-
Gebiet der Erfindung
-
Die
Erfindung der vorliegenden Anmeldung betrifft eine Vorrichtung und
ein Verfahren zum Anwenden von Ultraschallenergie auf eine flüssige Probe.
-
Beschreibung des Standes der
Technik
-
Es
ist wünschenswert,
in der Lage zu sein, Ultraschallenergie auf flüssige Proben, die in die Mulden
einer Muldenplatte verbracht sind, anzuwenden. Muldenplatten, die
Mulden für
96, 384 und 1536 flüssige
Proben enthalten, sind gegenwärtig
verfügbar. Bei
Verwendung in der vorliegenden Schrift betrifft der Ausdruck „flüssig" reine Flüssigkeiten
sowie Flüssigkeiten,
die suspendierte Partikel (insbesondere biologisches Material, das
zum Beispiel Proteine, DNA oder Zellen enthält) enthalten, und Lösungsmittel,
die gelöste
Substanz enthalten. Ultraschall (Ultraschallenergie) ist jahrelang
als ein Verfahren zum Scheren von großen Molekülen in kleinere Fragmente und zum
Aufbrechen von Pflanzenzellen oder Tierzellen verwendet worden,
um dadurch den Zelleninhalt in Lösung
abzugeben. Ultraschall ist weiterhin verwendet worden, um die Solubilisierung
von Verbindungen oder Chemikalien zu unterstützen und um chemische Reaktionen
zu begünstigen.
Eine Reihe verschiedener Beschallungsvorrichtungen steht gegenwärtig zur
Verfügung.
Eine ,Beschallungsvorrichtung' ist
ein Gerät,
das Ultraschall in eine Lösung
oder ein Material überträgt. Beschallungsvorrichtungssysteme
bestehen im Allgemeinen aus wenigstens einer Steuereinheit, einem
Verstärker
und einem Schallhorn. Das Horn ist normalerweise so geformt, dass
es die Ultraschallenergie maximal in die gewünschte Probe überträgt. Ein
,Mikrospitzen'-Horn
ist hergestellt worden und ist handelsüblich verfügbar. Das Mikrospitzen-Horn
richtet die Ultraschallenergie auf eine einzelne Spitze, die in
eine flüssige
Probe eingeführt werden
kann. Das Mikrospitzen-Horn kann verwendet werden, um kleine Proben
entweder in Schläuchen
oder in einzelnen Mulden einer Muldenplatte zu beschallen.
-
Das
Mikrospitzen-Horn weist den Nachteil auf, dass es nur eine Probe
auf einmal beschallen kann, jedoch nicht zum Beispiel 1536 Proben
in einer Muldenplatte mit 1536 Mulden. Mikrospitzen-Hörner weisen
weiterhin das Problem auf, dass die Spitze dazu neigt, aufgrund
des großen
Energieeintrages in die Spitze kleinen Durchmessers von dem Hauptkörper des
Horns weg zu scheren. Zusätzlich
kann das Horn nicht zuverlässig
zwischen den Anwendungen gereinigt werden, um Kreuzkontamination
der Proben zu verhindern.
-
JP 02025748 beschreibt
eine Beschallungsvorrichtung zum Aufbrechen von Zellen, die in einer Mikrotiterplatte
gezüchtet
werden.
-
Es
ist wünschenswert, über die
Fähigkeit
zu verfügen,
Ionen in flüssigen
Proben in Mulden in einer Muldenplatte auf Basis der elektrischen
Ladung der Ionen zu trennen. Während
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Zyklus-Sequenzierung von
DNA werden Reaktionskomponenten vor nachfolgenden Schritten aus
der Lösung
entfernt, und DNA, die verstärkt
worden ist, muss von den unverbrauchten Reaktionspartnern und anderen
Produkten gereinigt (getrennt) werden. Nukleinsäureverstärkung wird üblicherweise durch Wärme-Kälte-Zyklusreaktionen
in Gegenwart von wärmestabiler
DNA-Polymerase, wie zum Beispiel Taq-Polymerase, durchgeführt. Die
Lösung,
in der die Verstärkung
stattfindet, enthält üblicherweise
zahlreiche verschiedene Komponenten, wie unter anderem einen Puffer,
Nukleotidtriphosphate, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Dithiothreotol,
DNA, Oligonukleotide sowie die DNA-Polymerase (zum Beispiel Taq).
