DE69008173T2

DE69008173T2 - Hämoglobinzusammensetzung und ihre verwendung.

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Publication number: DE69008173T2
Application number: DE69008173T
Authority: DE
Inventors: Joachim Cornelis Bakker; Wilhelmus Antonius Mar Berbers; Petrus Theodorus Mari Biessels; Willem Karel Bleeker
Original assignee: Nederlanden Staat
Current assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 1989-05-10
Filing date: 1990-05-09
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: DK0475971T3; ATE104150T1; CA2060205A1; WO1990013309A1; DE69008173D1; ES2055432T3; EP0475971A1; NL8901174A; EP0475971B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Hämoglobinlösungen finden potentielle Anwendung bei (verwundeten) Menschen als Sauerstoff-tragende Plasmaexpander in solchen Situationen, in denen die Auffüllung des Gefäßsystems und die Sauerstofftransportfähigkeit des Bluts unzureichend sind. Der Voreil gegenüber Erythrozyten oder Blut ist, daß die Lösungen universell einsetzbar sind, ohne daß auf die Blutgruppentypen Rücksicht genommen werden muß. Ein zweiter Vorteil ist, daß die Hämoglobinlösungen eine längere Lagerbeständigkeit haben. Zu diesem Zweck ist es jedoch erforderlich, Hämoglobin aus Erythrozyten auf eine solche Weise herzustellen und zu modifizieren, daß die drei Hauptprobleme von Hämoglobinlösungen minimiert werden. Diese drei Probleme sind:
1) das Vorliegen von Ruckständen von Membranfragmenten (Stroma), die von Erythrozyten herrühren,
2) die hohe intrinsische Sauerstoffaffinität außerhalb der Umgebung des Erythrozyten und
3) die kurze Retentionszeit im Kreislauf, da (dissoziiertes) Hämoglobin aufgrund von Ausscheidung durch die Nieren schnell aus dem Gefäßsystem verschwindet.
Zu 1) Schon im Jahre 1967 beschrieb Rabiner eine Präparation von Hämoglobinlösungen, bei der Stroma durch Filtration und Zentrifugation entfernt wurde, so daß zuvor beobachtete Koagulationsprobleme in den Nieren von Hunden vermieden werden konnten (J. Expl. Med. 126, 1127 - 1142 (1967)). Dieses Verfahren zur Entfernung von Stroma erwies sich später als unzureichend, um alle Nebenwirkungen zu verhindern.
Zu 2) 1972 beschrieben Benesch et al. (Biochemistry 11, 3576-3582 (1972)), daß eine deutliche Abnahme der Sauerstoffaffinität erzielt werden kann, indem man Pyridoxal-5-phosphat (PLP) kovalent an Hämoglobin bindet. Diese permanente Bindung verhindert, daß PLP das freie Hämoglobin verläßt, das in den Kreislaufinfundiert wurde, wie es bei 2,3-Di-phosphoglycerat (2,3-DPG) der Fall wäre. PLP kann an verschiedenen Stellen an eine der β- Globinketten im 2,3-DPG-Bindungshohlraum gebunden werden.
Zu 3) Durch Polymerisation von Hämoglobin kann die Retentionszeit im Kreislauf verlängert werden. Dies wird von Mazur et al. (US-Patent 3 925 344 (1975)) mit (M)ethylglutarimidat, (M)ethylsuccinimidat und (M)ethylsuberimidat etc. und von Bonsen et al. (US-Patente 4 001 200, 4 001 401, 4 053 590 und 4 061 736 (1977)) unter anderem mit verschiedenen Dialdehyden, insbesondere Glutaraldehyd, beschrieben. Ein Problem dieser Hämoglobinmodifikationen ist, daß die Sauerstoffaffinität wesentlich zunimmt, so daß die Sauerstoffabgabe in vivo an die Gewebe nicht optimal sein kann. Durch Kopplung von Hämoglobin an PLP und Polymerisation von Hämoglobin mit Glutaraldehyd erhielten Bonhard et al. (US-Patente 4 136 093 und 4 336 248 (1979)) eine (nur geringe) Verbesserung der Sauerstoffaffinität in Kombination mit einer verlängerten Retentionszeit. Rausch et al. (WO 88/03408) beschreiben die Polymerisation von Rinderhämoglobin, mit dem eine lange Zirkulationszeit bei Testtieren gezeigt wurde. Der Unterschied in der Spezies wird jedoch der Anwendung beim Menschen im Wege stehen.
Trotz all dieser Verbesserungen ging man noch nicht zur klinischen Anwendung über, da die Verabreichung von kleinen Mengen Hämoglobinlösung an gesunde Freiwillige toxische Wirkungen zeigte (Savitsky et al., Clin. Pharmacol. Ther. 23, 73 - 90 (1978)). Vor kurzem jedoch verabreichte die Gruppe von Moss eine vergleichbare Dosis an gesunde Freiwillige, wobei keine Nebenwirkungen beobachtet wurden. Die damals verwendete Hämoglobinlösung war ein Polymerisationsprodukt von HbPLP, die dem Produkt nach Bonhard analog, jedoch verbessert war, wie in WO 87/07832 (Sehgal et al.) beschrieben wurde. Nach diesem Patent muß unumgewandeltes Hämoglobin aus der Polymerisationsmischung entfernt werden (um negative Wirkungen auf die Nierenfunktion zu verhindern), was durch Ultrafiltration, Gelfiltration und Affinitäts-Chromatographie erreicht wird.
Eine weitere Methode zur Verlängerung der Retentionszeit im Kreislauf und zur Herabsetzung der Sauerstoffaffinität ist intramolekulare Vernetzung. So wird Dissoziation des tetrameren Hb in Dimere und Austritt durch die Nieren verhindert. Daß die Vernetzung der β-Ketten die Retentionszeit verlängert, wurde zuerst von Bunn et al. mit Bis(N-maleidomethyl)ether gezeigt (J. Exp. Med. 129, 909-934 (1969)). Diese Modifikation führte jedoch zu einer beträchtlichen Erhöhung der Sauerstoffaffinität. Bakker et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 180, 345 - 356 (1985)) zeigten, daß durch Kopplung mit 2-Nor-2-formylpyridoxal-5-phosphat (NFPLP; siehe Formel I des Formelblatts), wie beschrieben von Benesch et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 1123 - 1129 (1975)), sowohl eine längere Retentionszeit wie auch eine niedrigere Sauerstoffaffinität realisiert werden. Walder et al. verwenden Diaspirin-Verbindungen zur Kopplung der α-Globinketten (US-Patente 4 598 604 und 4 600 531 (1986)). Die Sauerstoffaffinität ihrer Kopplungsprodukte ist gleich der von Erythrozyten und die Retentionszeit im Kreislauf wird um den Faktor 3 verlängert. Bucci et al. (US-Patent 4 584 130 (1986)) koppeln Hämoglobin intramolekular an negativ geladene organische Reagenzien. Kavanaugh et al. verwenden das bifunktionale Reagens 4,4'- Diisothiocyanostilben-2,2'-disulfonat (Biochemistry 27, 1804 - 1808 (1988)). Ihr Kopplungsprodukt hat eine physiologische Sauerstoffaffinität, wird jedoch in niedriger Ausbeute erhalten.
Die der physiologischen Situation nächstkommende Modifikation ist die Kopplung mit NFPLP oder später erwähnten analogen Verbindungen. Dies führte zur Kopplung der β-Ketten durch Valin-1 der ersten β-Kette und Lysin-87 der zweiten β-Kette (Arnone et al., J. Mol. Biol. 115, 627 - 642 (1977)). Das NFPLP wird kovalent gebunden und liegt permanent an der Stelle vor, an der 2,3-DPG in den Erythrozyten die Sauerstoffaffinität beeinflußt. Diese β- Kettenkopplung wurde zuerst von Benesch et al. 1975 beschrieben und weiter von Van der Plas et al. ausgearbeitet (J. Lab. Clin. Med. 108, 253 - 260 (1986), Transfusion 27, 425 - 430 (1987), Transfusion 28, 525 - 530 (1988)). Sie fanden eine wesentlich herabgesetzte Sauerstoffaffinität, die eine geeignete Sauerstoff-Freisetzung unter den häufigsten Bedingungen garantiert. Die Retentionszeit im Kreislauf wird um den Faktor 3 verlängert (Bleeker et al., J. Lab. Clin. Med. 108, 448 - 455 (1986)). Als Plasmaexpander mit Sauerstofftransportfähigkeit ist jedoch das vernetzte Hämoglobin (HbNFPLP) Gegenstand von Kritik aus den folgenden Gründen:
