DE68902071T2 - Human-wachstumshormon-derivat. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein neues Derivat von Humanwachstumshormon.
• Große polyfunktionale Moleküle, wie Proteine, sind zur Bildung verschiedenster Derivate des ursprünglichen Produkts befähigt. Entsprechende Abwandlungen, wie Glycosylierungen und -Carboxylierungen, sind daher wohlbekannt und spielen wichtige physiologische Rollen. Zu anderen Abwandlungen kommt es beim Reinigungsprozeß. Während der Lagerung des Proteins werden auch Abbauprodukte gebildet. Es ist jedoch unmöglich, von Anfang an zu wissen, welche dieser Strukturen als solche biologisch wirksam sind oder nicht oder über welchen Wirkungsspiegel und welche Wirkungsart sie verfügen, falls sie überhaupt eine Wirksamkeit zeigen. In der Literatur ist bereits von pituitär deriviertem Wachstumshormon (hGH) berichtet worden. Unterschiedliche Größenisomere von hGH sind im Plasma von sowohl normalen als auch akromegalen Lebewesen gefunden worden. Das überwiegende Größenisomer, nämlich das Monomer mit einer Größe von 22000 Dalton, ist in mehreren derivatisierten Formen festgestellt worden, und hierzu gehören drei proteolytisch modifizierte Formen [Chramback, A., Yadley, R.A., Ben-David, M. und Rodbard, D. (1973) Endocrinology 93, 848 bis 857; Singh, R.N.P., Seavey, B.K., Rice, V.P., Lindsey, T.T. und Lewis, U.J. (1974) Endocrinology 94, 883 bis 891] sowie eine acetylierte Form und zwei desamidierte Formen [Lewis, U.J., Singh, R.N.P., Bonewald, L.F., Lewis, L.3. und Vanderlaan, W.P. (1979) Endocrinology 104, 1256 bis 1265; Lewis, U.J., Singh, R.N.P., Bonewald, L.F. und Seavey, B.K. (1981) J. Biol. Chem. 256, 11645 bis 11650]. Es sind auch andere Derivate von hGH gefunden worden, die jedoch nicht charakterisiert wurden. Die seit kurzem übliche Anwendung rekombinanter DNA-Techniken zur Massenproduktion pharmazeutisch interessanter Proteine hat den Versuch zur Herstellung spezifisch modifizierter Produkte der nativen rekombinant hergestellten Materialien ermöglicht.
• Durch die Zugänglichkeit von Humanwachstumshormon konnte ein neues Desamidoderivat von Humanwachstumshormon aufgefunden und ein Verfahren zu dessen Herstellung entwickelt werden. Die Erfindung ist nun auf ein solches Derivat gerichtet. Die erfindungsgemäße Verbindung ist das Desamidoderivat von Humanwachstumshormon, bei dem der an Stellung 149 vorhandene Asparaginrest (Asn) durch einen Asparaginsäurerest (Asp) ersetzt ist. Der Einfachheit halber wird die erfindungsgemäße Verbindung als Asp¹&sup4;&sup9;-Humanwachstumshormon oder Asp¹&sup4;&sup9;-hGH bezeichnet. Die erfindungsgemäße Verbindung verfügt überraschenderweise über eine etwa mit dem hGH selbst vergleichbare Wirkungsstärke und unterscheidet sich vom Stand der Technik dadurch, daß bei den literaturbekannten Desamidoderivaten von hGH der Asparaginrest in Stellung 152 durch einen Aspartinsäurerest oder der Glutaminrest (Gln) in Stellung 137 durch einen Glutaminsäurerest (Glu) ersetzt ist [siehe oben erwähnte Literaturstelle von Lewis et al. (1981)].
• Die Erfindung ist, wie bereits erwähnt, auf Asp¹&sup4;&sup9;-hGH gerichtet, wobei, wie ebenfalls schon erwähnt, in Lewis et al. (1981) J. Biol. Chem. 256, 11645 bis 11650, zwei Desamidoderivate von Humanwachstumshormon beschrieben werden. Beim ersten Derivat ist Asn¹&sup5;² durch Asp¹&sup5;² ersetzt, während beim zweiten Derivat Gln¹³&sup7; durch Glu¹³&sup7; ersetzt ist. Für keines dieser beiden Moleküle wird über irgendwelche biologischen Eigenschaften berichtet.
• Die erfindungsgemäße Verbindung ist in allen meßtechnisch ermittelten Eigenschaften wirkungsgleich mit dem nativen Hormon.
• Asp¹&sup4;&sup9;-hGH kann aus dem nativen Hormon durch Behandlung mit Ammoniumbicarbonat in folgender Weise hergestellt werden:
• Zur Herstellung von Asp¹&sup4;&sup9;-hGH löst man 2 g biosynthetisches Humanwachstumshormon (hGH) in 200 ml 0,1 M Ammoniumbicarbonat vom pH 9 und bebrütet die Lösung 72 Stunden bei 37ºC, worauf die gesamte Probe lyophilisiert wird. Das Asp¹&sup4;&sup9;-hGH wird durch ein zweistufiges Verfahren gereinigt. Für die erste Reinigungsstufe wird eine Anionenaustauschersäule unter Verwendung von Mono Q (1,6 x 10 cm) eingesetzt. Das Ausgangsmaterial wird in 50 mM Tris-Base in einer Konzentration von 16,7 mg/ml gelöst. Nach vollständiger Auflösung der Probe wird Acetonitril bis zu 10% des Endvolumens und dann 1-Propanol bis zu 30% des Endvolumens zugesetzt. Die Lösung wird durch sieben Durchläufe durch die mit dem Mono Q gefüllte Säule gereinigt, wobei die Proteinbeladung zwischen 200 und 