Nachdem der Verstärkungsprozess
der DNA abgeschlossen ist, enthält
die Reaktionslösung
nicht nur die oben genannten Komponenten, sondern auch Reaktionsnebenprodukte.
Die verstärkte
Nukleinsäure
muss danach von diesem Gemisch gereinigt werden, bevor zusätzliche
Schritte durchgeführt
werden können.
Es gibt eine Reihe von Verfahren, mittels derer DNA gereinigt werden
kann, wie unter anderem die Größenausschluss-Chromatographie,
die Gelelektrophorese und die Ionenaustauschchromatographie. Andere
typische Verfahren zum "Reinigen" der DNA sind allesamt
Varianten der oben genannten drei Verfahren. Alle gegenwärtig zur
Verfügung
stehenden Verfahren zum „Reinigen" der DNA-Produkte
aus Lösung
erfordern mehrere zusätzliche
Schritte und die Übertragung
der Produktlösung
aus dem ursprünglichen
Reaktionsbehälter
in wenigstens einen zusätzlichen
Behälter.
Es wäre
vorteilhaft, in der Lage zu sein, sowohl die Nukleinsäureverstärkung als
auch die Reinigung in der gleichen Mulde einer Muldenplatte fortlaufend
und ohne weitere Zugaben zu der Mulde durchführen zu können.
-
Bei
der Ionenaustauschchromatographie werden Moleküle einer Ladung (entweder positiv oder
negativ) von Molekülen
der entgegengesetzten Ladung, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, üblicherweise
ein Glaspartikel oder ein unlöslicher
organischer Träger,
angezogen. Das unlösliche Trägermaterial
wird danach fortlaufend mit Lösungen,
die immer höhere
Konzentrationen eines bestimmten Salzes (üblicherweise Natriumchlorid)
enthalten, „ausgewaschen". Mit der Zunahme
der Salzkonzentration treten die Ionen in der Salzlösung miteinander „in Wettbewerb" um die Ionenbindungsstellen
mit dem Ergebnis, dass bei geringen Salzkonzentrationen Moleküle mit geringer
Nettoladung von dem festen Träger
verdrängt
(freigegeben) werden, während
Moleküle
mit größeren Nettoladungen
an den festen Träger
gebunden bleiben.
-
Nukleinsäuren, einschließlich der
Desoxyribonukleinsäure
(DNS) und der Ribonukleinsäure (RNS),
sind polymere Anionen. Als solche werden sie von unlöslichen
Trägern
angezogen, die eine positive Ladung (Kathoden) enthalten, und werden
sie von unlöslichen
Trägern
abgestoßen,
die negative Ladungen (Anoden) enthalten. Nukleinsäuren sind durch
Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung verschiedener Arten
von unlöslichen
Trägermaterialien
erfolgreich von heterogenen Lösungen
gereinigt worden. Üblicherweise
geschieht dies durch Zugabe eines Ionenaustauschmaterials zu der Lösung, die
die Nukleinsäure
enthält,
und durch Manipulation der Ionenstärke der Lösung durch Zugabe von kleinen
anorganischen Ionen, um Bindung der Nukleinsäure an den unlöslichen
Träger
zu ermöglichen.
Nachdem die Bindung der Nukleinsäure
an den unlöslichen
Träger
eingetreten ist, wird die Lösung und
werden somit die „Verunreinigungen" durch sequenzielles „Waschen" des Trägers aus
dem löslichen
Träger
entfernt. Durch Manipulieren der Ionenstärke der Waschlösung kann
ein Mittel der Kontrolle über
die Größe (Länge) des
an dem Träger
angelagert verbleibenden Nukleinsäurepolymers erzielt werden.
Die Ionen in der Waschlösung
treten mit der Nukleinsäure
in Wettbewerb um die Bindung an die Oberflächenladung auf dem unlöslichen
Träger,
und somit kann der Grad der Nukleinsäurebindung grob reguliert werden,
indem die Ionenkonzentration in der Waschlösung verändert wird. Bei einer relativ
geringen Ionenstärke
(zum Beispiel destilliertes Wasser) ist die Nukleinsäurebindung
an den unlöslichen
Träger
fast unabhängig
von der Größe. Mit
zunehmender Ionenstärke
der Waschlösung werden
kürzere Nukleinsäurepolymere
zuerst aus dem Träger
eluieren, gefolgt von längeren
Polymeren mit zunehmender Ionenstärke der Waschlösung.
