DE69120359T2 - Verfahren zur identifizierung von candida albicans mittels chromogener substanzen - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von candida albicans mittels chromogener substanzen

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung, zur Dosierung und/oder zur Identifikation von Candida albicans-Stämmen unter anderen Candida-Stämmen und unter verwandten Stämmen, die zur Torulopsis-Gruppe gehören, mittels chromogener Substrate vom Monoaminosäuren- oder Peptid-Typ.
    • STAND DER TECHNIK
  • Candidosen werden von pathogenen Candida-Stämmen oder von verwandten Stämmen hervorgerufen, die im wesentlichen zur Torulopsis-Gruppe gehören. Bekanntlich gehören in mehr als 60% der bekannten Fälle die für die Candidosen verantwortlichen Candida-Stämme zur Art Candida albicans und die verantwortlichen Stämme in den anderen Fällen zu anderen Candida- Arten, beispielsweise Candida tropicalis, Candida krusei, oder zur Gruppe von Stämmen, die mit Torulopsis verwandt sind, insbesondere zur Art Torulopsis glabrata.
  • Bekanntlich wurden zur Behebung der Schwierigkeiten (beträchtliche Anzahl von Manipulationen und lange Dauer von Tests) bisheriger Techniken [Blastese-Test (oder Filamentationstest in Serum), Test der Chlamydosporulation in PCB- oder RAT-Medium] zur Identifikation von Candida-Stämmen, im wesentlichen von Stämmen der Art Candida albicans, und verwandten Stämmen im biochemischen Fachgebiet bekannte Verfahren zum Nachweis von charakteristischen Hefeenzymen, wie Osidasen und Aminopeptidasen, vorgeschlagen. Man besann sich auf chromogene oder fluorogene Substrate.
  • Bis jetzt sind alle Verfahren zur Identifikation von Candida und Torulopsis durch Nachweis von Osidasen oder Aminopeptidasen an zuvor isolierten Stämmen durchgeführt worden.
  • Man kennt insbesondere von D.G. BOBEY et al.1 J. Clin. Microbiol., 13, (Nr. 2), Seiten 393-394, (1981), J.L. PERRY et al., J. Clin. Microbiol., 25, (Nr. 12), Seiten 2424-2425, (1987) und CM. SMITKA et al., J. Clin. Microbiol.1 27 (Nr. 1), Seiten 203-206, (1989) Tests mit Osidasesubstraten, die durch den fluorogenen Rest 4-Methylumbelliferyl (abgekürzt 4MU) markiert sindl nämlich insbesondere 4MU-β-D-Glucopyranosid, 4MU-2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosid, 4MU-β-D-Galactopyranosid bzw. 4MU-2-Acetamido-2-desoxy-β-D-galactopyranosid zum Nachweis von aus Candida-Stämmen stammender β-D- Glucosidase, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase, β-D-galactosidase bzw. N-Acetyl-β-D-galactosaminidase. Nach den Dokumenten zeigen die Candida- und Torulopsis-Stämme keine β-D-Galactosidase-, β-L-Fucosidase- und β-D-Glucosidase-Aktivität. Andererseits zeigen die Candida albicans-Stämme und einige Candida tropicalis-Stämme eine N-Acetyl-β-D-galactosaminidase- Aktivität. Es ist deutlich, daß die isolierte Verwendung dieser Substrate nicht direkt auf die Identifikation von Candida albicans-St&mmen in einem Gemisch von Candida- und gegebenenfalls Torulopsis-Stämmen anwendbar ist.
  • Ebenso kennt man von M. CASAL et al., Mycopathologia 81, Seiten 155-159, (1983) und 1. POLACHEK et al., J. Clin. Microbiol., 25, Seiten 907-910, (1987) die Verwendung von Osidase-Substraten, die eine fluorogene oder chromogene Gruppe tragen, wie p-Nitrophenyl (abgekürzt: PNP), 13-Naphthyl oder 6-Brom-β-Naphthyl [erhalten durch Kuppeln (nach der Erzeugung eines Brückenethers) einer Ose mit p-Nitrophenol, β- Naphthol bzw. 6-Brom-β-Naphthol] zur Bestimmung von isolierten Candida alticans- Stämmen. Nach der Lehre dieser beiden Dokumente reagieren diese Osidase-Substrate mit ihrer aus Candida-Stämmen und verwandten Stämmen stammenden Ziel-Osidase. Jedoch muß erwähnt werden, daß (i) das Substrat β-Naphthyl-N-acetyl-β-glucosaminid [Zielenzym: N-Acetyl-β-D- glucosaminidase] insbesondere mit isolierten Caridida albicans-, Candida tropicalis-, Candida stellatoidea- und Torulopsis glabra ta-Stämmen die gleiche positive Reaktion ergibt und (ii) das Substrat (6-Brom-β-naphthyl) -β-D-glucopyranosid [Zielenzym: β-D-Glucosidase] mit den isolierten Candida albicans-, Candida tropicalis-, Candida pseudotropicalis-, Torulopsis glabrata- und Cryptococcus neoformans-Stämmen die gleiche positive Reaktion ergibt. Anders gesagt, kann die Verwendung dieser Substrate nicht direkt auf die Bestimmung von Candida albicans in einem Gemisch angewendet werden, das andere Hefen wie Candida und Torulopsis enthält.
  • Bezüglich der Verwendung von Monoaminosäure- oder Peptid-Substraten, die gegenüber Amidasen und insbesondere Aminopeptidasen empfindlich sind, kennt man auf dem Gebiet der Identifikation von Candida- und verwandten Stämmen zwei Lösungsverfahren.
