DE69216912T2

DE69216912T2 - Verfahren zur Bestimmung von Thyroglobulin und Kit zu dessen Gebrauch

Info

Publication number: DE69216912T2
Application number: DE69216912T
Authority: DE
Inventors: Luciano Corvo; Giovanni Battista Salabe
Original assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 1991-05-20
Filing date: 1992-05-18
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2012-05-19
Also published as: ATE148232T1; DE69216912D1; DK0515323T3; EP0515323A1; EP0515323B1; ITRM910344A0; IT1248329B; ITRM910344A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Thyreoglobulin- Dosierung bzw. -Bestimmung.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Thyreoglobulin-Dosierung, das zur Bestimmung der Thyreoglobulinspiegel geeignet ist, die in der Schilddrüse vorliegen, und das selbst in klinischen Laboratorien, die nicht hochspezialisiert sind, rasch, einfach und genau sowie preisgünstig in der Anwendung ist, und mittels eines Kits.
Hinsichtlich der hier angegebenen Literaturstellen wird auf die am Schluß der vorliegenden Beschreibung beigefügten Literaturangaben verwiesen.
Menschliches Thyreoglobulin (hTg) ist das organospezifische Protein der Schilddrüse, das durch utrikuläre Zellen sekretiert wird und sich im Kolloid niederschlägt. Die Synthese, der Metabolismus, die primäre immunochemische Struktur und die Funktion der Genese von Hormonen sind sämtliche in großem Umfang untersucht worden (1 - 5).
Die hTg-Konzentration pro Gramm frisches Gewebe liegt zwischen 20 und 40 mg. Ein derartiger Wert kann bei verschiedenen Erkrankungen der veränderten Schilddrüsenfunktion variieren. Die Konzentration von hTg sinkt bei der Basedow-Krankheit, bei der Behandlung mit Antithyreodika, im heißen Knoten der Schilddrüse, bei Kropf, der durch Veränderung in der Genese von Hormonen verursacht wird, wogegen sie im Falle eines Gallertkropfes und im Anschluß an die Behandlung mit Jod (6, 7) steigt.
In Schilddrüsenneoplasmen tritt eine progressive Proteinreduktion hinsichtlich des Differenzierungsgrades von Neoplasmen auf: Das Protein liegt in Adenomen und in endemischem und sporadischem multinodulären Kropf vor, ist im Falle von follikulärem und papillärem Karzinom merklich reduziert, liegt nicht vor bei anaplastischen Neoplasmen, bei Schilddrüsenlymphom und bei medullärem Karzinom (8).
Die Erkrankung von Schilddrüsenknoten tritt beim Menschen im allgemeinen sehr häufig auf, es ist jedoch aufgrund der breiten geographischen Variabilität und der Multiplizität der Manifestationen der Erkrankung unmöglich, eine genaue und einzelne Prozentangabe zu machen, insbesondere in den Gebieten endemischer Kropferkrankungen. Es ist jedoch möglich zu schätzen, daß etwa ein Prozentsatz von 5 bis 15 % der Menschen an Kropf und/oder an der Knotenerkrankung der Schilddrüse leidet (11).
Demgemäß ist der cytologische Test von durch Aspiration mittels einer Nadel gewonnenem Schilddrüsenaewebe in den letzten Jahren in der klinischen Praxis als Richtschnur für die Auswahl einer geeigneten therapeutischen Behandlung (medikamentöse oder chirurgische Behandlung) des Schilddrüsenknotens weit verbreitet, um zwischen den Alternativen eines Kolloidknotens oder eines neoplastischen Knotens in den verschiedenen Differenzierungsstufen zu urteilen.
Der cytologische Test, der an den utrikulären Zellen von durch eine Nadel mittels Aspiration entnommenem Gewebe durchgeführt wird, kann jedoch Zweifel ergeben über das Bösartige der gutartigen Natur der Schilddrüsengeschwulst.
Die quantitative Bestimmung von hTg, einem Protein, das den spezifischen Hauptbestandteil des Kolloides darstellt, kann beim Formulieren und Integrieren der cytologischen Diagnose von großer Hilfe sein und erlaubt so, daß die cytologischen Kriterien durch die quantitative Bestimmung eines Zelldifferenzierungs-Markers gestützt werden.
Fontana et al., (Proceedings of the Serono Symposia, Bd. 33, 1980, 147 - 152) beschreiben die quantitative Bestimmung des Thyreoglobulins mittels eines hämolytischen radialen Immunodiffusionstests, der in der Lage ist, so geringe Mengen wie 60 bis 80 pg Thyreoglobulin nachzuweisen. In der EP-A-396342 wird eine radiale Immunodiffusionstechnik beschrieben, um die Konzentration eines Analyten abzuschätzen. M. Bayraktar et al (The Journal of International Medical Research, Bd. 18, 1990, 253 - 255) beschreiben die Wirkung einer Nadelaspiration von Schilddrüsenknoten auf die Serum-Thyreoglobulin-Konzentration.