-
Eines
der größten Probleme
bei den gegenwärtigen
Verfahren und Vorrichtungen zum Reinigen durch Ionenwechselwirkung
besteht darin, dass die Trägermaterialien
eine feste Oberflächenladung
aufweisen, die nicht verändert
werden kann. Die Trägermaterialien
werden üblicherweise
als „schwache", „mäßige" oder starke Anionen/Kationen-Austauschharze
beschrieben. Ein jedes dieser „Harze" ist in Wirklichkeit
ein unterschiedliches Material mit unterschiedlichen physikalischen
Eigenschaften. Um die Oberflächenladung
zu verändern,
werden unterschiedliche Materialien als der Träger verwendet, oder Gegenionen
werden verwendet, um die Ladung wirksam zu maskieren.
-
Die
US-Patentanmeldung Nr. 09/655,021 mit dem
Titel „Rapid
Thermal Cycling Device",
eingereicht am 5. September 2000, und die
US-Patentanmeldung Nr. 10/041,703 mit
dem Titel "Rapid
Thermal Cycling Device",
eingereicht am 8. Januar 2002, lehren allgemein die Verwendung eines
Deckels für eine
Muldenplatte, wobei der Deckel Stifte aufweist, die von dem Deckel
abhängen,
zwecks Einführung
in die Mulden einer Muldenplatte. Die Stifte erstrecken sich von
der Oberseite des Deckels durch den Deckel und in die Mulden der
Muldenplatte, wobei die Stifte mit den flüssigen Proben in den Mulden
in Kontakt kommen, wodurch Kontrolle der Temperatur der flüssigen Proben
durch Anwenden von Wärme
auf oder durch Entzug von Wärme
von der Oberseite des Deckels ermöglicht wird.
-
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zum Manipulieren
einer flüssigen
Probe, gelagert in wenigstens einer Mulde einer Muldenplatte, bereitgestellt,
wobei die Vorrichtung umfasst:
- a. einen Deckel
mit wenigstens einem Stift und einer Oberseite und einer Unterseite,
wobei die Unterseite des Deckels mit der Muldenplatte in Eingriff
steht;
- b. wobei der wenigstens eine Stift ein oberes Ende und ein unteres
Ende hat, wobei das obere Ende des wenigstens einen Stiftes die
obere Seite des Deckels durchstößt, wobei
das untere Ende des wenigstens einen Stiftes durch den Deckel in die
wenigstens eine Mulde der Muldenplatte hindurchgeht, wobei der wenigstens
eine Stift in dem Deckel gehalten wird;
- c. eine Einrichtung zum Übertragen
von Energie von oder zu dem oberen Ende des wenigstens einen Stiftes,
wobei der wenigstens eine Stift die Energie zu oder von der flüssigen Probe überträgt;
- d. wobei das untere Ende des wenigstens einen Stiftes in physikalischem
Kontakt mit der flüssigen Probe
steht; und
- e. wobei die Einrichtung zum Übertragen von Energie eine
Einrichtung zum Anwenden von Schallenergie auf das obere Ende des
wenigstens einen Stiftes umfasst, wobei der wenigstens eine Stift
die Schallenergie durch den verstifteten Deckel zu der flüssigen Probe überträgt und die Schallenergie
die flüssige
Probe beschallt.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Manipulieren einer flüssigen
Probe in einer Mulde einer Muldenplatte bereitgestellt, das die
Schritte umfasst:
- a. Verbringen der flüssigen Probe
in die Mulde der Muldenplatte;
- b. Anordnen eines Deckels mit wenigstens einem Stift auf der
Muldenplatte, wobei der Deckel eine Oberseite und eine Unterseite
aufweist, der wenigstens eine Stift ein oberes Ende und ein unteres
Ende hat, der Stift den Deckel durchdringt, das obere Ende des Stiftes
sich in die Mulde der Muldenplatte erstreckt, das untere Ende des
Stiftes die flüssige
Probe physikalisch kontaktiert, wobei der wenigstens eine Stift
in dem Deckel gehalten wird;
- c. Anwenden von Schallenergie auf das obere Ende des wenigstens
einen Stiftes, wobei der Stift die Schallenergie auf das untere
Ende des wenigstens einen Stiftes überträgt.
-
Bei
Verwendung in der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck „Stift" ein längliches
Element. Für
den Zweck der vorliegenden Anmeldung wird ein Deckel, der Stifte
gemäß der vorliegenden Erfindung
aufweist, hierin als „verstifteter
Deckel" bezeichnet.