  • Die erste Lösung wird durch den unter der Bezeichnung YEAST-IDENT vertriebenen Test dargestellt und ist auf zuvor isolierte Hefestämme anwendbar. Das Identifikationsverfahren beruht auf der Bestimmung des Enzymprofils des isolierten Stammes in einem flüssigen Medium, wobei dieses Profil mittels eines Systems von ungefähr zwanzig verschiedenen Substraten nach 4stündiger Inkubation bei 37ºC erhalten wird. Diese Substrate, die eine fluorogene Gruppe wie β-Naphthylamino (abgekürzt: NA) tragen, sind insbesondere H-Gly-NA, H- L-Pro-NA, H-L-Trp-NA, H-L-Hyp-NA, H-L-Ile-NA, H-L-Val-NA, H- L-Leu-Gly-NA, H-L-His-NA, H-L-Cys-NA, H-L-Tyr-NA und H-Gly- Gly-NA. Die Interpretation ist bei diesen Substraten schwierig. Da diese Substrate für Enzyme spezifisch sind, die bei zahlreichen Hefe- und insbesondere Candida-Stämmen vorkommen, muß man die gesamten, mit allen Substraten erhaltenen Ergebnisse berücksichtigen, um das enzymatische Profil eines gegebenen isolierten Candida-Stammes einzuschätzen. Die Anwendung dieses Lösungsverfahrens ist nicht direkt auf Gemische von Stämmen übertragbar. Tatsächlich ergibt das bestimmte Substrat H-L-Pro-NA eine positive Reaktion mit isolierten Candida albicans-, Candida guillermondii-, Candida intermedia-, Candida parapsilosis-, Candida pseudotropicalis-, Candida stellatoidea-, Candida ruqosa-, Candida zeylanoides- und Torulopsis candi da-Stämmen.
  • Die zweite, in der Übersicht von R.W. KELLEY et al. beschriebene und im Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., C 337, Seite 384 (1986) und in dem Artikel von J.L. PERRY et al., J. Clin. Microbiol., 28 (Nr. 3), Seiten 614-615 (März 1990), erschienene Lösung betrifft die Verwendung des obenerwähnten Substrates H-L-Pro-NA bei der Identifikation von Candida albicans und/oder Candida tropicalis. Die Übersicht C 337 deutet insbesondere auf die Möglichkeit, die Candida albicans-Stämme von Candida tropicalis-Stämmen zu unterscheiden, und schlägt zu diesem Zweck zwei Substrate vor, d. h.: PNP-N-Acetyl-β-D-galactosaminid und H-L-Pro-NA. Jedoch beschreibt diese übersicht weder das Verfahren, das die Unterscheidung Candida albicans/Candida tropicalis erlaubt, noch deutet sie an, ob dieses Verfahren auf Gemische von Stämmen anwendbar ist. Der Artikel von J.L. PERRY et al. schlägt die gleichzeitige Verwendung dieser beiden Substrate in der gleichen Identifikationsreaktion in flüssiger Phase ausgehend von zuvor isolierten Stämmen auf Standard-Agarmedium vor.
  • Aus dem Artikel von J. KUNERT et al., Journal of Medical and Veterinary Mycology 26, Seiten 187-194, (1988) ist bekannt, daß man chromogene Substrate untersuchte, die eine Monoaminosäure- oder Peptidkette tragen und in denen der chromogene Rest der p-Nitroanilin-Rest (abgekürzt: pNA) ist, um extrazelluläre proteolytische Enzyme von isolierten Hautpilzstämmen zu charakterisieren. Dieser Artikel zitiert insbesondere das Substrat H-L-Pro-pNA, betrifft aber nicht die Identifikation von Candida, die nicht zur Gruppe der Hautpilze gehören, noch schlägt er die Verwendung des Substrats zur Bestimmung von verschiedenen Candida-Stämmen, wie Candida albicans, in einem Gemisch aus Candida und verwandten Stämmen vor.
  • Es ist außerdem bekannt, daß das amerikanische Patent US-A-4 874 695 (veröffentlicht am 17. Oktober 1989) einerseits auf die mögliche Verwendung des Substrates H-L-Pro-pNA bei der Identifikation von Hefestämmen hinweist (siehe Tabelle I, Spalte 4, Zeile 36), und andererseits lehrt, daß dieses Substrat insbesondere nicht spezifisch ist, weil es gegenüber zahlreichen Candida-Stämmen, insbesondere C. albicans, C. guillennondii, C. intennedia, C. lipolytica, C. lusitanica, C. parapsilosis, C. rugosa und C. zeylanoides empfindlich ist (siehe Tabelle IV, Spalte 7, Substrat Nr. 8). Es sollte erwähnt werden, daß nach diesem amerikanischen Patent nicht angedeutet wird, wie man dieses Substrat spezifisch für Candida albicans-Stämme macht.
  • Folglich veranlaßt die Lektüre des amerikanischen Patentes US-A-4 874 695 den Fachmann keineswegs, das Substrat H-L- Pro-pNA zur Identifikation nicht isolierter Candida albicans- Stämme zu verwenden.
    • LÖSUNG DER ERFINDUNG
  • Erfindungsgemäß wird eine neue technische Lösung vorgeschlagen, die chromogene Substrate zur Bestimmung von Candida albicans-Stämmen verwendet und die zur Identifikation dieser Stämme unter den herkömmlichsten, wie einerseits Candida tropicalis, Candida krusei und Torulopsis glabrata (die pathogen sein können) und andererseits Candida guillermondii, Candida pseudotropicalis, Candida parapsilosis usw. (die wenig pathogen oder nicht pathogen sind), anwendbar ist.
  • Diese neue Lösung beruht insbesondere auf der Identifikation von Candida albicans-Stämmen in einem Gemisch von Candida-Stämmen und verwandten Stämmen aus der Torulopsis-Gruppe durch (i) Verwendung eines Systems chromogener Substrate und (ii) Verwendung eines Systems von Hemmstoffen.
  • Diese technische Lösung bietet den Vorteil, daß unter Candida und Torulopsis, die im wesentlichen die pathogenen Hefen umfassen, die man am häufigsten beim Menschen antrifft, die Candida albicans-Stämme identifiziert werden. Es wird in diesem Zusammenhang darauf hingewiesen, daß die Candida albicans-, Candida tropicalis- und Torulopsis glabrata-Stämme insbesondere für Vaginitis, Endokarditis, Pneumonien und Septikämien verantwortlich sind, und daß die Candida krusei- und Candida guillermondii-Stämme gegebenenfalls beim Menschen angetroffen werden können.
    • ZWECK DER ERFINDUNG
  • Erfindungsgemäß wird eine neue technische Lösung vorgeschlagen, die chromogene Substrate und ein System von Hemmstoffen zur Identifikation von Stämmen in einem Gemisch von Candida und Torulopsis verwendet, die man am häufigsten beim Menschen antrifft und die insbesondere pathogen sind, um im wesentlichen Candida albicans von Torulopsis glabratal candida tropicalis, Candida krusei und Candida guillermondii zu unterscheiden.