Die Mengenbestimmung von Thyreoglobulin im Schilddrüsengewebe, das durch eine Nadel entnommen wurde, wird derzeit nicht durchgeführt, da die verfügbaren Verfahren (RIA, IRMA, ELISA), die zur quantitativen Bestimmung der hTg- Konzentration in menschlichem Serum entwickelt worden sind, hTg-Mengen in der Größenordnung von ng bestimmen können, sodaß sie für die Anwendung der quantitativen Bestimmung der intrathyroiden Konzentration von hTg, die im Gegensatz dazu in der Größenordnung von mg liegt, recht ungeeignet sind.
Es ist demnach offensichtlich, daß ein Bedürfnis besteht nach einem einfachen, genauen und raschen Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Thyreoglobulin. in der Größenordnung von mg, in durch Nadeln angesaugtem Schilddrüsenzellmaterial , ohne daß dafür hochspezialisierte Laboratorien notwendig sind, sodaß das Verfahren für klinische und diagnostische Zwecke eingesetzt werden kann.
Die Autoren dieser Erfindung haben gefunden, daß ein Immunodiffusionsverfahren solchen Eigenschaften genügt sodaß es für die quantitative Bestimmung von Thyreoglobuim in durch Nadeln angesaugtem Schilddrüsenmaterial eingesetzt werden kann, sind zwar auf rasche und exakte Weiser ohne daß die Verwendung von Radioisotopen notwendig ist.
Demgemäß ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen bereitzustellen, das die quantitative Bestimmung von Thyreoglobulin umfaßt, wobei Thyreoglobulin in einer Schilddrüsenprobe, die durch Aspiration entnommen wurde, quantitativ bestimmt wird. Vorzugsweise wird die quantitative Bestimmung von Thyreoglobulin mittels Immunodiffusionstechniken erreicht. Noch bevorzugter umfassen die Immunodiffusionstechniken einfache radiale Immunodiffusion.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
- Herstellen eines inerten Gels das einen Liganden enthält, der in der Lage ist, Thyreoglobulin zu binden;
- In-Kontakt-bringen der Schilddrüsenprobe mit dem Gel:
- Inkubieren desselben:
- quantitative Bestimmung der Reaktion Ligand- Thyreoglobulin.
Vorzugsweise umfaßt der Ligand Anti-Thyreoglobulin- Immunseren oder gereinigte Anti-Thyreoglobulin-Antikörper.
Vorzugsweise umfaßt das inerte Gel Agarose in einer Konzentration im Bereich von 0,8 % bis 2,0 %. Bevorzugter ist die Agarose in einer Lösung gelöst, die NaCl und einen Phosphatpuffer enthält. Am meisten bevorzugt liegt NaCl in einer Konzentration von 0,15 M vor und die Lösung umfaßt Natriumglutamat und Chlorhexidin.
Vorzugsweise wird das inerte Gel in flüssigem Zustand in den Raum zwischen zwei Glasplatten gegossen, der in geeigneter Weise abgedichtet ist, und dann läßt man es fest werden. Bevorzugter ist eine der beiden Glasplatten
mit einem Material überzogen, das die Adhäsion des Geles zu der Glasplatte verbessert.
Gemäß einer Ausführunasform der Erfindung findet das In-Kontakt-bringen der Schilddrüsenprobe mit dem Gel durch Aspiration eines Teils des inerten Gels mittels einer Nadel und Bildung einer kreisförmigen Vertiefung, in die die Schilddrüsenprobe eingeführt wird, statt.
Vorzugsweise wird die Inkubation in einer feuchten Kammer für einen Zeitraum zwischen 2 Stunden und 60 Stunden durchgeführt. Bevorzugter liegt die Temperatur der feuchten Kammer im Bereich zwischen 20 ºC und 27 ºC und der Zeitrauin beträgt zwischen 24 Stunden und 50 Stunden.
Vorzugsweise ist die Reaktion zwischen dem Liganden und Thyreoglobulin eine Fällungsreaktion und die quantitative Bestimmung wird durch Messen bzw. Bestimmen von mindestens einem Durchmesser der Präzipitationsringe durchgeführt. Bevorzugter werden die Präzipitationsringe mittels Proteinfarbstoffen nach dem Trocknen des inerten Gels gefärbt.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung enthält die Schilddrüsenprobe Thyreoglobulin bei einer Konzentration zwischen 0,5 und 4,0 mg/ml oder sie wird verdünnt, um diese Konzentration zu erhalten.
Dieerfindung wird im folgenden bzgl. einiger Anwendungsbeispiele beschrieben. die die Erfindung jedoch lediglich veranschaulichen, nicht jedoch einschränken sollen.