-
Die
vorliegende Erfindung sieht die Beschallung von flüssigen Proben
vor, die in einer Muldenplatte enthalten sind, wie zum Beispiel
einer Muldenplatte mit 1536 Mulden, wobei eine jede Mulde ein Fassungsvermögen von
6 μl aufweist.
Ein verstifteter Deckel wird für
die Muldenplatte bereitgestellt. Ein Schallhorn wendet Ultraschallenergie
auf die Enden der Stifte auf der Oberseite des Deckels an. Ein jeder Stift überträgt Ultraschall energie
von der Oberseite des Deckels zu einer jeden flüssigen Probe, wodurch eine
jede flüssige
Probe beschallt wird. Eine elastische Dichtung kann auf die Unterseite
des Deckels angewendet werden, um den Inhalt einer jeden Mulde von
dem Inhalt einer jeden anderen Mulde in der Muldenplatte zu trennen.
Stifte können
elastisch so an dem Deckel angebracht sein, dass Bewegung der Stifte
in einer Richtung senkrecht zu der Ebene des Deckels ermöglicht wird,
wodurch sich die Stifte als Reaktion auf durch eine Peltier-Einrichtung
oder ein Schallhorn aufgebrachten Druck bewegen können. Elastisch
angebrachte Stifte ermöglichen,
dass die Peltier-Einrichtung oder das Schallhorn alle Stifte kontaktieren
können.
-
Ein
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung sieht die Trennung von Ionen, die unterschiedliche
elektrische Ladungen aufweisen, in flüssigen Proben, die in den Mulden
einer Muldenplatte enthalten sind, vor. Eine Muldenplatte wird mit
einem verstifteten Deckel versehen. Ein jeder Stift besteht aus,
ist beschichtet mit oder enthält
in seiner Oberfläche
ein Material, das elektrisch aufgeladen werden kann; das heißt, das
auf seiner Oberfläche
eine elektrische Nettoladung aufweist. Eine elektrische Ladung,
zum Beispiel eine positive Ladung, wird auf einen Stift angewendet.
Da der Stift in Kontakt mit der flüssigen Probe steht, werden
alle negativ geladenen Ionen von den positiv geladenen Stiften angezogen und
an diese gebunden werden. Indem die positive Nettoladung an den
Stiften verändert
wird, können Moleküle von unterschiedlicher
negativer Nettoladung getrennt werden. Zum Beispiel kann anfangs eine
hohe positive Nettoladung auf die Stifte angewendet werden, wodurch
bewirkt wird, dass die Mehrzahl der negativ gebundenen Ionen in
der Reaktionslösung
an den Stift gebunden werden. Der Stift kann danach aus der Lösung entfernt
werden und in eine andere Lösung
(Wasser, Pufferlösung
etc.) gegeben werden, und die positive Nettoladung an dem Stift
kann verringert werden, mit dem Ergebnis, dass Moleküle mit einer
geringen negativen Nettoladung in die Lösung abgegeben werden. Dieser
Prozess kann nach Erfordernis wiederholt werden, um die gewünschten
Moleküle
zu trennen. Die Trennung eines Materials aus der flüssigen Probe
einer Mulde einer Muldenplatte durch Anwenden einer elektrischen
Ladung auf einen Stift wird in der hier vorliegenden Anmeldung als „elektrische
Ladungstrennung" bezeichnet.
-
Ein
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung und ein
Verfahren zum selektiven Anwenden eines beliebigen Schrittes des
Wär me-Kälte-Zyklus,
der Beschallung oder der elektrischen Ladungstrennung in einer beliebigen
Sequenz auf eine flüssige
Probe, die in einer Mulde eine Muldenplatte enthalten ist.
-
Die
anhängenden
Zeichnungen, die in die Patentschrift eingearbeitet werden und Bestandteil derselben
sind, veranschaulichen die Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung
der Erläuterung
der Grundsätze
der Erfindung.
-
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
-
1 ist
eine Muldenplatte, die flüssige
Proben enthält.
-
2A veranschaulicht
einen verstifteten Deckel.
-
2B ist
eine vergrößerte Ansicht
eines verstifteten Deckels.
-
3 veranschaulicht
einen verstifteten Deckel, der an einer Muldenplatte angebracht
ist.