  • Dieses Verfahren ist direkt zur Bestimmung nicht isolierter Candida albicans-Stämme unter anderen Stämmen, insbesondere Torulopsis glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei und Candida guillennondii anwendbar.
    • ZIEL DER ERFINDUNG
  • Das Ziel der Erfindung und andere Vorteile werden durch die vorstehend genannten Merkmale zur Identifikation der hauptsächlichen, für Infektionen vom Candidose-Typ verantwortlichen Stämme, die man insbesondere beim Menschen antrifft, erhalten.
  • Es wird ein Verfahren zur Identifikation von Candida albicans-Stämmen unter anderen verwandten Stämmen vorgeschlagen, die pathogen sein können und zur Candida- und Torulopsis-Gruppe gehören, wobei das Verfahren, das ein chromogenes Substrat und einen Hemmstoff verwendet und das nicht die Isolation der zu identifizierenden Stämme beinhaltet, dadurch charakterisiert ist, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
  • (a) In-Kontakt-bringen von zu identifizierenden Stämmen mit einem Nährmedium, umfassend (i) eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Spurenelemente, (ii) ein chromogenes Substrat, das gegenüber mindestens einem Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Aminoamidasen und Aminopeptidasen, empfindlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
  • (α) H-L-Pro-pNA,
  • (β) H-L-Hyp-pNA,
  • (γ) H-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,
  • (δ) Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,
  • (ε) H-L-4Hyp-L-Pro-L-Arg-pNA,
  • (ξ) Boc-L-4Hyp-L-Pro-L-Arg-pNA und
  • (η) deren Additionssalzen,
  • und (iii) einen Hemmstoff, der aus einem Gentamycin/ Cycloheximid-Gemisch besteht, und
  • (b) Inkubieren, gefolgt von Beobachten der Kinetik der Spaltung des Substrats während mindestens 1 Std. anhand der Farbentstehung, die durch die Spaltung hervorgerufen wird.
    • ABKÜRZUNGEN
  • In der vorliegenden Beschreibung werden der Einfachheit halber die folgenden Abkürzungen verwendet:
    • -für die Aminosäurereste
  • Aib = 2-Aminoisobutyryl (oder 2-Methylalanyl)
  • Ala β-Alanyl
  • Arg Arginyl
  • ATC = Thiazolidin-4-carbonyl (oder Thiopropyl)
  • Abu = 2-Aminobutyryl
  • CHA = 3-Cyclohexylalanyl
  • CHG = a-Cyclohexylglycyl
  • CHT = 3- (4-Hydroxycyclohexyl) alanyl
  • Cys = Cysteyl
  • Gly = Glycyl
  • His = Histidyl
  • Hyp = Hydroxyprolyl (d. h. 3hyp oder 4Hyp)
  • 3Hyp = 3-Hydroxyprolyl (oder 3-Hydroxy-2-pyrrolidincarbonyl)
  • 4Hyp = 4-Hydroxyprolyl (oder 4-Hydroxy-2-pyrrolidincarbonyl)
  • Ile Isoleucyl
  • INC = Isonipecotyl [oder (Piperidin-4-yl)carbonyl]
  • Leu Leucyl
  • Lys = Lysyl
  • MeGly = N-Methylglycyl (oder Sarcosyl)
  • Nie = Norleucyl
  • Nva = Norvalyl
  • ONC = 2-Oxonipecotyl [oder (2-Oxopiperidin-3-yl)carbonyl]
  • Orn = Ornithinyl
  • Phe = Phenylalanyl
  • Phg = Phenylglycyl
  • Pip = Pipecolinoyl
  • Pro = Prolyl
  • Ser = Seryl
  • Thr = Threonyl
  • Trp = Tryptophanyl
  • Tyr = Tyrosyl
  • Val = Valyl
    • -für die anderen Abkürzungen:
  • AcOH = Essigsäure
  • Adoc = Adamantyloxycarbonyl
  • Aoc = t-Amyloxycarbonyl
  • Boc = t-Butyloxycarbonyl
  • (6-Br)NA = 6-Brom-β-naphthylamino
  • BU = n-Butyl
  • BZ = Benzoyl
  • Cbo = Carbobenzoxy
  • Et = Ethyl
  • EM Ethoxymalonyl (oder EtO-CO-CH&sub2;-CO)
  • Fmoc = 9 - Fluorenylmethyloxycarbonyl
  • Foc = Furfuryloxycarbonyl
  • HTFA = Trifluoressigsäure
  • Iboc = Isobornyloxycarbonyl
  • ipr = Isopropyl
  • Me = Methyl
  • MeO = Methoxy
  • (4-MeO)NA = 4-Methyloxy-β-naphthylamino
  • MM = Methyloxymalonyl (oder MeO-CO-CH&sub2;-CO)
  • 4MU = 4-Methylumbelliferyl
  • NA = β-Naphthylamino
  • ONP = 0-Nitrophenyl
  • PCB = Kulturmedium aus Kartoffel/Karotte/Galle
  • PEG = Polyethylenglycol
  • ph = Phenyl
  • pH = Logarithmus-Komplement der H+-Ionenkonzentration
  • PM = Molekulargewicht
  • pNA = p-Nitroanilin [oder (4-NO&sub2;)C&sub6;H&sub4;NH)
  • pNP = p-Nitrophenyl
  • Pr = Propyl
  • RAT = Kulturmedium aus Reis/Agar/Tween
  • RT = Umgebungstemperatur (15-20ºC)
  • tBu = t-Butyl
  • Tos = p-Toluolsulfonyl (oder Tosyl)
  • TTC = 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (oder Tetrazohumrot)
  • YNB = unter dem Handelsnamen "YEAST NITROGEN BASE" vertriebene Stickstoffquelle
  • z = Benzyloxycarbonyl
  • z (p-Cl) = p-Chlorbenzyloxycarbonyl
  • z (p-OMe) = p-Methoxybenzyloxycarbonyl.