1. die Halbwertszeit im menschlichen Kreislauf wird etwa 8 h betragen, wohingegen 24 h wünschenswert wären und
2. die Sauerstofftransportkapazität kann nicht mehr als die Hälfte der von normalem Blut betragen, da das freie Hämoglobin im Hinblick auf den kolloid-osmotischen Druck nur in einer Konzentration von maximal 6 bis 7 g/100 ml im Kreislauf vorliegen kann.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß diese Probleme überwunden werden können, indem das HbNFPLP polymerisiert wird. Die Erfindung kombiniert eine große Anzahl der zuvor erwähnten Verbesserungen. Anstelle von NFPLP erwiesen sich Bis-pyridoxalpolyphosphat-Verbindungen der Formel 2 des Formelblatts, in denen R ein Sauerstoffatom, eine Orthophosphatgruppe eine Pyrophosphatgruppe, ein Diphosphatrest oder ein Diphosphonatrest ist, wie vor kurzem beschrieben von Benesch und Kwong (Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 9 14 (1988)) als Ausgangsmaterial für das beschriebene Polymerisationsprodukt verwendbar. Das erfindungsgemäß modifizierte Hämoglobin wird mit PolyHbXlβ abgekürzt wobei "Hb" Hämoglobin bezeichnet, "Xlβ" eine intramolekulare Vernetzung durch die β-Ketten angibt (z.B. durch NFPLP oder durch Bis-pyridoxalpolyphosphate) und "Poly" bedeutet, daß das intramolekular vernetzte Hämoglobin polymerisiert wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Produkt ist ein Blutersatz, der aus einer vernetzten, polymerisierten Human-Hämoglobinlösung besteht. Human-Hämoglobin ist ein Tetramer, das aus zwei identischen α-Polypeptidketten und zwei identischen β-Ketten, die miteinander nicht-kovalent gebunden sind, aufgebaut ist. Das Tetramer kann schnell in zwei α,β-Dimere dissoziieren. Die Dissoziation in α,α- und β,β-Dimere oder in α- und β-Monomere findet unter physiologischen Bedingungen nicht statt. Um diese Dissoziation in α,β- Dimere und somit den Austritt durch die Nieren zu verhindern, wird das Hämoglobin zunächst in solcher Weise modifiziert, daß es eine kovalente intramolekulare Vernetzung zwischen den β-Ketten enthält. Die Modifikation wird mittels einer Reaktion von deoxygeniertem Hämoglobin mit einem wasserlöslichen bifunktionellen Reagens, wie dem zuvor erwähnten NFPLP oder einer der Bis-pyridoxalpolyphosphat-Verbindungen, ausgeführt. Nach Reinigung des so modifizierten Hämoglobins mit einer Ionenaustauschsäule zeigt es nicht nur eine erhöhte Retentionszeit im Kreislauf, sondern auch eine wesentlich verringerte Sauerstoffaffinität. Durch anschließende Polymerisation des modifizierten Hämoglobins wird die Sauerstoffaffinität noch einmal auf beinahe einen physiologischen Wert korrigiert. Außerdem steigt die Retentionszeit des vernetzten polymerisierten Hämoglobins (PolyHbXlβ) im Kreislauf wesentlich an. Die Polymerisation wird mit einem Polymerisations- Reagens, vorzugsweise Glutaraldehyd, bewirkt. Während dieses Verfahrens wird die Molekulargewichtsverteilung mittels Gelpermeations-Chromatographie analysiert. Die Abfolge der Schritte im Herstellungsverfahren wird nun detaillierter diskutiert.
Das Ausgangsmaterial zur Herstellung der hier beschriebenen Erfindung ist frisches menschliches Blut, das bezüglich Hepatitis B und HIV gescreent wurde. Erythrozyten werden daraus durch Entfernung des Plasmas durch Zentrifugation isoliert, die Leukozyten werden durch Adsorption an einen Leukozytenfilter (Cellselect, NPBI) und die Thrombozyten durch Entfernung des "Buffycoat" isoliert, wonach die Erythrozyten dreimal mit 0,9 % NaCl gewaschen werden. Die gereinigten sterilen Erythrozyten sind das Ausgangsmaterial für das geeignete Verfahren, das insgesamt zwischen 2ºC und 10ºC ausgeführt wird, mit der Ausnahme der Kopplung, die bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Am Ende jedes Einzelschritts des Herstellungsverfahrens wird das modifizierte oder unmodifizierte Hämoglobin immer durch Filtration über einen sterilen 0,2 um-Filter (Millipore) sterilisiert.
Die Erythrozyten können durch Zugabe von mindestens dem doppelten Volumen destilliertem Wasser lysiert werden. Zur Abtrennung des Hämoglobins und der Reste von roten Zellen (Stroma) wird eine Kreuzfiltration in einem Pellicon-System (Millipore) angewandt. Vorzugsweise werden jedoch die Erythrozyten in einem ähnlichen Pellicon-Systen gegen eine hypotonische Phosphat-gepufferte Salz-Lösung dialysiert, was dazu führt, daß die roten Blutkörperchen in einem solchen Ausmaß anschwellen, daß das Hämoglobin nach außen treten kann. Da in diesem Verfahren die Erythrozyten im wesentlichen intakt bleiben, wird die so erhaltene Hämoglobinlösung weniger Zelltrümmer enthalten (Membranfragmente, Phospholipide).
Die Synthese der Reagenzien, die die spezifische intramolekulare Kopplung des Hämoglobins sicherstellen, ist ein organisch-chemisches Verfahren, das im Fall von NFPLP aus 5 Schritten besteht, wobei das Ausgangsmaterial Pyridoxalhydrochlorid ist. Im ersten Schritt wird das N-Atom dieses Moleküls oxidiert und im zweiten Schritt wird der Sauerstoff an die benachbarte Methylgruppe umgelagert. Im dritten Schritt wird der so erhaltene Alkohol zu einem Aldehyd oxidiert. Im vierten Schritt werden die zwei Aldehydgruppen mit Toluidin zum 2-Nor-2-formylpyridoxalbistoluidin gekoppelt. Dies ergibt einen Schutz der Aldehydgruppen im letzten fünften Syntheseschritt, der Phosphorylierung der Methylalkoholgruppe des Moleküls mit Polyphosphorsäure. Nach Abtrennung der Toluidingruppen durch Hydrolyse wird das resultierende NFPLP von anorganischen Phosphat mittels einer Kationenaustauschersäule abgetrennt.
Zur Synthese von Bispyridoxalpolyphosphaten wird zunächst das Tetrabutylammoniumsalz (TBA) von PLP mit Diphenylphosphochloridat (DPPC, Aldrich) umgesetzt. Zum Rohprodukt der Reaktion wird das TBA-Salz des gewünschten Phosphats zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf einer Anionenaustauschersäule (Dowex 1-X8) mit einem Gradienten von 0 bis 0,2 M LiCl in einer 0,01 molaren HCl-Lösung als Eluierungsmittel getrennt.
