DE69232833T2

DE69232833T2 - Prüfung von alloantigenen durch bindungstest

Info

Publication number: DE69232833T2
Application number: DE69232833T
Authority: DE
Inventors: J. Pouletty
Original assignee: Sangstat Medical Corp
Current assignee: Sangstat Medical Corp
Priority date: 1991-12-13
Filing date: 1992-12-09
Publication date: 2003-06-18
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: EP0619884A1; CA2103997A1; EP0619884B1; US5292641A; WO1993012425A1; EP0619884A4; DE69232833D1; ES2185623T3

Description

Technisches Gebiet

Das Gebiet dieser Erfindung ist die Detektion von Reaktivität zwischen Alloantigenen und Alloantigen-spezifischen Liganden in biologischen Proben.

Hintergrund

Bei vielen Transplantationen gibt es Bedenken bezüglich unterschiedlicher Allotypen, insbesondere dem HLA-Typ, von Zellquelle und Zellempfänger. In Situationen, in denen allogene Zellen oder allogenes Gewebe einem Spender entnommen und in einen Empfänger eingesetzt werden, wird gewünscht, dass der Spender und der Empfänger in ihrem HLA möglichst gut abgestimmt werden. Die Gegenwart von Antikörpern im Patientenserum gegen HLA-Antigene des Spenders (spenderspezifische Kreuzprobe) oder gegen einen hohen Prozentsatz von HLA-Allelen (PRA-Test) sagt ein hohes Risiko für Transplantatabstoßung voraus.
Die Bestimmung des HLA-Phenotyps (HLA-Typisierung) ist in zahlreichen Situationen wie Transplantationen, Blutplättchentransfusionen und forensischen sowie Vaterschaftstests zweckdienlich. Die Standardtechnik für eine HLA-Typisierung und Detektion von Anti-HLA-Antikörpern ist die Mikrolymphozytotoxizität, wobei Serum, das Antikörper enthält, mit HLA-Antigen-exprimierenden Lymphozyten und im Anschluss daran mit dem Komplement inkubiert wird. Das Zytotoxizitäts-Niveau wird daraufhin bestimmt, indem unter Verwendung verschiedener Farbstoffe zwischen toten und lebensfähigen Zellen unterschieden wird. Dieses Verfahren weist jedoch zahlreiche Nachteile auf: es ist arbeitsintensiv; zeitraubend; erfordert die Isolierung der Zellen; erfordert lebensfähige Zellen; ist für HLA nicht spezifisch; und es erfordert eine subjektive Bewertung. Durchflusszytometrie kann ebenfalls eingesetzt werden, wenngleich hierfür eine große Anzahl von Zellen sowie teure Instrumente erforderlich sind.
Somit besteht ein Interesse daran, alternative Techniken bereitzustellen, die einfach durchgeführt und automatisiert werden können, keinen der oben angeführten Nachteile aufweisen und gut unterscheidbare Ergebnisse liefern, was für die Prognose der Akzeptanz eines Transplantais von Bedeutung ist.

Relevante Literatur

Literaturstellen von Interesse umfassen Duquesnoy et al., Transplantation 50, 427-437 (1990); Martin et al., Transplantation 44, 50-53 (1987); Grosse-Wilde et al., J. Immunogenet. 16, 149-55 (1989); Doxiadis et al., 59, 449-54 (1969); Doxiadis und Grosse-Wilde, Vox Sang 56, 196-99 (1989); Davies et al., Transplantation 47, 524-27 (1989); Tsuji et al., Tokai J. Exp. Clin. Med. 10, 169-74 (1985); Stevenson et al., J. Immunol. Methods 86, 187-90 (1986); Fachet et al., Transplantation 30, 114-129 (1989); Talbot et al., J. Immunol. Methods 112, 279-83 (1988); Iwaki et al., Clin. Transplantation 2, 81-84 (1988). N. Zavazava et al. offenbaren in J. Clin. Lab. Anal. 4, 426-429 (1990), die HLA-Typisierung mittels kompetitiven ELISAs, und K. J. Kao offenbart in Blood 70(1), 282-286 (1987), einen kompetitiven ELISA auf HLA-Antigene. Die WO 89/02079 offenbart einen passiven Latex-Agglutinierungstest zum Detektieren von Anti-Blutplättchen-Antikörpern.