Beispiel 1

Verfahren zur auantitativen Bestimmung von Thyreoglobulin für einfache radiale Immunodiffusion

Immunodiffusionstechniken sind in (12) beschrieben.
Die Aspiration mittels der Nadel wird unter Verwendung einer Vorrichtung zur Aspiration von Zellmaterial (Cameco, Schweden) mit einer 20 ml-Spritze und 21 G x 1-1/2, 0,8 x 40 mm-Nadel durchgeführt.
Das so angesaugte Material kann bestehen aus:
a) Einigen Tropfen hämatischer Flüssigkeit:
b) zystischer Flüssigkeit in variablen Mengen (mehr als 20 ml), braunfarbig oder von gelber oder hämatischer Farbe. Im Fall a) wird eine Fraktion des Volumens (30 ul) in 0,15 M NaCl verdünnt, 1-1 und dann wird dieses Volumen in Polyethylenröhrchen (29 x 6 mm), 2' bei 1.000 x g zentrifugiert, der überstand wird für die quantitative Bestimmung von hTg verwendet, der abgesetzte Teil wird sorgfältig suspendiert und wird dann ausgestrichen, um die zytologische Untersuchung durchzuführen. Im Falle b) wird die zystische Flüssigkeit zentrifugiert (1500 x g x 10') und auf ähnliche Weise wie in Fall a) wird der Überstand zur quantitativen Bestimmung von hTg verwendet, während der sedimentierte Teil für die cytologische Untersuchung verwendet wird.
1,5 g Agarose wurden durch Erwärmen in 100 ml Salzlösung (0,15 M NaCl) aufgelöst, die mit 0,05 M Phosphatpuffer. der 0,24 M Natriumglutamat und 0,005 % Chlorhexidin enthielt, gepuffert. Das Volumen wird auf 10 ml-Röhrchen verteilt und diese werden bei +4 ºC aufbewahrt.
Kaninchen-human-anti-Thyreoglobulin-Serum wird durch Emulgieren von 5 mg hTg in 1 ml vollständigen Freund'schem Adjuvans und Injizieren der Emulsion in die Fettpolster der Pfoten des Tieres hergestellt. Einen Monat danach wird eine Booster-Injektion durchgeführt, bei der genauso vorgegangen wird. Nach 15 Tagen wurde dem Tier durch Herzpunktion Blut abgenommen, der Antikörper wird mit normalem Human-Serum gebunden und die Konzentration wurde durch Plotten der Kurve der Präzipitine bestimmt. Es wurde ein Titer von 10 mg prazipitiertem hTg aus der Präzipitinkurve bei Aquivalenz pro ml Serum erhalten.
Das hTg wird aus einem Rohextrakt eines Kolloidstrumas durch Salzen und sukzessive Chromatographie auf einer superfeinen Sephadex G 200 -Säule (0.05 M Phosphatpuffer: pH 7,4) hergestellt. Die Reinheitsprüfung ergibt eine einzelne Bande bei der SDS-Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gel (8 - 10).
10 ml Agar werden bei 80 ºC auf einem Wasserbad aufgelöst und dann läßt man die Lösung abkühlen; wenn das Agar eine Temperatur von 56 ºC erreicht hat, werden 1 ml des Kaninchen-anti-hTg zugegeben, dann wird das Gemisch rasch auf einen Magnetrührer gegeben, um eine vollständige Mischung zu erhalten, dann wird das Agar-anti-Serum, während es im geschmolzenen Zustand ist, mittels einer Pipette in die Form verteilt.
