberwachungsschaltung
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Ein
in der PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/US-A-91-02320 und in der US-Patentanmeldung
Nr. 07-503791 dargestelltes System überwacht eine Zellkultur durch
kurzzeitiges Zuführen
eines Niederspannungs-Wechselspannungspotentials über ein
ausgewähltes
Stiftpaar 38, die sich in ein in einem Well 16 angeordnetes
Zellwachstumsmedium erstrecken. 5 zeigt ein
Blockdiagramm einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung zum Darstellen eines Abschnitts einer elektronischen Schaltung
zum Zuführen
eines Potentials über
ein Stiftpaar 38 und zum Überwachen kultivierter Zellen. Ein
Computerprogramm, das durch ein Computersystem (in 5 nicht
dargestellt) ausgeführt
wird, das im in diesen Patentanmeldungen dargestellten Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungssystem verwendet wird, veranlaßt einen in der Datenerfassungsplatine 44 angeordneten
programmierbaren Verstärker 42 eine
Spannung zu übertragen,
die die Spannung darstellt, die über
ein in einen Well 16 eingesetztes Stiftpaar 38 zugeführt wird,
um sie durch eine Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 zu
digitalisieren. Die Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 der
vorliegenden Ausführungsform
ist vorzugsweise eine Karte des Typs MetraByte DAS-8 Data Acquisition
and Control Board, die von Keithley Metrabyte Corporyation, Taunton,
Massachusetts vertrieben wird.
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Um
die Wechselspannung bereitzustellen, die über ein ausgewähltes Stiftpaar 38 zugeführt wird,
weist die Datenerfassungsplatine 44 eine programmierbare
Spannungsquelle 48 auf. Die programmierbare Spannungsquelle 48 weist
einen Wechselstromgenerator 52 auf, der ein Sinuswellensignal
mit einer Frequenz von 370 Hz ±20%
und 10 Volt Spitze-Spitze erzeugt. Das durch den Wechselstromgenerator 52 erzeugte
Ausgangssignal wird einem programmierbaren Dämpfungsglied 54 zugeführt, das
ebenfalls in der programmierbaren Spannungsquelle 48 angeordnet
ist. Digitale Anregungspegelsteuerungssignale, die dem programmierbaren Dämpfungsglied 54 vom
Computersystem über
Anregungspegelsteuersignalleitungen 56 zugeführt werden,
ermöglichen
eine Einstellung der Spitze-Spitze-Spannung
des einem ersten Anschluß 57 eines
20,04 kΩ Widerstands 58 zugeführten Wechselstroms.
Wie in den vorstehend erwähnten
Patentanmeldungen dargestellt ist, ist ein zweiter Anschluß 59 des
Widerstands 58 mit einer Reihe von Schaltern 62 verbunden.
Einer der Schalter 62 wird durch das Computersystem ausgewählt, um
die durch die programmierbare Spannungsquelle 48 bereitgestellte Wechselspannung
einem Stiftpaar 38 zuzuführen, die sich in das überwachte
Well 16 erstrecken.
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Gemäß der Beschreibung
der vorstehend erwähnten
Patentanmeldungen wird die über
ein Stiftpaar 38 zugeführte
Wechselspannung außerdem dem
Eingang des programmierbaren Verstärkers 42 zugeführt. Wie
in den Patentanmeldungen dargestellt ist, kann der Verstärkungsfaktor
des programmierbaren Verstärkers 42 durch
vom Computersystem über Verstärkungssteuersignalleitungen 64 zugeführte Steuersignale
geregelt werden. Die Ausgangssignale des programmierbaren Dämpfungsgliedes 54 und des
programmierbaren Verstärkers 42 werden
einem Multiplexer 66 zugeführt. Durch dem Multiplexer 66 vom
Computersystem über
Multiplexersteuersignalleitungen 68 zugeführte Steuersignale
wird eines dieser drei Signale ausgewählt und einem Eingang eines
in der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 angeordneten
Abtast-Halte-Verstärkers 70 zugeführt. Das
Ausgangssignal des Abtast-Halte-Verstärkers 70 wird dem
Eingang eines ebenfalls in der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 angeordneten A/D-Wandlers 72 zugeführt.