-
4 ist
eine Draufsicht eines Deckels und zeigt Löcher zur Aufnahme von Stiften.
-
5 ist
eine Alternative für
das Anbringen von Stiften an einem Deckel.
-
6 veranschaulicht
einen verstifteten Deckel mit Fixierösen; und
-
7 veranschaulicht
eine automatisierte Vorrichtung zum Manipulieren von Proben, die
in mehreren Muldenplatten enthalten sind.
-
8 ist
eine schematische Darstellung und zeigt die Anwendung einer elektrischen
Ladung auf die Stifte durch eine elektrische Ladungsvorrichtung.
-
9 ist
eine schematische Darstellung und zeigt die Anwendung von Schallenergie
auf die Stifte durch ein Schallhorn.
-
10 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Reinigen einer
Flüssigkeit
unter Verwendung der vorliegenden Erfindung.
-
11 ist
eine schematische Darstellung und zeigt die Anwendung von Wärme auf
beziehungsweise den Entzug von Wärme
von den Stiften und von der flüssigen
Probe zum Steuern der Temperatur der flüssigen Probe.
-
Beschreibung des bevorzugten
Ausführungsbeispieles
-
Bei
der Beschreibung eines Ausführungsbeispieles
der Erfindung wird für
eine bessere Verständlichkeit
eine spezielle Terminologie ausgewählt werden.
-
Aus 1 ist
eine Muldenplatte 2 ein Behälter für die gleichzeitige Manipulierung
zahlreicher flüssiger
Proben 4, die in Mulden 6 enthalten sind. Ein
verstifteter Deckel 10 wird für die Muldenplatte 2 bereitgestellt.
Der verstiftete Deckel 10 bedeckt eine jede der Mulden 6 in
der Muldenplatte 2 und dient der Verhinderung von Verdampfung
der flüssigen
Proben 4 oder der Verunreinigung einer flüssigen Probe 4 durch
eine andere flüssige
Probe 4. Der Deckel 10 kann aus einem Leiterplattenmaterial
oder aus einem beliebigen anderen ausreichend steifen Material 12 bestehen
und kann spritzgegossen sein. Stifte 14 (2A)
durchdringen den Deckel 10. Ein jeder der Stifte 14 weist
ein oberes Ende 16 und ein unteres Ende 18 auf
(2B). Das obere Ende 16 eines Stiftes 14 durchdringt
den Deckel 10 durch ein Loch 20 (4)
in dem Deckel 10.
-
Der
Deckel 10 steht in Eingriff mit der Muldenplatte 2. Ösen 22 (2B)
an dem Deckel 10 passen mit Schlitzen 24 (3)
an der Muldenplatte 2 zusammen, um den Deckel 10 präzise zu
fixieren und zu führen,
so dass die Stifte 14 die Muldenplatte 2 während des
Einbaus oder des Ausbaus des Deckels 10 an oder von der
Muldenplatte 2 nicht berühren. Wenn der Deckel 10 an
der Muldenplatte 2 angebaut ist, steht ein jeder Stift 14 in
eine Mulde 6 der Muldenplatte 2 vor. Ein Stift 14 steht
in physikalischem Kontakt mit der flüssigen Probe 4, die
in der Mulde 6 enthalten ist, in die der Stift 14 eingeführt wird.
-
Eine
Dichtung 26 (2B, 3) kann
bereitgestellt werden, um den Deckel 10 gegen die Mulden 6 der
Muldenplatte 2 abzudichten, wodurch Verdampfung der flüssigen Probe 4 während des
wiederholten Erwärmens
und Abkühlens
der Probe 4 während
des Wärme-Kälte-Zyklus
verhindert wird. Die Dichtung 26 besteht aus einem elastischen
Material, wie zum Beispiel Silikonkautschuk. Die Dichtung 26 kann
als dünne
Schicht aus elastischem Material vorliegen, die auf die Unterseite 28 des
Deckels 10 aufgebracht wird. Die Dichtung 26 dient
weiterhin dazu, zu verhindern, dass Mikropartikeltropfen von flüssiger Probe 4 während der
Beschallung von einer Mulde 6 in eine angrenzende Mulde 6 wandern.
Der erforderliche Grad der Abdichtung der Mulden 6 kann von
Anwendung zu Anwendung unterschiedlich sein. In Abhängigkeit
von der Anwendung kann der Deckel 10 mit einer Dichtung 26 unter
dem gesamten Deckel 10, mit nur einer Umfangsdichtung 26 oder
mit überhaupt
keiner Dichtung 26 versehen sein.