Die Form wird erhalten, indem zwei Glasplatten (7 x 15 cm) nahe aneinander gelegt werden, nachdem sie sorgfältig gereinigt wurden, wobei die beiden Platten durch ein U-förmiges Zwischenelement aus einem Kunststoffmaterial getrennt sind und mittels Metallklammern zusammengehalten werden. Eine der beiden Platten wird zuvor präpariert, indem sie mit einem Gel-Bond-Lamina (Pharmacia) überzogen wird.
Man läßt das Gel-Antiserum-Gemisch 1 Stunde lang auf Raumtemperatur abkühlen, dann wird die nicht mit Gel-Bond behandelte Platte entfernt, indem man sie leicht rutschen läßt. Das U-förmige Kunststoffzwischenelement wird ebenfalls entfernt. Durch Punktieren des Gels mit einer 2,5 mm-Aspirationsnadel, die mit einer Teleskop-Vorrichtung versehen ist, werden mittels vorsichtiger Aspiration (Wasserstrahlpumpen-Vakuum) zwei Reiben von 5 Vertiefungen erhalten, wobei der Durchmesser einer jeder Vertiefung 2,5 mm beträgt. 0,01 ml einer Lösung, die zunehmende Mengen von hTg (0,005 - 0,04 mg) enthält, werden mittels einer Eppendorf-Pipette oder ähnlichem in fünf Vertiefungen gegeben, wobei darauf geachtet wird, daß die Pipettenspitzen nach jeder Abgabe ausgewechselt werden; die verschiedenen zu untersuchenden Proben werden in die anderen vertiefungen gegeben. Man läßt die Platten dann 48 Stunden lang in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubationszeit wird der Durchmesser der Präzipitationsrinae mittels des geeigneten Meßinstrumentes zum Ablesen der Platte abgelesen. Es werden zwei Durchmesser bei rechten Winkeln gemessen und der Durchschnittswert wird genommen. Die beiden Durchmesser sollen voneinander nicht mehr als 5% abweichen. Das Ablesen kann auch exakter an den gefärbten Ringen durchgeführt werden, zusätzlich zu dem bei dem gekühlten Material durchgeführten Ablesen. Zu diesem Zweck werden die Platten einige Stunden lang in Wasser gewaschen und dann in einem Ofen 30 Minuten lang bei 100 ºC getrocknet. Proteine werden mittels der üblichen Proteinfärbestoffe (Bromphenolblau, Coomassie, Ponceau-Rot) gefärbt. Die Referenzkurve wird hergestellt, indem die hTg-Konzentration als die Abszisse und der Durchmesser der Ringe in mm als die Ordinate genommen wird.
Mittels dieses Verfahrens können Mengen von hTg von 0,5 bis 4 mg/ml Probe bestimmt werden.
Im Falle von konzentrierteren Proben ist es angemessen. geeignete Verdünnungen durchzuführen. TABELLE 1 Referenzkurven für die Bestimmung vom intraglandulärem Thyreoglobulin (ThTg) in dem mittels der einfachen radialen Immunodiffusion (RTD) angesaugtem Schilddrüsenzellmaterial. Werte von sieben an unterschiedlichen Tagen bestimmten Kurven (Tabelle folgt)
A.V. = Durchschnittswert
S.D. = Standardabweichung
V.C. % = Variationskoeffizient (S.D./A.M.) x 100

