DE69232946T2

DE69232946T2 - Inhibitoren von zellregulationsfaktoren und verfahren zur verhütung oder verminderung von narbenbildung

Info

Publication number: DE69232946T2
Application number: DE69232946T
Authority: DE
Inventors: A. Border; R. Harper; T. Longaker; D. Pierschbacher; I. Ruoslahti; J. Whitby
Original assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; University of California; University of Utah; La Jolla Cancer Research Foundation
Current assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; University of California; University of Utah; La Jolla Cancer Research Foundation
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2003-12-18
Anticipated expiration: 2012-11-14
Also published as: EP1230929A1; FI942244A0; EP0667784B1; ES2188585T3; WO1993009800A1; DE69232946D1; CA2123418A1; NO941821L; NO941821D0; AU673506B2; AU3138593A; EP0667784A1; ATE233568T1; FI942244A; JPH07504886A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Zellbiologie und spezieller die Kontrolle der Zellvermehrung. Proteoglycane sind Proteine, die eine oder mehrere Glycosaminoglycan-Ketten tragen. Die bekannten Proteoglycane üben eine breite Vielfalt von Funktionen aus und werden in verschiedenen zellulären Lokalisierungen gefunden. Viele Proteoglycane sind Bestandteile der extrazellulären Matrix, wo sie an dem Zusammenbau von Zellen teilnehmen und die Anheftung von Zellen an die Matrix bewirken.
Eine der Schlüsselfunktionen der extrazellulären Matrix besteht in der Lagerung und Präsentation von Wachstumsfaktoren gegenüber Zellen. Proteoglycane sind wichtige Vermittler der Bindung von Wachstumsfaktoren und es ist gezeigt worden, dass sie die biologischen Aktivitäten verschiedener Wachstumsfaktoren durch eine Wechselwirkung über ihre Glycosaminoglycan- Komponenten wie auch ihre Kernproteine modulieren (Ruoslahti, 1989; Ruoslahti und Yamaguchi, 1991).
Wachstumsfaktoren, die an Glycosaminoglycane binden, umfassen sauren und basischen FGF (siehe Burgess und Maciag, 1989), GM- CSF, Interleukin-3 (Roberts et al., 1988), Pleiotrophin (Li et al., 1990), Amphiregulin (Shoyab et al., 1988), HB-EGF (Higashiyama et al., 1991) und Plättchenfaktor 4 (Huang et al., 1982), von denen jeder stark an Heparin und Heparansulfat bindet. Die Bindung von FGFs an Heparin oder an Heparansulfat- Proteoglycane schützt die Wachstumsfaktoren vor einem proteolytischen Abbau und es wird angenommen, dass ein Matrixgebundenes Wachstumsfaktor-Reservoir gebildet wird (Saksela et al., 1988; Gospodarowicz et al., 1990), ausgehend von welchem der Wachstumsfaktor in einer aktiven Form durch partielle Proteolyse des Proteoglycan-Kernproteins oder durch Abbau der Heparansulfat-Komponente der Proteoglycane freigesetzt werden kann (Saksela und Rifkin, 1990; Ishai-Michaeli et al., 1990). Basischer FGF muss an Glycosaminoglycan gebunden werden, damit er in der Lage ist, mit seinem Signaltransduktionsrezeptor zu wechselwirken (Yayon et al., 1991; Rapraeger et al., 1991).
Die Bindung von TGF-β an Proteoglycane repräsentiert einen unterschiedlichen Typ von Wachstumsfaktor-Proteoglycan- Wechselwirkung. Es ist gezeigt worden, dass TGF-β an die Kernproteine von wenigstens zwei Proteoglycanen bindet. Eines dieser Proteoglycane ist Decorin, ein kleines interstitiell vorkommendes Proteoglycan der extrazellulären Matrix, das mit TGF-β über sein Kernprotein wechselwirken kann (Yamaguchi et al., 1990). Decorin, das auch als PG-II oder PG-40 bekannt ist, ist ein kleines Proteoglycan, das durch Fibroblasten produziert wird. Sein Kernprotein hat ein Molekulargewicht von ungefähr 40000 Dalton. Der Kern ist sequenziert worden (Krusius und Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7683 (1986); Day et al., Biochem. J. 248: 801 (1987)) und trägt bekanntermaßen eine einzelne Glycosaminoglycan-Kette eines Chondroitinsulfat/Dermatansulfat-Typs (Pearson et al., J. Biol. Chem. 258: 15101 (1983)). Die einzige zuvor bekannte Funktion für Decorin ist das Binden an Collagen vom Typ I und Typ II und dessen Wirkung auf die Fibrillenbildung durch diese Collagene (Vogel et al., Biochem. J. 223: 587 (1984); Schmidt et al., J. Cell Biol. 104: 1683 (1987)). Decorin (Krusius und Ruoslahti, 1986) ist der Prototyp einer Gruppe von Proteoglycanen, die durch Kernproteine von ~40 kDa gekennzeichnet sind, die hauptsächlich aus Leucin-reichen wiederholten Sequenzen von 20 bis 24 Aminosäuren bestehen (Patthy, 1987). Bislang sind vier Mitglieder dieser Gruppe von Proteoglycanen kloniert worden; zusätzlich zu Decorin sind diese Biglycan (Fisher et al., 1989), Fibromodulin (Oldberg et al., 1989) und Lumican (Blochberger et al., 1992). Decorin und Biglycan sind ubiquitär, obwohl sie innerhalb von Geweben eine relativ divergierende Lokalisierung zeigen, wobei Decorin mehr in der extrazellulären Matrix von Geweben gefunden wird, wo es an Collagen vom Typ I gebunden ist (Vogel et al., 1984; Scott, 1986; Brown und Vogel, 1989), und Biglycan enger um Zellen herum lokalisiert ist (Bianco et al., 1990). Fibromodulin hat eine etwas stärker eingeschränkte Verteilung mit hohen Konzentrationen in Knorpel, Sehne und Sklera, während es in der Haut und im mineralisierten Knochen nur in geringen Konzentrationen vorhanden ist (Heinegard et al., 1986). Lumican wird hauptsächlich in der Cornea gefunden (Blochberger et al., 1992). Zusammen bilden diese Proteine eine Überfamilie von Proteinen (Ruoslahti, Ann. Rev. Cell Biol. 4: 229, (1988); McFarland et al., Science 245: 494 (1989)).
Der zweite Typ von TGF-β-bindendem Proteoglycan ist der TGF-β- Rezeptor vom Typ III, Betaglycan (Segarini und Seyedin et al., 1988; Andres et al., 1989). Betaglycan ist ein Zellmembran- Proteoglycan (Lopez-Casillas et al., 1991); Wang et al., 1991), das offensichtlich an dem TGF-β-Signaltransduktionsweg nicht beteiligt ist, sondern möglicherweise als ein TGF-β- Reservoir an der Zelloberfläche wirkt, das TGF-β gegenüber seinen Signaltransduktionsrezeptoren präsentiert.
Die transformierenden Wachstumsfaktoren β (TGF-β) sind eine Familie von multifunktionellen zellregulatorischen Faktoren, die durch viele Typen von Zellen in verschiedenen Formen produziert werden (für eine Übersicht siehe Sporn et al., J. Cell Biol. 105: 1039, (1987)). Es sind fünf verschiedene TGF-βs bekannt, aber detailliert sind die Funktionen von nur zwei, TGF- β1 und TGF-β2, charakterisiert worden. TGF-βs sind Gegenstand der U.S.-Patente Nr. 4,863,899; 4,816,561 und 4,742,003, die unter Bezugnahme aufgenommen werden. TGF-β1 und TGF-β2 sind öffentlich durch viele kommerzielle Quellen (z. B. R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN) erhältlich. Bei einigen Zellen fördert TGF-β die Zellproliferation, bei anderen unterdrückt es die Proliferation. Eine ausgeprägte Wirkung von TGF-β besteht darin, dass es die Produktion von extrazellulären Matrixproteinen und deren Rezeptoren durch Zellen fördert (für eine Übersicht siehe Keski-Oja et al., J. Cell. Biochem 33: 95 (1987); Massague, Cell 49: 437 (1987); Roberts und Sporn in "Peptides Growth Factors and Their Receptors" [Springer-Verlag, Heidelberg] (1989)).
Während TGF-β viele essentielle zellregulatorische Funktionen hat, kann eine unpassende TGF-β-Aktivität für einen Organismus schädlich sein. Da die Vermehrung von Mesenchym und die Proliferation von Mesenchymzellen durch TGF-β stimuliert wird, könnten einige Tumorzellen TGF-β als einen autokrinen Wachstumsfaktor benutzen. Wenn dementsprechend die Wachstumsfaktor- Aktivität von TGF-β verhindert werden könnte, könnte Tumorwachstum kontrolliert werden. In anderen Fällen könnte die Hemmung der Zellproliferation durch TGF-β schädlich sein, indem es möglicherweise die Heilung von verletzten Geweben verhindert. Die Stimulierung der Produktion von extrazellulärer Matrix durch TGF-β ist in Situationen, wie der Wundheilung, wichtig. Jedoch übertreibt der Körper in einigen Fällen mit dieser Reaktion und es resultiert eine übermäßige Anhäufung von extrazellulärer Matrix. Ein Beispiel einer übermäßigen Anhäufung von extrazellulärer Matrix ist Glomerulonephritis, eine Krankheit mit einer abträglichen Beteiligung von TGF-β.
Folglich gibt es einen kritischen Bedarf, Verbindungen zu entwickeln, welche die Wirkungen von zellregulatorischen Faktoren, wie TGF-β, modulieren können. Die Erfindung befriedigt dieses Bedürfnis und stellt damit in Zusammenhang stehende Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids, das eine TGF-β1 bindende Domäne eines Proteins umfasst und wobei das Protein durch eine Leucin-reiche wiederholte Sequenz von ungefähr 24 Aminosäuren gekennzeichnet ist, oder vorzugsweise von Decorin, einem 40.000 Dalton-Protein, das üblicherweise eine Glycosaminoglycan-Kette trägt, oder von dessen funktionellem Äquivalent (vorzugsweise Biglycan oder Fibromodulin) für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, "adult respiratory distress syndrome" (Schocklunge), Postmyokardinfarkt oder Postangioplastie-Restenose.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Fibromodulin oder Biglycan für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Verhütung oder Verringerung von Narbenbildung. Die Zusammensetzungen werden an Wunden verabreicht und sind besonders nützlich, um die Haut betreffende Wunden, die aus Verbrennungen, Verletzungen oder chirurgischen Eingriffen resultieren, zu behandeln. Zusätzlich umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die Fibromodulin oder Biglycan, ein Mittel das die Wundheilung fördert, (vorzugsweise ein RGD-enthaltendes Polypeptid) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die Expression von Decorin-cDNA, die eine Mutation der Serin-Akzeptor-Stelle zu Alanin enthält. COS-1-Kulturen wurden mit cDNA transfiziert, die Wildtyp-Decorin (Bahn 1), Decorin, bei dem der Serin-4-Rest durch ein Alanin ersetzt war (Bahn 2), oder Decorin, bei dem der Serin-4-Rest durch ein Threonin ersetzt war (Bahn 3), kodiert. Es wurden Immunpräzipitationen mit einem anti-Decorin-Antikörper und Medium, das mit ³&sup5;S-Sulfat (A) oder ³H-Leucin (B)- markiert war, ausgeführt. Bahn 4 zeigt ein Immunpräzipitat aus scheintransfizierten COS- 1-Kulturen. Der Pfeil zeigt die Oberkante des Gels an. Die. Zahlen geben Mr · 10&supmin;³ für Molekulargewichtstandardverbindungen an.
Fig. 2 zeigt die Bindung von [¹²&sup5;I]-TGF-β1 an Decorin-Sepharose. Fig. 2A zeigt die Fraktionierung von [¹²&sup5;I]-TGF-β1 durch Affinitätschromatographie an Decorin-Sepharose. [¹²&sup5;I]-TGF-β1 (5 · 10&sup5; cpm) wurde in mit BSA (Rinderserumalbumin) beschichteten Polypropylenröhrchen mit 0,2 ml gepackter Decorin-Sepharose ( ) oder Gelatine-Sepharose (o) in 2 ml PBS, pH 7,4, enthaltend 1 M NaCl und 0,05% Tween 20, inkubiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Affinitätsmatrices in mit BSA (Rinderserumalbumin) beschichtete Einweg-Säulen (Bio Rad) transferiert und mit dem Bindungspuffer gewaschen. Eine Elution erfolgte zuerst mit 3 M NaCl in dem Bindungspuffer und dann mit 8 M Harnstoff in dem gleichen Puffer. Fig. 2B zeigt die Analyse von eluiertem Material von der Decorin-Sepharose-Affinitätschromatographie durch ein SDS-Polyacrylamidgel unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Bahn 1: die ursprüngliche [¹²&sup5;I]-markierte TGF-β1- Probe; Bahnen 2-7: Durchfluss und Waschfraktionen; Bahnen 8- 10: 3 M NaCl-Fraktionen; Bahnen 11-14: 8 M Harnstoff- Fraktionen. Pfeile zeigen die Oberkante und die Unterkante des 12%-igen Trenngels an.
Fig. 3 zeigt die Hemmung der Bindung von [¹²&sup5;I]-TGF-β1 an Decorin durch Proteoglycane und deren Kernproteine. Fig. 3A zeigt die Kompetition der [¹²&sup5;I]-TGF-β1-Bindung an mit Decorin beschichtete Mikrotiterplattenvertiefungen durch rekombinantes Decorin ( ), aus Rinderhaut isoliertes Decorin (PGII) ( ), aus Rindergelenkknorpel isoliertes Biglycan (PGI) ( ), Knorpel- Proteoglycan aus Huhn (o) und BSA ( ). Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von Doppelbestimmungen. Fig. 3B zeigt die Kompetition der [¹²&sup5;I]-TGF-β1-Bindung mit Chondroitinase ABC-behandelten Proteoglycanen und BSA. Die Konzentrationen der kompetitierenden Substanzen wurden als intaktes Proteoglycan ausgedrückt. Die Symbole sind die gleichen wie in Fig. 3A.