Zusammenfassung der Erfindung

Reaktivität zwischen HLA und Anti-HLA-Liganden wird durch Kombination von: (a) einem festen Träger, der durch Immobilisierung zumindest eines HLA-Antigens oder Bindungsabschnitts davon an einer festen Phase hergestellt wird; (b) einer Probe, die entweder Anti-HLA oder HLA-Antigene enthält; und (c) einer Reagens-Zusammensetzung, die das kompetitive oder reziproke Bindungselement enthält, bestimmt. Eine reduzierte Bindung von Antikörpern im Vergleich zum Standard ist ein Maß für die Gegenwart von Antikörpern in der Probe oder die Gegenwart einer bestimmten HLA-Allel- Zusammensetzung in der Probe.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Sets bereit, wie sie in den Ansprüchen 1, 4, 5 und 6 definiert sind.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Gemäß vorliegender Erfindung ist ein einfaches, schnelles und genaues Verfahren zum Nachweis der Gegenwart zumindest eines bestimmten HLA-Allels oder der Gegenwart von Antikörpern gegen zumindest ein HLA-Allel bereitgestellt. Das Verfahren umfasst, dass ein oder mehrere bekannte(s) HLA-Antigen(e) oder Bindungsfragment(e) davon an eine Oberfläche gebunden wird/werden. Abhängig davon, was getestet wird, entweder Antikörper gegen ein oder mehrere HLA-Antigene oder Blutplättchen, weiße Blutkörperchen oder dergleichen oder lösliche HLA-Antigene, d. h. dispergierbare HLA-Antigene, wird die Probe mit dem reziproken Bindungselement kombiniert. Danach wird die Menge an Antikörpern gemessen, entweder anhand der Gegenwart von spezifischen Antikörpern in der Probe, die sich an das/die bekannte(n), trägergebundene(n) Allel(e) binden, oder anhand bestimmter HLA-Antigene in der Probe. Zum Nachweisen der Gegenwart von an den Träger gebundenen Antikörpern kann jedes Mittel eingesetzt werden.
Eine große Vielzahl von Proben kann verwendet werden, wenn Interesse daran besteht, die Gegenwart von entweder Antikörpern oder Alloantigenen, z. B. HLA-Antigenen, nachzuweisen. Ausführungsformen dieser Erfindung werden zur Identifizierung von Antikörpern gegen bekannte Histokompatibilitäts-Antigene mit Antikörpern bekannter Spezifitäten (Kreuzprobe), zur Identifizierung von Histokompatibilitäts-Antigenen mit Antikörpern bekannter Spezifitäten (HLA-Typisierung) oder zur Identifizierung allgemeiner Alloreaktivität gegen eine Reihe von Histokompatibilitäts-Antigenen ("Panel Reactive Antibody testing", PRA) verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Alloantigen ein direktes oder indirektes Produkt eines Allels einer Spezies, das von einem anderen Element derselben Spezies als Antigen detektiert werden kann, insbeson dere wenn das Allel ein HLA-Antigen ist. Die HLA-Antigene können der Klasse I, II oder der kleineren Gruppe der Histokompatibilitäts-Antigene angehören. Andere Alloantigene umfassen jene, die mit roten Blutkörperchen oder dergleichen in Beziehung stehen. (Der Bezug auf HLA-Antigene ist so zu verstehen, dass jedes größere Histokompatibilitäts-Komplex-Antigen oder jeder Antikörper dagegen detektiert werden kann.)
Die eingesetzten Proben können Serum, Plasma, Vollblut, Zellen, z. B. weiße Blutkörperchen oder Blutplättchen, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit, andere Gewebe oder Zellen, abhängig davon, ob der Analyt von Interesse das HLA-Antigen oder der Antikörper ist.
Das Antikörper-Reagens, das als kompetitives oder komplementäres Bindungsmaterial verwendet wird, kann monoklonale Antikörper oder Alloantiseren, saubere, verdünnte oder affinitätsfreie Antiseren, die für ein oder mehrere Allele von Interesse spezifisch sein können, umfassen. Die Konzentration des Antikörpers wird so eingestellt, dass kein so großer Überschuss davon vorhanden ist, um das Auftreten von Bindungshemmung an die feste Phase durch die Minimalmenge an zu detektierendem Alloantigenen zu verhindern. Die kann leicht dadurch bestimmt werden, dass eine Reihenverdünnung mit Standards durchgeführt wird. Alternativ dazu kann ein Inhibitor der Probe und/oder des Reagens verwendet werden, um das Fortschritssverhältnis zu definieren; üblicherweise liegt die Verdünnung bei etwa 1 : 5 bis 1 : 1.000.