Das stromafreie Hämoglobin wird an NFPLP oder eine Bispyridoxalpolyphosphat-Verbindung einem Molverhältnis, das von 1:1 bis 1:2 variiert, gekoppelt. Die Kopplungsreaktion findet in einem Trishydrochloridpuffer mit einer Endkonzentration von etwa 0,1 M und einem pH von etwa 7,0 statt. Die Hämoglobinlösung wird zunächst vollständig von Sauerstoff befreit, was in einem rotierenden Kolben geschehen kann, in den Stickstoff oder ein anderes Inertgas eingeleitet wird. Vorzugsweise wird jedoch ein Gasaustauscher verwendet (Endotronics), wobei das Hämoglobin durch Schläuche, die im wesentlichen sauerstoffimpermeabel sind (Tygon) zirkuliert. Durch Zugabe eines Überschusses an Reduktionsmittel, vorzugsweise Natriumborhydrid (Merck) zur Kopplungsmischung, wird die Vernetzung irreversibel und die Bindung kovalent. Ein typisches Beispiel einer Analyse einer Kopplungsmischung mittels Ionenaustausch-Chromatographie (Mono Q, Pharmacia) wird in Fig. 1 a gezeigt. Das gekoppelte Hämoglobin wird im Pellicon-System gegen einen Trishydrochloridpuffer mit einer Konzentration von etwa 0,1 M und einem pH von etwa 8,3 zur Entfernung des Reagenzienüberschusses und um die richtigen Bedingungen für den nächsten Verfahrensschritt, die Reinigung, zu schaffen, dialysiert.
Das gekoppelte Hämoglobin (HbXlβ) wird durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Auf einer mit einem Anionenaustauscher vom tertiären Amintyp gefüllten Säule, vorzugsweise Diethylaminoethyl-A50, Diethylaminoethyl-Sephacel oder Diethylaminoethyl-Sepharose (Pharmacia) wird HbXlβ von ungekoppeltem Hämoglobin mittels eines linearen Salzgradienten, mit dem die Säule eluiert wird, abgetrennt. Der Salzgradient besteht aus einer steigenden Konzentration Natriumchlorid von 0 bis etwa 0,1 M im obigen Trispuffer mit einem pH von 8,3. Die Hämoglobindetektion wird spektrophotometrisch in einer Durchflußküvette durchgeführt. Das gereinigte HbXlβ wird separat vom anderen Eluat mittels eines automatisch kontrollierten Ventils (Pharmacia) gesammelt. Ein typisches Beispiel einer Analyse des gereinigten HbXlβ wird in Fig. 1 b gezeigt. Dieser Reinigungsschritt führt zu einem spezifischen Produkt in dem auch eine wesentliche Verringerung von möglicherweise toxischen Substanzen, wie beispielsweise Membranfragmenten der Erythrozyten, Endotoxinen und viralen Antigenen, soweit diese im stromafreien Hämoglobin vorliegen, erhalten wird.
Anschließend wird das gereinigte HbXlβ mit vorzugsweise Glutaraldehyd (Sigma) polymerisiert, was mittels eines Nierendialysefilters (Andante, Organon Tecknika) durchgeführt wird. Ein solcher Filter besteht aus einer großen Anzahl Hohlfasern, einer semipermeablen Membran, durch die kleine Moleküle, wie beispielsweise Wasser, Salze und auch Glutaraldehyd frei durchwandern können, was große Moleküle wie beispielsweise Hämoglobin nicht können. So wird es möglich, die Geschwindigkeit der Polymerisationsreaktion zu kontrollieren, da der Glutaraldehyd zum Hämoglobin allmählich und in kleinen Portionen zugegeben werden kann. Die Reaktionszeit und die Menge des zugesetzten Glutaraldehyds hängt von der Menge des HbXlβ und der gewünschten Molekulargewichtsverteilung des Endprodukts ab. Die Polymerisation führt zu einer Mischung von Produkten, die durch Gelpermeations- Chromatographie (Superose 12, Pharmacia) analysiert werden kann. Durch ein solches Analyseverfahren kann die Mischung in Monomere, Dimere, Trimere, Tetramere und Polymere aufgetrennt werden. Das Verhältnis dieser verschiedenen Polymere im Endprodukt hängt von der Reaktionszeit und Reaktionsgeschwindigkeit ab. So kann die Mischung in den folgenden Verhältnissen variieren (Prozent bezogen auf die Gesamtmenge): Polymere Tetra/Trimere Dimere Monomere
Schließlich wird die gesamte Mischung aus großen Polymeren bestehen, wenn die Reaktion nicht rechtzeitig gestoppt wird. Dies kann durch Zugabe eines Überschusses von Lysin zur Reaktionsmischung erreicht werden, so daß die immer noch vorliegenden freien Aldehydgruppen blockiert werden und die Polymerisation unterbrochen wird. Durch Zugabe eines Reduktionsmittels, vorzugsweise Natriumborhydrid, werden die Vernetzungen kovalent. So kann ein stabiles Endprodukt erhalten werden. Wenn der optimale Polymerisationsgrad des Endprodukts (PolyHbXlβ) bestimmt wird, muß die Retentionszeit im Kreislauf in Betracht gezogen werden, jedoch auch die Effekte der Polymerisation auf den kolloid-osmotischen Druck und die Viskosität des PolyHbXlβ. Bei einer gleichen Hb-Konzentration wird der kolloid-osmotische Druck mit einem zunehmenden Polymerisationsgrad abnehmen, jedoch die Viskosität wird zunehmen. Das Hämoglobin kann zu einer Mischung polymerisiert werden, von der 40 %, vorzugsweise mindestens 50 %, aus Di-, Tri- und Tetrameren bestehen. Bis zu 40 % des Hämoglobins können als Monomere vorliegen, doch liegt im wesentlichen kein dissoziierbares Monomer vor. Fig. 2 zeigt ein typisches Beispiel eines Gelfiltrationsmusters von PolyHbXlβ. Vom Endprodukt bestehen vorzugsweise 10 % aus Polymeren, 40 % aus Tetra/Trimeren, 20 % aus Dimeren und 30 % aus Monomeren. Ein solcher Polymerisationsgrad stellt sicher, daß die Retentionszeit von PolyHbXlβ im Kreislauf von Ratten um einen Faktor 7 im Vergleich zu unmodifiziertem Hämoglobin verlängert wird. Der kolloid-osmotische Druck wird dann auf einen solchen Wert reduziert, daß unter physiologischen Bedingungen eine Konzentration von 10 g/100 ml möglich ist und die Viskosität sich nur leicht auf einen Wert erhöht, der dem von Plasma vergleichbar ist (siehe Fig. 3 und 4). Das Molekulargewicht von monomerem Hb beträgt 68 kD; die verschiedenen Polymere sind Vielfache davon. Die Polymerfraktion wird mit dem Leervolumen der Säule eluiert, die routinemäßig für die Gelfiltrationsanalysen verwendet wird. Analysen auf Säulen mit einem anderen Trennbereich zeigten, daß das Molekulargewicht der Polymerfraktion von PolyHbXlβ im Bereich von 300 bis 600 kD liegt. Das durchschnittliche Molekulargewicht des Endprodukts kann vom Verhältnis der verschiedenen Polymere in PolyHbXlβ abgeleitet werden und wird ungefähr 160 bis 270 kD, insbesondere von 160 bis 220 kD betragen, obwohl das durchschnittliche Molekulargewicht von 140 bis 380 kD variieren kann. Infolgedessen hat das durchschnittliche Polymer in PolyHbXlβ eine Größe im Bereich von zwischen einem Dimer und einem Trimer. Die Monomerfraktion im Endprodukt beträgt 30 %, muß jedoch nicht davon entfernt werden, da das Hämoglobin intramolekular gekoppelt ist und daher nicht nephrotoxisch ist. Die Hämoglobin-Zusammensetzung der Erfindung kann eine iso-osmotische Hämoglobinkonzentration von mehr als 9 g/100 ml haben; eine relative Viskosität von unter 4, vorzugsweise unter 2,5; eine Sauerstoffaffinität, die einem p 50-Wert von 19 bis 24 mmHg entspricht; und kann die Form einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung oder die Form einer gefriergetrockneten Zusammensetzung annehmen.