Fig. 4 zeigt die Neutralisierung der vermehrungsregulierenden Aktivität von TGF-β1 durch Decorin. Fig. 4A zeigt die Hemmung der durch TGF-β1 induzierten Vermehrung von CHO-Zellen durch Decorin. Der [³H]-Thymidin-Einbauassay wurde, wie in der Legende von Fig. 1 beschrieben, in Gegenwart von 5 ng/ml TGF-β1 und der angegebenen Konzentrationen von gereinigtem Decorin ( ) oder BSA (o) ausgeführt. Bei der verwendeten Konzentration induzierte TGF-β1 eine 50%-ige Zunahme des [³H]-Thymidin-Einbaus in die CHO-Zellen. Die Daten repräsentieren die prozentuale Neutralisierung dieser Vermehrungsstimulierung; d. h. [³H]- Thymidin-Einbau in Abwesenheit von entweder TGF-β1 oder Decorin = 0%, Einbau in Gegenwart von TGF-β, aber nicht von Decorin = 100%. Jeder Punkt zeigt den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachproben. Fig. 4B zeigt die Neutralisierung der durch TGF-β1 induzierten Hemmung der Vermehrung bei MvLu-Zellen durch Decorin. Der Assay wurde ausgeführt wie in A mit der Ausnahme, dass TGF-β1 zu einer Konzentration von 0,5 ng/ml zugesetzt wurde. Diese Konzentration von TGF-β1 induziert eine 50%-ige Verringerung des [³H]-Thymidin-Einbaus in die MvLu-Zellen. Die Daten repräsentieren die Neutralisierung der durch TGF-β induzierten Vermehrungshemmung; d. h. [³H]-Thymidin-Einbau in Gegenwart von weder TGF-β noch Decorin = 100%; Einbau in Gegenwart von TGF-β, aber nicht von Decorin = 0%.
Fig. 5A zeigt die Trennung der Vermehrungs-inhibitorischen Aktivität von Decorin exprimierenden CHO-Zellen durch Gelfiltration. Serumfreies konditioniertes Medium von Decorin überxrimierenden. Zellen wurde durch DEAE-Sepharose-Chromatographie in einem neutralen Tris-HCl-Puffer aufgetrennt und Fraktionen, die Vermehrungs-inhibitorische Aktivität enthielten, wurden vereinigt, auf 4 M Guanidin-HCl gebracht und an einer Sepharose CL-6B-Säule, die mit der gleichen Guanidin-HCl-Lösung äqui¬ libriert worden war, aufgetrennt. Die Fraktionen wurden hinsichtlich Proteingehalt, Decorin-Gehalt und Vermehrungsregulatorischen Aktivitäten analysiert. Die Elutionspositionen von Markerproteinen sind durch Pfeile angegeben. BSA: Rinderserumalbumin (Mr = 66.000); CA: Carbonatdehydrase (Mr = 29.000); Cy: Cytochrom c (Mr = 12.400); Ap: Aprotinin (Mr = 6.500); TGF: [¹²&sup5;I]-TGF-β1 (Mr = 25.000).
Fig. 5B zeigt die Identifizierung des Vermehrungs-stimulierenden Materials aus der Gelfiltration als TGF-β1. Die Vermehrungs-stimulierende Aktivität aus den späten Fraktionen von der Sepharose 6B (Balken in Feld A) wurde identifiziert, indem die Aktivität mit Protein A-gereinigtem IgG aus einem anti- TGF-β-Antiserum gehemmt wurde. Die Daten repräsentieren die prozentuale Hemmung der Vermehrungsstimulierenden Aktivität in einem [³H]-Thymidin-Einbauassay. Jeder Punkt zeigt den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen. Anti- TGF-β1 ( ), normales Kaninchen IgG (o):
Fig. 6 zeigt Mikrophotographien, die eine Decorin-bindende zellregulatorische Aktivität, die durch Antikörper gegen TGF-β1 nicht supprimiert wird, zeigen.
Fig. 7 zeigt, dass Decorin die Bindung von [¹²&sup5;I]-TGF-β an den TGF-β-Rezeptor vom Typ III (β-Glycan) auf HepG2-Zellen hemmt. Fig. 7a zeigt das nicht-reduzierte Lysat von HepG2- Zellen, das im Rahmen einer SDS-PAGE mit einem 4-12%-igen Gel aufgetrennt worden ist. Fig. 7b zeigt das reduzierte Lysat, das im Rahmen einer SDS-PAGE auf einem 4-12%-igen Gel aufgetrennt worden ist. Es ist die Verringerung der Intensität der β-Glycan-Bande (ungefähr 300 kDa) und der nicht-quervernetzten Bande (freies TGF-β, 25 kDa) in Gegenwart von Decorin (10.000- facher molarer Überschuss) gezeigt.
Fig. 8 zeigt, dass Decorin die Bindung von [¹²&sup5;I]-TGF-β an den TGF-β-Rezeptor vom Typ III auf MG-63-Zellen hemmt. Fig. 8a zeigt die Auftrennung des Lysats bei einer SDS-PAGE auf einem 4-12%-igen Gel unter nicht-reduzierten Bedingungen, während Fig. 8b die Ergebnisse unter reduzierten Bedingungen zeigt.
Fig. 9 zeigt, dass Decorin (DC-9, DC-12) und Biglycan die Bindung von [¹²&sup5;I]-TGF-β an immobilisiertes Decorin hemmen.
Fig. 10 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Decorin- Inhibition der [¹²&sup5;I]-TGF-β-Bindung an HepG2-Zellen.
Fig. 11 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem Fibromodulin, die aus der cDNA abgeleitet worden ist. Die menschliche Fibromodulin-Sequenz ist in Ausrichtung ("alignment") mit den Aminosäuresequenzen von Rinder-Fibromodulin (Oldberg et al., 1989), menschlichem Decorin (Krusius und Ruoslahti, 1986) und menschlichem Biglycan (Fisher et al., 1989) gezeigt. Ein Stern markiert die Sequenzposition, wo die NH&sub2;-Termini der Proteoglycan-Kernproteine, denen ihre vorhergesagten Signalsequenzen fehlten, mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) aus E. coli fusioniert worden sind, wobei zwei zusätzliche Aminosäuren, Glycin und Serin, an der Verknüpfungsstelle hinzugefügt worden sind. Identische Aminosäuren sind eingerahmt.
Fig. 12 zeigt die Konstruktion eines prokaryotischen Expressionsvektors für Proteoglycan-Fusionsproteine. Der Ausgangsvektor pQE-8 wurde durch Insertion eines BglII/BamHI-MBP- Fragments modifiziert. Dieses Fragment umfasste auch eine Faktor Xa-Proteaseschnittstelle und stellte eine einmalig vorkommende BamHI-Klonierungsstelle für das Einführen der Proteoglycan-Kernprotein-Inserts bereit. RBS = Ribosomenbindungsstelle; 6 · His = kodierende Sequenz für sechs aufeinanderfolgende Histidine; MBP = kodierende Sequenz für das Maltose-bindende Protein aus E. coli; to = Transkriptionsterminatorsequenz "to" des Phagen lambda (Schwarz et al., 1987); cat = Promotorfreies Gen für Chloramphenicolacetyltransferase; T1 = Transkriptionsterminatorsequenz T1 des rrnB-Operons aus E. coli (Brosius et al., 1981).
Fig. 13 zeigt die Analysen von gereinigten rekombinanten Proteoglycan-Kern-Fusionsproteinen durch Gelelektrophorese. Jedes gereinigte Protein (1 ug/Vertiefung) wurde auf ein 4-20%-iges NaDodSO&sub4;-Polyacrylamidgel aufgeladen. Nach einer Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde das Gel mit Coomassie-Blau R-250 angefärbt. A = Maltose-bindendes Protein; B = MBP-Biglycan; C = MBP-Decorin; D = MBP-Fibromodulin. Es sind die Größen (kDa) von Molekulargewichtsmarker-Proteinen angegeben.
Fig. 14 zeigt die Bindung von radioaktiv markierten Proteoglycan-Fusionsproteinen und MBP an Mikrotiterplattenvertiefungen, die mit TGF-β1 beschichtet sind. TGF-β1 wurde in den angegebenen Konzentrationen (75 ul/Vertiefung) verwendet, um Mikrotiterplattenvertiefungen zu beschichten. Die Vertiefungen wurden mit ¹²&sup5;I-markiertem MBP-Biglycan ( ), MBP-Decorin ( ), BP-Fibromodulin ( ) oder MBP ( ) inkubiert. Es wurden konstante Mengen (~50.000 cpm/Vertiefung, spezifische Aktivitäten 2300-2800 Cl/mmol) der markierten Proteine zu den mit TGF-β1 beschichteten Vertiefungen (Gesamtvolumen 100 ul) zugesetzt. Nach einer Inkubation für 6 h bei 37ºC wurden die Vertiefungen viermal gewaschen. Die TGF-β1-Bindung wurde bestimmt, indem die gesamten Vertiefungen in einem Gammazähler gezählt wurden, und ist als Prozentsatz der Gesamtmenge an markierten Proteinen, die den Vertiefungen zugesetzt worden sind, ausgedrückt (± Standardabweichung).
Fig. 15 zeigt die Spezifität der Proteoglycan-Kernprotein- Bindung an TGF-β1. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit den angegebenen Proteinen (75 ul/Vertiefung, 3 ug/ml) beschichtet. ¹²&sup5;I-MBP-Biglycan (schraffierte Balken), ¹²&sup5;I-MBP-Decorin (ausgefüllte Balken) oder ¹²&sup5;I-MBP-Fibromodulin (kreuzweise schraffierte Balken) wurden den Vertiefungen zugesetzt (Gesamtvolumen 100 ul). Nach einer Inkubation für 6 h bei 37ºC wurden die Vertiefungen dreimal gewaschen und in einem Gammazähler gezählt. Die Bindung (± Standardabweichung) ist als Prozentsatz der Gesamtmenge an markierten Proteinen, die den Vertiefungen zugesetzt worden ist, ausgedrückt.
Fig. 16 zeigt den zeitlichen Verlauf der MBP-Biglycan-Bindung an TGF-β1. ¹²&sup5;I-MBP-Biglycan wurde zu mit TGF-β1 beschichteten Vertiefungen (75 ul, 1 ug/ml) bei 4ºC ( ) bzw. 37ºC ( ) zugesetzt. Nach den angegebenen Zeitspannen wurden die Vertiefungen dreimal gewaschen und in einem Gammazähler gezählt. Die Bindung (± Standardabweichung) ist als Prozentsatz der Gesamtmenge von zugesetztem ¹²&sup5;I-MBP-Biglycan ausgedrückt.
Fig. 17 zeigt die Inhibition der Bindung von Biglycan-Fusionsprotein an TGF-β1 durch Proteoglycan-Fusionsproteine und intakte Proteoglycane. Die Bindung von ¹²&sup5;I-MBP-Biglycan an TGF-β1 wurde in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von (A) unmarkiertem MBP-BG ( ), MBP-DEC ( ), MBP-FM ( ) oder MBP ( ) oder (B) gereinigtem Biglycan ( ), Decorin ( ) oder Fibromodulin ( ) gemessen. Nach einer Inkubation von 6 h bei 37ºC wurden die Vertiefungen dreimal gewaschen und in einem Gammazähler gezählt. Die Bindung (± Standardabweichung) ist als Prozentsatz der radioaktiven Markierung, die in Abwesenheit von kompetitierenden Verbindungen gebunden wird, ausgedrückt.
Fig. 18 zeigt die Kompetition hinsichtlich der Bindung von radioaktiv markiertem TGF-β1, -β2 und -β3 an Mikrotiterplattenvertiefungen, die mit Biglycan-Fusionsprotein beschichtet worden sind. Die Bindung ¹²&sup5;I-markiertem TGF-β1 (ausgefüllte Balken), TGF-β2 (schraffierte Balken) oder TGF-β3 (leere Balken) (50000 cpm/Vertiefung, spezifische Aktivitäten 5000 bis 7.000 Cl/mmol) an Oberflächen-gebundenes MBP-Biglycan (Beschichtungskonzentration 10 ug/ml; 75 ul/Vertiefung) wurde in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von unmarkiertem MBP- BG, MB-DEC, MBP-FM, MBP, Biglycan, Decorin oder Fibromodulin (1 uM) untersucht. Die Bindung wurde hinsichtlich einer nicht- spezifischen Bindung korrigiert und (wie) ist als Prozentsatz (± Standardabweichung) der Gesamtmenge von markiertem TGF-β1, 2 oder 3, die den Vertiefungen hinzugesetzt worden war, ausgedrückt.
Fig. 19 zeigt die Kompetition hinsichtlich der Bindung von markiertem TGF-β1 an MvLu-Zellen durch Proteoglycan-Fusionsproteine. (A) Subkonfluente Kulturen von MvLu-Nerzlungenzellen, kultiviert in Platten mit 48 Vertiefungen, wurden mit ¹²&sup5;I-TGF-β1 (100 pM) in Gegenwart (n.gez.) oder Abwesenheit (Bo) von unmarkiertem TGF-β1 (20 nM) oder den angegebenen Konzentrationen von Proteoglycan-Fusionsproteinen in einem Gesamtvolumen von 100 ul inkubiert. Nach einer Inkubation für 4 h bei 4ºC wurden die Zellen viermal gewaschen. Die Zellen wurden dann 40 min in 1% Triton-X 100 solubilisiert und hinsichtlich Radioaktivität in einem Gammazähler untersucht. Die Bindung (± Standardabweichung, n = 3) ist als Prozentsatz der Gesamtmenge an ¹²&sup5;I-TGF-β1, die zugesetzt worden war, ausgedrückt. (B) Nerzlungenzellen wurden mit ¹²&sup5;I-TGF-β1 (100 pM) in Abwesenheit oder Gegenwart von unmarkiertem TGF-β (20 nM) oder MBP-Fusionsproteinen (3 uM) in Platten mit 24 Vertiefungen inkubiert. Nach einer Inkubation für 4 h bei 4ºC wurden die Zellen mit dem Vernetzungslinker Disuccinimidylsuberat behandelt und durch NaDodSO&sub4;-PAGE und Autoradiographie analysiert. Bindung in Abwesenheit von kompetitierenden Verbindungen (a), mit TGF-β1 (b), MBP-BG (c), MBP-DEC (d), MBP-FM (e) oder MBP (f). Es sind die Positionen von vorab angefärbten Markerproteinen angegeben. Es sind die Positionen der TGF-β-Rezeptoren vom Typ I und Typ II und von Betaglycan (β-G) angegeben. Pfeile deuten auf die Rezeptoren und das Betaglycan (β-G).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es ist festgestellt worden, dass eine erhöhte TGF-β-Produktion ein bedeutsames Element bei zahlreichen fibrotischen Erkrankungen, die durch eine Anhäufung von Komponenten der extrazellulären Matrix gekennzeichnet sind, darstellt (Border und Ruoslahti, 1992). Neben Fibronectin, Collagenen und Tenascin (Ignotz und Massague, 1986; Varga et al., 1987; Pearson et al., 1988) reguliert TGF-β auch die Expression von Proteoglycanen hoch (Bassols und Massagure, 1988). Bei Mesangialzellen können sowohl Decorin als auch Biglycan nach einer Induktion durch TGF-β auf das bis zu 50-fache zunehmen (Border et al., 1990a), wohingegen bei Fibroblasten nur Biglycan erhöht zu sein scheint (Romaris et al., 1992; Kahari et al., 1991). Fibromodulin ist in dieser Hinsicht nicht untersucht worden. TGF-β spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von experimentell induzierter Glomerulonephritis, deren kritischste Manifestation die Anhäufung von extrazellulärer Matrix in den Glomeruli ist (Border et al., 1990). Eine neuere Studie zeigt, dass eine Injektion von rekombinantem Decorin in Ratten mit Glomerulonephritis die Matrixanhäufung unterdrücken kann (Border et al., 1992). Die Erfindung liefert Hinweise darauf, dass Fibromodulin in jener Situation sogar noch wirkungsvoller sein kann. Die TGF-β-neutralisierenden Aktivitäten der Proteoglycane von Decorin-Typ weisen darauf hin, dass neue Arten von therapeutischen Mitteln basierend auf diesen Molekülen entwickelt werden können.