Da die gemessenen Werte eine reduzierte Menge an Antikörper-Reagens sind, die an den Träger gebunden ist, weil HLA-Antigene oder Alloantiserum in der Probe vorhanden ist, ist man vorrangig an einem ausreichenden Unterschied in der Menge an Immunglobulin interessiert, die an den Träger gebunden ist, um eine nachweisbare Menge bereitzustellen und gegebenenfalls für eine quantitative Bestimmung zu sorgen. Somit weist die Menge an HLA-Antigenen, die an den Träger zur Detektion des löslichen HLA- Antigens gebunden ist, gewöhnlich einen deutlichen Überschuss an Bindungsstellen ge genüber der Menge an Immunoglobulin-Bindungsstellen für das im Testmedium vorhandene Antigen und für die Menge an Immunoglobulin-Reagenzien auf.
Für das Reagens des kompetitiven Tests wird die Menge an HLA-Antigenen auf dem Träger in Bezug auf die Menge des eingesetzten Reagens beschränkt. Das HLA-Antigen, das an den Träger gebunden ist, und das Antikörper-Reagens im Testmedium werden so gewählt, dass in Gegenwart von Alloantiseren eine detektierbare Reaktion des HLA-Antigens auf dem Träger erfolgt. Ein oder mehrere monoklonale Antikörper können vermischt werden, wenn ein Interesse an der Gegenwart oder dem Fehlen eines oder mehrerer HLA-Antigene besteht, es kann Alloantiserum mit bekannter Spezifität verwendet werden, es kann affinitätsgereinigtes Alloantiserum eingesetzt werden oder dergleichen.
Das positive Ergebnis eines vorhandenen HLA-Antigens oder von Antiseren gegen ein HLA-Antigen liegt in der reduzierten Bindung des Immunoglobulin-Reagens an den Träger. Dies beweist die Gegenwart des/der HLA-Antigen-Allels(e) von Interesse oder von Antikörpern gegen (ein) solche(s) Allel(e) in der Probe. Für ein oder mehrere bestimmte(s) HLA-Allel(e) oder Antikörper dagegen kann dasselbe Reagens verwendet werden.
Die an den Träger gebundenen Allele können von einer herkömmlichen Quelle abstammen, abhängig von der Natur des HLA-Allels von Interesse, Klasse I, II oder Neben-Histokompatibilitäts-Antigengruppe. Somit können die Antigene von menschlichen Spendern stammen, einschließlich Blutplättchen, Plasma, Serum oder renalen Dialysederivaten, Lymphoblasten-Zelllinien (oder davon abstammenden Hybridomen), transfektanten Zelllinien oder einer anderen herkömmlichen Quelle des gewünschten Antigen-Repertoires. Gemische verschiedener Ausführungsformen können eingesetzt werden, um einen universellen Träger bereitzustellen, der alle permanenten Allele trägt. Die Antigene können nach bekannten Techniken an den Träger gebunden werden, wobei sie von der Natur des Trägers abhängig sind. Die Bindung kann in diesem Zusammenhang kovalent oder nichtkovalent, aber nicht diffusionsfähig sein. Der Träger kann jeder her kömmliche feste Träger sein und dabei Behälterwände oder -böden umfassen, wie z. B. Mikrotiterplatten-Näpfe, Teströhrchen, Perlen, Objektträger, absorbierende Folien, Membranen, Teilchen, z. B. Magnetteilchen, oder dergleichen. Der jeweilige Träger ist nicht entscheidend, und somit kann jeder Träger verwendet werden, durch welchen eine nicht spezifische Bindung minimiert werden kann, wenn der Träger nicht die Messung beeinträchtigt und wenn der Träger eine herkömmliche Arbeitsvorschrift ermöglicht. Eine große Anzahl fester Träger ist bekannt, die aktiviert sind und kovalente Bindungen mit Proteinen bilden. Andere Träger sind bekannt, bei welchen der Träger durch Zusatz von Reagenzien aktiviert werden kann, was zur Reaktion mit Proteinen führt. Zusätzlich dazu führt in manchen Fällen leichtes Erwärmen zu einer nicht diffusionsfähigen Bindung der Proteine an den Träger. Der Träger kann Glas, Kunststoff, wie z. B. Polystyrol, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, etc., Cellulose, wie z. B. Papier, Nitrocellulose, Celluloseacetat, etc., und dergleichen umfassen.
Nach der Bindung der Antigene an den Träger kann eine Blockergruppe praktischerweise hinzugefügt werden, normalerweise ein unbedenkliches Protein, um mit jeder beliebigen der aktiven Stellen zu reagieren, oder ein Detergens, um auf diese Weise nichtspezifische Bindung zu reduzieren. Zahlreiche Blockermaterialien wurden bisher eingesetzt, wie z. B. Milch, Rinderserum-Albumin, β-Globin, Tween 20, etc.