-
Das
obere Ende 16 eines jeden Stiftes 14 wird durch
eine elastische Schicht 30 getragen, die auf der Oberseite 32 des
Deckels 10 angeordnet ist. Die elastische Schicht 30 besteht
aus Silikonkautschuk oder einem beliebigen anderen geeigneten elastischen
Material. Der Stift 14 kann auf der elastischen Schicht 30 ,schwimmen'; das heißt, sich
in der Richtung senkrecht zu der Ebene des Oberseite 32 des
Deckels 10 als Reaktion auf zum Beispiel durch eine Peltier-Einrichtung 34 (11)
oder das Schallhorn 36 (9) auf den
Stift 14 aufgebrachten Druck bewegen. Da ein jeder Stift 14 ,schwimmen' kann, können geringfügige Unterschiede
in der Höhe
der Stifte 14 über
der Oberseite 32 des Deckels 10 durch elastische
Verformung der elastischen Schicht 30 überwunden werden, so dass ein
jeder Stift 14 mit der Peltier-Einrichtung 34 oder
dem Schallhorn 36 in Berührung kommen wird.
-
Eine
Vielzahl von Löchern 20,
im Wesentlichen von dem Durchmesser der Stifte 14 oder
geringfügig
größer, werden
in einem Maßfeld
entsprechend den Abmessungen der Muldenplatte 2, die verwendet
werden wird, in den Deckel gebohrt oder geformt werden. Für eine Muldenplatte 2 mit
einem Feld von 32 Mal 48 Mulden 6 werden die Löcher 20 zum
Beispiel in einem Feld 32 Mal 48 mit einem Mittenabstand
von 2,25 Millimetern gebohrt. Die 1536 Stifte 14 werden
danach durch die Löcher 20 dergestalt
ein geführt,
dass die Stifte 14 über
die Dichtung 26 hervorstehen. Auf Basis der Tiefe einer
1536er Standardmuldenplatte 2 werden die Stifte 14 etwa
3 mm von der Bodenfläche 28 des
Deckels 10 hervorstehen. Die Stifte 14 können von
3 mm für
eine Muldenplatte 2 mit 1536 Mulden 6 bis zu größer als
45 mm für
eine tiefe Muldenplatte 2 mit 96 Mulden 6 hervorstehen.
-
Die
Vielzahl von Löchern 20 sowie
die Anzahl und die Lage der Stifte 14 passen mit der Anzahl und
der Lage der Mulden 6 in der Muldenplatte 2, für die der
Deckel 10 verwendet werden wird, zusammen. Für Muldenplatten 2 mit
96 Mulden 6 ist das Muster von Löchern 20 und Stiften 14 ein
Regelfeld von 8 × 12
Löchern 20 und
Stiften 14. Für
Muldenplatten 2 mit 384 Mulden 6 ist das Muster
von Löchern 20 und
Stiften 14 ein Feld von 16 × 24 Löchern 20 und Stiften 14.
Für Muldenplatten 2 mit
1536 Mulden 6 ist das Muster von Löchern 20 und Stiften 6 ein Feld
von 32 × 48
Löchern 20 und
Stiften 6.
-
Alternativ
dazu können
die Stifte 14 und die Löcher 20 dimensioniert
sein, um ein Festsitz zu sein, und die Stifte 14 können durch
Pressung in dem Deckel gehalten werden. Rändel 38 (5)
oder Köpfe können an
oder in der Nähe
des Oberteils eines jeden Stiftes 14 ausgebildet werden,
um den Festsitz der Stifte 14 durch Pressung zu unterstützen, und können verhindern,
dass der Stift 14 vollständig durch das Loch 20 in
dem Deckel 10 gleitet. Andere Mittel zum Befestigen der
Stifte 14 können
verwendet werden, zum Beispiel die Ausrüstung der Oberfläche 32 des
Deckels 10 mit einer Kupferplattierung und das Löten des
oberen Endes 16 eines jeden Stiftes 14 an die
kupferplattierte Oberfläche
oder das Verbinden des Stiftes 14 mit dem Deckel 10 mittels
eines Klebstoffes oder mit Wärme.
-
Die
Stifte 14 können
von der Oberseite 32 des Deckels 10 hervorstehen.