Mit "zellregulatorischem Faktor" ist ein Molekül gemeint, das eine Aktivität einer Zelle regulieren kann. Die zellregulatorischen Faktoren sind im allgemeinen Proteine, die Zelloberflächenrezeptoren binden, und umfassen Wachstumsfaktoren. Beispiele von zellregulatorischen Faktoren umfassen die fünf TGF- βs, den Plättchenwachstumsfaktor, den epidermalen Wachstumsfaktor, den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und II, den Fibroblastenwachstumsfaktor, Interleukin-2, den Nervenwachstumsfaktor, die hämopoetischen Zellwachstumsfaktoren (IL-3, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, Erythropoietin) und den neu entdeckten Morphologie-wiederherstellenden Faktor ("Morphology Restoring Factor"), im Folgenden "MRF". Unterschiedliche regulatorische Faktoren können durch unterschiedliche Proteine gebunden werden, die die Aktivität des regulatorischen Faktors beeinflussen können. TGF-β1 wird beispielsweise durch Decorin, Biglycan und Fibromodulin gebunden und MRF wird durch Decorin gebunden.
Mit "Bindungsdomäne für einen zellregulatorischen Faktor" ist das Fragment eines Proteins gemeint, das an den zellregulatorischen Faktor bindet. Obwohl die hier aufgeführten speziellen Beispiele Proteine einsetzen, versteht es sich, dass ein Proteinfragment, das die Bindungsaktivität beibehält, innerhalb des Umfangs der Erfindung enthalten ist. Fragmente, die eine solche Aktivität beibehalten, können anhand ihrer Fähigkeit, die Bindung von beispielsweise Decorin an TGF-β oder von anderen Polypeptiden, die Leucin-reiche wiederholte Sequenzen enthalten, an die diese erkennenden Wachstumsfaktoren kompetitiv zu hemmen, identifiziert werden. Als ein Beispiel können Fragmente durch Verdau des nativen Polypeptids oder durch Synthese von Fragmenten basierend auf der bekannten Aminosäuresequenz erhalten werden. Solche Fragmente können dann in einem kompetitiven Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob sie nach wie vor Bindungsaffinität aufweisen. Beispielsweise kann Decorin an eine Affinitätsmatrix angeheftet werden, wie durch das Verfahren von Beispiel II. Markiertes TGF-β und das fragliche Fragment können dann mit der Affinitätsmatrix in Berührung gebracht werden und die Menge von TGF-β, die daran gebunden wird, kann bestimmt werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Decorin" auf ein Proteoglycan, das im wesentlichen die strukturellen Charakteristiken aufweist, die diesem in Krusius und Ruoslahti, a.a.O., zugeschrieben worden sind. Decorin aus menschlichen Fibroblasten hat im wesentlichen die Aminosäuresequenz, die in Krusius und Ruoslahti, a.a.O., angegeben worden ist. "Decorin" bezieht sich sowohl auf die native Zusammensetzung als auch auf Modifikationen davon, die im wesentlichen die funktionellen Charakteristiken beibehalten. Decorin-Kernprotein bezieht sich auf Decorin, das nicht länger substantiell mit Glycosaminoglycan substituiert ist, und ist in der Definition von Decorin mit enthalten. Decorin kann durch Mutation oder andere Maßnahmen, wie beispielsweise durch Produzieren von rekombinantem Decorin in Zellen, die nicht in der Lage sind, Glycosaminoglycan-Ketten an ein Kernprotein anzuheften, Glycosaminoglycanfrei gemacht werden.
Funktionelle Äquivalente von Decorin umfassen Modifikationen von Decorin, die dessen funktionelle Charakteristiken bewahren, und Moleküle, die zu Decorin homolog sind, wie beispielsweise Biglycan und Fibromodulin, die eine gleichartige funktionelle Aktivität wie Decorin aufweisen. Modifikationen können beispielsweise das Hinzufügen von einer oder mehreren Seitenketten, die mit der funktionellen Aktivität des Decorin- Kernproteins licht interferieren, umfassen.
Da die regulatorische Faktoren bindenden Proteine jeweils Leucin-reiche wiederholte Sequenzen von ungefähr 24 Aminosäuren, die bis zu 80% des Proteins ausmachen können, enthalten, ist es wahrscheinlich, dass die Fragmente, welche die Bindungsaktivität beibehalten, in den Leucin-reichen wiederholten Sequenzen auftreten. Es ist jedoch möglich, dass die Bindungsaktivität in den carboxyterminalen Aminosäuren oder in der Verbindungsstelle der wiederholten Sequenzen und der carboxyterminalen Aminosäuren liegt.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ein allgemeines Verfahren, wodurch ein Fachmann auf diesem Gebiet Proteine identifizieren kann, die an zellregulatorische Faktoren binden können, oder zellregulatorische Faktoren identifizieren kann, die an eine bestimmte Familie von Proteinen binden. Die Anmeldung lehrt auch ein allgemeines Verfahren, wodurch diese neuen Proteine oder bekannte existierende Proteine mittels eines Assays untersucht werden können, um zu bestimmen, ob sie eine Aktivität eines zellregulatorischen Faktors beeinflussen. Speziell lehrt die Erfindung die Entdeckung, dass Decorin und Biglycan TGF-βs binden und dass eine solche Bindung die zellregulatorischen Funktionen von TGF-βs inhibieren kann. Ferner sind Decorin und Biglycan beide zu ungefähr 80% homolog und enthalten eine Leucin-reiche wiederholte Sequenz von ungefähr 24 Aminosäuren, in welcher die Anordnung der Leucinreste konserviert ist. Wie definiert, enthält jede wiederholte Sequenz im allgemeinen mindestens zwei Leucinreste und kann fünf oder mehr enthalten. Diese Proteoglycane werden folglich als Mitglieder derselben Proteinfamilie angesehen. Siehe Ruoslahti, a.a.O., Fisher et al., J. Biol. Chem., 264: 4571-4576 (1989) und Patthy, J. Mol. Biol., 198: 567-577 (1987). Von anderen bekannten oder später entdeckten Proteinen, die diese Leuchin-reiche wiederholte Sequenz aufweisen, d. h. Fibromodulin, würde erwartet werden, dass sie eine ähnliche zellregulatorische Aktivität aufweisen. Die Fähigkeit solcher Proteine, zellregulatorische Faktoren zu binden, könnte leicht untersucht werden, beispielsweise durch Affinitätschromatographie oder durch Mikrotiter-Assay, wie in Beispiel 11 erläutert, unter Verwendung von bekannten zellregulatorischen Faktoren, wie den TGF-βs. Alternativ könnte ein jeglicher später entdeckter zellregulatorischer Faktor untersucht werden, beispielsweise durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von einem oder mehreren regulatorische Faktoren bindenden Proteinen. Ist einmal ermittelt, dass eine solche Bindung auftritt, kann die Auswirkung der Bindung auf die Aktivität aller regulatorischen Faktoren durch Methoden, wie Vermehrungs-Assays, wie in Beispiel III erläutert, bestimmt werden. Darüber hinaus könnte ein Fachmann auf diesem Gebiet in den Beispielen einfach einen TGF-β durch einen neuen zellregulatorischen Faktor ersetzen oder Decorin oder Biglycin durch ein neues Protein mit Leucin-reichen wiederholten Sequenzen ersetzen, um deren Aktivitäten zu bestimmen. Folglich stellt die vorliegende Anmeldung allgemeine Verfahren zur Identifizierung und Untersuchung von neuen zellregulatorischen Faktoren und Proteinen, die die Aktivität dieser Faktoren beeinflussen, bereit.
Die Erfindung betrifft zusätzlich die Verwendung eines gereinigten Polypeptids, wobei das Polypeptid die TGF-β-bindende Domäne eines Proteins umfasst und wobei das Protein durch eine Leucin-reiche wiederholte Sequenz von ungefähr 24 Aminosäuren gekennzeichnet ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, "adult respiratory distress syndrome" (Schocklunge), Postmyokardinfarkt oder Postangioplastie-Restenose.
Zusätzlich ist festgestellt worden, dass Decorin die Bindung von TGF-βs an deren Rezeptoren hemmt. Die Fig. 7, 8 und 10 zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchungen, bei denen TGF-β- Rezeptoren (Betaglycan) tragende Zellen mit TGF-β in Gegenwart und Abwesenheit von Decorin inkubiert wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Biglycan oder Fibromodulin, funktionellen Äquivalenten von Decorin, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhütung und Verringerung von Narbenbildung, indem die Zusammensetzung einer Wunde verabreicht wird. Die Haut betreffende Narbenbildung ist ein Prozess, der verschiedenen die Haut betreffenden Verletzungen folgt, der zu der übermäßigen Anhäufung von fibrösen Bindegeweben, umfassend Collagen, Fibronectin und Proteoglycane, führt. Die Induktion der Anhäufung von fibröser Matrix ist ein Ergebnis der Wachstumsfaktorfreisetzung am Ort der Wunde durch Plättchen und Entzündungszellen. Der hauptsächliche Wachstumsfaktor, von dem angenommen wird, dass er die Ablagerung von fibrösem Narbengewebe induziert, ist der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β). Decorin bindet und neutralisiert verschiedene biologische Funktionen von TGF-β, einschließlich der Induktion von extrazellulärer Matrix. Aufgrund des Fehlens von elastischen Eigenschaften dieser fibrösen extrazellulären Matrix beeinträchtigt das aus einer schweren Hautverletzung resultierende Narbengewebe oftmals essentielle Gewebefunktionen und kann zu einer unansehnlichen Narbe führen. Gemäß der Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass Fibromodulin und Biglycan besonders nützlich sind, Narbenbildung zu verhüten oder zu verringern.
Der Vorteil einer Verwendung von Biglycan oder Fibromodulin besteht darin, dass die Letztgenannten funktionelle Äquivalente von Decorin, einem normalen menschlichen Protein, sind, von dem angenommen wird, dass es an dem natürlichen TGF-β- Regulationsweg beteiligt ist. Folglich können Biglycan und Fibromodulin verwendet werden, um die Haut betreffende Narbenbildung aufgrund von Verbrennungsverletzungen, anderen invasi¬ ven Hautverletzungen und kosmetischen oder rekonstruktiven operativen Eingriffen zu verhüten oder zu verringern.
Es wurde festgestellt, dass mit Decorin behandelte Wunden im wesentlichen keine nachweisbare Narbenbildung verglichen mit Kontrollwunden, die nicht mit Decorin behandelt worden sind, zeigen. Es ist gezeigt worden, dass der TGF-β-induzierte Narbenbildungsprozess für Erwachsene und menschliche Föten im dritten Trimester einzigartig ist, aber bei Föten während der ersten beiden Trimester im wesentlichen fehlt. Das Fehlen von Narbenbildung bei fötalen Wunden ist mit dem Fehlen von TGF-β im Wundbett korreliert worden. Im Gegensatz dazu finden sich im Wundbett von erwachsenem Gewebe große Mengen an TGF-β und die vollständig verheilte Wunde wird durch eine gerötete, zerfurchte Narbe ersetzt, die reichlich fibröse, kollagenartige Matrix enthält. Die mit Decorin behandelten Wunden waren histologisch normal und ähnelten fötalen Wunden in den ersten beiden Trimestern.
Zusätzlich betrifft die Erfindung des weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Biglycan oder Fibromodulin, ein Mittel, das die Wundheilung fördert und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, die in den obigen Verfahren nützlich ist. Pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen beispielsweise Hyaluronsäure und wässrige Lösungen, wie Bicarbonatpuffer, Phosphatpuffer, Ringer-Lösung und physiologische Kochsalzlösung, ergänzt mit 5% Dextrose oder menschlichem Serumalbumin, sofern gewünscht. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten auch andere Mittel, die die Wundheilung fördern, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Solche Mittel können beispielsweise biologisch wirksame Chemikalien und Polypeptide, einschließlich RGD-enthaltender Polypeptide, die an ein biologisch abbaubares Polymer gebunden sind, wie in PCT WO 90/06767, veröffentlicht am 28. Juni 1990, beschrieben, umfassen. Solche Polypeptide können an Polymere durch jegliche Mittel oder Maßnahmen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich beispielsweise einer kovalenten oder ionischen Bindung, gebunden werden.
Es versteht sich, dass Modifizierungen, die die Aktivität der verschiedenen erfindungsgemäß verwendeten Moleküle, einschließlich TGF-β, MRF, Decorin, Biglycan und Fibromodulin, nicht substantiell beeinflussen, auch von der Definition jener Moleküle mit umfasst werden. Es versteht sich gleichfalls, dass die Kernproteine von Decorin, Biglycan und Fibromodulin ebenfalls von der Definition jener Moleküle mit umfasst werden.

