DE69007482T2

DE69007482T2 - Nachweis von schimmeln.

Info

Publication number: DE69007482T2
Application number: DE69007482T
Authority: DE
Inventors: Ole Munch; Henrik Sundberg
Original assignee: ASSURANCE COMPAGNIET BALTICA A
Current assignee: Tryg Forsikring Ballerup Dk AS
Priority date: 1989-06-15
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2010-06-16
Also published as: EP0478682A1; DE69007482D1; EP0478682B1; WO1990015879A1; DK295289D0; DK0478682T3; ATE103004T1

Description

1. DAS TECHNISCHE GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung.
Die Feststellung und Bestimmung des Ausmaßes eines Schadens an Gebäuden oder Baumaterialien in Verbindung mit einer Kontrolle von Pilzinfektionen kann heute mit Hilfe verschiedener Techniken ausgeführt werden, einschließlich einer destruktiven Probenentnahme wie auch physikalisch nicht destruktiver Meßmethoden.
Um in wirksamer Weise eine Pilzinfektion zu kontrollieren, ist es wichtig, im voraus genau zu wissen, wo der Pilzbefall lokalisiert ist, ob der Pilz lebend ist und, wenig dies der Fall ist, die erforderliche Dauer und das Ausmaß der Pilzbehandlung. Dies liegt daran, daß es im Fall älterer trockener Pilzinfektionen natürlich ist, daß lediglich Teile des Pilzes lebensfähig sind und dementsprechend die Wiederherstellung des Gebäudes oft auf die Wachstumszone beschränkt oder vollständig vermieden werden kann, und zwar im Falle von seit langem toten Pilzen in Baumaterialien mit sonst intakten Festigkeitseigenschaften. Durch die Ungewißheit, die mit der Lebensfähigkeit des hitzebehandelten Fungus verbunden ist, werden Reparaturen häufig so ausgedehnt, daß sie eine Sicherheitszone mit einschließen, deren Reparatur die Kosten weiterhin erhöht und in bestimmten Fällen vermieden werden kann, wenn die Lebensfähigkeit des Fungus sicher festgestellt werden könnte.
Weiterhin ist es heute schwierig zu bestimmen, bei welcher Temperatur und wie lange eine vorgegebene Pilzbehandlung durch Mittel, beispielsweise eine Hitzebehandlung, ausgeführt werden muß, beispielsweise unter Benutzung einer Mikrowellenkanone, um eine wirksame und zuverlässige Kontrolle des Pilzes zu erhalten oder zu einem solchen Ergebnis beizutragen.
Bei der Behandlung und Reparierung von Pilzinfektionen ist es daher wichtig, eine einfache Methode zum Bestimmen der Lebensfähigkeit von Pilzzellen in Gebäuden oder Baumaterialien zur Verfügung zu haben.