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Das
Ausgangssignal mit 10 Volt Spitze-Spitze vom Wechselstromgenerator 52 wird
nicht nur dem programmierbaren Dämpfungsglied 54 zugeführt, sondern
auch dem Eingang eines Vergleichers 74. Das Ausgangssignal
des Vergleichers 74 ändert bei
jedem Durchgang der durch den Wechselstromgenerator 52 erzeugten
Wechselspannung durch null Volt seinen Zustand. Dadurch ist, während die
durch den Generator 52 erzeugte Wechselspannung ein Potential
aufweist, das größer ist
als null Volt, das Ausgangssignal des Vergleichers 74 auf
einen Zustand eingestellt, und während
diese Spannung ein Potenti al aufweist, das kleiner ist als null
Volt, ist das Ausgangssignal des Vergleichers 74 auf den
anderen Zustand eingestellt. Das Ausgangssignal des Vergleichers 74 wird
einem in der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 angeordneten
programmierbaren Zeitgeber 76 zugeführt.
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Bestimmung der Verzögerungszeit
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Während die
durch den Wechselstromgenerator 52 erzeugte Spitze-Spitze-Spannung über mehrere
Tage eines Tests ausreichend konstant bleibt, ist die Frequenz seines
Ausgangssignals weitaus weniger stabil. Zum Bestimmen der elektrischen
Leitfähigkeit
zwischen einem Stiftpaar 38 mit einer ausreichenden Genauigkeit,
während über das
Stiftpaar 38 nur ein 10-mV-Potential zugeführt wird,
ist es erforderlich, daß das
Ausgangssignal des programmierbaren Verstärkers 42 durch den
Abtast-Halte-Verstärker 70 exakt
zu dem Zeitpunkt abgetastet wird, zu dem die dem ersten Anschluß 57 des
Widerstands 58 zugeführte
Spannung ihren Maximalwert erreicht. Weil die Frequenz der Wechselspannung
sich über die
Zeit ändern
kann, hat es sich für
einen präzisen und
reproduzierbaren Betrieb des Zellkulturüberwachungs- und -aufzeichnungssystems
als vorteilhaft erwiesen, den Zeitpunkt, zu dem der Abtast-Halte-Verstärker 70 das
Ausgangssignal des programmierbaren Verstärkers 42 abtastet,
so einzustellen, daß er
der Frequenz der durch die programmierbare Spannungsquelle 48 erzeugten
Wechselspannung angepaßt
ist.
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6 zeigt
eine sinusförmige
Wechselspannungs-Wellenform 82 der
am Ausgang des Wechselstromgenerators 52 bereitgestellten
Spannung zusammen mit einer digitalen Wellenform 84 des
durch den Vergleicher 74 erzeugten Ausgangssignals. Während der
Initialisierung des Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungssystems und zu jedem nachfolgenden Zeitpunkt,
der durch eine Bedienungsperson des Zellkultur überwachungs- und -aufzeichnungssystems
angefordert wird, führt
das durch das Computersystem ausgeführte Computerprogramm eine
Prozedur zum Festlegen einer in 6 dargestellten
Verzögerungszeit
("D") aus, die zu einem
ersten Zeitpunkt beginnt, zu dem die Sinuswellenform 82 bei
der Änderung
von einem positiven Potential in ein negatives Potential ein Potential
von null Volt hat, und sich bis zu einem Zeitpunkt erstreckt, zu dem
die Sinuswellenform 82 ihren unmittelbar nächsten positiven
Maximalwert aufweist.
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Bei
der Messung der Verzögerungszeit
D verwendet das Computerprogramm das Ausgangssignal vom Vergleicher 74 auf
der Datenerfassungsplatine 44 zusammen mit dem Signal des
in der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 angeordneten
programmierbaren Zeitgebers 76 zum Bestimmen der Zeitdauer
einer Periode der Sinuswellenform 82. Das Computerprogramm
legt dann die Verzögerungszeit D
auf 3/4 einer Periode der Sinuswellenform 82 fest. Nachdem
das Computerprogramm eine geeignete Verzögerungszeit D bestimmt hat,
lädt es
diese Verzögerungszeit
in den programmierbaren Zeitgeber 76, so daß alle nachfolgenden
Messungen des elektrischen Potentials über ein Stiftpaar 38 exakt
zu dem Zeitpunkt erfolgen, zu dem die dem ersten Anschluß 57 des
Widerstands 58 zugeführt
Spannung ihren Maximalwert erreicht.
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Bei
der Messung der über
ein Stiftpaar 38 zugeführten
Spannung beginnt der programmierbare Zeitgeber 76 mit der
Messung jeder Verzögerungszeit
zu dem Zeitpunkt, zu dem die Sinuswellenform 82 bei der Änderung
von einem positiven Potential zu einem negativen Potential ein Potential
von null Volt aufweist, d. h. unmittelbar nachdem der Digitalwert des
dem programmierbaren Zeitgeber 76 zugeführten Ausgangssignals des Vergleichers 74 sich
vom Zustand "0" auf den Zustand "1" ändert.