BEISPIEL I

EXPRESSION UND REINIGUNG VON REKOMBINANTEM DECORIN UND DECORIN-KERNPROTEIN

Expressionssystem

Die in Krusius und Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7683 (1986), beschriebene 1,8 kb-Volllängen-Decorin-cDNA wurde für die Konstruktion von Decorin-Expressionsvektoren verwendet. Für die Expression von Decorin-Kernprotein wurde cDNA mutagenisiert, so dass das vierte Kodon, TCT, das Serin kodiert, zu ACT, das Threonin kodiert, oder GCT, das Alanin kodiert, verändert wurde. Dies erfolgte gentechnisch durch ortsgerichtete Mutagenese gemäß der Methode von Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Das Vorliegen der passenden Mutation wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die Säugetier-Expressionsvektoren pSV2-Decorin und pSV2- Decorin/OP-thr4-Kernprotein wurden konstruiert, indem die Decorin-cDNA oder die mutagenisierte Decorin-cDNA in das 3,4 kb- HindIII-BamHI-Fragment von pSV2 (Mulligen und Berg, Science 209: 1423 (1980), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) ligiert wurde.
Dihydrofolatreduktase (dhfr)-negative CHO-Zellen (CHO-DG44) wurden mit pSV2-Decorin oder pSV2-Decorin/CP und pSV2dhfr durch die Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode cotransfiziert. Die mit pSV2-Decorin transfizierten CHO-DG44-Zellen sind bei der American Type Culture Collection unter der Aufnahmenummer ATCC Nr. CRL 10332 hinterlegt. Die transfizierten Zellen wurden in alpha-modifiziertem essentiellem Minimalmedium ohne Nukleoside (α-MEM) (GIBCO, Long Island), ergänzt mit 9% dialysiertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin, kultiviert. Kolonien, die ausgehend von transfizierten Zellen entstanden, wurden unter Verwendung von Klonierungszylindern gepickt, vermehrt und hinsichtlich der Expression von Decorin durch Immunpräzipitation aus ³&sup5;SO&sub4;-markierten Kulturüberständen überprüft. Klone, die eine substantielle Menge Decorin exprimierten, wurden dann einer Genamplifizierung durch schrittweises Erhöhen der Methotrexat (MTX)-Konzentration bis auf 0,64 uM (Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601 (1982)) unterworfen. Alle amplifizierten Zelllinien wurden entweder durch limitierende oder Grenzwert-Verdünnung oder durch Picken von einzelnen MTX- resistenten Kolonien kloniert. Stammkulturen dieser etablierten Zelllinien wurden in MTX enthaltendem Medium aufbewahrt. Vor einer Verwendung bei der Proteinproduktion wurden die Zellen ausgehend von Stammkulturen in Medium ohne MTX subkultiviert und wenigstens einmal in diesem Medium passagiert, um die möglichen MTX-Effekte zu eliminieren.
Alternativ wurde das Kernprotein in COS-1-Zellen exprimiert, wie in Adams und Rose, Cell 41: 1007, (1985), beschrieben. Kurz zusammengefasst, wurden in Mehrfachvertiefungs ("multiwell")- platten mit 6 Vertiefungen 3-5 · 10&sup5; Zellen pro 9,6 cm² Vermehrungsfläche ausgesät und man ließ sie sich 24 h anheften und vermehren. Kulturen wurden mit Plasmid-DNA transfiziert, wenn sie zu 50-70% konfluent waren. Zellschichten wurden kurz mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), enthaltend 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,2, ergänzt mit 1 mM CaCl&sub2; und 0,5 mM MgCl&sub2;, bei 37ºC gewaschen, um eine Ablösung zu verhindern. Die Vertiefungen wurden 30 min bei 37ºC mit 1 ml der obigen Lösung, die 2 ug von geschlossener zirkulärer Plasmid-DNA und 0,5 mg/ml DEAE-Dextran (Sigma) mit einer durchschnittlichen Molekülmasse von 500.000 enthielt, inkubiert. Als Kontrolle wurden Kulturen mit dem pSV2-Expressionsplasmid, dem ein jegliches Decorin-Insert fehlte, transfiziert oder mit keinerlei DNA scheintransfiziert. Die Kulturen wurden dann 3 h bei 37ºC mit Dulbecco's Modified Eagle's-Medium (Irvine Scientific), das 10% fötales Kälberserum und 100 uM Chloroquin (Sigma) enthielt, inkubiert, nachdem die DNA/TBS/DEAE-Dextranlösung entfernt worden War und die Vertiefungen mit TBS gewaschen worden waren. Die Zellschichten wurden dann zweimal gespült und in dem obigen Medium, dem jegliches Chloroquin fehlte, ungefähr 36 h kultiviert. Embryonale menschliche WI38- Lungenfibroblasten wurden routinemäßig in dem gleichen Medium kultiviert.
COS-1-Kulturen wurden 36-48 h nach der Transfektion mit den Plasmid-DNAs radioaktiv markiert. Alle radioaktiv markierten Stoffwechselvorläuferverbindungen wurden von New England Nuclear (Boston, MA) erworben. Die verwendeten Isotope waren s-sulfat (460 mCi/ml), L-[3,4,5-³H(N)]-Leucin (140 Ci/ml) und L-[¹&sup4;C(U)]-Aminosäuremischung (Produktnummer 445E). Kulturen wurden 24 h in Hams F12-Medium (GIBCO Labs), ergänzt mit 10% dialysiertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1 mM Brenztraubensäure und enthaltend 200 uCi/ml ³&sup5;S-Sulfat oder 3H- Leucin oder 10 uCi/ml der ¹&sup4;C-Aminosäuremischung, markiert. Das Medium wurde gesammelt, mit 5 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,04 mg/ml Aprotinin und 1 ug/ml Pepstatin, um Proteaseaktivität zu hemmen, ergänzt, von Zellrückständen durch Zentrifugation für 20 min bei 2.000 · G befreit und bei -20ºC aufbewahrt. Zellextrakte wurden durch Spülen der Zellschichten mit TBS und dann Abkratzen mit einem Gummiwischer in 1 ml/Vertiefung von eiskaltem Zelllysepuffer: 0,05 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% BSA, 1% NP-40, 0,5% Triton X-100, 0,1% SDS, pH 8,3, hergestellt. Die Zellextrakte wurden durch Zentrifugation für 1,5 h bei 13000 · g bei 4ºC geklärt.
Kaninchen-Antiserum wurde gegen ein synthetisches Peptid, das auf den ersten 15 Resten der reifen Form des menschlichen Decorin-Kernproteins (Asp-Glu-Ala-Ser-Gly-Ile-Gly-Pro-Glu-Val- Pro-Asp-Asp-Arg-Asp) basiette, hergestellt. Das synthetische Peptid und das Antiserum gegen dieses sind anderswo (Krusius und Ruoslahti, a.a.O.) beschrieben worden. Kurz zusammengefasst, wurde das Peptid mit einem Festphasen-Peptidsynthetisiergerät (Applied Biosystems, Foster City, CA) durch Verwendung der Chemie, die vom Hersteller vorgeschlagen wird, synthetisiert. Das Peptid wurde an Schlüssellochnapfschnecken- Hämocyanin durch Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt. Die resultierenden Konjugate wurden in komplettem Freund'-Adjuvans emulgiert und Kaninchen injiziert. Weitere Injektionen von Konjugat in nicht-komplettem Freund'-Adjuvans erfolgten nach ein, zwei und drei Monaten. Die Dosis von jeder Injektion war äquivalent zu 0,6 mg Peptid. Blut wurde 10 Tage nach der dritten und vierten Injektion gesammelt. Die Antiseren wurden gegen die Glutaraldehyd-vernetzten Peptide und isoliertes Decorin im Rahmen eines ELISA (Engvall, Meth. Enzymol. 70: 419-439 (1980)), einer Immunpräzipitation und eines Immunblotting und durch Anfarben von Zellen im Rahmen von Immunfluoreszenz, wie in diesem Fachgebiet wohlbekannt ist, getestet.
Immunpräzipitationen wurden ausgeführt, indem 20 ul Antiserum zu dem konditionierten Medium oder Zellextrakt, gesammelt aus jeweils zwei Vertiefungen, hinzugesetzt wurden und dann über Nacht bei 4ºC gemischt wurde. Immunkomplexe wurden durch Inkubationen für 2 h bei 4ºC mit 20 ul gepackter Protein A-Agarose (Sigma) isoliert. Die Körnchen wurden mit Zelllysepuffer mit drei Röhrchenwechseln gewaschen und dann zweimal mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen vor einem Kochen in Gelelektrophorese-Probenpuffer, der 10% Mercaptoethanol enthielt. Immunpräzipitierte Proteine wurden durch SDS-PAGE in 7,5-20%- igen Gradientengelen oder 7,5%-igen Nicht-Gradientengelen, wie dies in diesem Fachgebiet wohlbekannt ist, aufgetrennt. Fluorographie erfolgte durch Verwendung von Enlightning (New England Nuclear) mit Verstärkerschirmen. Typische Expositionszeiten betrugen 7-10 Tage bei -70ºC. Autoradiographen wurden mittels eines LKB Ultrascan XL Enhanced Laser-Densitometers gescannt, um die relativen Intensitäten und Mobilitäten der Proteoglycan-Banden zu vergleichen.
Eine SDS-PAGE-Analyse von Zellextrakten und Kulturmedium von COS-1-Zellen, die mit dem Decorin-pSV2-Konstrukt transfiziert und metabolisch mit ³&sup5;S-Sulfat radioaktiv markiert worden waren, enthüllte eine sulfatierte Bande, die in scheintransfizierten Zellen nicht vorhanden war. Die Immunpräzipitation mit dem Antiserum, das gegen ein von dem Decorin-Kernprotein abgeleitetes synthetisches Peptid erzeugt worden war, zeigte, dass die neue Bande Decorin war.
Die Expression des Konstrukts, das derart mutiert worden war, dass der Serinrest, der normalerweise mit einem Glycosaminoglycan substituiert ist (Serin-4), durch einen Threoninrest ersetzt war, ergab anhand von SDS-PAGE nur ungefähr 10% der Menge an Proteoglycan, die mit dem Wildtyp-Konstrukt erhalten wird. Der Rest des immunreaktiven Materials wanderte bei der Position von freiem Kernprotein.
Das Alanin mutierte cDNA-Konstrukt ergab, wenn es auf eine ähnliche Weise exprimiert und analysiert wurde, nur Kernprotein und keine Proteoglycan-Form von Decorin. Fig. 1 zeigt die Expression von Decorin (Bahnen 1) und dessen zu Threonin-4 (Bahnen 3) und Alanin-4 (Bahnen 2) mutierten Kernproteinen, die in COS-Zell-Transfektanten exprimiert wurden. ³&sup5;SO&sub4;- markierte (A) und ³H-Leucin-markierte (B) Kulturüberstände wurden mit Kaninchen-anti-Peptid-Antiserum, das gegen den NH&sub2;- Terminus von menschlichem Decorin hergestellt worden war, immunpräzipitiert.