    • - für die Beurteilung von Färbung und Fluoreszenz:
  • - = nicht vorhanden
  • + = schwach
  • ++ = mittel
  • +++ = intensiv
  • ++++ = sehr intensiv
    • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die erfindungsgemäß geeigneten chromogenen Substrate und ihre Additionssalze, die gewöhnlich eine größere Empfindlichkeit gegenüber Candida- und Torulopsis-Stämmen als die fluorogenen Substrate aufweisen (aufgrund einer gegebenenfalls substituierten NA-Gruppe), können durch die allgemeine Formel
  • R- (An) -A&sub1;-Ra (Io)
  • dargestellt werden, worin
  • R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe darstellt, die den N-Terminus blockiert,
  • An eine Einfachbindung, einen Monoaminosäurerest oder einen Peptidrest darstellt, der 2 bis 5 Aminosäurereste tragen kann,
  • A&sub1; einen α-Aminosäurerest darstellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Resten Gly, Megly, L-Arg, L-Lys, L- His, L-Pro, L-Hyp, L-Cys, L-Val und L-Trp, und
  • Ra einen aminierten chromogenen Rest darstellt, der insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend den p-Nitroanilinrest und den p-Nitroanilinrest, bei dem die Phenylgruppe substituiert ist.
  • Die Additionssalze sind hier im wesentlichen Säureadditionssalze, die durch Reaktion einer Verbindung der Formel I mit einer anorganischen oder organischen Säure, insbesondere HCl, HBr, AcOH oder HTFA, erhalten werden.
  • Die chromogene Gruppe Ra, die allgemein die quantitative Bestimmung von proteolytischen Aminoamidase- und Aminopeptidase-Enzymen erlaubt, entspricht der Formel
  • worin Y H, BR, Cl, F, CF&sub3;, COOH, COOW, CONH&sub2;, CONHW, CONW&sub2;, CONH(CH&sub2;)mNMe&sub2;, HOSO&sub2;, CN, OH oder OW ist, wobei W eine C&sub1;-C&sub6;- Alkylgruppe, C&sub6;-C&sub1;&sub0;-Arylgruppe, C&sub7;-C&sub1;&sub1;-Aralkylgruppe oder eine alicyclische C&sub3;-C&sub8;-Gruppe ist und m eine ganze Zahl mit dem Wert 1 bis 10 ist.
  • Gruppen der Formel II, worin das Kernphenyl der pNA- Gruppe substituiert ist, sind insbesondere in dem Dokument EP-A-0 110 306 beschrieben. Unter diesen Gruppen kann man insbesondere die geeigneten Gruppen nennen: pNA, 2-Carboxy-4- nitroanilin und 3-Carboxy-4-nitroanilin, 2-Halogen-4-nitroanilin und 3-Halogen-4-nitroanilin (wobei das Halogen F, Cl oder Br ist), 2-Methoxy-5-methyl-4-nitroanilin, 2-Hydroxysulfonyl-4-nitroanilin, 4-Trifluormethyl-2-nitroanilin, 4-Trifluormethyl-3-nitroanilin, 4-Cyano-2-nitroanilin und Analoga. Die bevorzugte Ra-Gruppe ist pNA.
  • Der Rest R stellt H oder eine Schutzgruppe für den N- Terminus dar. Eine solche Schutzgruppe ist im Fachgebiet wohlbekannt, beispielsweise unter den Resten, die den N-Terminus von Peptiden blockieren, wie die in EP-A-0 110 306, US- A-4 480 030, FR-A-2 293 439 und US-A-4 440 678 beschriebenen. Unter den Gruppen R, die verschieden von H sind, kann man insbesondere die C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen (insbesondere Me, Et, Pr, iPr, Bu, tBu), gegebenenfalls substituierte Arylgruppen (insbesondere pH, Tolyl, Xylyl, Chlorphenyl, Trifluormethylphenyl, Methoxyphenyl), gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen (insbesondere Bzl, Chlorbenzyl, Dichlorbenzyl, Trifluormethylbenzyl, Difluorbenzyl, Methoxybenzyl, Ethoxybenzyl, 3,4-Methylendioxybenzyl) und die klassischen Schutzgruppen für den Peptid-N-Terminus [insbesondere Ac, Tos, Adoc, Aoc, Bz, Cbo, Fmoc, Foc, Iboc, Z, Z(p-Cl) und Z(p-OMe)] nennen.
  • Die Reste R werden hier ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem Oxymalonylrest der Formel R1-O-CO-CH&sub2;- CO, wobei R1 eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine mit einer oder mehreren Me-, MeO-, Cl-, Br-, F-, CF3-Gruppen substituierte Phenylgruppe, eine C&sub3;-C&sub6;-Cycloalkylgruppe, eine Benzylgruppe, eine durch eine oder mehrere Me-, MeO-, Cl-, Br-, F-, CF3-Gruppen substituierte Benzylgruppe oder eine Cycloalkylmethylgruppe ist, wobei der Cycloalkylanteil C&sub3;-C&sub6; ist, und (b) einem Polyethylenglycolrest der Formel R2&submin;O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CO, wobei R2 eine C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe, Phenylgruppe oder Benzylgruppe ist, und n eine ganze Zahl mit dem Wert 1 bis 170 ist.
  • Allgemein werden hier Substrate bevorzugt, bei denen R H ist, da, mit der Ausnahme einiger besonderer Fälle, insbesondere für Candida guillermondii und Torulopsis glabrata, die Anwesenheit einer N-terminalen Schutzgruppe die Kinetik der Spaltung durch die Aminoamidasen oder die Aminopeptidasen verringert.
  • Unter den in der Formel 10 enthaltenen chromogenen Substraten lassen sich die Substrate
  • und ihre Additionssalze nennen, wobei R, A&sub1; und Ra wie vorstehend definiert sind, und A&sub2;, A&sub3;, A&sub4; jeweils einen Aminosäurerest darstellen.
  • Hier werden im Gegensatz zu der klassischen Nomenklatur von Peptidketten die Aminosäurereste von chromogenen Substraten mit 1, 2, 3 usw. ausgehend vom C-Terminus und nicht ausgehend vom N-Terminus numeriert.
  • Ist An ein Monoaminosäurerest (siehe zur Veranschaulichung die Formel 12), stellt er vorteilhafterweise Gly, L- Pro, L-Hyp, L-ONC, L-Phg oder L-ATC dar.
  • Ist An ein Dipeptidrest (siehe zur Veranschaulichung die Formel 13), ist der Aminosäurerest an Position 2 (d.h. A2) vorteilhafterweise Gly, L-Pro, L-Hyp oder L-Phg, und der Nterminale Aminosäurerest an Position 3 (d.h. A3) ist vorteilhafterweise Gly, D-Pro, L-Pro, D-Hyp, L-Hyp, D-Leu, L-Leu, D- Ala, L-Ala, D-Val, L-Val, D-ONC, L-ONC oder INC.