Nach Ablauf der Verzögerungszeit
D veranlaßt
der programmierbare Zeitgeber 76 den Abtast-Halte- Verstärker 60 unmittelbar,
die Spannung des vom Ausgang des programmierbaren Verstärkers 42 über den
Multiplexer 66 zugeführten
Signals abzutasten und zu halten, wie in 6 durch
die Wellenform 88 dargestellt ist. Der programmierbare
Zeitgeber 76 veranlaßt
außerdem den
A/D-Wandler 72, die Spannung des vom Abtast-Halte-Verstärker 70 empfangenen
Analogsignals in eine Digitalzahl umzuwandeln. Anschließend wird, wie
in den vorstehend erwähnten
Patentanmeldungen dargestellt ist, diese Digitalzahl von der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 zum
Computersystem übertragen,
um sie als geeignete Rohdaten für eine
nachfolgende Analyse und eine grafische Darstellung zu speichern.
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Einstellung der über ein Stiftpaar 38 zugeführten Spannung
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Nachdem
das durch das Computersystem ausgeführte Programm die aktuelle
Verzögerungszeit
D für die Überwachung
von Zellkulturen bestimmt hat, bereitet es die während eines solchen Überwachungsvorgangs
vom zweiten Anschluß 59 des
Widerstandes 58 über
ein Stiftpaar 38 zuzuführende Wechselspannung
vor. Um diese Wechselspannung vorzubereiten, stellt das Computerprogramm
zunächst
das programmierbare Dämpfungsglied 54 so ein,
daß an
seinem Ausgang und am ersten Anschluß 57 des Widerstands 58 ein
Potential von etwa 10 mV bereitgestellt wird. Weil der ersten Anschluß 57 des
Widerstands 58 aufgrund seines Widerstandswert von 20,04
kΩ von
seinem zweiten Anschluß 59 getrennt
ist, und weil durch jegliches im Well 16 angeordnete Zellwachstumsmedium
eine elektrische Leitfähigkeit
zwischen dem darin einführten
Stiftpaar 38 bereitgestellt wird, muß die Spannung am zweiten Anschluß 59 und über ein
Stiftpaar 38 anfangs kleiner sein als der Wert von 10 mV,
der zum Messen der Leitfähigkeit
zwischen einem Stiftpaar 38 verwendet werden soll. Das Computerprogramm
veranlaßt
dann den Multiplexer 66, das Ausgangssignal des programmierbaren
Verstärkers 42 auszuwählen, um
es dem Eingang des Abtast-Halte-Verstärkers 70 zuzuführen, setzt
den Verstärkungsfaktor
des programmierbaren Verstärkers 42 derart,
daß durch
eine Spitzenspannung von 10 mV am zweiten Anschluß 59 des
Widerstands 58 veranlaßt
wird, daß der
A/D-Wandler 72 eine Digitalzahl erzeugt, die etwa 83,3%
des vollen Bereichs des A/D-Wandlers 72 entspricht, und
veranlaßt
die Reihe von Schaltern 62, ein Stiftpaar 38 auszuwählen, um ihnen
die Wechselspannung zuzuführen.
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Unter
Verwendung der zuvor bestimmten Verzögerungszeit D und der Meßeingangs-/-ausgangsschaltung 46 mißt das Zellkulturüberwachungs-
und -aufzeichnungssystem anschließend den Spitzenwert der am
zweiten Anschluß 59 des
Widerstandes 58 vorhandenen Wechselspannung, die über das
Stiftpaar 38 zugeführt
wird. Wenn die Spannung am zweiten Anschluß 59 und über das
Stiftpaar 38 kleiner ist als 5 mV, verdoppelt das Computerprogramm
die durch das programmierbare Dämpfungsglied 54 erzeugte
Wechselspannung wiederholt, bis die am zweiten Anschluß 50 gemessene
Spannung den Wert von 5 mV überschreitet.
Indem hierdurch eine Wechselspannung über das Stiftpaar 38 zugeführt und
gemessen wurde, die den Wert von 5 mV überschreitet, und weil die
Einstellung für
das programmierbare Dämpfungsglied 54 bekannt
ist, durch die diese Spannung erzeugt wird, berechnet das Computerprogramm
anschließend
eine neue Einstellung für
das programmierbare Dämpfungsglied 54, durch
die dem zweiten Anschluß 59 und über das Stiftpaar 38 eine
Wechselspannung von etwa 10 mV zugeführt wird, und überträgt dann
Steuersignale zum Einstellen des Dämpfungsgliedes 54 auf
den berechneten Wert.