Reinigung von Decorin und Decorin-Kernprotein aus verbrauchten Kulturmedien

Zellen, die mit dem pSV2-Decorin-Vektor transfiziert und, wie oben und in Yamaguchi und Ruoslahti, Nature 36: 244-246 (1988) beschrieben, amplifiziert worden waren, wurden bis zu 90% Konfluenz in 8 175 cm²-Kulturkolben in α-MEM ohne Nukleotide, ergänzt mit 9% dialysiertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin, vermehrt. Bei 90% Konfluenz wurde das Kulturmedium gegen 25 ml pro Kolben von Nukleosid-freiem α-MEM, ergänzt mit 6% dialysiertem fötalem Kälberserum, das durch eine mit 0,25 M NaCl in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, äquilibrierte DEAE-Sepharose- Fast Flow-Säule (Pharmacia) geleitet worden war, ausgetauscht. Die Zellen wurden 3 Tage kultiviert, verbrauchtes Medium wurde gesammelt und unverzüglich auf 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 ug/ml Pepstatin, 0,04 mg/ml Aprotinin und 5 mM EDTA gebracht.
Vierhundert Milliliter der verbrauchten Medien würden, zuerst durch Gelatine-Sepharose geleitet, um Fibronectin und Materialien, die an Sepharose binden würden, zu entfernen. Die Durchflussfraktion wurde dann mit in 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, plus 0,2 M NaCl voräquilibrierter DEAE-Sepharose gemischt und der Ansatz über Nacht bei 4ºC unter sanftem Mischen absorbiert. Die Aufschlämmung wurde in eine 1,6 · 24 cm-Säule gegossen, umfassend mit 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, die 0,2 M NaCl enthält, gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0,2 M-0,8 M NaCl in 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, eluiert. Die Decorinkonzentration wurde durch kompetitiven ELISA bestimmt, wie in Yamaguchi und Ruoslahti, a.a.O. beschrieben. Die Decorin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und an einer Sephadex-Gelfiltrationssäule, die mit 8 M Harnstoff in dem Tris-HCl-Puffer äquilibriert worden war, weiter aufgetrennt. Decorin enthaltende Fraktionen wurden gesammelt.
Das Kernprotein wird aus den klonierten, mit dem pSV2-Decorin/CP-Vektor oder dem Vektor, der die hinsichtlich Alanin mutierte cDNA enthält, transfizierten und, wie oben beschrieben, amplifizierten Zelllinien gereinigt. Diese Zellen werden, wie oben beschrieben, bis zu Konfluenz vermehrt. Bei Konfluenz wird die Zell-Monolayer viermal mit serumfreiem Medium gewaschen und in α-MEM, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 2 h inkubiert. Dieses verbrauchte Medium wird verworfen. Die Zellen werden dann mit α-MEM, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 2 h inkubiert und die verbrauchten Medien werden gesammelt und unverzüglich auf 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 ug/ml Pepstatin, 0,04 mg/ml Aprotinin und 5 mM EDTA als serumfreie verbrauchte Medien gebracht. Die verbrauchten Medien werden zuerst durch Gelatine-Sepharose geleitet und die Durchfluss-Fraktion wird dann chargenweise an cm-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), voräquilibriert in 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, enthaltend 0,1 M NaCl, adsorbiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wird die Aufschlämmung in eine Säule gegossen, umfassend mit dem Voräquilibrierungspuffer gewaschen und mit einem linearen 0,1 M-1 M NaCl-Gradienten in 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, eluiert. Die Decorin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, gegen 50 mM NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Material wird in 50 mM Tris, pH 7,4, enthaltend 8 M Harnstoff, gelöst und auf eine Sephacryl S-200- Säule (1,5 · 110 cm) aufgetragen. Decorin-Kernproteine enthaltende Fraktionen, wie durch SDS-Polyacrylamidelektrophorese enthüllt, werden gesammelt und stellen gereinigtes Decorin- Kernprotein dar.

BEISPIEL II

BINDUNG VON TGF-β AN DECORIN

a. Affinitätschromatographie von TGF-β an Decorin-Sepharose

Decorin und Gelatine wurden an Bromcyan-aktivierte Sepharose (Sigma) gekoppelt, indem 1 mg Protein pro ml Sepharose-Matrix gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Kommerziell erhaltenes TGF-β1 (Calbiochem, La Jolla, CA) wurde durch die Chloramin T-Methode (Frolik et al., J. Biol. Chem. 259: 10995-11000 (1984)) ¹²&sup5;I-markiert und das markierte TGF-β wurde von dem nicht-umgesetzten Iod durch Gelfiltration an Sephadex G-25, äquilibriert mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), abgetrennt (Fig. 2). [¹²&sup5;I]-TGF-β1 (5 · 10&sup5; cpm) wurde in BSA- beschichteten Polypropylenröhrchen mit 0,2 ml gepackter Decorin-Sepharose ( ) oder Gelatine-Sepharose (o) in 2 ml PBS, pH 7,4, enthaltend 1 M NaCl und 0,05% Tween 20, inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Affinitätsmatrices in BSA-beschichtete Einwegsäulen (BioRad) transferiert und mit dem Bindungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgte zuerst mit 3 M NaCl im Bindungspuffer und dann mit 8 M Harnstoff in dem gleichen Puffer. Es wurden Fraktionen gesammelt, hinsichtlich Radioaktivität in einem Gammazähler gezählt und durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 12%-igen Gelen analysiert.
Fig. 2A zeigt das Radioaktivitätsprofil aus den beiden Säulen und die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen ist in Fig. 2B gezeigt. Das TGF-β1-Ausgangsmaterial enthält eine stärkere Bande bei 25 kd. Diese Bande repräsentiert das native TGF-β1-Dimer. Zusätzlich gibt es in dem Präparat zahlreiche schwächere Banden. Ungefähr 20-30% der Radioaktivität binden an die Decorin- Säule und eluieren mit 8 M Harnstoff, wohingegen nur ungefähr 2% der Radioaktivität in den mittels Harnstoff eluierten Fraktionen bei der Kontroll-Auftrennung, die an Gelatine-Sepharose ausgeführt wird, vorhanden sind (Fig. 2A). Die durch Decorin- Sepharose nicht gebundene Fraktion enthält die Gesamtmenge der in geringeren Mengen vorhandenen Komponenten und einen Teil des 25 kD-TGF-β1, wohingegen die gebundene, mittels Harnstoff eluierte Fraktion nur TGF-β1 enthält (Fig. 2B). Diese Ergebnisse zeigen, dass TGF-β1 spezifisch an Decorin bindet, da unter den verschiedenen Komponenten, die in dem ursprünglichen TGF-β1-Präparat vorhanden waren, nur TGF-β1 an die Decorin- Sepharose-Affinitätsmatrix band, und da es eine sehr geringe Bindung an die Gelatine-Sepharose-Kontroll-Affinitätsmatrix gab. Der TGF-β1, der an die Decorin-Sepharose-Säule nicht band, könnte durch die Iodierung denaturiert worden sein. Ein Nachweis für diese Möglichkeit wurde durch Affinitätschromatographie von unmarkiertem TGF-β1, wie nachfolgend beschrieben, bereitgestellt.
In einem zweiten Experiment wurde unmarkiertes TGF-β1, 180 ng, an Decorin-Sepharose aufgetrennt, wie oben für ¹²&sup5;I-TGF-β beschrieben.
TGF-β1 (180 ng) wurde mit Decorin-Sepharose oder BSA-Agarose (0,2 ml gepacktes Volumen) in PBS (pH 7,4), die 1% BSA enthielt, inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Harze mit 15 ml des Puffers gewaschen und zuerst mit 5 ml 3 M NaCl in PBS, dann mit 5 ml PBS, die 8 M Harnstoff enthielt, eluiert. Aliquots von jedem Pool wurden gegen Kulturmedium ohne Serum dialysiert und hinsichtlich der Hemmung eines [³H]-Thymidineinbaus in MvLu-Zellen untersucht (Beispiel III). Die Mengen an TGF-β1 in jedem Pool wurden aus der Standardkurve des [³H]-Thymidineinbaus, erhalten aus einem parallelen Experiment mit bekannten Konzentrationen von TGF-β1, berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass TGF-β1 im wesentlichen quantitativ an die Decorin-Säule band, wohingegen es nur wenig Bindung an die Kontrollsäule gab (Tabelle 1). Die teilweise Rückgewinnung der TGF-β1-Aktivität kann auf einen Verlust von TGF-β1 bei den Dialysen zurückzuführen sein. TABELLE I Decorin-Sepharose-Affinitätschromatographie von nicht-markiertem TGF-β1, verfolgt mittels eines Vermehrungsinhibitionsassays in MvLu-Zellen

b. Bindung von TGF-β1 an Decorin in einem Mikrotiter-Assay: Hemmung durch Kernprotein und Biglycan

Die Bindung von TGF-β1 an Decorin wurde auch in einem Mikrotiter-Bindungsassay untersucht. Um den Assay auszuführen, wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen über Nacht mit 2 ug/ml rekombinantem Decorin in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet. Die Vertiefungen wurden mit PBS, die 0,05% Tween enthielt, (PBS/Tween) gewaschen und Proben, die 5 · 10&sup4; cpm [¹²&sup5;I]-TGF-β1 und verschiedene Konzentrationen von kompetitierenden Verbindungen in PBS/Tween enthielten, wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platten wurden dann bei 37ºC 4 h inkubiert (bei 4ºC über Nacht bei Experimenten mit mit Chondroitinase ABC verdauten Proteoglycanen), mit PBS/Tween gewaschen und die gebundene Radioaktivität wurde mit 1% SDS in 0,2 M NaOH solubilisiert. Die gesamte Bindung ohne kompetitierende Verbindungen betrug unter den verwendeten Bedingungen ungefähr 4%. Die nicht-spezifische Bindung, die durch Zugeben eines 100-fachen molaren Überschusses von unmarkiertem TGF-β1 gegenüber dem markierten TGF-β1 zu der Inkubationsmischung bestimmt wurde, betrug ungefähr 13% der gesamten Bindung. Dieser Assay wurde auch verwendet, um die Fähigkeit von anderen Decorin-Präparaten und verwandten Proteinen zu untersuchen, mit der Wechselwirkung zu kompetitieren.
Die Bewerkstelligung der Decorin-Bindung wurde mit den folgenden Proteinen untersucht (Fig. 3; die Symbole sind in dem Abschnitt KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN angegeben; (1) aus Rinderhaut isoliertes Decorin (PGII), (2) aus Rinder-Gelenkknorpel isoliertes Biglycan (PGI) (sowohl PGI als auch PGII wurden von Dr. Lawrence Rosenberg, Monteflore Medical Center, N. Y., erhalten und sind in Rosenberg et al., J. Biol. Chem. 250: 6304-6313, (1985), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben) und (3) Hühnerknorpel- Proteoglycan (zur Verfügung gestellt von Dr. Paul Goetinck, La Jolla Cancer Research Foundation, La Jolla, CA, und beschrieben in Goetinck, P. F., in The Glycoconjugates, Band III, Horwitz, M. I., Herausgeber, S. 197-217, Academic Press, NY).
Für die Herstellung von Kernproteinen wurden Proteoglycane mit Chondroitinase ABC (Seikagaku, Tokyo, Japan) verdaut, indem 500 ug Proteoglycan mit 0,8 Einheiten Chondroitinase ABC in 250 ul 0,1 M Tris/Cl, pH 8,0, 30 mM Natriumacetat, 2 mM PMSF, 10 mM N-Ethylmaleimid, 10 mM EDTA und 0,36 mM Pepstatin 1 h bei 37ºC inkubiert wurden. Rekombinantes Decorin und Decorin, das aus Rinderhaut isoliert worden war, (PGII) hemmten, wie erwartet, die Bindung von [¹²&sup5;I]-TGF-β1 (Fig. 3A). Aus Rinder- Gelenkknorpel isoliertes Biglycan war ein so wirksamer Inhibitor wie Decorin. Da Hühnerknorpel-Proteoglycan, das viele Chondroitinsulfatketten trägt, keinerlei Hemmung zeigte, ist unwahrscheinlich, dass die Wirkung von Decorin und Biglycan auf Glycosaminoglycane zurückzuführen ist. Rinderserumalbumin zeigte keinerlei Hemmung. Diese Ansicht wurde durch Kompetitionsexperimente mit dem mutierten Decorin-Kernprotein (nicht gezeigt) und Chondroitinase ABC-verdautem Decorin und Biglycan (Fig. 3B) weiter gestützt. Jedes dieser Proteine war inhibitorisch, wohingegen Proteoglycan-Kernprotein aus Knorpel dies nicht war. Die Decorin- und Biglycan-Kernproteine waren etwas aktiver als die intakten Proteoglycane. Mit Chondroitinase ABC behandeltes Rinderserumalbumin zeigte keinerlei Hemmung. Zusätzliche Bindungsexperimente zeigten, dass [¹²&sup5;I]-TGF-β1 an mit Biglycan oder dessen Chondroitinase-behandeltem Kernprotein beschichtete Mikrotiterplattenvertiefungen band. Diese Ergebnisse zeigen, dass TGF-β1 an das Kernprotein von Decorin und Biglycan bindet und impliziert die Leucin-reichen wiederholten Sequenzen, die diese Proteine gemein haben, als potentielle Bindungsstellen.