  • Ist An ein Tripeptidrest (siehe zur Veranschaulichung die Formel 14), ist der Aminosäurerest an Position 2 (d.h. A2) vorteilhafterweise Gly, L-Pro, L-Hyp, L-Thr oder L-Phg, der Aminosäurerest an Position 3 (d.h. A&sub3;) ist vorteilhafterweise Gly, L-Pro, L-Hyp, L-Leu, L-Ala, L-Ser oder L-Val, und der N-terminale Aminosäurerest (d.h. A&sub4;) ist vorteilhafterweise Gly, D-Pro, L-Pro, D-Hyp, L-Hyp, D-Leu, L-Leu, D-Ala, L-Ala, D-Val, L-Val, D-ONC, L-ONC oder INC.
  • Vorteilhafterweise trägt An erfindungsgemäß keinen CHA- oder CHT-Rest.
  • Die interessantesten erfindungsgemäßen Substrate sind gewöhnlich diejenigen, bei denen An eine Einfachbindung, ein Monoaminosäure-, Dipeptid- oder Tripeptidrest ist.
  • Vorteilhafterweise ist A&sub1; L-Pro, L-Hyp, L-Arg oder L- Lys, und besser L-Pro oder L-Arg.
  • In der Praxis hat der C-terminale Aminosäurerest des chromogenen Substrates immer die L-Konfiguration, der Aminosäurerest an Position 2 ist ein mit einem asymmetrischen Kohlenstoffatom versehener Rest, wie Gly, oder ein a-Aminosäurerest der L-Konfiguration, der N-terminale Aminosäurerest auf einer Position höher als 2 ist ein mit einem asymmetrischen Kohlenstoffatom versehener Rest, wie Gly, oder ein a-Aminosäurerest der D- oder L-Konfiguration und die eventuell zwischen der Position 2 und dem N-terminalen Aminosäurerest vorhandenen Aminsosäurereste sind entweder mit einem asymmetrischen Kohlenstoffatom versehen oder haben L-Konfiguration.
  • In den nachstehenden Tabellen I bis V ist eine bestimmte Anzahl chromogener Substrate aufgeführt, die an zahlreichen Stämmen getestet wurden. Die in den Tabellen I-IV aufgeführten Ergebnisse wurden ausgehend von einem bei pH-Wert 6,0 gepufferten Kulturmedium erhalten, das eine Stickstoffquelle (YNU, 6,7 g/l), Glucose (20 g/l), Agar (20 g/l), ein Antibiotikum (Gentamycin, 0,05 g/l) und das zu untersuchende Substrat umfaßte. Die Tabelle I listet außerdem bezüglich verschiedener Candida-Stämme Vergleichsbeispiele mit fluorogenen Substraten des Standes der Technik auf.
  • Diese Tabellen zeigen, daß allgemein alle Substrate der Formel I&sub1;, I&sub2;, I&sub3; und I&sub4;, wobei R H ist, durch die Aminoamidasen und Aminopeptidasen der C. tropicalis-Stämme hydrolisierbar sind. Tablle I TEST VON SUBSTRATEN AN CANDIDA ALBICANS-STÄMMEN Tabelle I (Forsetzg.) TEST VON SUBSTRATEN AN CANDIDA ALBICANS-STÄMMEN Tabelle II TEST VON SUBSTRATEN AN CANDIDA TROPICALIS Tabelle III VERGLEICH VON SUBSTRATEN AN C TROPICALS UND T. GLABRATA Tabelle III VERGLEICH VON SUBSTRATEN AN C TROPICALS UND T. GLABRATA Tabelle IV TEST VON SUBSTRATEN AN CANDIDA KRUSEI Tabelle IV TEST VON SUBSTRATEN AN CANDIDA GUILLERMOND II
  • Die in den vorstehenden Tabellen I-V und den weiteren Tabellen aufgeführten chromogenen Substrate sind gemäß klassischen Peptidsyntheseverfahren hergestellt worden, insbesondere denjenigen, die im vorstehenden Stand der Technik und in der französischen Anmeldung Nr. 90 01965 vom 19. Februar 1990 der Anmelderin beschrieben sind.
  • Die Tabelle I bestätigt, daß zur Identifikation der Candida albicans-Stämme die geeigneten erfindungsgemäßen Substrate ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Verbindungen der Formel
  • R-A&sub1;-Ra (Ii)
  • wobei R, A&sub1; und Ra wie vorstehend beschrieben definiert sind (insbesondere H-L-Pro-pNA und H-L-Hyp-pNA), und den Verbindungen der Formeln:
  • H-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,
  • Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,
  • H-L-4Hyp-L-Pro-L-Arg-pNA,
  • Boc-L-4Hyp-L-Pro-L-Arg-pNA und ihren Additionssalzen.
  • Es stellt sich heraus, daß die Substrate der Formel I&sub1;, die als Aminosäure A&sub1; einen L-Arg-, L-Trp-, L-Val-, L-Hisoder L-Cys-Rest tragen und die von den Candida albicans-Stämmen hydrolisiert werden, gewöhnlich ebenso von mehr als 90% der T. glabrata-, C. krusei- und C. tropicalis-Stämme (die pathogen sein können) hydrolisiert werden. Dagegen wurde erfindungsgemäß beobachtet, daß die Substrate der Formel I&sub1;, worin A&sub1; L-Pro oder L-Hyp und R H ist, für C. alticans spezifischer sind, weil sie nur durch C. guillermondii, C. parapsilosisl C. zeylanoides und Tr. cutaneum (die wenig pathogen oder nicht pathogen sind) hydrolisiert werden.
  • Durch Zugabe von Inhibitoren zu dem Substrat wird erfindungsgemäß die Spezifität des Identifikationsverfahrens bestätigt. Insbesondere hemmt Cycloheximid in dem Kulturmedium, das das Candida albicans-Substrat enthält, das Wachstum aller Hefen, die zur Candida- und Torulopsis-Gruppe gehören und die mit der Spezifität des Candida albicans-Substrates interferieren. Einige Candida zeylanoides-Stämme, die nicht durch Cycloheximid gehemmt werden, können selektiv durch die Verwendung von Maltose anstelle von Glucose als Kohlenstoffquelle gehemmt werden, um die Identifikation von Candida albicans zu gewährleisten.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Identifikationsverfahrens wird ein Nährmedium angeimpft, das einerseits eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Spurenelemente und andererseits einen Inhibitor enthält. Vorteilhafterweise ist das Anzuchtmedium ein festes Medium (Agar), auch wenn das Anzuchtmedium in dem vorstehenden Patent US-A-4 874 695 flüssig ist.