2. TECHNISCHER HINTERGRUND

Bisher bestand das in der Praxis angewandte Verfahren zur Feststellung der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien vor oder nach einer Zell-Abtötungsbehandlung im Sammeln von Proben auf den infizierten Gebäuden oder Baumaterialien und Transport der Proben zu einem gut ausgerüsteten, biologischen Laboratorium, wo die Proben auf geeigneten Substraten zum Wachsen gebracht wurden. Entsprechend bekannten Techniken wird versucht, den Pilz unter optimalen Bedingungen wieder zu beleben, einschließlich einer Inokulation auf ein Wachstumssubstrat und zwei bis sechs Monate in einer Züchtungskammer, worauf es, typischerweise nicht bis nach sechs Monaten erfolgloser Wiederbelebungsversuche, als vernünftigerweise wahrscheinlich betrachtet wird, daß der Pilz nicht lebensfähig ist.
Ein Beispiel einer einfachen Züchtung von z.B. Trockerfäulnis durch Kultivation auf Substraten, die Malzextrakt und Agar enthalten, ist bei S. Cymorek and B. Hegarty, Int., Res. Groups Wood Pres., Doc. No. IRG/WP/2255, 1986, beschrieben.
Es ist ein bedeutsamer Nachteil bei der Züchtung von Pilzzellen als Lebensfähigkeitstest, daß das Verfahren zeitraubend ist. Inkubationsdauern von zwei Monaten oder mehr werden oft empfohlen, in welcher Zeit eine Pilzinfektion zu einem Ausmaß angewachsen sein kann, die meist irreparabel ist. Es wurde festgestellt, daß der Pilz unter günstigen Bedingungen sich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 cm in 24 Stunden ausbreitet und bis zur Höhe eines vierstöckigen Gebäudes wächst.
Weiterhin kann das Wachstum anderer Pilze häufig das Wachstum desjenigen Pilzes überdecken, welcher festgestellt werden soll, d.h. fehlendes Wachstum des interessierenden Pilzes in der Versuchskultur kann sowohl darauf zurückgehen, daß der Pilz tot ist oder auf erfolglose Versuche, ihn aus dem sterbenden Zustand wiederzuerwecken.
Eine Wiederbelebung durch einfache Züchtung ist somit eine langsame und ungewisse Methode zur Feststellung der Lebensfähigkeit.
Verfahren zum Anfärben von DNA der Chromosomen sind bekannt.
Laurits W. Olson, 0pera Botanica, No. 73, 1984, S. 65 - 66 offenbart die Feulgen-Kernanfärbebezugsmethode, bei welcher die DNA der Chromosomen mit Hilfe basischen Fuchsins angefärbt wird.
Die Techniken der Fluoreszenzmikroskopie wurden neuerdings zu einem wertvollen Werkzeug für die biologische Forschung zur Bestimmung von Organismen in biologischen Proben entwickelt, erleichtert durch Nukleinsäure-Färbeeigenschaften von fluoreszierenden Farbstoffen.
US-Patent Nr. 4,544,546 zeigt ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe, welche darin besteht, die biologische Probe mit einer wirksamen Menge eines Farbstoffes in Berührung zu bringen, wodurch ein Komplex zwischen dem Farbstoff und der Nukleinsäure erzeugt wird; Bestrahlen des Komplexes mit Licht einem Anregungswellenlänge, wodurch der Komplex veranlaßt wird, Fluoreszenz zu emittieren; und Messen der emittierten Fluoreszenz. Die Bestimmung der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien ist weder offenbart noch nahegelegt.
World Patent Index, Acc. No. 5408875, G. Varekhov et al. offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Pilzen durch Behandlung einer Myzelsuspension mit Aminoakridinfarbstoff und Messen der erhaltenen Fluoreszenz bei zwei Wellenlängen. Nichts wird offenbart oder nahegelegt mit Bezug auf die Bestimmung der Lebensfähigkeit von Pilzzellen in Proben aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien.
Eine andere auf Fluoreszenz beruhende Methode ist die DAPI-Kernfärbemethode gemäß welcher der Fluoreszenzfarbstoff 4',6-Diamino-2-phenylindol, DAPI, zum Anfärben von Chromosomen-DNA benutzt wird, die anschließend eine blaue oder bläuliche Farbe im Fluoreszenzmikroskop zeigt. Das Verfahren wurde zur Bestimmung von Kernen in Sporen von trockenem Fäulnispilz angewandt, der in Laboratorkulturen zu dem Zwecke gezüchtet wurde, die Struktur und Keimung von Basidiosporen zu überprüfen, B. Hegarty and U. Schmitt Int. Res. Group. Wood Preservation, 19. Annual Meeting, Madrid, Spain 24-29 April 1988. Eine Verwendung der DAPI- Anfärbemethode bei diesen Untersuchungen betrifft jedoch nicht die Feststellung der Lebensfähigkeit innerhalb der Bedeutung vorliegender Erfindung, noch was Sporen oder Pilzzellen betrifft.

3. OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung zu vermitteln, wobei die Gefahr der Feststellung falscher lebensfähiger Zellen reduziert ist.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Bestimmen der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung, wobei eine Probe aus den behandelten Gebäuden oder Baumaterialien einer Anfärbebehandlung mit einer Substanz unterworfen wird, die einen Farbstoff enthält, der zum Anfärben der Chromosomen im Zellkern verwendet wird, worauf die angefärbten Zellkernchromosomen festgestellt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe während einer Zeitdauer abgelagert wird, die lange genug ist, um die Chromosomen der abgetöteten Zellen aus der Zellkernen verschwinden zu lassen, bevor die Anfärbebehandlung ausgeführt wird.
Obwohl es bekannt ist, die DNA, d.h. die Desoxyribonukleinsäure, der Chromosomen in Verbindung mit Zellstrukturuntersuchungen und dergleichen anzufärben, wurde bisher keine sogenannte Kernanfärbemethode im Zusammenhang mit der Feststellung der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung angegeben.
Aus durchgeführten Feld- und Laboratoriumsversuchen ergab sich, daß die Gefahr der Feststellung nicht lebensfähiger Zellen als lebensfähige Zellen reduziert werden kann, wenn die Probe während einer Zeitdauer gelagert wird, die Lang genug ist, daß die Chromosomen der abgetöteten Zellen aus dem Zellkern verschwinden, bevor die Anfärbebehandlung ausgeführt wird.
Es wird allgemein angenommen, daß das Probenzellmaterial unmittelbar nach der Probeentnahme fixiert werden muß, um die Probe für eine spätere Laboranalyse zu konservieren. Wenn diese Konservierung nicht durchgeführt wird, werden die Zellen leicht von anderen Organismen überwachsen, insbesondere wenn die Pilzzellen tot sind, so daß die Proben ruiniert sind und die Gefahr einer falschen Interpretation der Lebensfähigkeit der als Probe entnommenen Spezimen wächst.
Bei Anwendung einer traditionellen Fixierung der Probe, die unmittelbar einer Zell-Abtötungsbehandlung, beispielsweise einer letalen Mikrowellenbestrahlung, nachfolgt, ergab es sich, daß die Chromosomen im Kern noch nicht verschwunden waren und infolgedessen "zu früh" fixiert erhalten wurden. Daher können im Mikroskop gut konservierte Kerne in den Zellen festgestellt werden, welche tatsächlich tot sind. Daher war es möglich, eine Stunde nachdem das Myzel von aktiv wachsendem trockenem Fäulnispilz vier Minuten lang gekocht worden war, Chromosomenmaterial im Zellkern zu entdecken. Beim Fixieren 24 Stunden später war das Kernmaterial verschwunden.
Infolgedessen wird gemäß der Erfindung die Probe aus den einer Zell-Abtötung unterworfenen Gebäuden und Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung nicht unmittelbar nach der Probeentnahme fixiert, sondern erst nach einer Lagerperiode, die gewährleistet, daß das Chromosomenmaterial im Kern nicht lebensfähiger Zellen vor der Fixierung verschwindet, wobei eine Trocknung und Mikroskopierung ausgeführt wird, so daß die Gefahr einer Mißinterpretation toter Zellen als lebensfähiger Zellen vermindert ist.
Die Lagerungsdauer kann vorteilhafterweise auf die Behandlungsmethode der Pilzinfektion eingestellt werden. So kann bei einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere im Falle eines der Hitze ausgesetzten Pilzmyzels die Lagerperiode 48 Stunden, vorzugsweise bis zu 24 Stunden betragen; jedoch sind auch kürzere Dauern möglich. Optimale Dauern werden leicht entsprechend der Behandlungsmethode, dem Aussetzungseffekt und der Aussetzungszeit eingestellt.