300 mg schwankt. Das Protein wird unter Anwendung eines aus zwei Lösungsmitteln gebildeten Gradienten gereinigt, nämlich A aus 60% Tris-Puffer (50 mM Tris HCl vom pH 8), 10% Acetonitril und 30% 1-Propanol und B aus 60% Tris-Puffer (50 mM Tris HCl vom pH 8), 30% 1-Propanol und 250 mM NaCl. Als Gradient werden 0- bis 25%-iges B während 15 Minuten, isokratisches 25%-iges B während 10 Minuten und 25- bis 50%-iges B während 60 Minuten angewandt. Die zusammengefaßten Fraktionen werden zur weiteren Reinigung einer präparativen Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer Säule unterzogen, die mit Vydac , C&sub1;&sub8; und Siliciumdioxid mit einem Porendurchmesser von 30 nm (300 Å) gefüllt ist und 22,5 x 250 mm mißt. Die zusammengefaßten Fraktionen werden auf pH 7,5 eingestellt, und die Konzentration an 1-Propanol wird auf 25% gebracht, bevor die Säule damit beladen wird. Die Menge an Proteinbeladung schwankt zwischen 140 und 240 mg. Das Protein wird von der Säule mit einem aus zwei Lösungsmitteln gebildeten Gradienten eluiert, nämlich A aus 30% Acetonitril und 70% Tris-Puffer (50 mM Tris HCl vom pH 7,5) und B aus 40% 1-Propanol und 60% Tris- Puffer (50 mM Tris HCl vom pH 7,5). Der Gradient beträgt 66% B bis 72% B während 150 Minuten. Die Temperatur der Säule wird auf 45ºC gehalten, und die Fließgeschwindigkeit beträgt 6 ml pro Minute. Vor der Aufgabe der Probe wird die Säule mit 66% B equilibriert. In der beschriebenen Weise werden vier Säulendurchläufe vorgenommen, wobei die das Asp¹&sup4;&sup9;-hGH enthaltenden Fraktionen zusammengefaßt, zur Entfernung der organischen Lösungsmittel und der Puffersalze durch eine mit Sephadex G-25 gefüllte Säule geführt und dann lyophilisiert werden. Die mit dem G-25 gefüllte Säule wird equilibriert, und das Protein wird unter Verwendung von mit Ammoniak gepuffertem Wasser (pH 7,5) eluiert.
• Die isolierte Verbindung erweist sich als Asp¹&sup4;&sup9;-hGH. Der Strukturbeweis erfolgt durch Vornahme einer in der Literatur beschriebenen Peptidkartographie [Hsiung, H.M., Mayne, N.G. und Becker, G.W. (1986) Bio/Technology 4, 991 bis 995]. Proteinproben [1 bis 2 mg/ml in Tris-Acetat (50 mM, pH 7,5)] werden mit Trypsin (TPCK-Trypsin, Cooper Biomedical) bei 37ºC unter einem Gewichtsverhältnis von Enzym zu Substrat von 1:25 während 16 Stunden verdaut. Die erhaltenen tryptischen Peptide werden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer mit Aquapore RP-300 gefüllten Säule (4,6 x 250 mm, Brownlee Labs) unter Anwendung eines aus zwei Lösungsmitteln gebildeten Gradienten aufgetrennt, nämlich A aus 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und B aus 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril. Der Gradient beträgt 0 bis 20% B während 20 Minuten, 20 bis 25% B während 20 Minuten und 25 bis 50% B während 25 Minuten. Die Fließgeschwindigkeit liegt bei 1,0 m1 pro Minute. Eine Menge von 100 ul des tryptischen Verdauungsprodukts wird auf die Säule gegeben, und die Elution der Peptide wird spektrophotometrisch bei 214 nm überwacht.
• Ein Vergleich der aus Asp¹&sup4;&sup9;-hGH gebildeten Peptide mit den von nicht abgewandeltem hGH herrührenden Peptiden zeigt, daß mit einer Ausnahme alle Peptide gleich sind. Dieses abgewandelte Peptid wird aus dem Trypsinverdauungsprodukt des Derivats isoliert und ergibt durch Messung in einem Edman-Abbauautomaten die Sequenz: Phe-Asp-Thr-Asp-Ser-His-Asn-Asp. Diese Sequenz entspricht den Aminosäuren 146 bis 153 von hGH mit der Ausnahme, daß beim nicht abgewandelten hGH die Aminosäure in Stellung 149 Asn anstelle von Asp ist. Dies belegt, daß es sich bei der isolierten Verbindung um Asp¹&sup4;&sup9;-hGH handelt.
• Die biologische Wirksamkeit von Asp¹&sup4;&sup9;-hGH wird an weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit herausgeschnittener Hypophyse unter Anwendung des standardisierten Tibia-Versuchs [Marx, W., Simpson, M.E. und Evans, H.M. (1942) Endocrinology 30, 1 bis 10; und Evans, H.M., Simpson, M.E., Marx, W. und Kirbrick, E. (1943) J. Endocrinology 32, 13 bis 16] bestimmt. Auf Basis dieser Analyse läßt sich die biologische Wirksamkeit von Asp¹&sup4;&sup9;-hGH statistisch nicht von der Wirksamkeit des nicht abgewandelten hGH unterscheiden, und es verfügt über eine anabolische Wirksamkeit.

Claims (3)

1. Asp¹&sup4;&sup9;-Humanwachstumshormon.

2. Pharmazeutische Formulierung aus einem Asp¹&sup4;&sup9;-Wachstumshormon als Wirkstoff in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen hierfür.

3. Asp¹&sup4;&sup9;-Humanwachstumshormon zur Anwendung bei der anabolischen Therapie.