BEISPIEL III

ANALYSE DER WIRKUNG VON DECORIN AUF DIE ZELLPROLIFERATION, DIE DURCH TGF-β1 STIMULIERT ODER GEHEMMT WIRD

Die Fähigkeit von Decorin, die Aktivität von TGF-β1 zu modulieren, wurde in [³H]-Thymidineinbauassays untersucht. In einem Assay wurde eine nicht-amplifizierte CHO-Zelllinie, die nur mit pSV2dhfr transfiziert worden war, (Kontrollzelllinie A in Referenz 1, hier bezeichnet als CHO-Zellen) verwendet. Die Zellen wurden in Nukleosid-freiem alpha-modifiziertem essentiellem Minimalmedium (α-MEM, GIBCO, Long Island, NY), ergänzt mit 9% dialysiertem fötalem Kälberserum (dFCS), gehalten und der [³H]-Thymidineinbau wurde untersucht, wie beschrieben (Cheifetz et al., Cell 48: 409-415 (1987)). TGF-β1 wurde den CHO-Zellkulturen zu 5 ng/ml zugesetzt. Bei dieser Konzentration induzierte dieser eine 50%-ige Zunahme des [³H]-Thymidineinbaus in diese Zellen. Decorin oder BSA wurde dem Medium zu unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4A gezeigt. Die Daten repräsentieren den Prozentsatz der Neutralisierung dar TGF-β1-induzierten Vermehrungsstimulation, d. h. des [³H]-Thymidineinbaus, in Abwesenheit von entweder TGF-β1 oder Decorin = 0%, Einbau in Gegenwart von TGF-β1, aber nicht von Decorin = 100%. Jeder Punkt zeigt den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachproben. Decorin ( ), BSA (o).
Decorin neutralisierte die die Vermehrung stimulierende Aktivität von TGF-β1 mit einer halbmaximalen Aktivität bei ungefähr 5 ug/ml. Darüber hinaus senkte zusätzliches Decorin den [³H]- Thymidineinbau ab unter das Niveau, das ohne jeglichen zugesetzten TGF-β1 beobachtet wird, was zeigt, dass Decorin auch TGF-β, der durch die CHO-Zellen selbst hergestellt wird, hemmte. Sowohl die Decorin exprimierenden als auch die Kontroll- CHO-Zellen produzierten eine offensichtlich aktive TGF-β- Konzentration von ungefähr 0,25 ng/ml Konzentration in deren konditionierten Medien, wie durch die Hemmung der Vermehrung von Nerzlungen-Epithelzellen bestimmt wurde. (Der Assay konnte ohne Interferenz von Seiten des Decorins in den Kulturmedien ausgeführt werden, da, wie nachfolgend gezeigt, die Wirkung von TGF-β auf die Nerzzellen bei den Decorinkonzentrationen, die in den Decorin-Produzenten-Medien vorhanden waren, nicht wesentlich gehemmt wurde).
Experimente in MvLu-Nerzlungen-Epithelzellen (American Type Culture Collection CCL 64) enthüllten ebenfalls eine Wirkung von Decorin auf die Aktivität von TGF-β1. Fig. 4B zeigt, dass bei diesen Zellen deren Vermehrung, die durch Thymidineinbau gemessen wird, durch TGF-β1 supprimiert worden war. Der Assay wurde ausgeführt, wie in Fig. 4A, mit der Ausnahme, dass TGF- β1 zu 0,5 ng/ml zugesetzt wurde. Diese Konzentration von TGF-β induziert eine 50%-ige Verringerung des [³H]-Thymidineinbaus in die MvLu-Zellen. Die Daten repräsentieren die Neutralisierung der durch TGF-β induzierten Vermehrungshemmung; d. h. [³H]-Thymidineinbau in Gegenwart von weder TGF-β noch Decorin = 100%; Einbau in Gegenwart von TGF-β1, aber nicht von Decorin = 0%.

BEISPIEL IV

NEUER DECORIN-BINDENDER FAKTOR, DER DIE ZELLVERBREITUNG UND SÄTTIGUNGSDICHTE KONTROLLIERT (nur zur Information)

Eine Analyse des in den Kulturmedien der überexprimierenden Zellen enthaltenen Decorins enthüllte nicht nur die oben beschriebenen Aktivitäten von Decorin, sondern enthüllte auch die Anwesenheit von anderen mit Decorin verbundenen Vermehrungs-regulatorischen Aktivitäten. Es wurde festgestellt, dass die Medien der überexprimierenden Zellen eine TGF-β-artige Vermehrungs-inhibitorische Aktivität enthalten. Dies wurde durch Gelfiltration des DEAE-isolierten Decorins unter dissoziierenden Bedingungen gezeigt. Serumfreies konditioniertes Medium von Decorin überexprimierenden CHO-DG44-Zellen, die mit Decorin-cDNA transfiziert worden waren, wurde durch DEAE-Sepharose-Chromatographie in einem neutralen Tris-HOl-Puffer aufgetrennt und Fraktionen, die Vermehrungs-inhibitorische Aktivität enthielten, gegen 50 mM NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert, lyophilisiert und in 4 M (mit) Guanidin-HCl in einem Natriumacetatpuffer, pH 5,9, gelöst. Das gelöste Material wurde an einer 1,5 · 70 cm Sepharose-CL-6B-Säule, die mit der gleichen Guanidin-HCl- Lösung äquilibriert worden war, aufgetrennt. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, Decorin-ELISA und Zellvermehrungsassays, die allesamt oben beschrieben wurden, analysiert. Es wurden drei Proteinpeaks erhalten. Einer enthielt Proteine von hohem Molekulargewicht, wie Fibronectin (M. G. 500000) und keine nachweisbaren Vermehrungs-regulatorischen Aktivitäten, der zweite war Decorin mit den im Rahmen von Beispiel III beschriebenen Aktivitäten und der dritte war eine Fraktion von niedrigem Molekulargewicht (10.000-30.000 Dalton), die eine Vermehrungs-inhibitorische Aktivität in dem Nerzzellen-Assay aufwies und die Vermehrung der CHO-Zellen stimulierte. Fig. 5 fasst diese Ergebnisse zusammen. Es sind die Fähigkeit der Gelfiltrationsfraktionen, einen [³H]-Thymidineinbau durch die CHO-Zellen zu beeinflussen, und die Konzentration von Decorin, wie durch Enzymimmungssay bestimmt, gezeigt. Auch gezeigt (Pfeile) sind die Elutionspositionen von Molekülgrößenmarkern: BSA, Rinderserumalbumin (Mr = 66.000); CA, Carbonatdehydrase (Mr = 29.000); Cy, Cytochrom c (Mr = 12.400); AP, Aprotinin (Mr = 6.500); TGF, [¹²&sup5;I] TGF-β1 (Mr = 25.000).
Die Natur der Vermehrungs-regulatorischen Aktivität, die in der Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht detektiert wird, wurde mit einem anti-TGF-β1-Antiserum untersucht. Das Antiserum wurde gegen ein synthetisches Peptid aus den Resten 78-109 des menschlichen reifen TGF-β1 hergestellt. Es ist zuvor gezeigt worden, dass durch andere gegen eine cyclische Form des gleichen Peptids, dessen terminale Cysteinreste durch Dirsulfidbrücken verknüpft waren, erzeugte Antiseren die Bindung von TGF-β1 an dessen Rezeptoren hemmen (Flanders et al., Biochemistry 27: 739-746 (1988)). Das Peptid wurde in einem Applied Biosystems Festphasen-Peptidsynthetisiergerät synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Ein Kaninchen wurde subkutan mit 2 mg pro Injektion des Peptids, das mit 0,5 mg methyliertem BSA (Sigma, St. Louis, MO) gemischt und in komplettem Freund'- Adjuvans emulgiert worden war, immunisiert. Die Injektionen wurden im allgemeinen in Abständen von vier Wochen verabreicht und man nahm dem Kaninchen ungefähr eine Woche nach der zweiten und jeder nachfolgenden Injektion Blut ab. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Antiseren hatten einen Titer (50% Bindung) von 1 : 6.000 bei einem Radioimmungssay, gebunden an TGF-β1 in Immunblots.
Dieses Antiserum war in der Lage, die Aktivität von gereinigtem TGF-β1 gegenüber den CHO-Zellen zu hemmen. Darüberhinaus hemmte das Antiserum auch, wie in Fig. 5 gezeigt, die Vermehrungs-stimulierende Aktivität der Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht, wie durch den [³H]-Thymidineinbauassay an den CHO-Zellen bestimmt wurde. Steigende Konzentrationen einer IgG-Fraktion, die ausgehend von dem anti-TGF-β1-Antiserum hergestellt worden ist, supprimierten die stimulierende Wirkung der Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht in einer konzentrationsabhängigen Weise ( ). IgG aus einem normalen Kaninchenserum hatte in dem Assay keine Wirkung (o).
Das obige Ergebnis identifizierte den stimulatorischen Faktor in der Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht als TGF-β1. Jedoch ist TGF-β1 in jener Fraktion nicht die einzige aktive Verbindung. Trotz der Wiederherstellung des Thymidineinbaus durch den anti-TGF-β1-Antikörper, die in Fig. 5 gezeigt ist, unterschieden sich die mit der Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht behandelten Zellen morphologisch von den Zellen, die mit dem Kontroll-IgG behandelt worden waren, oder Zellen, die mit Antikörper allein behandelt worden waren. Dieser Effekt war besonders deutlich, wenn die mit Antikörper behandelte Fraktion von niedrigem Molekulargewicht zu Kulturen von H-rastransformierten NIH-3T3-Zellen (Der et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3637-3640 (1982)) hinzugesetzt würde. Wie in Fig. 6 gezeigt, erschienen Zellen, die mit der Fraktion von niedrigem Molekulargewicht und Antikörper behandelt worden waren (Mikrophotographie in Feld B), stärker ausgedehnt und kontaktgehemmt als die Kontrollzellen (Mikrophotographie in Feld A). Dieses Ergebnis zeigt, dass das von CHO-Zellen abgeleitete rekombinante Decorin mit einem zellregulatorischen Faktor, dem Morphologie-wiederherstellenden Faktor (MRF; Morphology Restoring Factor), der sich von den gut charakterisierten TGF-βs unterscheidet, assoziiert ist.
Zusätzliche Nachweise, dass der neue Faktor sich von TGF-β1 unterscheidet, kamen aus HPLC-Experimenten. Weitere Trennungen des niedrigen Molekulargewichts von der Sepharose CL-6B-Säule erfolgten an einer Vydac C4-Umkehrphasen-Säule (1 · 25 cm, 5 um Teilchengröße, the Separations Group, Hesperia, CA) in 0,1% Trifluoressigsäure. Gebundene Proteine wurden mit einem Gradienten von Acetonitril (22-40%) eluiert und die Fraktionen hinsichtlich Vermehrungs-inhibitorischer Aktivität in den Nerzlungen-Epithelzellen und MRF-Aktivität in H-ras-3T3-Zellen untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass die TGF-β1-Aktivität zu Beginn des Gradienten eluierte, wohingegen die MRF-Aktivität gegen Ende des Gradienten eluierte.

BEISPIEL V

HEMMUNG DER TGF-β-BINDUNG

A. Vernetzung von [¹²&sup5;I]-TGF-β mit HepG2-Zellen

Ungefähr 2,5 · 10&sup4; HepG2-Zellen (menschliches Leberzellkarzinom, ATCC Nr. HB 8065) wurden mit 100 pM [¹²&sup5;I]-TGF-β in Gegenwart von rekombinantem Decorin, TGF-β oder α-TGF-β-Antikörper 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden viermal gewaschen, bevor sie in Bindungspuffer (128 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM Mg&sub2;SO&sub4;, 1,2 mM CaCl&sub2;, 50 mM HEPES, 2 mg/ml BSA, pH 7,5), enthaltend 0,25 mM Disuccinimidylsuberat (DSS), 15 min suspendiert wurden. Die Zellen wurden nachfolgend in Waschpuffer (Bindungspuffer ohne BSA), enthaltend 150 mM Sucrose, gewaschen und lysiert vor einer Suspendierung in SDS enthaltendem Laemmli-Probenpuffer, der den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist. Die Lysate wurden mittels 4-12%-SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Vernetztes TGF-β wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen. Decorin hemmt die Bindung von TGF-β an β-Glycan, einen TGF-β-Rezeptor, der auf HepG2-Zellen gefunden wird.

B. Vernetzung von [¹²&sup5;I]-TGF-β mit MG-63-Zellen

Ungefähr 10&sup5; MG-63-Zellen (männliches Osteosarkom, ATCC Nr. CRL 1427) wurden mit 150 pM [¹²&sup5;I]-TGF-β in Gegenwart einer rekombinanten Decorin-Präparation (bezeichnet als DC-13) oder TGF-β 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden viermal in eiskaltem Bindungspuffer von Beispiel V(A) gewaschen, bevor sie in Bindungspuffer, der 0,25 mM DSS enthielt, 15 min suspendiert wurden. Die Zellen wurden in 250 mM Sucrosepuffer gewaschen vor einer Lyse in 1% Triton X-100-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthielt. Lysierte Zellen wurden bei 12000 · g zentrifugiert, um die Zellkerne zu entfernen. Äquivalente Volumen von Laemmli-SDS-Probenpuffer wurden jedem Überstand vor einer Elektrophorese durch 4-12%-ige Tris-Glycin-Gele zugesetzt. Das vernetzte TGF-225 wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen. Ähnlich zu den obigen Untersuchungen mit HepG2-Zellen hemmt Decorin ebenfalls die TGF-β-Bindung an dessen Rezeptoren auf den MG-63- Zellen.