Nach Präparierung des festen Trägers können die Probe und das Immunoglobulin-Reagens kombiniert werden. Die Probe kann einer vorangegangenen Behandlung, wie z. B. Verdünnung, Entfernung sämtlicher störender Materialien, z. B. rote Blutkörperchen, Koagulationsmittel und dergleichen, unterzogen worden sein. Die Probe, die im Allgemeinen etwa 1 ul bis etwa 0,5 ml umfasst, kann danach mit dem Reagens kombiniert werden. Wie bereits angeführt kann das Reagens eine Lösung eines oder mehrerer monoklonaler Antikörper oder Alloantiseren mit bekannter Spezifität sein. Die Menge an vorhandenen Antikörpern wird so gewählt, dass selbige, wenn sie an den Träger gebunden sind, messbar sind. Die Menge wird dabei so gewählt, dass sichergestellt wird, dass die Menge an HLA-Antigenen oder Anti-(HLA-Antigen) in der Probe ausreicht, zwischen Gegenwart und Abwesenheit eines oder mehrerer bestimmter Allele oder Antiseren zu unterscheiden.
Die Probe und das Reagens werden üblicherweise vor der Kombination mit dem festen Träger kombiniert, obwohl die Probe, das Reagens und der feste Träger gleichzeitig kombiniert werden können oder die Probe zuerst dem festen Träger zugesetzt werden kann, oder zuerst der Antikörper zugesetzt werden kann, je nach Arbeitsvorschrift und dessen, was gemessen wird. Das Testmedium ist gewöhnlich mit einem geeigneten Puffer gepuffert, wobei der pH-Wert im Bereich von etwa 5-10 liegt. Der Puffer kann Phosphat, Carbonat, Hepes, Mops, Tris oder dergleichen sein. Im Allgemeinen ist die Pufferkonzentration ausreichend, um den gewünschten pH-Wert zu halten, und beträgt im Allgemeinen zumindest 15 mM und nicht mehr als etwa 500 mM. Andere Additive können ebenfalls in geringeren Mengen vorhanden sein, so z. B. unbedenkliche Proteine, die im Allgemeinen nicht mehr als 15% ausmachen, Stabilisierungsmittel, z. B. Azide, etc.
Das Gemisch kann über einen Zeitraum inkubiert werden, der ausreicht, um in jeder Stufe eine Reaktion hervorzurufen. Gewöhnlich liegen die Inkubationszeiten im Bereich von etwa 1 Minute bis 180 Minuten, insbesondere von etwa 5 Minuten bis 30 Minuten, außer wenn eine Durchflussvorrichtung verwendet wird, in welcher die Zeitspanne kürzer sein kann. Nachdem eine ausreichende Zeitspanne für die Bindung an den Träger verstrichen ist, kann der Träger mit jedem herkömmlichen Mittel unter Verwendung von Wasser oder einem gepufferten Medium gewaschen werden, wobei der pH-Wert im Allgemeinen im Bereich von etwa 5-10 liegt und das Puffermittel in einer Konzentration von etwa 10 bis 500 mM vorhanden ist. Ein oder mehrere Waschgänge können durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass im Wesentlichen jegliche nichtspezifische Bindung entfernt wurde.
Nach den Inkubationswaschungen kann die Menge an die Oberfläche gebundener Antikörper bestimmt werden. Jegliche Technik zur Bestimmung der an die Oberfläche gebundenen Antikörper kann verwendet werden, die ein zusätzliches Detektionsmolekül umfassen kann oder auch nicht. Es gibt eine große Anzahl von Reagenzien, die an Antikörper binden. Man kann Anti-Human-Antikörper, Protein A, Fc-Rezeptoren, etc. verwenden. Die Antikörper-Reagenzien, insbesondere Anti-HLA-Antikörper, können markiert werden, um somit direkt nachweisbar zu sein. Diese Markierungen können Farbstoffe, Fluoreszenzmittel, Enzyme, Chemolumineszenzmittel, Teilchen, Radioisotope, Biotin zur Bindung an markiertes Adivin oder andere detektierbare Mittel umfassen. Hinsichtlich der Enzyme können verschiedene Substrate zum Einsatz kommen, die für Lichtabsorption, Fluoreszenz, Chemolumineszenz oder dergleichen sorgen. Die jeweilige Markierung ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend und primär eine Frage der einfachen Handhabung. Im Fall einer Enzymmarkierung wird die Reaktion üblicherweise zeitlich abgestimmt und auf beliebige herkömmliche Weise abgebrochen.