In Abhängigkeit
von der Anwendung müssen
die Stifte 14 um einen Betrag über die Oberseite 32 des
Deckels 10 hervorstehen, der ausreichend ist, um zu ermöglichen,
dass alle Stifte 14 in Eingriff mit einer Peltier-Einrichtung 34,
dem Schallhorn 36 oder anderen Mitteln, um Energie auf
die Stifte aufzubringen oder von diesen zu abzuführen, stehen, vorzugsweise
jedoch um höchstens
1 mm. Die Stifte 14 müssen
aus einem Material gefertigt sein, das Wärme oder Schallenergie leitet und
das durch die Wärme
und die Schallenergie nicht beschädigt wird. Wenn elektrische
Ladungstrennung durchgeführt
wird, muss ein Material, das eine elektrische Ladung auf seiner
Oberfläche
tragen kann, entweder in der Stiftstruktur oder als Beschichtung für alle oder
für einen
Teil der Stifte in die Stifte 14 eingearbeitet werden.
-
Zum
Beispiel können
Stifte 14, die aus unlegiertem Messing gefertigt werden,
für Beschallung geeignet
sein. Wenn Beschallung, Wärme-Kälte-Zyklus
und elektrische Ladungstrennung durchgeführt werden, können Stifte 14 aus
mit einer Nickelschicht von fünf
Mikrometer beschichtetem zylindrischem Material mit nachfolgender
Verzinnung/Verbleiung hergestellt werden. Andere Materialien, wie
zum Beispiel Aluminium, Gold, Kupfer oder andere Metalle können zusammen
mit bestimmten Keramikwerkstoffen und Kunststoffwerkstoffen verwendet
werden.
-
Ein
Abschnitt des Stiftes 14, der sich von der Unterseite 28 des
Deckels 10 erstreckt, ist ausgelegt, um in Kontakt mit
der in der jeweiligen Mulde 6 gelagerten Probe 4 zu
kommen. Die Länge
des Stiftes 14 und die Menge von flüssiger Probe 4 werden
so eingestellt, dass sichergestellt ist, dass die Stifte 14 wenigstens
teilweise in der flüssigen
Probe 4 eingetaucht sind. In dem Wärmezyklus-Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung wird die Temperatur des oberen Endes 16 der
Stifte 14 verändert,
wie zum Beispiel durch eine Peltier-Einrichtung 34, einen Wärmeblock
oder einen Strahl erwärmter
oder gekühlter
Luft. Dementsprechend, wenn die Temperatur des oberen Endes 16 eines
Stiftes 14 verändert
wird, wird die Temperatur des unteren Endes 18 des Stiftes 14 verändert, wodurch
die Probe 4 direkt erwärmt oder
gekühlt
wird. Bei Beschallung überträgt ein Ultraschallhorn 38 Schallenergie
direkt auf das obere Ende 16 des Stiftes 14. Die
Schallenergie wird durch den Stift 14 und in die flüssige Probe 4 übertragen, wodurch
die flüssige
Probe 4 beschallt wird. In dem Ausführungsbeispiel der elektrischen
Ladungstrennung wird eine elektrische Ladung auf das obere Ende 16 eines
Stiftes 14 angewendet, wodurch die Ladung auf das untere
Ende 18 des Stiftes 14 und somit auf die flüssige Probe 4 übertragen
wird.
-
Ein
Stift 14 muss teilweise in die flüssige Probe 4 eingetaucht
werden und somit in physikalischen Kontakt mit derselben kommen.
-
Das
Volumen des in die flüssige
Probe 4 eingetauchten Stiftes 14 kann ausgehend
von dem Anwendungsfall ausgewählt
werden. Für
Vorgänge
des Wärme-Kälte-Zyklus und der elektrischen
Ladungstrennung muss der Abschnitt des Stiftes 14, der direkt in
die flüssige
Probe 4 eingetaucht wird, ein Volumen von etwa zehn Prozent
des Volumens der flüssigen Probe 4 haben.