Es hat sich als ein Vorteil erwiesen, das als Probe entnommene Versuchsmaterial zu trocknen, wahlweise gefrierzutrocknen, insbesondere bei Proben, die nach einer Hitzeaussetzung entnommen waren, worauf sie bis zur Fixierung, Anfärbung und mikroskopischen Untersuchung trockengehalten wurden.
Daher ist bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Probe wahlweise durch Trocknen oder Gefriertrocknen vorbehandelt wird, worauf sie in einer Ablagerungsperiode trockengehalten wird, bevor sie fixiert und/oder wahlweise zur Abtrennung von Hyphen nachbehandelt wird.
Vor der Anfärbebehandlung wird die Probe vorteilhafterweise fixiert. Das Fixiermittel wird vorteilhafterweise im Hinblick auf das Behandlungsverfahren und das Versuchsmaterial ausgewählt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Fixiermittel vorzugsweise Äthanol/Eisessigsäuremischungen, insbesondere in einem bevorzugten Verhältnis von 3:1.
Der zum Anfärben der Chromosomen im Zellkern benutzte Farbstoff ist ein DNA-Farbstoff, d.h. eine Substanz, welche DNA anfärbt, oder ein fluoreszierender DNA-Farbstoff, und die Bestimmung wird mit Hilfe der Lichtmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie oder einer anderen geeigneten Bestimmungsmethode ausgeführt.
Beispiele für Fluoreszenzfarbstoffe, welche DNA anfärben und zum Anfärben der Chromosomen gemäß der Erfindung geeignet sind, umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise Bis-amino-phenyl-oxadiazol, Akriflavin, Pararosanilin, Bis-benzimid (Hoechst 33258) und 4',6-Diamino-2-phenylindol, DAPI. Derartige Farbstoffe wurden zur Bestimmung von Chromosomen und Zellkernen für unterschiedliche Zwecke benutzt.
Weitere Beispiele typischer DNA-Fluoreszenzfarbstoffe sind Propidiumjodid, Äthidiumbromid, Dihydroäthidium, Äthidiummonazid, 9-Azidoakridin, Äthidiumhomodimer(5,5'-diazadekamethylen)bis(3,8-diamino-6-phenylphenanthridium)dichlorid, Akridin-äthidiumheterodimer, Akridinhomodimer (bis-(6- chloro-2-methoxy-9-akridinyl)spermin), Akridinorange, Hoechst 33342, 7-Aminoaktinomyzin D, Thiazolorange, 9-Amino-6-chloro-2-methoxyakridin, 4,5',8-Trimethylpsoralen und Malachitgrünakrylamid. Andere brauchbare Farbstoffe können durch einen einschlägigen Fachmann ausgewählt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der fluoreszierende DNA-Farbstoff zum Anfärben der Chromosomen 4',6-Diamino-2-phenylindol, DAPI, in einer Konzentration von vorzugsweise 1 - 5 ug/ml.
In Verbindung mit der mikroskopischen Untersuchung erwies es sich ferner als ein Vorteil, die Hyphen vorzugsweise mechanisch auf solchem Wege abzutrennen, daß der Test einfach und unkompliziert wird.
Infolgedessen wird bei einer bevorzugten Ausführungsform die Probe nachbehandelt, um Hyphen abzutrennen, vorzugsweise durch mechanische Pulverisierung, bevor die mikroskopische Untersuchung erfolgt.
Neben der Anwendung einer Nachbehandlung der fixierten und angefärbten Probe zur Abtrennung der Hyphen erwies es sich als zusätzlicher Vorteil, die spezifische DAPI-Absorption der Chromosomen-DNA zu steigern, beispielsweise in trockenem Fäulnispilz, und zwar durch Zugabe einer Detergenz-Lösung. Brauchbare Detergenzien-Lösungen schließen an sich bekannte Detergenzien ein, vorzugsweise Triton 100-X und verschiedene Detergenzien-Konzentrationen, beispielsweise 5 %.
Daher wird bei einer bevorzugten Ausführungsform die Substanz, welche den Zellkernchromosomenfarbstoff enthält, in einer Detergenz-Lösung aufgelöst, vorzugsweise etwa 5 % an Triton 100-X.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, daß
a) die Probe wahlweise durch Trocknen oder Gefriertrocknen vorbehandelt wird, worauf sie in einer Ablagerungsperiode trockengehalten wird, bevor sie fixiert und/oder wahlweise zur Abtrennung von Hyphen nachbehandelt wird;