Vorteile der Erfindung

Die hier beschriebene Erfindung hat die folgenden Vorteile über existierende Produkte.
1) Ein erster Vorteil betrifft das Zwischenprodukt HbXlβ. Dies wird durch spezifische Kopplung eines Aldehyds an beide β-Ketten von Hb erhalten. HbXlβ wird mit einer Ausbeute von mindestens 70 % gebildet und kann vom unumgesetzten nephrotoxischen Hb durch einen einzigen Reinigungsschritt mit einem Ionenaustauscher abgetrennt werden. Die Kopplung von Hb an PLP ergibt 4 bis 6 Produkte, von denen nur 25 % Hauptprodukt sind.
2) PolyHbXlβ ist eine Polymermischung, die auch nichtpolymerisiertes HbXlβ umfaßt. Ein wichtiger Vorteil ist, daß dieses nichtpolymerisierte HbXlβ nicht entfernt werden muß. Tatsächlich kann HbXlβ aufgrund der intramolekularen Vernetzung nicht in Dimere dissoziieren, so daß es nicht durch die Niere filtriert wird und z.B. keine Nephrotoxizität verursacht. Dies steht im Gegensatz zu z.B. PolyHbNFPLP, dessen nichtpolymerisiertes HbPLP nephrotoxisch ist, so daß es erforderlich ist, dies sorgfältig mittels komplizierter Reinigungsschritte zu entfernen. Diese Tatsache ermöglicht ein einfacheres Verfahren zur Herstellung von PolyHbNFPLP und infolgedessen einen höheren Wirkungsgrad.
3) Die Sauerstoffaffinität von PolyHbXlβ ist niedriger als die von PolyHbPLP (Sehgal), so daß in vivo eine bessere Sauerstoffabgabe möglich sein muß.
4) Die Präparation beginnt mit menschlichen Erythrozytensuspensionen, die von Leukozyten, Thrombozyten und Plasmaproteinen durch Filtration und Zentrifugation gereinigt sind, so daß eine Kontamination mit Metaboliten und anderen Substanzen aus diesen Fraktionen vermieden wird.
5) Die Entfernung des Stroma aus Hämoglobinlösungen wird mittels des Phospholipidgehalts und des Membranantigens Glycophorin-α gemessen. Der Phospholipidgehalt beträgt weniger als 4 um/g Hb (Erythrozyten: 9 mg/g Hb). Die Glycophorin-α-Menge beträgt weniger als 0,01 % derer, die in Erythrozyten vorliegt.
6) PolyHbXlβ kann im folgenden Verhältnis hergestellt werden: 30 % Monomer, 20 % Dimer, 40 % Tri/Tetramer und 10 % Polymer. Dann hat die benannte Lösung eine iso-onkotische Hämoglobinkonzentration von 10 g/100 ml und eine relative Viskosität von weniger als 2, bezogen auf Wasser. Für PolyHbPLP beschrieb Bonhard, daß ein Hämoglobingehalt von maximal 8 g/100 ml erreicht werden kann, wohingegen das Produkt von Sehgal bereits eine Viskosität von 3 cP bei 8 g/100 ml hat.
7) Der Zerfall von HbNFPLP ist bereits gut verstanden, was für die Bewertung von möglichen Nebenwirkungen wichtig ist. Es wurde gefunden, daß keine HbNFPLP-Akkumulation in Leber oder Nieren auftritt (Bleeker et al., J. Lab. Clin. Med. 113, 151 - 171 (1989)). Es wurde gezeigt, daß das Kopplungsmolekül NFPLP im wesentlichen im Urin und Stuhlgang innerhalb von 8 Tagen ausgeschieden wird.
8) Eine Anzahl von Maßnahmen und Schritten, die im Herstellungsverfahren durchgeführt werden, führen dazu, daß eine Kontamination mit Viren, wenn eine solche überhaupt vorliegen sollte, beinahe unmöglich ist: u.a. durch Untersuchung der Spender, Einsatz einer Leukozytenfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie der Kopplungsmischung.