C. Bindungsuntersuchungen von ¹²&sup5;I-TGF-β an immobilisiertes Decorin

Eine Linbro-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit 0,5 ug/ml rekombinantem Decorin bei 50 ul/Vertiefung beschichtet. Die Platte wurde über Nacht in einen 37ºC-Brutschrank gelegt und danach dreimal mit 200 ul PBS (0,15 M. NaCl) pro Vertiefung gewaschen, um nicht gebundenes Decorin zu entfernen. Mit 1251 markiertes TGF-β (400 pM, New England Nuclear, Bolton-Hunter- Labeled) wurde mit oder ohne kompetitierende Verbindungen in 200 ul PBS/0,05% Tween-20 1 h, 45 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die kompetitierenden Verbindungen umfassten rekombinante humane Decorin-Präparate (DC-9 und DC-12) und Biglycan mit MBP als Negativkontrolle. DC-9 und. DC-12 sind unterschiedliche Präparate von rekombinantem menschlichem Decorin; PT-71 oder MBP (Maltose-bindendes Protein) ist eine Negativkontrol¬ le; und Biglycan ist rekombinantes menschliches Biglycan.
Fünfzig ul/Vertiefung der vorinkubierten TGF-β-Mischung oder Kontrolle wurden zugesetzt und über Nacht bei 0ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 50 ul der freien TGF-β-Überstände in markierte Röhrchen überführt. Die Platte wurde dreimal mit 0,05% Tween-20 in PBS (200 ul/Vertiefung) gewaschen. Reduzierender Probenpuffer (2 · Laemmli-Probenpuffer) würde zu 100 ul/Vertiefung zugesetzt und bei 37ºC 30 min inkubiert. Während die Lösung sanft gepulst wurde, wurden 100 ul von gebundenem ¹²&sup5;I-TGF-β aus jeder Vertiefung entfernt und in Röhrchen für ein Zählen in einem Gammazähler überführt. Die 50 ul-freies TGF-β- Proben wurden parallel zu den 100 ul-gebundenes TGF-β-Proben gezählt, um das gebunden : frei-Verhältnis zu erhalten. Die Ergebnisse der Bindungsuntersuchungen mit immobilisiertem Decorin sind in Fig. 9 zusammengefasst.

D. Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β an HepG2-Zellen

Ungefähr 2,5 · 10&sup9; HepG2-Zellen wurden mit 250 pM [¹²&sup5;I]-TGF-β in Gegenwart von rekombinantem menschlichem Decorin (DC-12) oder PT-71 (MBP) 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit dem Waschpuffer von Beispiel V(A) viermal vor der Bestimmung der gebundenen CPM gewaschen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 10 zusammengefasst. Tabelle 11 gibt die numerischen Daten für die Decorin (DC-12)-Hemmung der TGF-β-Bindung an HepG2-Zellen an. "% Veränderung" repräsentiert die Differenz bei den mittleren cpm der Testproben verglichen mit den cpm des Mediums (Negativkontrolle). Der α-TGF-β-Antikörper hemmt die Bindung von markiertem TGF-β an Zellen, die TGF-β-Rezeptoren tragen, und dient als eine Positivkontrolle. TABELLE 11 BINDUNG VON ¹²&sup5;I-TGF-β1 an HEPG2-ZELLEN
* 25.000 HepG2-Zellen, erhalten aus subkonfluenten Kulturen, wurden mit 250 pM ¹²&sup5;I-TGF-β1 und TGF-β, anti-TGF-β, Decorin oder Decorin-Fragmenten 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.
** Nicht-gebundenes ¹²&sup5;I-TGF-β1 wurde von Gebundenem durch viermaliges Waschen der Zellen entfernt.

BEISPIEL VI

VERNARBUNGSUNTERSUCHUNGEN (Vergleichstest)

Bei erwachsenen Mäusen wurden Einschnitte mit paarweisen, längs verlaufenden Wunden auf der geschorenen dorsalen Haut gemacht. Es wurde Sorge darauf verwendet, durch den Panniculus hindurch hinunter in die Skelettmuskulatur der dorsalen Haut zu schneiden. Die Einschnitte wurden mit einer einzelnen 250 ul-Dosis von entweder 10 mg/ml Hyaluronsäure (Kontrolle) oder einer Decorin (0,5 mg/ml)/Hyaluronsäure (10 mg/ml)-Mischung in TBS behandelt. Um die Mischung zu bilden, wurde 0, 5 mg/ml rekombinantes Decorin mit 10 mg/ml Hyaluronsäure gemischt. Jede Maus hatte einen Kontroll-Blind- und einen behandelten Einschnitt. Die Wunden wurden mit Nähten verschlossen. Nach 14 Tagen wurden die Einschnitte im Ganzen überprüft und für eine Histologie entnommen. Gefrorene Schnitte der Kontroll- und behandelten Einschnittstellen (4 Mikrometer) wurden unter Verwendung von histologischen Standardprozeduren mit Massons Trichrom analysiert, um die Anfärbung sichtbar zu machen.
Die Hyaluronsäure-Kontrolle zeigte eine typische Hautnarbe, wie sie bei normalen erwachsenen Tieren festgestellt wird, wohingegen die mit Decorin behandelten Wunden keine nachweisbare Narbe zeigten und im wesentlichen histologisch normal waren. Die mit Decorin behandelten Wunden ähnelten fötalen Wunden in den ersten beiden Trimestern.

BEISPIEL VII

KLONIERUNG VON MENSCHLICHEN BIGLYCAN- UND FIBROMODULIN-cDNAs

Zelluläre Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Guanidiniumisothiocyanat (Sambrook et al., 1989) aus subkonfluenten Kulturen von menschlichen WI-38-Lungenfibroblasten (ATCC-Aufnahmenummer CCL 75; Rockville, MD), die 12 h TGF-β1 (3 ng/ml) ausgesetzt worden waren, extrahiert. Die zelluläre Gesamt-RNA (1 ug) wurde mit MoMuLv-reverse Transkriptase unter Verwendung von Hexanukleotiden mit zufälliger Sequenz für das cDNA- Priming revers transkribiert (Kawasaki, 1989). Doppelsträngige cDNAs, die die kodierenden Volllängen-Sequenzen von menschlichem Biglycan oder menschlichem Fibromodulin kodierten, wurden durch Amplifizierung der revers transkribierten WI-38-RNAs unter Verwendung von Amplimeren basierend auf den veröffentlichten Sequenzen von menschlichem Biglycan (Fisher et al., 1989) oder Rinder-Fibromodulin (Oldberg et al., 1989) erzeugt. Für Decorin wurde eine zuvor beschriebene Decorin-cDNA als Matrize verwendet (Krusius und Ruoslahti, 1986). Die PCR-Produkte wurden in pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert. Die Identitäten der resultierenden PCR-Produkte wurden durch DNA- Sequenzierung (Sanger et al., 1977) verifiziert. Dex durch PCR erzeugte Biglycan-Klon unterscheidet sich von der veröffentlichten Biglycansequenz in fünf Basen. Zwei Sequenzunterschiede konnten durch erneutes Sequenzieren des Klons p16 von Fisher et al. (1989), der von Dr. L. Fisher freundlicherweise bereitgestellt worden war, geklärt werden. Die verbleibenden Unterschiede führten zu einem Aminosäureaustausch (Lys&sub1;&sub7;&sub6; zu Asn&sub1;&sub7;&sub6;).
Es wurde festgestellt, dass menschliches Fibromodulin zu dessen Äquivalent aus dem Rind hochgradig homolog war. Eine DNA- Sequenzierungsanalyse des 1,2 kb-PCR-Produkts enthüllte ein offenes Leseraster von 1128 bp, das ein Protein von 376 Aminosäuren kodiert. Die abgeleitete Proteinsequenz weist eine Übereinstimmung mit 92% Sequenzidentität zu der zuvor veröffentlichten Rinder-Fibromodulin-Sequenz auf. Fig. 11 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem Fibromodulin ausgerichtet zu der Fibromodulin-Sequenz aus dem Rind und den Sequenzen der anderen beiden Proteoglycane, die im Rahmen dieser Untersuchung verwendet worden sind.

BEISPIEL VIII

KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN UND REINIGUNG VON FUSIONSPROTEINEN

Eine modifizierte MBP-Sequenz mit einer COOH-terminalen Faktor Xa-Spaltstelle wurde in einen Vektor, pQE-8 (Qiagen; Chatsworth, CA), der auch eine Affinitätsmarkierung, bestehend aus einer Kassette von sechs Histidinen, kodierte, insertiert. Der pQE-8/MBP-Expressionsvektor würde erzeugt, indem das MBP und eine Faktor Xa-Protease-Spaltstelle kodierende BglII/BamHI- DNA-Fragment in die BamHI-Stelle von pQE-8 subkloniert wurde (Fig. 12). BamHI-Fragmente, die die Kernproteine von menschlichem Biglycan, Decorin oder Fibromodulin kodierten, wurden nachfolgend in die resultierende einzige BamHI-Stelle in pQE8/MBP kloniert (Fig. 12).
Die Histidin-Affinitätsmarkierung ermöglichte die Reinigung der Fusionsproteine auf > 95% Reinheit in einem einzigen Reinigungsschritt, der eine Ni-Metallchelat-Affinitätssäule (Hochuli et al., 1987) einsetzt.
Biglycan, Decorin und Fibromodulin wurden gemäß den Anweisungen von Qiagen (Chatsworth, CA) hergestellt. Kurz zusammengefasst, wurden rekombinante Bakterien in Ampicillin (100 ug/ml) und Kanamycin (25 ug/ml) enthaltendem LB-Medium bei 37ºC bis zu einer Dichte von OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 0,6 bis 0,8 vermehrt. Dann wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugesetzt und man ließ die Proteinexpression 3 h ablaufen. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation (5000 · g, 15 min) gesammelt und 45 bis 60 min in Puffer A (0,1 M NaHPO&sub4;, 0,01 M Tris, 6 M Guanidinium-HCl, pH 8,0) lysiert. Die Lysate wurden 20 min bei 20000 · g zentrifugiert. Imidazol wurde den Überständen bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt und die Mischungen wurden auf Ni-NTA-Säulen aufgetragen. Die Säulen wurden mit mehreren Säulenvolumen von Puffer B (0,1 M NaHPO&sub4;, 0,01 M Tris, 8 M Harnstoff, pH 8,0) gewaschen und wurden mit Puffer C (Puffer B, der auf pH 5,9 eingestellt worden war) eluiert. Protein enthaltende Fraktionen wurden auf pH 8 eingestellt, indem 1 M Tris-HCl in 8 M Harnstoff hinzugesetzt wurde. Nach einer Reduktion der Proteine mit Dithiothreitol und Carboxymethylierung mit Iodacetamid (Charbonneau, 1989) wurden die Proteine von den Reagenzien abgetrennt und die Puffer gegen die jeweiligen Bindungspuffer durch Gelfiltration unter Verwendung von PD-10-Säulen (Pharmacia LKB Biotechnology) ausgetauscht.
Die gereinigten MBP-Fusionsproteine zeigten bei einer SDS-PAGE elektrophoretische Mobilitäten, die mit den vorhergesagten Aminosäuresequenzen (Fig. 13) übereinstimmten. Diese Proteine waren in physiologischen Puffern relativ löslich, obwohl während einer länger dauernden Aufbewahrung bei 4ºC ein gewisses Ausmaß an Präzipitation stattfand.

BEISPIEL IX

PROTEINIODIERUNG

Die bakteriell exprimierten Fusionsproteine wurden unter Verwendung von IODO-GEN gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pierce Chemical Co.) iodiert. Kurz zusammengefasst, wurden 50 ul einer IODO-GEN-Lösung (1 mg/25 ml CHCl&sub3;) auf dem Boden eines Borosilikat-Glasröhrchens getrocknet. Protein (10-20 ug), das in Iodierungspuffer (0,1 M NaPi, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, pH 7,4) gelöst worden war, und trägerfreies Na¹²&sup5;I wurden dem Röhrchen zugesetzt. Nach einer Inkubation für 12 min bei Raumtemperatur wurden 200 ul Iodierungspuffer und die Mischung auf eine PD-10-Säule für eine radiochemische Reinigung des markierten Proteins aufgeladen. Die spezifischen Aktivitäten und radiochemischen Reinheiten der markierten Fusionsproteine wurden berechnet durch Bestimmung der mittels Pikrinsäure ausfällbaren radioaktiven Proteinfraktion in der Markierungsmischung vor und nach dem Reinigungsschritt. Die spezifischen Aktivitäten reichten von 2300 bis 2800 Ci/mmol bei radiochemischen Reinheiten von mehr als 95%. TGF-β1, 2 und 3 (1-5 ug) wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung von 0,25 M NaPi, 2 M Harnstoff, pH 7,4, als Iodierungspuffer markiert.