b) die wahlweise vorbehandelte Probe in einer Äthanol/Eisessigsäuremischung, vorzugsweise im Verhältnis 3:1, fixiert wird;
c) die Probe in destilliertem Wasser gewaschen wird;
d) die Probe während einer Zeitdauer von etwa 5 Minuten bis zu etwa 2 Stunden angefärbt wird, vorzugsweise mit einer Mischung von 2 % 4',6-Diaminophenylindol, DAPI, in Azeton und 5 % Triton 100-X-Detergenz mit einer endgültigen DAPI-Konzentration von 1 - 5 ug/ml;
e) die Probe in destilliertem Wasser gewaschen wird;
f) die Probe wahlweise zerkleinert wird, um die einzelnen Hyphen abzutrennen und;
g) die Probe mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bei 1000-facher Vergrößerung mikroskopiert wird, unter Verwendung einer Quecksilberlampe, 365 bis 366 nm, Filter, 40 bis 100-X-Objektiv und Ölimmersion.
Innerhalb der Bedeutung der Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Lebensfähigkeit" die Fähigkeit der Pilzzellen, sich selbst zu reproduzieren, so daß sich die Pilzzellen ausbreiten können und eine Myzelausbreitung zu den umgebenden Gebäuden und Baumaterialien erfolgt.
Weiter ist es nicht ausreichend, daß die Pilzzellen zu einem Stoffwechsel befähigt sind, da Pilze unter gewissen Bedingungen, insbesondere geringer Feuchtigkeit, eine Art "Schlafzustand" einnehmen können, in welchem ihr Stoffwechselprozeß sehr langsam wirkt. In Abhängigkeit von der Pilzart kann der Schlafzustand zwei bis zehn Jahre dauern. Vorher sind die Pilzzellen lebensfähig und können unter geeigneten Züchtungsbedingungen wiederbelebt werden. Lebensfähige Zellen im Bedeutungsbereich der Erfindung umfassen alle einen Kern mit Chromosomen, welche die Zelle in die Lage versetzen, sich selbst zu reproduzieren. Wenn eine Pilzzelle in der Bedeutung der Erfindung nicht länger lebensfähig ist, verschwinden die Chromosomen des Zellkerns, und die Zelle ist nicht mehr in der Lage, sich selbst fortzupflanzen.
Pilzzellen, die einen Zellkern mit Chromosomen aufweisen, sind somit entweder lebensfähige Zellen in Form aktiver Zellen, die zu einer Selbstfortpflanzung befähigt sind, oder in Form von Zellen in einem Schlafzustand, oder nicht lebensfähige Zellen, deren Chromosomen im Kern noch nicht aufgelöst sind. In Abwesenheit eines Zellkernes, der Chromosomen enthält, sind die Pilzzellen im Sinne der Erfindung nicht mehr lebensfähig.
Gemäß der Erfindung schließen Pilze ein: Serpula lacrymans, Coniophora putana, Antrodia sp., Gloeophyllum trabeum, etc. und andere Pilze, die Gebäude und Baumaterialien infizieren können.
Gemäß der Erfindung schließen Proben von Gebäuden oder Baumaterialien ein: Thallus, Myzelium, Hyphae, Einheitszellen oder Sporen des Pilzes.
Gebäude oder Baumaterialien im Sinne der Erfindung umfassen alle Materialien, welche einen Teil von Gebäuden und Gebäudekonstruktionen bilden oder bilden können, welche vom Pilz infiziert werden können, unabhängig davon, ob es beispielsweise das Ende der Lebensdauer des Baumaterials bedeutet.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Im folgenden wird das Verfahren gemäß der Erfindung detaillierter beschrieben, wobei Bezug auf die Zeichnungen genommen wird, in denen zeigen:
Fig. 1 die Anwesenheit von Zellkernchromosomen, welche Pilzhyphen enthalten, festgestellt mit Hilfe der Feulgen-Kernanfärbemethode und Fluoreszenzmikroskopie,
Fig. 2 die Anwesenheit von Zellkernen, welche lebende Pilzhyphen in einem schlaferden Zustand enthalten, festgestellt mit Hilfe der DAPI-Kernanfärbemethode und Fluoreszenzmikroskopie gemäß der Erfindung, und
Fig. 3 nicht lebensfähige Pilzhyphen ohne Chromosomen enthaltende Zellkerne aus Myzel, welche vier Minuten lang gekocht, nach 24 Stunden fixiert und mit Hilfe der DAPI-Kernanfärbemethode und Fluoreszenzmikroskopie gemäß der Erfindung gemessen wurden.