Beispiele

Die Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, daß diese Beispiele nur zu erläuternden Zwecken gegeben werden und die Nacharbeitbarkeit der Erfindung beleuchten, jedoch in keiner Weise definitive Bedingungen der unterschiedlichen Schritte des Herstellungsverfahrens bedeuten und den gesamten Bereich der Erfindung abdecken. Alle Verfahrensschritte werden unter sterilen Bedingungen (GMP Standards) durchgeführt, und alle Produktionsschritte werden bei etwa 5ºC und unter Atmosphärendruck ausgeführt, mit der Ausnahme der Kopplungsreaktion, die bei Raumtemperatur ausgeführt wird.

Beispiel 1

PolyHbNFPLP

A. Herstellung einer stromafreien Hämoglobinlösung

Frisches menschliches Blut wird vom Plasma durch Zentrifugation, von Leukozyten durch einen Leukozytenfilter und von Thrombozyten durch Entfernung des Gerinnungshäutchens abgetrennt. Die Einheiten der roten Blutkörperchen werden 3mal in sterilen Plastikbeuteln mit 0,5 l 0,9 % NaCl gewaschen und 5 min bei 3200 Upm zentrifugiert. Die gewaschenen Erythrozyten ("gepackte Zellen") mit 8 Einheiten werden vereinigt und in 4 Volumina einer 0,1 molaren NaCl-Lösung, die mit 0,01 molarem Phosphat gepuffert war, suspendiert, was zu einer 6 bis 8 l Suspension mit einem Hämatokrit von 20 bis 30 % führte. In einem Pelliconsystem, das mit einer 0,45 um Cut- off HVLP-Kassette (Millipore) versehen ist, wird diese Suspension zunächst gegen etwa 5 l der Phosphat-gepufferten 0,1 molaren NaCl-Lösung und dann gegen eine Phosphat-gepufferte 0,05 molare NaCl-Lösung dialysiert. Wenn das Hämoglobin aus den Zellen auszutreten beginnt, wird das Filtrat gesammelt. Gewöhnlich werden etwa 15 bis 20 l Filtrat gesammelt und dann im selben Pellicon-System, das aber nun mit einer 10 000 Dalton Cut-off PTGC-Kassette versehen wird, konzentriert. Das Ultrafiltrat hat eine Hämoglobinkonzentration von 10 bis 20 g/100 ml und wird steril filtriert. Die Ausbeute an stromafreier Hämoglobinlösung beträgt 80 bis 90 % und der Methämoglobingehalt beträgt unter 1 %. Der Phospholipidgehalt in der Hämoglobinlösung liegt unter 4 ug/g Hb.

B. Synthese von NFPLP

Dies ist eine 5stufige Synthese, ausgehend von Pyridoxalhydrochlorid (Merck).

1. Synthese des N-Oxids.

a) 200 g Pyridoxalhydrochlorid werden in 2 l Ethanol (96 %) gelöst und gekocht. Nach 1 h Rückfluß wird die Lösung abgekühlt und 1 Äquivalent Natriumbicarbonat (84 g) vorsichtig zugegeben. Die Lösung wird 30 min unter Rückfluß gekocht. Der Salzniederschlag wird über "Celite-Hyflo-Super-Cel" (Hyflo, Merck) filtriert und mit einer kleinen Menge Ethanol (96 %) gespült. Die ethanolische Lösung wird für Reaktion b weiterverwendet.
b) Die Lösung des Pyridoxalethylacetals wird auf -30ºC mit CO&sub2;/Aceton gekühlt. Während 1/2 h wird eine Lösung von 345 g Metachloroperbenzoesäure (Aldrich) in 1 l Ethanol (-10ºC) unter Rühren zugegeben. Die leichtgelbe Reaktionsmischung wird 40 h bei -30ºC stehen gelassen. Das N-Oxid kristallisiert zu weißen Kristallen aus, wird filtriert und mit Ether gewaschen.

2. Umlagerung des N-Oxids

a) 35 g N-oxid und 100 g Trifluoressigsäureanhydrid (Aldrich) werden auf -30ºC gekühlt. Die Trifluoressigsäure wird langsam zum festen N-Oxid zugetropft und die Suspension 12 bis 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die dunkelrote Lösung mit 40 ml 2 molarer HCl hydrolysiert und 1 h unter Rückfluß gehalten.
b) Nach Eindampfen wird der Rückstand in einer kleinen Menge Methanol gelöst und Tetrahydrofuran (THF) zugesetzt bis die Lösung trübe wird. Die Kristallisation geschieht über Nacht bei -30ºC.

3. Oxidation mit Pyrolusit

In einer Mischung aus 50 ml Methanol und 200 ml THF werden 6 g des HCl-Salzes gelöst, 25 g aktiviertes Mangandioxid (Merck) zugesetzt und die Mischung 12 bis 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wird mit Dünnschichtchromatographie (DC, Merck) mit einem Laufmittel Chloroform/Methanol (95/5) mitverfolgt. Das Pyrolusit und das resultierende Manganchlorid werden über Hyflo abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Silicagel wird zum Filtrat zugesetzt und dann eingedampft. Das Silicagel wird mit nacheinander 800 ml Chloroform und 500 ml Chloroform/Methanol 97,5/2,5 eluiert. Die Lösung wird eingedampft.

4. Herstellung von 2-Nor-2-formylpyridoxalbistoluidin

In kochendem Wasser werden 4 g 2-Nor-2-formylpyridoxal zum freien Dialdehyd hydrolysiert. Die Reaktion wird durch DC mitverfolgt. Die Lösung wird langsam in eine Lösung von 6,6 g p-Toluidin (Merck) in 100 ml Methanol eingegossen und refluxiert, bis die Lösung trübe wird. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur läßt man die Lösung über Nacht bei 4ºC stehen. Der gebildete orange Niederschlag wird abfiltriert und mit kaltem, trockenem Ether gewaschen.