  • Als Inhibitor wird ein Gemisch aus einem Bakterizid und einem Fungizid empfohlen, nämlich einerseits Gentamycin und andererseits Cycloheximid, die in Gegenwart eines spezifischen erfindungsgemäßen Substrates, wie H-L-Pro-pNA, nur die Hydrolyse durch Candida albicans erlauben, um Kontaminanten zu beseitigen oder die Stämme zu selektionieren, die man identifizieren möchte. Anders gesagt, hemmt die Gegenwart von Cycloheximid das Wachstum von Hefen, die insbesondere Torulopsis und andere Candida umfassen, die die Bestimmung von Candida albicans stören.
  • Das Kulturmedium kann ebenfalls einen Farbstoff, insbesondere Rhodamin (Rhodamin 6G oder Rhodamin B), in der Endkonzentration 0,001-0,005 g/l oder einen Oxidoreduktionsfarbstoff, insbesondere ein Tetrazoliumsalz (Tetrazohumrot (TTC) oder auch Tetrazoliumblau], in der Konzentration 0,05-0,9 g/l enthalten.
  • Die Farbstoffe wirken als Hemmstoffe der Kultur bestimmter Candida-Spezies. Insbesondere Rhodamin und insbesondere Rhodamin 6G hemmt das Wachstum von C. tropicalis, und das Tetrazoliumsalz wird von den T. glabrata- und C. krusei-Stämmen nicht reduziert.
  • Die Stickstoffquelle ist vorteilhafterweise ein natürliches oder synthetisches Pepton. Erfindungsgemäß gehören dazu insbesondere die mit den Handelsbezeichnungen "YEAST NITROGEN BASE" (YNB), Bezugsnr. 0392, NEOPEPTONE, Bezugsnr. 0119, PRO- TEOSE PEPTONE, Bezugsnr. 0122, BACTO PEPTONE, Bezugsnr. 0118 (geliefert von der Fa. DIFCO), und der Hefeextrakt, Bezugsnr. 64341 (geliefert vom Pasteur-Institut) vertriebenen Produkte. Das Pepton wird in der Konzentration von 4 bis 15 g/l und vorzugsweise der Konzentration von 10 g/l eingesetzt.
  • Die Kohlenstoffquelle besteht aus einem Zucker, insbesondere Glucose oder Maltose, in der Konzentration von 10 bis 40 g/1. Wie oben beschrieben, hat Maltose den Vorteil, daß sie das Wachstum von Candida albicans-Stämmen erlaubt und das der Candida zeylanoides-Stämme hemmt.
  • Das Kulturmedium kann vorteilhafterweise fest sein und enthält zu diesem Zweck 10 bis 30 g/1 Agar. Dazu gehören beispielsweise die unter den Bezeichnungen BACTO AGAR, Bezugsnr. 0140, CORN MEAL AGAR, Bezugsnr. 0386, BITEK AGAR, Bezugsnr. 0138 (geliefert von der Fa. DIFCO) vertriebenen Produkte.
  • Das Kulturmedium kann bei pH-Wert 4,5, pH-Wert 5,0-5,5 und besser pH-Wert 6,0 (0,1 M Acetatpuffer) oder pH-Wert 8, (0,1 M Tris-Puffer) gepuffert sein. Da sich die Candida guillermondii-Stämme bei einem pH-Wert über oder gleich 6 und besser in einem alkalischen Medium vermehren, kann man eine eventuelle c. guillermondii-Störung bei der Bestimmung von C. albicans verhindern, indem man die isolierten oder nicht isolierten C. albicans-Stämme bei einem pH-Wert von 4,5-5 kultiviert, da die C. albicans-Stämme gewöhnlich in sauren Medien mit einem pH-Wert von 4,5-5 beständig sind. Erfindungsgemäß braucht man sich um diese Störung nicht zu kümmern, wenn man die Entwicklung von Hefen, die von C. albicans verschieden sind, mittels Cycloheximid hemmt. In Gegenwart von Cycloheximid reicht es aus, bei einem pH-Wert von 6,0 oder 8,0 zu arbeiten.
  • Die beste Art zur Durchführung der Erfindung besteht aus:
  • (1) Herstellen eines festen Kulturmediums durch Zugabe von Pepton (10 g/l), Zucker (10 bis 40 g/l), Agar (10 bis 30 g/l) zu 980 ml Puffer, Homogenisieren des erhaltenen Gemisches bei RT, Sterilisieren des Gemisches (insbesondere 0,25 Std. bei 120-125ºC), Aufbewahren des Gemisches während weniger als 4 Std. bei 45-50ºC nach der Sterilisation, Zugabe einer Substratzusammensetzung in Puffermedium, die vorher über eine Filtrationsmembran sterilisiert worden ist, wobei die Konzentration des Substrates zwischen 0,5 und 2 mM liegt und vorzugsweise gleich 1 mM ist (beispielsweise eine Endkonzentration von 0,35 g Substrat H-L-Pro-pNA pro Liter Agar), Zugabe von Gentamycin (a) und Cycloheximid (d) und gegebenenfalls anderer Inhibitoren (b, c oder e), die zuvor in folgenden Mengen sterilfiltriert wurden:
  • (a) gepufferte Gentamycin-Lösung (in der Endkonzentration 0,03-0,06 g, vorzugsweise 0,05 g pro Liter Agar),
  • (b) gepufferte Tetrazoliumsalz-Lösung (vorzugsweise TTC, in der Endkonzentration von 0,1 g pro Liter Agar),
  • (c) Chloramphenicol-Lösung (in der Endkonzentration von 0,25 g pro Liter Agar),
  • (d) Cycloheximid-Lösung (in der Endkonzentration von 0,1-0,5 g, vorzugsweise 0,5 g pro Liter Agar), (e) Rhodamin 6G-Lösung (in der Endkonzentration von 0,001-0,003 g pro Liter Agar),
  • Einteilen des erhaltenen Gemisches in eine für die Dosierung geeignete Form (Petrischalen, Röhrchen, Streifen oder andere), Abkühlenlassen des konditionierten Gemisches während mindestens 0,25 Std. bei 20-25ºC in einer sterilen Atmosphäre; das so erhaltene Produkt wird bei 12-15ºC unter Lichtabschluß aufbewahrt, es kann in geeignete Beutel oder Taschen, insbesondere aus Kunststoff, gelegt werden, um Verdunstung vollständig zu verhindern;
  • (2) Animpfen des so konditionierten Kulturmediums mit einer Kolonie des isolierten Stammes oder einem Gemisch zu untersuchender Stämme (das Animpfen kann durch Beschichtung, durch Aufstreichen und auch durch Plattieren durchgeführt werden), wobei die Kolonie in destilliertem Wasser oder physiologischem Serum emulgiert ist;
  • (3) Inkubieren des Kulturmediums bei einer Temperatur zwischen RT und 40ºC (vorzugsweise bei 37ºC) während mindestens 18 Std., einem pH-Wert über oder gleich 4,5 und besser zwischen 6,0 bis 8,0;
  • (4) optische Beobachtung der erhaltenen Reaktion.