Beispiel 2

Durch Einsatz des Verfahrens der quantitativen Bestimmung von Thyreoglobulin erhaltene Ergebnisse

Die Ergebnisse von sieben Referenzkurven sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Variabilität der verschiedenen Experimente hat ihre Maximumwerte von 13% an den niedrigsten Punkten der Kurve erreicht, wogegen sie Maximumwerte von 8% und Minimumwerte von 3 % in Proben mit höheren konzentrationen erreicht hat
Die vergleichende Bestimmung zwischen der einfachen radialen Immunodiffusion (RID) und dem RIA-Verfahren, das unter Verwendung handelsüblicher Kits an einer limitierten Anzahl von Proben durchgeführt wurde, zeigte eine optimale Korrelation (r = 0,93, p kleiner als 0,01).
Die intrathyroidale Konzentration von ThTg, die mittels der RID-Technik in dem durch Suktion von 54 Schilddrüsengeschwulsten gesammelten cytologischen Material bestimmt wurde, ist in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Intrathyroidale Konzentration von Thyreoglobulin (ThTg) bestimmt durch die einfache radiale Immunodiffusionstechnik in cytologischem Material, das durch Suktion von 54 Schilddrüsengeschwulsten mit unterschiedlicher cytologischer oder klinischer Diagnose entnommen wurde.
nd = nicht bestimmbar
Bei der nodulären Hyperplasie zeigt sich eine Durchschnittskonzentration von ThTg von 1,30 ± 0,5 mg/ml, in drei von acht Fällen jedoch, die in den Berechnungen des Durchschnittswertes nicht enthalten sind, stellte es sich heraus, daß die Konzentration von ThTg definitiv höher war, da es notwendig war, die Probe zu verdünnen, um sie aus der Referenzkurve ablesen zu können. Konzentrationen ähnlich derjenigen des hyperplastischen Knotens wurden in denaturierten Scheinzvsten beobachtet (1,58 ± 0,69 mg/ml).
Derartige Scheinzysten können als ein hyperplastischer Knoten angesehen werden, der bereits in Nekrose und Verflüssigung übergegangen ist. In dieser Gruppe werden vereinzelt auch einige sehr hohe Werte angegeben. In solchen Fällen ist eine kolloidozystische Degeneration eingetreten. Interessanterweise war es möglich, daß in einer Gruppe von sechs Proben von durch Aspiration extrahiertem cytologischen Material, in der die typischen Schilddrüsenelemente nicht nachgewiesen werden konnten (Ränder von urtikulären Zellen oder Schilddrüsenfollikeln), eine Konzentration von ThTg quantitativ zu bestimmen, die mit der in dem hyperplastischen Knoten festgestellten vergleichbar war. Diese Beobachtung beweist einen weiteren Vorteil dieses Verfahrens, da selbst in Abwesenheit von typischen Zellelementen es ein Element zur Organdiagnose zur Verfügung stellt sowie eine Beurteilung der Natur der Geschwulst erlaubt.
Bei den anderen nach cytologischen Kriterien (chronische lymphozytische Thyreoditis, follikuläre Neoplasie) oder nach klinischen Laborkriterien (heißer Knoten, Basedow- Krankheit) klassifizierten Gruppen von Schilddrüsenerkrankungen stellte sich heraus, daß die Konzentration von ThTg bei Konzentrationen von 0,5 mg/ml lag oder gar nicht vorhanden war. Dieses Ergebnis ist in guter übereinstimmung mit dem, was wir bereits aus histologischen und biochemischen Untersuchungen wissen, in denen gezeigt wird, daß im Falle der Basedow-Krankheit, beim heißen Knoten, bei Adenom und beim Schilddrüsenkarzinom des Kolloids, bei denen die ThTg-Einlagerung sehr gering ist, sowie bei lymphozytischer Thyreoditis, bei der das follikuläre Gewebe durch die lymphatische Infiltration substituiert ist.
Demgemäß kann, bei Vorliegen der cytologischen Situation einer "follikulären Hyperplasie oder hei Verdacht auf "lymphozvtische Thyreoditis" die quantitative Bestimmung von ThTg ein brauchbares Element zur Einbeziehung in die Diagnose sein. Bestehen beispielsweise Zweifel zwischen "chronischer lymphozytischer Thyreoditis" und fokaler Thyreoditis bei nodulärer Hyperplasie" kann die quantitative Bestimmung von ThTg Hinweise auf die Diagnose "chronische lymphozytische Thyreoditis" (ThTg mit niedriger Konzentration oder sogar nicht vorhanden) oder auf die Diagnose "noduläre Hyperplasie" (hohe Konzentration von ThTg) geben. In Falle eines durch Suktion extrahierten Zellmaterials, das reich an Zellen ist, kann auf ähnliche Weise, wenn Zweifel bestehen zwischen Hyperplasie oder nodulärer Neoplasie, die Bestimmung von ThTg Hinweise geben in Richtung der Diagnose "Hyperplasie", wenn hohe ThTg-Werte erhalten werden oder in Richtung der Diagnose "Neoplasie", wenn ThTg nicht vorliegt oder in niedrigen Konzentrationen vorliegt.