Testtechniken zur Messung von menschlichem Antikörper können ELISA, FIA, RIA oder dergleichen umfassen, in welchen Techniken das markierte Reagens sich spezifisch an den Human-Antikörper bindet.
Üblicherweise wird ein negativer Vergleichstest durchgeführt wird, in welchem die Probe durch einen Puffer oder einen Puffer enthaltenden unbedenklichen Antikörper oder ein anderes Medium ersetzt wird, das die Natur der Probe nachahmt, z. B. ein Nährmedium, ein Zellkultur-Überstand, etc. Somit ahmt der Kontrolltest im Allgemeinen den Probentest so weit wie möglich nach. Gewöhnlich werden mehrfache Kontrollen verwendet, um eine Basis und somit eine Standardabweichung zu schaffen, so dass normalerweise zwei Standardabweichungen als Grundlinie für ein positives Ergebnis verwendet werden.
Auch verschiedene andere Vorschriften als die oben beschriebene können eingesetzt werden, was von den verwendeten und zur Verfügung stehenden Materialien und Vorrichtungen abhängt. So kann beispielsweise ein Agglutinationsformat angewendet werden, in welchem Alloantigene an Perlen, wie z. B. Latexperlen mit einem Durchmesser von im Allgemeinen 10 u bis 100 u, gebunden werden, so dass die Perlen mit zumindest den am weitesten verbreiteten Antigenen, vorzugsweise im Wesentlichen allen der Klasse von Interesse, beschichtet werden. Das Verhältnis von Perlen zu Probe wird beispielsweise mittels Reihenverdünnung ausgewählt, um die Gegenwart von Antikörpern gegen das/die Alloantigen(e) auf den Perlen nachzuweisen.
Im nächsten Test sind zwei Unbekannte vorhanden, wenn man an einer Kreuzprobe interessiert ist, z. B. Blut, das gewöhnlich als Serum von einem Transplantat-Spender mit Blutserum eines Transplantat-Empfängers gekreuzt wird. In diesem Format wird der Test mit dem Kandidatenblut durchgeführt, z. B. dem Empfängerblut, um die Gegenwart oder das Fehlen von Bindung an die HLA-Antigene auf den Perlen nachzuweisen. Derselbe Test wird auch in Gegenwart der Spenderprobe, z. B. Zellen, löslichem HLA im Serum, etc., durchgeführt. Die Perlen werden mit einer Vielzahl von HLA-Antigenen konjugiert, beispielsweise aus einem Querschnitt von Individuen, wobei die ausgewählten HLA-Antigene einen Querschnitt gemeinsamer HLA-Antigene oder dergleichen liefern. Wird im letzteren Fall keine Agglutination beobachtet, gibt es keine Anti-HLA-Antikörper. Eine Bindung ohne Spenderprobe weist auf die Gegenwart von Anti-HLA-Antikörpern und einer positiven PRA hin. In Gegenwart der Spenderprobe weist eine Bindungsreduktion auf eine positive Kreuzprobe hin, während das Fehlen jeglicher Reduktion eine negative Kreuzprobe anzeigt. Auf diese Weise kann man die Reaktivität eines Kandidatenserums und die Kreuzprobe bestimmen, wobei zwei Unbekannte gleichzeitig oder separat analysiert werden.
Die Reagenzien für die vorliegende Erfindung können in einem Set bereitgestellt werden. Ein Set umfasst die an den Träger gebundenen HLA-Antigene, Kontrolllösungen sowie die Reagenzien, die für die Bestimmung notwendig sind, welche, wie bereits angeführt, Reagenzien für einen Immuntest auf Enzymbasis, einen Radioimmuntest, Fluorenszenzimmuntest oder Chemolumineszenztest sein können. Andere Reagenzien, die vorhanden sein können, umfassen Puffer, die geeignet verdünnt sein können, Substrate, im Fall eines Enzymimmuntests Stopperlösung, um die Farbentwicklung zu abzubre chen, Software-Programme zur Aufzeichnung und/oder Analyse der Ergebnisse sowie der Allel-Spezifitäten. Die Resultate können gemäß der Natur des Tests unter Verwendung eines Spektralphotometers, eines Fluorimeters, eines Szintillationszählers, Reflektometers, Luminometers, etc. bestimmt werden.
Das vorliegende Verfahren weist zahlreiche Vorteile auf, indem es beispielsweise fähig ist, Alloantiseren zu verwenden, eine schnelle Typisierung der zahlreichen Allele ermöglicht, eine quantitative und objektive Resultatablesung ermöglicht, über eine simple Arbeitsvorschrift verfügt und eine große Vielzahl an Reagenzien einsetzen kann, die leicht verfügbar sind.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration und keineswegs als Einschränkung.