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Bestimmung der Leitfähigkeit des Wells 16
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Nachdem
der Wert für
die durch das programmierbare Dämpfungsglied 54 dem
ersten Anschluß 57 des
Widerstandes 58 zugeführte
Wechselspannung festgelegt wurde, ist das System nunmehr bereit,
die elektrische Leitfähigkeit
des Wells 16 zu überwachen
und aufzuzeichnen. Bei der Messung der Leitfähigkeit des Wells 16 mißt das Computerprogramm
zunächst
wiederholt die über
das Stiftpaar 38 und dem zweiten Anschluß 59 des
Widerstandes zugeführte
Spannung. Nachdem 16 aufeinanderfolgende Werte für diese
Spannung erfaßt
wurden, berechnet das Computerprogramm unter Verwendung eines Mittelwert-
oder Boxcar-Filters einen Mittelwert der 16 Werte, um einen einzelnen
Mittelwert für
die über das
Stiftpaar 38 zugeführte
Spannung zu erhalten. Unter Verwendung des einzelnen Wertes der über das
Stiftpaar 38 zugeführten
Spannung, des Wertes der dem ersten Anschluß 57 des Widerstandes 58 durch
das programmierbare Dämpfungsglied 54 zugeführten Spannung
und des Widerstandswertes des Widerstandes 58 berechnet
das Computerprogramm anschließend
die Leitfähigkeit
des Zellwachstumsmediums und der gegebenenfalls vorhandenen Zellen
zwischen dem Stiftpaar 38.
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Nachdem
die Leitfähigkeit
zwischen dem Stiftpaar 38 für dieses Well 16 bestimmt
wurde, speichert das Computerprogramm zunächst den Leitfähigkeitswert
für eine
nachfolgende Analyse und schreitet dann fort, um die Leitfähigkeit
zwischen einem anderen Stiftpaar 38 zu messen, das sich
in ein anderes Well 16 der Laborschale 14 erstreckt.
Bei der Bestimmung der Leitfähigkeit
jedes Wells verwendet das Zellkulturüberwachungs- und -aufzeichnungssystem
die vorstehend beschriebenen Prozeduren, gemäß denen zunächst die über das Siftpaar 38 zugeführte Wechselspannung
eingestellt und dann die über
das sich in das Well 16 erstreckende Stiftpaar 38 zugeführte Spannung
gemessen und gemittelt wird. Diese Ein stellung der zugeführten Spannung
und die Bestimmung der Zellenleitfähigkeit werden wiederholt,
bis die Leitfähigkeit
aller Wells 16 in der Laborschale 14 bestimmt
und gespeichert worden ist.
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Analyse der Leitfähigkeit der Wells 16
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Wie
in den vorstehend erwähnten
Patentanmeldungen beschrieben ist, muß mindestens eines der Wells 16 in
der Laborschale 14 ein Referenz-Well 16 sein,
in dem sich nur ein Zellkulturmedium ohne Zellen befindet. Außerdem muß dieses
Referenz-Well 16 für
das Analysecomputerprogramm spezifisch identifiziert sein, weil
das Programm den Leitfähigkeitswert
für das
Referenz-Well 16 zum Analysieren der Leitfähigkeit
für alle
anderen Wells 16 verwendet.
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In
den vorstehend erwähnten
Patentanmeldungen weist die Analyse der Leitfähigkeit eines Wells 16,
das sowohl ein Zellwachstumsmedium als auch Zellen enthält, das
Dividieren des Leitfähigkeitswertes,
der für
den Referenz-Well 16 gemessenen wurde, durch den Leitfähigkeitswert
auf, der für ein
Well 16 gemessen wurde, das sowohl ein Zellwachstumsmedium
als auch Zellen enthält.
Anstatt die elektrische Leitfähigkeit
des Referenz-Wells 16 bei der Analyse der Leitfähigkeit
eines Wells, das sowohl ein Zellwachstumsmedium als auch Zellen
enthält,
als Wert zum Ermitteln einer Bruchzahl zu verwenden, hat es sich
für die
Analyse der Leitfähigkeit von
Wells 16, die sowohl ein Zellwachstumsmedium als auch Zellen
enthalten, als vorteilhafter erwiesen, die für den Referenz-Well 16 bestimmte
Leitfähigkeit von
der Leitfähigkeit
für das
Well 16 zu subtrahieren, das sowohl ein Zellwachstumsmedium
als auch Zellen enthält.