5. Phosphorylierung

Polyphosphorsäure (PPA) wird aus einer Mischung von 10 g P&sub2;O&sub5; und 13 g H&sub3;PO&sub4; hergestellt. 15 ml PPA werden zu 1,5 g Bistoluidin gegeben. Die Reaktionsmischung wird 1 h bei 60ºC unter Luftabschluß gerührt. Dann werden 7,5 ml 0,1 N HCl zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 15 min bei 60ºC gerührt. Die dunkelviolette Mischung wird auf eine Säule aufgebracht, die mit einem Kationenaustauscher gefüllt ist (Biorad 50Wx80; H-Form, 200 - 300 Mesh) und mit destilliertem Wasser eluiert. Das Eluat wird in 10 ml Fraktionen gesammelt.
Mit dem Molybdat-Test (W.C. Hulsman, Doktorarbeit 1958, Amsterdam) wird gemessen, welche Fraktionen freie Phosphorsäure enthalten. Die Fraktionen, die organisches Phosphat (A&sub4;&sub1;&sub5; in 1 M Phosphatpuffer (pH=7) in 1:100 Verdünnung > 0,1 Absorptionseinheiten) enthalten, werden vereinigt. Das NFPLP wird als Pool bei 4ºC im Dunkeln aufbewahrt.

C. Kopplung des NFPLPs an stromafreies Hämoglobin

Die stromafreie Hämoglobinlösung wird im Pellicon-System gegen 10 Volumina 0,1 molare Trishydrochloridlösung mit einem pH von 7,0 dialysiert. Gewöhnlich werden etwa 1 l des 10 g/100 ml Hämoglobins gekoppelt, doch das Volumen kann leicht in einen größeren Maßstab übertragen werden. Die Hämoglobinlösung mit einem pH, der von 6,9 bis 7,1 variiert, wird mittels eines Membrangasaustauschers, durch den Stickstoffgas mit einer Geschwindigkeit von 2 l/min durchgeleitet wird, von Sauerstoff befreit. Die Hämoglobinlösung wird durch den Gasaustauscher aus einem geschlossenen Reservoir mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min (Sarns Pumpe) gepumpt. Innerhalb von 1 h ist der Sauerstoff entfernt, was mittels einer Sauerstoffsättigungsmessung (unter 5 %, gemessen durch Multikomponentenanalyse auf einem Diodenarrayspektrophotometer (Hewlett-Packard)) mitverfolgt wird. Gewünschtenfalls kann das Hämoglobin auch in einem geschlossenen rotierenden Kolben mit einem Volumen von 10 l, in den Stickstoff eingeleitet wird, von Sauerstoff befreit werden. Dieses Verfahren ergibt dasselbe Ergebnis in Bezug auf den DeoxyHb-Gehalt, dauert jedoch 3- bis 5mal länger.
Zu der von Sauerstoff befreiten Hämoglobinlösung im Reservoir wird eine Sauerstoff befreite wäßrige NFPLP-Lösung langsam zugegeben. Das Molverhältnis bezüglich Hämoglobin kann von 1:1 bis 2:1 variieren. Meistens wird ein kleiner Überschuß an NFPLP zugegeben. Die Reaktionszeit beträgt mindestens 1 h. Dann wird ein 20facher Überschuß Natriumborhydrid zur Kopplungsmischung zugegeben. Das Natriumborhydrid wird in 30 bis 50 ml einer 0,001 molaren KOH-Lösung, die ebenfalls von Sauerstoff befreit wird, gelöst. Da auch Stickstoff in das Reservoir eingeleitet werden kann, verursacht die Gasbildung, die während der Reduktion auftritt, kein Problem und wird zusammen mit dem Stickstoff abgeleitet. Am Ende der Reaktion wird der Überschuß der Reagenzien durch Dialyse entfernt und die Kopplungsmischung durch Filtration sterilisiert. Die Maximalausbeute von gekoppeltem Hämoglobin beträgt 60 bis 70 %, was durch Integration der Peaks eines Chromatogramms, das bei einer FPLC-Analyse der Mischung in einer Ionenaustauschersäule erhalten wird (siehe Fig. 1a), bestimmt werden kann. Mit steigender Salzkonzentration werden erst Hb und dann HbNFPLP von der Säule eluiert.

D. Reinigung von HbNFPLP

Am Ende der Reaktion wird die Kopplungsmischung gegen 10 Volumina des Ausgangspuffers der Ionenaustausch-Chromatographie, einem 0,1 molaren Trishydrochloridpuffer mit einem pH von 8,3, dialysiert. Eine Säule von 25 bis 5 cm wird mit Diethylaminoethyl-Sephacel in Ausgangspffer gefüllt und mit mindestens 5 Säulenvolumina dieses Ausgangspuffers mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min (Cenco-Pumpe) eluiert. Anschließend werden 200 ml der Kopplungsmischung mit maximal 10 g/100 ml auf die Säule aufgebracht und dann mit mindestens einem Säulenvolumen Ausgangspuffer eluiert. Die Säule wird dann mit einem Gradienten von 0 bis 0,1 molarer NaCl in etwa 3 l Ausgangspuffer eluiert. Eine Analyse der verschiedenen Fraktionen findet spektrophotometrisch mittels einer Durchflußküvette bei 540 nm statt. Die verschiedenen Fraktionen (ungekoppeltes Hb und HbNFPLP) können mittels eines automatisch kontrollierten Ventils abgesondert vom anderen Eluat gesammelt werden. Das gereinigte HbNFPLP wird in einem Pellicon-System (PTGC-Kassette) konzentriert und durch Filtration sterilisiert. Analyse des gereinigten Produkts findet durch FPLC Ionenaustausch-Chromatographie statt (siehe Fig. 1b). Mehr als 95 % des so erhaltenen HbNFPLPs ist rein. Nach dieser Säulenreinigung beträgt die Ausbeute an HbNFPLP 40 bis 50 % der Kopplungsmischung, was 70 bis 80 % des gekoppelten Produkts entspricht.