5. EINZELBESCHREIBUNG

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfaßt folgende Schritte:
1. Vorbehandlung der Probe durch Trocknen, vorzugsweise Gefriertrocknen, und Lagerung der trockenen Probe während einer Lagerungszeit von 24 Stunden,
2. Fixierung der vorbehandelten Probe in Äthanol/Eisessigmischung, vorzugsweise im Verhältnis 3:1,
3. Waschen der Probe in destilliertem Wasser,
4. Anfärben der Probe während etwa fünf Minuten bis zwei Stunden, vorzugsweise mit einer 2 %igen Mischung des Fluoreszenzfarbstoffes DAPI (Sigma) in einer Azeton-Basislösung, die zu einer Endkonzentration von 1-5 ug/ml und einer 5 %igen Triton 100-X-Detergenzlösung führt,
5. Waschung der Probe in destilliertem Wasser,
6. wahlweise Zerkleinerung der Probe, um einzelne Hyphen abzutrennen, mit Hilfe eines Deckglases und eines Wassertropfens, und
7. mikroskopische Untersuchung der Probe mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bei 100 x Vergrößerung unter Verwendung einer Quecksilberlampe, 365 bis 366 nm, Filter, 40 bis 100 x Objektiv und Ölimmersion.

6. BEISPIELE

Das Verfahren gemäß der Erfindung wurde zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Pilzzellen sowohl in lebendem und totem Myzel von trockenem Fäulnispilz angewandt.
Lebende Myzelien wurden nicht sterilisiert gezüchtet aus pilzinfiziertem Holz, Steinwolle und Überbrückungswerk, nämlich Mörtel und Ziegelsteinen, und zwar im Laboratorium, worauf sie im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit auf die Farbstoffe untersucht wurden. Totes Myzel wurde vermittelt durch Hitzebehandlung des lebenden Myzels in einem Mikrowellenofen bzw. durch Kochen während beispielsweise vier bis 10 Minuten. Altes, vermutlich inaktives Myzel wurde ebenfalls bereitgestellt.
In allen Fällen erwies sich das Verfahren als befriedigend.

BEISPIEL 1

Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde die Feulgen-Kernanfärbemethode an Proben lebenden Myzels des trockenen Fäulnispilzes angewandt.
Figur 1 zeigt die Fluoreszenzmikroskopie der Pilzhyphen aus lebendem Myzel des trockenen Fäulnispilzes, der mit Hilfe der Feulgen-Anfärbemethode angefärbt wurde. Der Pfeil in der Mitte des Bildes bezieht sich auf einen Kern, der sich in einem Farbbild selbst darstellt als dunkelrot bis violett auf einem rötlichen Hintergrund. Es erscheint, daß die Feulgen-Anfärbemethode, welche gewöhnlich die Chromosomen mit einer leuchtenden rötlichen Farbe anfärbt, Pilzmyzelien lediglich schwach färbt. Dies geht wahrscheinlich auf den Chitingehalt der Zellwand und die spärliche Menge von im Zellkern vorhandenen Chromosomen zurück.
Daneben ist es eine extrem zeitraubende Präparation, wobei bestimmte Schritte in der Prozedur leicht falsch ausgeführt werden können und das Verfahren die Anwendung einer Phasenkontrastmikroskopie verlangt, um eine Kernentdeckung zu ermöglichen. Infolgedessen ist das Verfahren zu einer Anwendung weniger vorteilhaft, wenn die Prozedur gemäß der Erfindung ausgeführt wird.

BEISPIEL 2

Zur Erläuterung des Verfahrens gemäß der Erfindung fand die DAPI-Kernanfärbemethode auf das zuvor erwähnte lebende und tote Myzel von trockenem Fäulnispilz Anwendung.
Figur 2 zeigt die Fluoreszenzmikroskopie lebensfähiger Pilzhyphen in einem schlafenden Zustand. In dem Bild erscheinen die leuchtend blau gefärbten Kerne als weiße Stellen in den abgeblendeteren Konturen der Pilzhyphen.
Im Vergleich mit der Feulgen-Kernanfärbemethode ist die DAPI-Methode im Gebrauch weit praktischer.

BEISPIEL 3

Figur 3 zeigt die Fluoreszenzmikroskopie nicht lebensfähiger Pilzhyphen aus Myzel, welches vier Minuten lang gekocht und später 24 Stunden fixiert wurde, worauf sie mit Hilfe der DAPI-Kernanfärbemethode angefärbt wurden. Das Bild zeigt klar die Abwesenheit angefärbter Kerne.