  • Die Inkubation dauert gewöhnlich weniger als 48 Std. Vorzugsweise wird die Inkubation bei 37ºC in einem festen Agarmedium während 20-30 Std., und besser während 24 Std. durchgeführt.
  • Durch Beobachten des Stadiums (3) kann die Anwesenheit oder Abwesenheit einer positiven Reaktion bewertet werden, wobei die positive Reaktion insbesondere gekennzeichnet ist durch:
  • - eine mit bloßem Auge sichtbare Gelbfärbung aufgrund der Freisetzung des erfindungsgemäß bevorzugten chromogenen Restes H-pNA (oder eine orange Färbung aufgrund der Anwesenheit von Rhodamin), und
  • - das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Rose- oder Violettönung des Mediums durch die Art Candida aufgrund der Reduktion von TTC.
  • Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele und Vergleichsexpenmente besser verstanden. Diese gesamten Bestandteile sind in keiner Weise beschränkend, sondern werden zur Veranschaulichung gegeben.
    • BEISPIEL 1
  • Nach der 0. g. besten Art der Durchführung wird ein Kulturmedium hergestellt, das die nachstehenden Inhaltsstoffe enthält, nachstehend Agar 1 genannt, und bei pH-Wert 6,0 gepuffert ist.
    • BEISPIEL 2
  • Nach der 0. g. besten Art der Durchführung wird ein Kulturmedium hergestellt, das die nachstehenden Inhaltsstoffe enthält, nachstehend als Agar 2 bezeichnet, und bei pH-Wert 6,0 gepuffert ist.
    • BEISPIEL 3
  • Nach der 0. g. besten Art der Durchführung wird ein Kulturmedium hergestellt, das die nachstehenden Inhaltsstoffe enthält, nachstehend als Agar 3 bezeichnet, und bei pH-Wert 6,0 gepuffert ist.
    • BEISPIEL 4
  • Nach der o. g. besten Art der Durchführung wird ein Kulturmedium hergestellt, das die nachstehenden Inhaltsstoffe enthält, nachstehend als Agar 4 bezeichnet, und bei pH 6, gepuffert ist.
    • BEISPIEL 5
  • Nach der o. g. besten Art der Durchführung wird ein Kulturmedium hergestellt, das die nachstehenden Inhaltsstoffe enthält, nachstehend als Agar 5 bezeichnet, und bei pH-Wert 6,0 gepuffert ist.
    • BEISPIEL 6
  • In den Medien der Beispiele 1 bis 5 wurden zahlreiche isolierte C. albicans-, C. tropicalis-, C. krusei-, C. guillermondii-, C. pseudotropicalis-, C. parapsilosis-, C. zeylanoides-, T. glabrata- und Trichosporon cutaneum-Stämme angeimpft und inkubiert. Es wurde festgestellt, daß mit dem Substrat H-Pro-pNA,AcOH, Agar 5 für Candida albicans-Stämme am besten geeignet ist. Ein Teil der erhaltenen Ergebnisse ist in der nachstehenden Tabelle VI aufgeführt, in der die Spalte TTC Ergebnisse von Versuchen angibt, die getrennt in einem Standard-Agarmedium, das TTC enthielt, durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse zeigen den Vorteil der Verwendung von Cycloheximid, um das Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH für Candida albicans-Stämme spezifisch zu machen.
    • BEISPIEL 7
  • In den Medien des Beispiels 2 [das entweder das Substrat des Standes der Technik N-Ac-β-D-Galactosaminid-PNP oder die Substrate H-L-Pro-pNA,AcOH (spezifisch für C. albicans), EM- L-Phg-L-Arg-pNA,AcOH (spezifisch für T. glabrata) und H-Gly- L-Pro-L-Arg-pNA,2AcOH (spezifisch für C. krusei) enthielt] und des Beispiels 5 (das das Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH enthielt) wurden zahlreiche isolierte c. albicans-, C. tropica lis-, C. krusei-, C. guillermondii- und T. glabrata-Stämme angeimpft und inkubiert.
  • Man stellte fest, daß die Substrate EM-L-Phg-L-ArgpNA,AcOH und H-Gly-L-Pro-pNA,AcOH von den C. tropicalis-Stämmen hydrolisiert werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII aufgeführt, in der die Spalte TTC Ergebnisse von Versuchen angibt, die getrennt in einem Standard-Agarmedium, das TTC enthielt, durchgeführt wurden. TABELLE VI CANDIDA-ALBICANS-DIAGNOSTIK (ausgehend von isolierten Kolonien) abgelesen bei t = 24 Std.
  • Anmerkungen:
  • (a) Anzahl der Stämme
  • (b) weiß oder schwach rosé in einem Fall
  • (c) weiß-rosé
  • (d) bei 4 untersuchten Stämmen gaben 3 ein - - Resultat und 1 ein +++ - Resultat
  • (1) Agar 2 mit Substrat N-Ac-β-D-Galactosaminid-PNP
  • (2) Agar 2 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH
  • (3) Agar 5 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH TABELLE VII DIAGNOSTIK DER WICHTIGSTEN CAADIDA-ARTEN (ausgehend von isolierten Kolonien) abgelesen bei t = 24 Std.