E. Polymerisation von HbNFPLP

Das gereinigte HbNFPLP wird mittels eines Nieren-Dialysefilters polymerisiert. Die NFPLP-Lösung wird durch die künstliche Niere aus einem Tank mit einer Geschwindigkeit von 0,3 l/min durchgepumpt, während als Dialysat Phosphat-gepufferte NaCl-Lösung (PBS) mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min zirkuliert (Sarns Pumpen). Zum Dialysat werden schrittweise immer wieder 1 ml 25 % Glutaraldehyd zugesetzt und die Geschwindigkeit der Polymerisationsreaktion mittels Gelfiltrationsanalysen mitverfolgt. Die Glutaraldehydmenge, die erforderlich ist, um einen bestimmten Polymerisationsgrad zu erhalten, hängt von der Menge und Konzentration der eingesetzten HbNFPLP-Lösung ab. Ein typisches Beispiel einer Gelfiltrationsanalyse eines Endprodukts wird in Fig. 2 gezeigt. In diesem Fall besteht das Endprodukt aus 10 % Polymer, 40 % Tetra/Trimer, 20 % Dimer und 30 % Monomer, was das gewünschte Verhältnis ist, doch im Prinzip hängt der Polymerisationgrad von der Reaktionszeit ab. Ausgehend von 0,5 l einer 5 g/100 ml HbNFPLP-Lösung sind mindestens 5 ml 25 % Glutaraldehyd erforderlich, um ein solches Endstadium, wie es in Fig. 2 gezeigt wird, innerhalb einer vernünftigen Zeit (ein paar Stunden) zu erreichen. Pro 1 Mol Hämoglobin werden mindestens 8 Mol Glutaraldehyd zugegeben. Die Reaktion kann abgebrochen werden, indem man dem Reservoir einen 10fachen Überschuß bezogen auf Glutaraldehyd, einer 1 molaren Lysinlösung mit einem pH von etwa 7,0 zusetzt. Auch wird das Dialysat abgepumpt und durch neue PBS ersetzt. Dann wird die Dialyse einige Stunden fortgesetzt, und durch mehrmaliges Ersetzen des Dialysats kann das PolyHbNFPLP in einen beliebigen gewünschten Puffer eingebracht werden, für Austauschtransfusionen vorzugsweise in Nierendialysepuffer. Manchmal polymerisiert das so hergestellte PolyHbNFPLP in den folgenden Monaten langsam weiter, was vorzugsweise dadurch vermieden wird, daß man der Polymerisationsmischung, nachdem die Polymerisationreaktion mit Lysin abgebrochen wurde, auch eine Natriumborhydridmenge zugibt, die bezüglich Glutaraldehyd äquimolar ist, so daß ein stabiles Endprodukt erzeugt wird. Nach Dialyse kann das PolyHbNFPLP konzentriert und durch Filtration sterilisiert werden. Die Ausbeute der Polymerisationreaktion beträgt fast 100 % und der Methämoglobingehalt im Endprodukt liegt unter 5 % (Mehrkomponentenanalyse). Der Phospholipdidgehalt wird bestimmt, indem man die Phospholipide aus der PolyHbNFPLP-Lösung mittels Chloroform und Methanol extrahiert. Die Extrakt wird mit Perchlorsäure behandelt und das freigesetzte Phosphat bildet einen Komplex mit Ammoniummolybdat und Malachitgrün (Merck), dessen Absorption bei 630 nm gemessen wird. Der Gehalt im Endprodukt liegt unter 1 ug/g Hb, was eine Reduktion um einen Faktor 4 relativ zur stromafreien Hämoglobinlösung bedeutet. Die Menge an Glycophorin-α im Endprodukt liegt unter der Nachweisgrenze für dieses Erythrozytenmembranantigen (Radioimmunoassay mit monoklonalen Antikörper), was einen Wert von weniger als 0,01 % dessen bedeutet, der in Erythrozyten vorliegt. Der Endotoxingehalt wird durch den Limulus-Test bestimmt (Bleeker et al., in Progress in Clinical and Biological Research, Band 189, Bacterial Endotoxins, 293 - 302 (1985), Herausgeber ten Cate et al.) und liegt unter 2 EU/g Hb für PolyHbNFPLP.

F. Physiologische Charakterisierung von PolyHbNFPLP

Die Polymerisation beeinflußt einige Eigenschaften der Hämoglobinlösung die im Fall der Verwendung als Blutersatz wesentlich sind; den kolloid-osmotischen Druck, die Viskosität und die Sauerstoffaffinität.

1. Kolloid-osmotischer Druck

Wenn die Polymerisation weiter voranschreitet, nimmt der kolloid- osmotische Druck, der durch die Lösung verursacht werden kann, ab. Fig. 3a zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration und dem kolloid-osmotischen Druck für verschiedene Hämoglobinlösungen. Der kolloid-osmotische Druck wird mit einem Druckmesser (Statham P23Db) über einer Ultrafiltrationsmembran gemessen. Die Konzentration wird photometrisch bestimmt. Die horizontale gepunktete Linie zeigt den kolloid-osmotischen Druck von menschlichem Plasma an. So kann ersehen werden, daß die iso-onkotische Konzentration (d.h. die Konzentration, bei der die Lösung denselben kolloid-osmotischen Druck wie Plasma hat) von unmodifiziertem Hämoglobin (Hb) 7 g/100 ml beträgt. Durch Polymerisation wird die iso-onkotische Konzentration auf etwa 9 g/100 ml für PolyHbNFPLP ohne große Polymere und auf etwa 11 g/100 ml für PolyHbNFPLP, in dem 45 % größere Polymere gebildet sind, erhöht. Diese höhere iso-onkotische Konzentration bedeutet, daß während der Transfusion eine höhere Plasmakonzentration erhalten werden kann, ohne daß das Risiko der Überfüllung des Gefäßsystems besteht.

2. Viskosität

Fig. 3b zeigt die Beziehung zwischen Konzentration und Viskosität für dieselben Hämoglobinlösungen. Die relative Viskosität mit einem Ostwald- Viskosimeter gemessen. Dieser Graph zeigt die andere Seite der Polymerisation: den Anstieg der Viskosität. Bei einem niedrigen Polymerisationgrad (PolyHbNFPLP 0, 40, 20, 40) ist dieser Anstieg jedoch so niedrig, daß die relative Viskosität bei 9 g/100 ml 1,5 beträgt und daher noch unter der von Plasma liegt. Bei einem höheren Polymerisationsgrad (PolyHbNFPLP 45, 30, 10, 15) wurde eine relative Viskosität von 4 bei 11 g/100 ml gefunden, d.h. ein Wert gleich dem für vollständiges Blut. Dies bedeutet, daß die Viskosität von PolyHbNFPLP akzeptabel bleibt, wenn die Polymerisation nicht jenseits von 45 % Polymeren ausgeführt wird (Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 600 kD).

3. Sauerstoffaffinität

Die Sauerstoffbindenden Eigenschaften wurden mit einem Sauerstoff- Dissoziationskurvenanalysator (DCA, Radiometer) unter physiologischen Bedingungen von pH, pCO&sub2; und Temperatur untersucht. Fig. 4 zeigt die Messungen für unmodifiziertes Hämoglobin (Hb), HbNFPLP und PolyHbNFPLP. Der 50 % Sättigungspunkt, der p50 von PolyHbNFPLP, liegt bei einem pO&sub2; von 22 mmHg und ist somit im wesentlichen gleich dem p50 von vollständigem Blut (26 mmHg). Eine klare Verbesserung über die unmodifizierte Hämoglobinlösung (p50:14 mmHg) und MbNFPLP (p50:45 mmHg) trat auf.