Durch Subtrahieren der für
das Referenz-Well 16, d. h. für das Well, das nur ein Zellwachstumsmedium
ohne Zellen enthält,
gemessenen Leitfähigkeit
von der für
Wells gemessenen Leitfähigkeit,
die so wohl ein Zellwachstumsmedium als auch Zellen enthalten, wird
die elektrische Leitfähigkeit
des Zellwachstumsmediums von den Daten für die Wells 16 eliminiert.
Durch Eliminieren der Leitfähigkeit
des Zellwachstumsmediums von den Daten für die Wells 16 werden
Datenwerte für
die Wells 16 erhalten, die sowohl ein Zellwachstumsmedium
als auch Zellen enthalten, wobei die Datenwerte die elektrische
Leitfähigkeit
nur der Zellen selbst und der metabolischen oder Stoffwechselprodukte
der Zellen präziser
darstellen.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Obwohl
in der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung eine sinusförmige
Wechselspannung für
die Überwachung
von Zellkulturen verwendet wird, kann zum Bestimmen der Leitfähigkeit
zwischen einem Stiftpaar 38 eine beliebige periodische
Spannungswellenform verwendet werden, die um null Volt symmetrisch
ist. Daher könnte
ein erfindungsgemäßes System
zum Überwachen
und Aufzeichnen von Zellkulturen beispielsweise eine Wechselspannung
mit einer dreieckigen Wellenform verwenden.
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Weil
eine Wechselspannung mit einer dreieckigen Wellenform unter Verwendung
einer digitalen Logikschaltung leicht erzeugt werden kann, wäre es in
einem System, in dem eine derartige Wellenform verwendet wird, unnötig, die
Verzögerungszeit
D, wie vorstehend beschrieben, direkt zu messen. Statt dessen könnten die
zum Erzeugen der Wechselspannung mit einer dreieckigen Wellenform
verwendeten digitalen Schaltungen selbst Signale zum Steuern der
Operation des Abtast-Halte-Verstärkers 70 und des
A/D-Wandlers 72 direkt erzeugen. Ein derartiges System
zum Überwachen
und Aufzeichnen von Zellkulturen würde lediglich eine andere,
bekannte Technik zum Bestimmen der Verzögerungszeit für seine Wechselspannung
verwenden, die einem Zeitintervall zwischen einem momentanen Potentialwert
von null Volt und einem momentanen Potentialwert gleicht, der dem
Maximalwert der Wechselspannung gleicht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zum Überwachen
und Aufzeichnen von Zellkulturen kann zum zerstörungsfreien Messen der Kinetik
des Zellwachstums verwendet werden. Es kann auch zum Messen der
Reaktionskinetik von Ziel-Zellpopulationen auf Hormone, Wachstumsfaktoren,
Wachstumsinhibitoren, Zytotoxine und Medikamente, die zellularen
Stoffwechsel stören,
verwendet werden. Dieses Verfahren zum Überwachen und Aufzeichnen von Zellkulturen
ist insbesondere für
Anwendungsgebiete wie beispielsweise Antikrebsmedikament-Screening geeignet.
Herkömmliche
Screening-Verfahren messen Zellkulturreaktionen nach einer festen
Inkubationszeit. Chemotherapeutuische Medikamente, die eine verzögerte Wirkung
entfalten, werden häufig fälschlicherweise
als inaktiv oder unwirksam identifiziert, während Medikamente, die sehr
schnell wirken, von langsamer wirkenden Zusammensetzungen oder Mitteln
ununterscheidbar sein können.
Im Vergleich zu herkömmlichen
Tests oder Assays mit kolorimetrischem Endpunkt werden, indem eine
Folge von Messungen über
eine ausgedehnte Zeitdauer ausgeführt wird, durch das erfindungsgemäße Verfahren
zum Überwachen
und Aufzeichnen von Zellkulturen längere Testzeitdauern zum Identifizieren von
Medikamenten ermöglicht,
die eine verzögerte Wirkung
haben, während
gleichzeitig aber auch schneller wirkende Medikamente identifiziert
werden.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung bezüglich der
gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
beschrieben worden ist, dient die Beschreibung lediglich zur Darstellung
und soll nicht im einschränkenden
Sinn verstanden werden. Daher ist für Fachleute offensichtlich,
daß innerhalb
des durch die beigefügten
Patentansprüche
definierten Schutzumfangs der vorliegenden Erfindungen zahlreiche Änderungen, Modifikationen
und/oder alternative Anwendungen der Erfindung möglich sind.