Experimenteller Teil

Materialien

- Alloantiserum # 939 Probe (Titer 1 : 8 und Anti-B7 mittels Mikrolymphozytotoxizität)
- Inhibitor = Überstand der Lymphoblasten-Zelllinie (Ref 7666, Phenotyp: HLA A3, AW29, B7, B12 mittels Mikrolymphozytotoxizität, 0,50 ug/ml der gesamten HLA-Klasse 1, wie dies mittels sHLA-STATTm-Klasse1-ELISA [SangStat Medical Corp.] gemessen und in RPMI 1640 20% FBS kultiviert wurde)
Nunc-Platten, die unter Verwendung von HLA-Antigen [stammend aus einem Pool von 60 zufälligen Blutplättchenspendern; von Blutplättchen unter Verwendung von Detergens (NP40) extrahiert, gefolgt von Differentialzentrifugation und Affinitätschromatographie (unter Verwendung von HLA-Klasse I-spezifischem monoklonalem Antikörper W6.32)] beschichtet wurden.
Beschichtung mittels Inkubation von 100 ul pro Napf an HLA-Antigen (2,5 ug/ml in PBS pH 7,4 über Nacht bei 4ºC; Näpfe wurden mit 250 ul/Napf PBS blockiert, enthaltend 1% Casein und 0,05% Tween 20 (4 Stunden bei Raumtemperatur)).

Studie 1

Der Test wurde wie folgt durchgeführt:
1. Verdünnen der Humanserum-Probe in einen Inhibitor, d. h. entweder Überstand einer Lymphoblasten-Zelllinie (Ref 7666, 0,5 ug/ml) oder RPMI 1640 20% FBS (Negativkontrolle):

Endserum

Verdünnung Serum-Inhibitor-Verhältnis (Vol./Vol.; ul)

1/2 110 : 110
1/10 25 : 225
1 /100 5 : 495
2. Grüngliches Vermischen von Serum und Antigen sowie 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
3. Pipettieren von 100 ul des Gemischs in je zwei Näpfe einer mit HLA beschichteten Platte und 45-minütige Inkubation bei 37ºC. Dreimalige Wäsche mit PBS/1% Casein.
4. Verdünnen von Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc-Peroxidase-Konjugat (Jackson Lab) 1 : 50.000 in PBS/1% Casein und 30-minütige Inkubation bei 37ºC von 100 ul pro Napf. Dreimalige Wäsche wie oben beschrieben.
5. Verdünnen einer 30 mg-OPD-Tablette in OPD-Substratpuffer (Phosphat/Citrat, pH 4,5 mit H&sub2;O&sub2;) mit einer Endkonzentration von 3 mg/ml. Zugabe von 100 ul des Substrats zu jedem Napf und 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
6. Unterbrechen der Entwicklung mit 100 ul HCl und Ablesung der Platte bei 492 nm.