LITERATURANGABEN

1) Biochimie 72, 9.1989. Der gesamte Band.
2) RAWTICH A.B., LITWER M.R., GREGG J., TURNER C. D., ROUSE J. B., HAMILTON, J.W.: The Isolation of Identical Thyroxine Containing Amino Acids Sequences from Bovine, Ovine and Porcine Thyroglobulins, Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 423-429, 1984
3) MERCKEN L., SIMONS M.J., SWILLENS S., MASSAER M., VASSART G.: Primary structure of bovine thyroglobulin deduced from the sequence of its 8431-base complementary DNA, Natura, (Lond.) 316, 647-651, 1985
4) T. HOTTA, I. ISHII, H. ISHIHARA, S. TEJIMA, O. TARUTANI, N. TAKAHASHI: "Comparative study of oligosaccharides of human Thyroglobulins obtained from normal subjects and patients with various diseases". J. Appl. Biochemistry 7, 98-103, 1985.
5) GARTNER R., BECHTNER G., GRELL W., HORN K., PICKARDT C.R.: "Characterization of microheterogeneity of human thyroglobulin from different thyroid disorders". Acta Endocrinologica 109, 76-82, 1985
6)SALABE' G.B., PAPA C.: Proteine solubili tiroidee; studio elettroforetico di estratti di tiroide normale e patologica, Folia Endocr. 17, 372, 1964.
7) SALABE' G.B., BASCHIERI L., TONELLI S.: Studio delle proteine solubili della tiroide di soggetti trattati con soluzione iodio-iodurata e con tiuracilici, Folia Endocr. 17, 293, 1964.
8) OLJVIERI A., MARZULLO A., SALABE' G.B, FAZZINI C., GILARDI E., CARTA S.: Isoelectric pattern of thyroglobulin and antithyreoglobulin antibodies, Thyroidology; im Druck
9) DERRINE Y., MICHEL R., PEDERSEN K.O., ROCHE J.. Recherches sur la preparation et les propriétés de la thyréoglobuline pure, Biochim. Biophys. Acta 3, 346, 1949.
10) SALVATORE G.. SALVATORE M., CAHUMANN H.J., ROBBINS J.: Separation of Thyroidal Iodoproteins and Purifaction of Thyroglobulin by Gel Filtration and Density Gradient Centrifugation, J. Biol. CHEM. 239, 3267-3274, 1964.
11) TUNBRIDGE W.M.G., EVERED D.C., HALL R., APPLETON D., BRIWIS M., CLARK F., GRIMLEY EVANS J., YOUNG E., BIRD T., SMITH P.A.: The Sectrum of thyroid disease in a community: The Whickam survey Clinical Endocr. 7, 481-493, 1977.
12) CROWLE A.J., Immunodiffusion, 2. Auflage, Academic Press New York and London, 1973.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen, umfassend die quantitative Bestimmung des darin enthaltenen Thyreoglobulins, dadurch gekennzeichnet, daß Thyreoglobulin in einer Schilddrüsenprobe, die durch Aspiration entnommen wurde, quantitativ bestimmt wird.

2. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 1 wobei die quantitative Bestiminung von Thyreoglobulin mittels Immunodiffusionstechniken erreicht wird.

3. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 2, wobei die Immunodiffusionstechniken die einfache radiale Immunodiffusion umfassen.

4. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 3, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

- Herstellen eines inerten Geles, das einen zum Binden von Thyreoglobulin fähigen Liganden enthält;

- In-Kontakt-bringen der Schilddrüsenprobe mit dem Gel;

- Inkubieren desselben;

- quantitative Bestimmung der Reaktion Ligand- Thyreoglobulin.

5. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 4, wobei der Ligand anti-Thyreoglobulin- Immunoserum oder gereinigte anti-Thyreoglobulin Antikörper enthält.

6. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 4 oder 5, wobei das inerte Gel Agarose in einer Konzentration im Bereich von 0,8% bis 2,0% umfaßt.

7. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 6, wobei die Agarose in einer Lösung aufgelöst wird, die NaCl und einen Phosphatpuffer enthält.

8. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 7, wobei das NaCl bei einer Konzentration von 0,15 M vorliegt und die Lösung Natriumglutamat und Chlorhexidin enthält.

9. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 8, wobei das inerte Gel in flüssigem Zustand in den Raum zwischen zwei in geeigneter Weise gedichteten Glasplatten gegossen und aushärten gelassen wird.

10. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 9, wobei eine der beiden Glasplatten mit einem Material überzogen ist, das die Adhäsion des Gels an die Glasplatte verbessert.

11. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 10, wobei das In-Kontakt-Bringen durch Aspiration eines Teils des inerten Gels mittels einer Nadel und der Bildung einer kreisförmigen Vertiefung, in die die Schilddrüsenprobe eingeführt wird, stattfindet.

12. Verfahren zur Diagnose yon Schilddrüsenstörungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 11, wobei die Inkubation in einer feuchten Kammer für einen Zeitraum zwischen 2 Stunden und 60 Stunden durchgeführt wird.

13. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 12, wobei die Temperatur der feuchten Kammer im Bereich zwischen 20 ºC und 27 ºC liegt und der Zeitraum zwischen 24 Stunden und 50 Stunden beträgt.

14. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 13, wobei die Reaktion zwischen dem Liganden und Thyreoglobulin eine Fällungsreaktion ist und die quantitative Bestimmung durch Messen mindestens eines Durchmessers der Präzipitationsringe durchgeführt wird.

15. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach Anspruch 14, wobei die Präzipitationsringe nach Trocknen des inerten Geles durch Proteinfarbstoffe gefärbt werden.

16. Verfahren zur Diagnose von Schilddrüsenstörungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schilddrüsenprobe Thyreoglobulin in einer Konzentration zwischen 0,5 und 4,0 mg/ml enthält oder verdünnt wird, um diese Konzentration zu erhalten.