G. In vivo Charakteristika von PolyHbNFPLP

1. Retentionszeit im Kreislauf

Die Retentionszeit im Kreislauf wurde bei Ratten nach Ersatz von 50 % des Bluts durch eine Hämoglobinlösung überprüft. Fig. 5 zeigt die Plasma- Verschwindungs-Kurve von PolyHbNFPLP mit 30 bis 40 % Polymeren im Vergleich zu der einer unmodifizierten Hämoglobinlösung (Hb) und einer Hämoglobinlösung, die nur durch intramolekulare Vernetzung mit NFPLP modifiziert war. Der Zeitpunkt, bei dem die Plasma-Konzentration halbiert war, (T50 %) liegt bei etwa 2 h für Hb. Intramolekulare Vernetzung verbessert den T50 % um einen Faktor von 3. Nach Polymerisation stieg die T50 % um einen Faktor 7 bezüglich Hb an. Im Hinblick auf Literaturergebnisse bei Forschungen mit verschiedenen Hämoglobinlösungen in verschiedenen Testtieren einschließlich Affen, wird eine Retentionszeit von mehr als 24 h für PolyHbNFPLP beim Menschen erwartet.

2. Nierentoxizität

Nach Ersatz von 50 % des Blutvolumens durch eine Hämoglobinlösung bei Ratten werden 40 % der verabreichten Dosis im Urin ausgeschieden. Histochemische Untersuchungen zeigen eine starke Akkumulation von Hämoglobin in den Nieren, ein klarer Indikator einer eingeschränkten Nierenfunktion. Nach intramolekularer Vernetzung der β-Ketten werden weniger als 5 % der Dosis im Urin ausgeschieden und histochemische Untersuchungen zeigen nur eine minimale Akkumulation von HbNFPLP. Das Auftreten einer Verschlechterung der Nierenfunktion, die durch HbXlβ verursacht wird, ist daher unwahrscheinlich. Nach einer Austauschtransfusion mit PolyHbNFPLP ist Hämoglobin weder im Urin detektierbar noch in den Nieren selbst. Somit ist eine Verschlechterung der Nierenfunktion, die durch intrarenale Niederschläge von PolyHbNFPLP verursacht wird, unmöglich.

Beispiel 2

PolyHb(BisPL)P&sub2;

Die Herstellung von PolyHb(BisPL)P&sub2; verläuft identisch zu der von PolyHbNFPLP, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme der Synthese des Kopplungsmoleküls. Die Charakteristika des Endprodukts (PolyHb(BisPL)P&sub2;) sind auch im wesentlichen identisch denen von PolyHbNFPLP. Die Synthese von (BisPL)P&sub2; verläuft wie folgt:
Nach Reaktion von 0,002 Mol PLP mit 0,0025 Molen DPPC werden 0,004 Mol PLP-TBA in 10 ml trockenem Pyridin dazu zugegeben. Nachdem die Reaktionsmischung eine Nacht stehen gelassen wurde, wird sie auf eine Ionenaustauschsäule aufgebracht und mit 0,01 molarer HCl eluiert. (BisPL)P&sub2; kommt von der Säule als erste Fraktion, gefolgt von PLP. Nach Neutralisation wird die Fraktion eingedampft; Ausbeute: 350 mg Produkt (30 %). UV- Spektrum: Maxima bei 294 und 335 nm in 0,1 molarer HCl, 330 (s) und 391 nm in Phosphatpuffer bei einem pH von 7, 308 und 391 nn in 0,1 molarer NaOH.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1

Chromatogramme, die mit einer Anionenaustauschsäule (Mono Q) erhalten wurden. Linkes Chromatogramm (Fig. 1a): Mischung aus Hb (linker Peak) und HbNFPLP (rechter Peak), erhalten nach der Kopplungsreaktion von Hb mit NFPLP. Rechtes Chromatogramm (Fig. 1b): Gereinigtes Hauptprodukt (HbNFPLP) aus der Kopplungsmischung.

Fig. 2

Polymerzusammensetzung von PolyHbNFPLP, bestimmt durch Gelfiltration über eine Superose 12-Säule. Das Eluierungsmuster zeigt die folgenden Peaks: I - Polymere, die größer als Tetramere sind, II - Tetramere, III - Trimere, IV - Dimere, V - Monomere.

Fig. 3

Oberer Graph (Fig. 3a): Beziehung zwischen Konzentration und kolloid- osmotischem Druck einer unmodifizierten Hämoglobinlösung (Hb) und drei unterschiedlich polymerisierten PolyHbNFPLP-Lösungen. Von den PolyHbNFPLP- Lösungen ist die Polymerzusammensetzung in Prozent angegeben (po: Polymere, t/t: Tetra/Trimere, di: Dimere, mo: Monomere). Die horizontale gepunktete Linie zeigt den kolloid-osmotischen Druck von menschlichem Plasma an.
Unterer Graph (Fig. 3b): Beziehung zwischen Konzentration und Viskosität der selben Hämoglobinlösungen.

Fig. 4

Sauerstoff-Dissoziationskurven gemessen unter physiologischen Bedingungen von pH, pCO&sub2; und Temperatur, einer unmodifizierten Hämoglobinlösung (Hb), HbNFPLP und PolyHbNFPLP.

Fig. 5

Plasma-Verschwindungs-Kurven von freiem Hämoglobin bei Ratten nach Ersatz von 50 % des Blutvolumens durch: 1 - unmodifiziertes Hämoglobin (Hb, n = 5), 2 - HbNFPLP (n = 3) und 3 - PolyHbNFPLP (n = 3).

Claims

1. Im wesentlichen stromafreie Hämoglobinzusammensetzung, die ein intramolekular über die β-Ketten vernetztes, polymerisiertes humanes Hämoglobin enthält.

2. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Hämoglobin intramolekular über die β-Ketten durch ein Pyridoxal-5-phosphat-Derivat mit 2 Aldehydgruppen vernetzt ist.

3. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Hämoglobin intramolekular über die β-Ketten durch 2-Nor-2- formylpyridoxal-5-phosphat vernetzt ist.

4. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Hämoglobin intramolekular über die β-Ketten durch ein Bis- pyridoxalpolyphosphat der Formel 2 vernetzt ist, in der R ein Sauerstoffatom, eine Orthophosphatgruppe, eine Pyrophosphatgruppe, einen Diphosphatrest oder einen Diphosphonatrest bedeutet.

5. Hamoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Hämoglobin durch Glutaraldehyd polymerisiert ist.

6. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Hämoglobin bis zu einem Durchschnittsmolekulargewicht zwischen 140 und 380 kD, vorzugsweise zwischen 160 und 270 kD polymerisiert ist.

7. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Hämoglobin zu einem Gemisch polymerisiert ist, das zu mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, aus Di-, Tri- und Tetrameren besteht.

8. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, in der bis zu 40% des Hämoglobins als Monomer anwesend ist, aber im wesentlichen kein dissoziierbares Monomer anwesend ist.

9. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine isoonkotische Hämoglobinkonzentration von über 9 g/100 ml und eine relative Viskosität von unter 4, vorzugsweise unter 2,5.

10. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Sauerstoffaffinität, die einem p50-Wert von 19-24 mm Hg entspricht.

11. Hämoglobinzusammensetzung nach Anspruch 1 in Form einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung oder in Form einer gefriergetrockneten Zusammensetzung.