BEISPIEL X

GLEICHGEWICHTSBINDUNGS-EXPERIMENTE

Festphasen-Bindungsassays wurden ausgeführt, indem radioaktiv markierte MBP-Proteoglycan-Fusionsproteine in Mikrotiterplattenvertiefungen, die mit steigenden Mengen von TGF-β1 beschichtet waren, inkubiert wurden.
Immulon-2-Mikrotiterplattenvertiefungen (Dynatech; Chantilly, VA) wurden mit TGF-β1 (75 ul, 1 ug/ml) oder anderen Proteinen, die in 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH 9,5, gelöst waren, über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die beschichteten Vertiefungen wurden dann durch einen schnellen Schlag getrocknet bzw. geleert und mit 200 ul Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2% BSA, 0,05% Tween-20, 0,01% NaN&sub3;) 3 h bei 37ºC inkubiert, um nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden entweder sofort verwendet oder für eine Verwendung in der Zukunft bei -20ºC für bis zu 2 Wochen aufbewahrt. Für Bindungsassays wurden die blockierten Vertiefungen einmal gewaschen, dann wurden markierte und unmarkierte Proteine in einem Gesamtvolumen von 100 ul Bindungspuffer zugesetzt und 6 h bei 37ºC inkubiert, sofern nicht anders angegeben. Danach wurde der Inhalt der Vertiefungen durch Ansaugen entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen. Die Bindung an die Oberflächen-immobilisierten Proteine wurde durch Zählen der gesamten Vertiefungen in einem Gammazähler bestimmt.
Die nicht-spezifische Bindung an die Vertiefungen war geringer als 5% der gesamten hinzugesetzten Radioaktivität. Die Beschichtungseffizienz für TGF-β1 betrug 58,7 ± 0,5% (n = 3), was ungefähr 44 ng TGF-β1 pro Vertiefung ergibt. Die Beschichtungseffizienz wurde berechnet, indem eine kleine Menge von ¹²&sup5;I- markiertem TGF-β1 zu der Beschichtungslösung hinzugesetzt wurde und die Oberflächenassoziierte Radioaktivität nach der Inkubationsperiode über Nacht und dem nachfolgenden Waschschritt bestimmt wurde. Alle Experimente wurden doppelt oder dreifach ausgeführt.
Radioaktiv markiertes MBP-Biglycan (MBP-BG), MBP-Decorin (MBP- DEC) und MBP-Fibromodulin (MBP-FM) banden an TGF-β1-beschichtete Vertiefungen in einer konzentrationsabhängigen Weise, wobei sie eine maximale Bindung von 50%, 20% bzw. 55% zeigten (Fig. 14). Radioaktiv markiertes MBP allein band nicht an die TGF-β1- beschichteten Vertiefungen.
Die Bindung der radioaktiv markierten Fusionsproteine war für TGF-β spezifisch, da wenig oder keine Bindung an immobilisiertes NGF, EGF, Insulin oder immobilisierten Plättchenfaktor 4 beobachtet wurde. MBP-FM band geringfügig an immobilisiertes TGF-β1-Vorläuferprotein, aber MBP-BG und MBP-DEC taten dies nicht (Fig. 15).
Da das Biglycan-Fusionsprotein, MBP-Biglycan, eine hohe Bindungsaktivität gegenüber TGF-β1 zeigte, wurde es verwendet, um die Proteoglycan-TGF-β1-Wechselwirkungen weiter zu charakterisieren. Die Bindung von MBP-BG an TGF-β1 war Zeit- und temperaturabhängig (Fig. 16). Die Bindung nahm bei 37ºC schnell, bei 4ºC aber sehr langsam zu, wobei bei 4ºC nur ungefähr 20% der maximalen Bindung, die bei 37ºC festgestellt wird, erreicht werden.
Unmarkiertes MBP-BG zeigte eine Kompetition hinsichtlich der Bindung von ¹²&sup5;I- markiertem MBP-BG an TGF-β1 in einer konzentrationsabhängigen Weise (Fig. 17A). MBP-DEC und MBP-FM zeigten eine Kompetition hinsichtlich der Bindung von markiertem MBP- BG ab TGF-β1. Sie waren ungefähr gleich wirksame kompetitierende Verbindungen wie MBP-BG, wobei halbmaximale inhibitorische Konzentrationen von ungefähr 30 bis 40 nM erhalten wurden. MBP war inaktiv. Wenn gereinigte Proteoglycane aus dem Rind als kompetitierende Verbindungen verwendet wurden, wurde festgestellt, dass Biglycan und Decorin weniger wirkungsvoll als Fibromodulin waren; die halbmaximalen inhibitorischen Konzentrationen betrugen 150, 200 bzw. 10 nM.
Daten aus den in Fig. 17A gezeigten Assays wurden unter Verwendung des Computerprogramms LIGAND (Munson und Rodbard, 1980) analysiert, um Dissoziationskonstanten (Kd) und maximale Bindungsstellenkonzentrationen (Bmax) für die Wechselwirkung der Proteoglycan-Fusionsproteine mit TGF-β1 zu berechnen. Die besten Ergebnisse wurden für zwei Stellen-Bindungsmodelle erhalten mit Kd-Werten, die für Bindungsstellen von hoher Affinität von 1 bis 17 nM bzw. für Bindungsstellen von niedriger Affinität von 47 bis 200 nM reichten. Die Bmax-Werte lagen im Bereich von 10&supmin;¹³ mol pro Vertiefung für die Bindungsstellen von hoher Affinität bzw. 1,6 · 10&supmin;¹² mol pro Vertiefung für die Bindungsstellen von niedriger Affinität. Bei einer angenommenen TGF-β1-Beschichtungskonzentration von 1 ug/ml, einem Beschichtungsvolumen von 75 ul und einer Beschichtungseffizienz von ungefähr 60% zeigen diese Werte ein Molverhältnis zwischen Proteoglycan-Fusionsprotein und TGF-β1 von eins zu zehn für die Bindungsstelle von hoher Affinität bzw. von eins zu eins für die Bindungsstelle von niedriger Affinität an.
Proteoglycane wurden auch hinsichtlich ihrer Fähigkeit, TGF-β2 und TGF-β3, die anderen bekannten Isoformen von TGF-β in Säugetieren, zu binden, untersucht. Die Bindung von TGF-β1, 2 und 3 an immobilisiertes MBP-Biglycan wurde durch alle drei Fusionsproteine und alle drei intakten Proteoglycane gehemmt (Fig. 18). Die TGF-β3-Bindung an MBP-BG wurde durch Decorin und Biglycan effektiver gehemmt als durch Fibromodulin.
Radioaktiver Ligand-Festphasen-Bindungsuntersuchungen zeigten, dass rekombinante Fusionsproteine, die die Kernproteinsequenzen von menschlichem Biglycan, Decorin und Fibromodulin enthalten, eine Kompetition hinsichtlich der Bindung von markiertem MBP-Biglycan an TGF-β1 mit ähnlichen Affinitäten zeigen, was anzeigt, dass funktionell hochgradig konservierte Regionen der Kernproteine an der Bindung an TGF-β beteiligt sind. Die Tatsache, dass bakteriell produzierte rekombinante Proteoglycan-Kernproteine ähnliche Aktivitäten wie rekombinantes Decorin, das durch Säugetierzellen produziert wird (Yamaguchi et al., 1990) und von Geweben abgeleitete Proteoglycane hatten, wies definitiv das Vorhandensein der TGF-β-bindenden Aktivität in den Kernproteinen dieser Proteoglycane nach.

BEISPIEL XI

ZELLBINDUNGSEXPERIMENTE

Die Fähigkeit der Proteoglycan-Fusionsproteine, mit TGF-β1 um die Bindung an Zellen zu kompetitieren, wurde in Zellbindungsexperimenten untersucht. Zellbindungsexperimente wurden gemäß Massague (1987) ausgeführt. Kurz zusammengefasst, wurden subkonfluente Monolayer von MvLu- oder HepG2-Zellen (ATCC Aufnahmenummern CCL 64 bzw. HB 8065; Rockville, MD) in Zellkulturschalen mit 48 oder 24 Vertiefungen (Costar; Cambridge, MA), die in 10% FCS enthaltendem DMEM gehalten wurden, in Bindungsexperimenten verwendet. Die Zellen wurden mit markiertem TGF-β1 in Gegenwart oder Abwesenheit von unmarkiertem TGF-β1 oder Proteoglycan-Fusionsproteinen inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem Bindungspuffer (128 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgSO&sub4;, 1,2 mM CaCl&sub2;, 50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mg/ml BSA) gewaschen und dann mit Zellbindungspuffer 30 min bei 4ºC inkubiert, um endogenen Rezeptor-assoziierten TGF-β zu entfernen.
Proben, die markierte und unmarkierte Proteine enthielten, wurden den Vertiefungen in einem Gesamtvolumen von 100 ul für Platten mit 48 Vertiefungen oder 200 ul für Platten mit 24 Vertiefungen hinzugesetzt und wurden bei 4ºC unter sanfter Bewegung auf einer rotierenden Plattform inkubiert. Nach einer vierstündigen Inkubation wurden die Zellen dreimal mit Bindungspuffer gewaschen. Einhundert Mikroliter (200 ul für Platten mit 24 Vertiefungen) Solubilisierungspuffer (25 mM HEPES, pH 7,5, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA) wurden jeder Vertiefung zugesetzt und 30 min bei 4ºC inkubiert. Die Zell-assoziierte Radioaktivität aus Dreifachproben wurde durch Zählen eines Teils der solubilisierten Zellen in einem Gammazähler bestimmt.
Während unmarkiertes TGF-β1 eine wirksame Kompetition hinsichtlich der Bindung von markiertem TGF-β1 an alle drei Typen von TGF-β-Rezeptoren zeigte, wurden viel höhere Konzentrationen der Proteoglycan-Fusionsproteine benötigt, um mit TGF-β1 um die Bindung an diese Zellen zu kompetitieren (Fig. 19A). Die halbmaximale Kompetition wurde durch Fusionsproteinkonzentrationen von durchschnittlich ungefähr 3 uM erzielt.

BEISPIEL XII

VERNETZUNG VON TGF-β MIT REZEPTOREN

Für die Vernetzung mit Rezeptoren wurden Zellen in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen kultiviert und wurden, wie oben beschrieben, weiterbehandelt. Nach einer Inkubation mit markierten und unmarkierten Liganden wurden die Zellen einmal mit Bindungspuffer und dreimal mit Bindungspuffer ohne BSA gewaschen. Dann wurden 100 ul Bindungspuffer (ohne BSA), der Disuccinimidylsuberat (Endkonzentration 0,2 mM) enthielt, zugesetzt und die Zellen wurden 15 min bei 4ºC inkubiert. Nach der Vernetzungsreaktion wurden die Zellen in 100 ul Solubilisierungspuffer (125 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 ug/ml Leupeptin, 10 ug/ml Antipain, 50 mg/ml Aprotinin, 100 ug/ml Benzamidin-HCl, 10 ug/ml Pepstatin) lysiert. Die Lysate wurden mit Probenpuffer gemischt und durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von vorgegossenen 4-12%-igen Novex-Gelen analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und gegenüber XAR- 100-Röntgenfilmen mehrere Tage bei -70ºC exponiert.
Vernetzungsexperimente enthüllten, dass die Bindung von TGF-β1 an die Rezeptoren vom Typ I und Typ III durch alle drei Proteoglycan-Fusionsproteine mehr beeinflusst wurde als die Bindung an die Rezeptoren vom Typ II, die im wesentlichen unverändert war (Fig. 19B). Laserdensitometrie-Analysen der jeweiligen Autoradiogramme zeigten, dass die Bindung von markiertem TGF-β1 an Rezeptoren vom Typ I und III bei der verwendeten Proteoglycan-Konzentration um ungefähr 25% bzw. 50% verringert war.
Die Kompetition war am effektivsten bei der Bindung von TGF-β an die TGF-β-Rezeptoren vom Typ I und Typ III, vielleicht da diese Rezeptoren eine geringere Affinität für TGF-β aufweisen als der Typ II-Rezeptor. Obwohl die Affinitäten der Proteoglycane für TGF-β viel geringer sind als jene von einem jeglichen der Rezeptoren, sind alle diese Proteoglycane in Geweben im Überfluss vorhanden, so dass potentiell die Konzentration das ausgleicht, was ihnen an Affinität fehlen mag. Darüber hinaus begünstigen die bei den Zellbindungsexperimenten eingesetzten Versuchsbedingungen die Bindung von TGF-β an Proteoglycane nicht.

Claims

1. Verwendung von Fibromodulin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhütung und Verringerung von Narbenbildung.

2. Verwendung von Biglycan zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhütung und Verringerung von Narbenbildung.

3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die Narbenbildung die Haut betreffende Narbenbildung ist.

4. Verwendung eines gereinigten Polypeptids, umfassend eine TGF-β-bindende Domäne eines Proteins, wobei das Protein durch eine Leucin-reiche wiederholte Sequenz von 24 Aminosäuren gekennzeichnet ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, "adult respiratory distress syndrome" (Schocklunge), Postmyokardinfarkt oder Postangioplastie-Restenose.

5. Verwendung von Decorin oder dessen funktionellem Äquivalent zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, "adult respiratory distress syndrome" (Schocklunge), Postmyokardinfarkt oder Postangioplastie-Restenose.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das funktionelle Äquivalent ein Protein ist, das eine einen zellregulatorischen Faktor bindende Domäne enthält, die durch eine Leucin-reiche wiederholte Sequenz von ungefähr 24 Aminosäuren gekennzeichnet ist.

7. Verwendung nach den Ansprüchen 4 bis 6, wobei das Protein Biglycan ist.

8. Verwendung nach den Ansprüchen 4 bis 6, wobei das Protein Fibromodulin ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die Fibromodulin oder Biglycan, ein Mittel, das die Wundheilung fördert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Mittel ein RGD-enthaltendes Polypeptid ist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das RGD-enthaltende Polypeptid an ein biologisch abbaubares Polymer gebunden ist.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das biologisch abbaubare Polymer Hyaluronsäure ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger Hyaluronsäure ist.