Ergebnisse

Serum-Endverdünnung % Inhibierung *
1/2 1,27%
1/10 27,5 0/0
1/100 45,9 0/0
* = 1 - [Verhältnis: Absorption der Probe mit HLA-Antigen, dividiert durch die Absorption der Probe mit Negativkontrolle]
Diese Resultate zeigten, dass eine dosisabhängige spezifische Hemmung der Antikörperbindung erzielt werden kann.

Studie 2

Dieselbe Arbeitsvorschrift wie zuvor. Getestete Seren
Aus obigen Resultaten ist ersichtlich, dass das vorliegende Verfahren ein einfaches Verfahren zur HLA-Bestimmung aus einer großen Vielzahl an Quellen bereitstellt, umfassend lösliche und nicht lösliche Antigene, wie z. B. Oberflächenmembran-HLAs. Das Verfahren ist schnell, leicht durchführbar, erfordert leicht erhältliche Reagenzien und kann mit zahlreichen Proben durchgeführt werden, wobei zahlreiche Allele in höchst effizienter Weise bestimmt werden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart zumindest eines Human-Antikörpers gegen ein HLA-Antigen in einem Antiserum in einer physiologischen Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

das Kombinieren der Probe mit Antikörper-Reagens gegen das zumindest eine HLA-Antigen und einem festen Träger, der das HLA-Antigen umfasst; und

das Detektieren der Menge an auf dem Träger vorhandenem Antikörper-Reagens im Vergleich zu einem Vergleichswert,

worin eine reduzierte Menge an an den Träger gebundenem Antikörper-Reagens die Gegenwart des zumindest einen Human-Antikörpers gegen ein HLA-Antigen in der Probe anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Antikörper-Reagens mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Detektieren Folgendes umfasst:

das Waschen des festen Trägers im Wesentlichen frei von nichtspezifisch gebundenem Antikörper-Reagens;

die Zugabe eines markierten Detektormoleküls zum gewaschenen festen Träger, wobei sich das markierte Detektormolekül an das Antikörper-Reagens bindet; und

das Detektieren der auf dem Träger vorhandenen Menge an Antikörper-Reagens anhand des markierten Detektormoleküls im Vergleich zu einem Vergleichswert.

4. Verfahren zum Detektieren zumindest eines Alloantigens oder eines Antikörpers dagegen in einer physiologischen Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

das Kombinieren der Probe mit Antikörper-Reagens gegen das zumindest eine Alloantigen mit Perlen, die das zumindest eine Alloantigen umfassen, worin das Verhältnis der Bindungsstellen zwischen Alloantigen auf den Perlen und Antikörper-Reagens zu einer Änderung der Agglutination in Gegenwart des Alloantigens oder Antikörpers dagegen führt; und

das Detektieren der Änderung der Agglutination mit der Probe im Vergleich zur Agglutination ohne Probe.

5. Verfahren zur HLA-Anpassung von Spender und Empfänger beim Transplantieren eines Organs, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

den Nachweis der Gegenwart von Antikörpern gegen ein oder mehrere HLA-Antigen(e) in einer Empfänger-Blutprabe;

das Kombinieren einer Blutprobe vom Empfänger mit einer physiologischen Probe vom Spender und einer Auswahl von an Latexperlen konjugierten HLA-Antigenen, worin die Menge an Probe und Latexperlen so gewählt ist, dass für Agglutination gesorgt wird, wenn die Empfänger-Probe Antikörper gegen zumindest eines der an die Latexperlen konjugierten HLA-Antigene aufweist; und

den Nachweis der Gegenwart von Anti-HLA-Antigen-Antikörpern gegen ein HLA- Antigen des Spenders im Empfänger durch eine Reduktion der Agglutination im Vergleich zum Ausmaß an Agglutination ohne die physiologische Probe vom Spender.

6. Set zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Set Latexperlen umfasst, die mit mehreren HLA-Antigenen einer Auswahl von Individuen beschichtet sind.