  • Anmerkungen:
  • (a) Anzahl der Stämme
  • (b) weiß-rosé
  • (c) Positives Ergebnis (++) für nur 1 von 9 getesteten Stämmen, negativ für die anderen
  • (1) Agar 2 mit Substrat N-Ac-β-D-Galactosaminid-PNP
  • (2) Agar 2 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH
  • (3) Agar 2 mit Substrat EM-L-Phg-L-Arg-pNA,AcOH, spezifisch für T. glabrata
  • (4) Agar 2 mit Substrat H-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,2AcOH, spezifisch für C. krusei
  • (5) Agar 5 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH, und Cycloheximid
  • Die Ergebnisse der Tabelle VII zeigen, daß man in 24 Std. die vier hauptsächlichen Candida- und Torulopsis-Hefen identifizieren kann, die man in pathologischen Fällen antrifft.
    • BEISPIEL 8
  • In den Kulturmedien gemäß den Beispielen 1 bis 5, die das Substrat des Standes der Technik N-Ac-β-D-Galactosaminid- PNP oder das erfindungsgemäße Substrat H-Pro-pNA,AcOH enthielten, wurde ein Gemisch zahlreicher nicht isolierter C. albiancs-, C. tropicalis-, C. krusei-, C. guillermondii-, C. pseudotropicalis-, C. parapsilosis-, Cryptococcus neofformans- , Torulopsis glabrata- und Trichosporon cutaneum-Stämme angeimpft und inkubiert. Die Ergebnisse, die insbsondere mit Agar 2 und Agar 5 erhalten wurden, sind in der nachstehenden Tabelle VIII aufgeführt, in der die Spalte TTC die Ergebnisse von Versuchen angibt, die getrennt mit einem Standard-Agarmedium, das TTC enthielt, durchgeführt wurden.
    • BEISPIEL 9
  • Mit den Kulturmedien gemäß Beispiel 5, die das Substrat des Standes der Technik N-Ac-β-D-Galactosaminid-PNP oder das erfindungsgemäße Substrat H-Pro-pNA,AcOH enthielten, wurde ein Gemisch zahlreicher, nicht isolierter C. albicans-, C. tropicalis-, C. krusei-, C. guillermondii, C. pseudotropicaus-, C. parapsilosis-, C. zeylanoides-, C. ciferii-, C. cerevisiae-, Torulopsis glabrata- und Trichosporon cutaneum- Stämme angeimpft und inkubiert. Die mit Agar 5 erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX aufgeführt, die den Vorteil der Verwendung des Inhibitors, in dem Fall Cycloheximid, in Verbindung mit Maltose zeigt und in der die Spalte TTC die Ergebnisse von Versuchen angibt, die getrennt in einem Standard-Agarmedium, das TTC enthielt, durchgeführt wurden. TABELLE VIII CANDIDA-ALBICANS -DIAGNOSTIK (ausgehend von nicht isolierten Kolonien) abgelesen bei t = 24 Std. (Gesamtanzahl der Stämme: 35)
  • Anmerkungen:
  • (a) Anzahl der Stämme
  • (b) weiß-malvenfarbig
  • (c) keine Kultur, nur in 1 Fall eine schwache Kultur
  • (d) weiß-rosé
  • (e) Ergebnis - für 1 Stamm und Ergebnis +++ für den anderen Stamm
  • (1) Agar 2 mit Substrat N-Ac-β-D-Galactosaminid-PNP
  • (2) Agar 2 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH
  • (3) Agar 5 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH TABELLE IX CANDIDA-ALBICANS -DIAGNOSTIK (ausgehend von nicht isolierten Kolonien und in Anwesenheit von Cycloheximid) abgelesen bei t = 24 Std. (Gesamtanzahl der Stämme)
  • Anmerkungen:
  • (a) Anzahl der Stämme
  • (b) 87 Stämme rose, 2 Stämme malvenfarbig
  • (c) 2 unter 89 Stämmen negativ
  • (d) rosé-malvenfarbig
  • (1) Agar 5 mit Substrat N-Ac-β-D-Galactosaminid-PNP
  • (2) Agar 5 mit Substrat H-L-Pro-pNA,AcOH

Claims (6)

1. Verfähren zur Identifizierung von Candida albicans- Stämmen unter anderen, verwandten Stämmen, die pathogen sein können und der Gruppe aus Candida und Torulopsis angehören, wobei das Verfähren, das ein chromogenes Substrat und einen Hemmstoff verwendet und das nicht die Isolation der zu identifizierenden Stämme beinhaltet, dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Schritte umfäßt:
(a) In-Kontakt-bringen einer Probe von zu identifizierenden Stämmen mit einem Nährmedium, umfässend (i) eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle sowie gegebenenfälls Spurenelemente, (ä) ein chromogenes Substrat, das gegenüber mindestens einem Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Aminoamidasen und Aminopeptidasen, empfindlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
(α) H-L-Pro-pNA,
(β) H-L-Hyp-pNA,
(γ) H-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,
(δ) Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA,
(ε) H-L-4Hyp-I-Pro-L-Arg-pNA,
(ξ) Boc-L-4Hyp-L-Pro-L-Arg-pNA sowie
(η) deren Additionssalzen,
und (iii) einen Hemmstoff, der aus einem Gentamycin/Cycloheximid-Gemisch besteht, und
(b) Inkubieren, gefolgt von Beobachten der Kinetik der Spaltung des Substrats wahrend mindestens 1 Std. anhand der Farbentstehung, die durch die Spaltung hervorgerufen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Inkubation in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert größer oder gleich 4,5 und stärker bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0, gefolgt von Beobachten der Kinetik der Spaltung des Substrats während mindestens 1 Std..
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Inkubation in einem festen Gelmedium bei einem pH-Wert größer oder gleich 4,5 und stärker bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0, gefolgt von Beobachten der Kinetik der Spaltung des Substrats während mindestens 12 Std..
4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium fest ist und enthält:
(1) 4 bis 15 g/l pepton,
(2) 10 bis 40 g/l Glueose oder Maltose,
(3) 10 bis 30 g/l Agar,
(4) 0,5 bis 2 mM chromogenes Substrat.
5. Verfähren nach Anspmch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultrmedium außerdem enthält:
(5) 0,03 bis 0,06 g/l Gentamycin und
(6) 0,1 bis 0,5 g/l Cycloheximid.
6. Verfähren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation bei einer Temperatur, umfässend zwischen 15ºC und 40ºC, durchgeführt wird.
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