Claims

1. Ein Verfahren zum Bestimmen der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung, wobei eine Probe von den behandelten Gebäuden oder Baumaterialen einer Anfärbebehandlung mit einer Substanz unterworfen wird, die einen Farbstoff enthält, der zum Anfärben der Chromosomen im Zellkern verwendet wird, worauf die angefärbten Zellkernchromosomen festgestellt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe während einer Zeitdauer abgelagert wird, die lange genug ist, um die Chromosomen der abgetöteten Zellen aus den Zellkernen verschwinden zu lassen, bevor die Anfärbebehandlung ausgeführt wird.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ablagerungsdauer bis zu 48 Stunden, vorzugsweise bis zu 24 Stunden oder kürzer ist.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vor der Ablagerungsperiode getrocknet wird.

4. Ein Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vor Ausführung der Anfärbebehandlung mit einem Fixiermittel, vorzugsweise einer 3:1 Äthanol/Eisessigsäure fixiert wird.

5. Ein Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Anfärbehandlung die Probe behandelt wird, um Hyphen, vorzugsweise durch mechanische Pulverisierung, abzutrennen.

6. Ein Verfahren nach Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff zum Anfärben der Chromosomen ein fluoreszierender DNA-Farbstoff ist, vorzugsweise ein 4',6-Diamino-2-Phenyl-Indol, DAPI, in einer Konzentration von 1-5 ug/ml.

7. Ein Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz, welche den Zellkernchromosomenfarbstoff enthält, in einer Detergens-Lösung aufgelöst wird, vorzugsweise etwa 5% Triton 100-X.

8. Ein Verfahren zum Bestimmen der Lebensfähigkeit von Pilzzellen aus pilzinfizierten Gebäuden oder Baumaterialien nach einer Zell-Abtötungsbehandlung, wobei eine Probe von den behandelten Gebäuden oder dem Baumaterial einer Anfärbebehandlung mit einer Substanz unterworfen wird, die einen Farbstoff enthält, der zum Anfärben der Chromosomen im Zellkern verwendet wird, worauf die angefärbten Zellkernchromosomen festgestellt werden, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Probe wahlweise durch Trocknen oder Gefriertrocknen vorbehandelt wird, worauf sie in einer Ablagerungsperiode trockengehalten wird, bevor sie fixiert und/oder wahlweise zur Abtrennung von Hylphen nachbehandelt wird;

b) die wahlweise vorbehandelte Probe in einer Äthanol/Eisessigsäuremischung, vorzugsweise im Verhältnis 3:1 fixiert wird;

c) die Probe in destilliertem Wasser gewaschen wird;

d) die Probe während einer Zeitdauer von etwa 5 Minuten bis zu etwa 2 Stunden angefärbt wird, vorzugsweise mit einer Mischung aus 2% 4',6-Diamino-Phenyl-Indol, DAPI, in Aceton und 5% Triton 100-X Detergens mit einer endgültigen DAPI-Konzentration von 1-5 ug/ml;

e) die Probe in destilliertem Wasser gewaschen wird;

f) die Probe wahlweise zerkleinert wird, um die einzelnen Hyphen abzutrennen; und

g) die Probe mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bei 1000-facher Vergrößerung mikroskopiert wird, unter Verwendung einer Quecksilberlampe, 365 bis 366 nm, Filter, 40 bis 100 x Ojektiv und Ölimmersion.

9. In einem Verfahren zur Kontrolle der Pilzinfektion von Gebäuden oder Baumaterialien, wobei die infizierten Bereiche einer Zell-Abtötungsbehandlung unterworfen werden, vorzugsweise einer Hitzebehandlung unter Verwendung von Mikrowellen, werden Proben der durch Pilzzellabtötung behandelten Gebäude oder Baumaterialien getrocknet und anschließend während einer Zeitdauer abgelagert, die lange genug ist, um die Chromosomen der abgetöteten Zellen aus den Zellkernen verschwinden zu lassen, und im Falle einer Wärmebehandlung typischerweise bis zu 48 Stunden, vorzugsweise bis zu 24 Stunden oder kürzer; und werden die abgelagerten Proben einer Anfärbehandlung mit einer Substanz unterworfen, die einen Farbstoff enthält, der zum Anfärben der Chromosomen im Zellkern verwendet wird, vorzugsweise eine Mischung aus 4',6-Diamino-2-Phenyl-Indol, DAPI, und Triton 100-X, worauf die angefärbten Zellkernchromosomen festgestellt werden.