Dieser vergleichsweise große
Stift 14 gewährleistet
ein rasches Temperaturgleichgewicht in der Probe 4 während des
Wärme-Kälte-Zyklus ebenso wie
eine relativ große
Oberfläche
für die
Bindung von Ionen für
elektrische Ladungstrennung. Weiterhin kann der Stift 14 ausgelegt
sein, um die Oberfläche
dergestalt zu maximieren, dass die Wärmeübertragung zwischen der flüssigen Probe 4 und dem
Stift 14 optimiert wird oder dass die Oberfläche für elektrische
Ladungstrennung maximiert wird. Je größer die Querschnittsfläche des
Stiftes 14 ist, umso schneller ist die Wärmeübertragung
und umso größer ist
die Oberfläche
für elektrische
Ladungstrennung (Oberfläche
eines Zylinders = (pi)rh). Für
Beschallung können
unterschiedliche Verhältnisse
des eingetauchten Volumens des Stiftes 14 zu dem Flüssigkeitsvolumen
geeignet sein.
-
Die
Temperatur der Probe 4 kann durch Anwendung von Wärme oder
durch Entzug von Wärme von
dem oberen Ende 16 des Stiftes 14 während des Wärme-Kälte-Zyklus rascher auf
eine gewünschte Temperatur
gebracht werden. Der Wärme-Kälte-Zyklus durch Änderung
der Temperatur des Stiftes 14 kann aufgrund der Nähe des erwärmten beziehungsweise
abgekühlten
Stiftes 14 zu der flüssigen
Probe 4 gleichwohl die Temperatur der flüssigen Probe 4 ändern. Für Beschallung
oder elektrische Ladungstrennung ist direkter Kontakt zwischen dem
Stift 14 und der Probe 4 in der Mulde 6 der
Muldenplatte 2 erforderlich.
-
Die
Zusammensetzung und der Aufbau der Stifte 14 können so
festgelegt werden, dass keine Störung
beziehungsweise Störung
lediglich auf gewünschte
Art und Weise mit den Reaktionen und durchzuführenden Arbeitsvorgängen auftritt.
In einigen Anwendungsfällen
können
Metallstifte 14 mit einem Kunststoff oder einem anderen
reaktionsträgen Material
beschichtet werden, so dass das Metall die Reaktion nicht stört. Die
Stifte 14 können
mit Gold, mit Polypropylen, Polystyrol oder mit anderen Metallen,
Kunststoffwerkstoffen, Keramikwerkstoffen oder mit anderen Materialien,
die biologisch oder chemisch reaktionsträge sind, beschichtet werden.
-
Die
Stifte 14 können
von zylindrischer Form sein. Rechtwinklige, hexagonale, elliptische,
sternförmige
oder anders geformte Stifte 14 können ebenfalls verwendet werden.
Die Spitze des Stiftes 14, die in die flüssige Probe 4 hervorsteht,
kann konkav oder konvex sein und kann Erhöhungen oder andere Strukturen
aufweisen, die kleine Mengen der flüssigen Probe 4 einschließen oder
einfangen können. Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass, nachdem
die flüssigen
Proben 4 durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Zyklus-Sequenzierungsreaktion
oder durch andere Vorgänge
manipuliert worden sind, der Deckel 10 entfernt werden
kann und ein jeder Stift 14 als zeitweilige Lagereinrichtung für eine kleine
Menge der flüssigen
Probe 4 genutzt werden kann, die sich in der Mulde 6 befunden
hat. Wenn die Reaktion wiederholt werden muss, kann der Deckel 10 mit
den kleinen Mengen von an den Stiften 14 anhängender
flüssiger
Proben 4 auf eine zweite Muldenplatte 2 verbracht
werden. Die kleine Menge flüssiger
Probe 4 an den Stiften 14 wird dabei zu den Mulden 6 der
zweiten Muldenplatte 2 zusammen mit geeigneten Medien zugegeben
werden, um neue flüssige
Proben 4 zu erzeugen. Der Deckel 10 kann auch
verwendet werden, um kleine Mengen der Probe 4 auf andere
Substrate zu geben. Ein jeder Stift 14 kann aufgrund der
Form des Stiftes 14 eine kleine Menge des Materials der
flüssigen
Probe 4 einfangen oder einschließen; alternativ dazu kann ein
Teil des Materials der Probe 4 durch elektrische Ladungstrennung
an den Stift 14 gebunden werden, um für weiterführende Manipulation auf eine
andere Muldenplatte 2 überführt zu werden.
-
Bei
Arbeitsvorgängen
des Wärme-Kälte-Zyklus
kann die Peltier-Einrichtung 34 oder eine andere Quelle
für Erwärmung oder
Kühlen
selektiv mit allen oder einigen der Stifte 14 in Kontakt
stehen. Zum Beispiel kann eine Peltier-Einrichtung 34 konfiguriert sein,
um mit bestimmten Reihen und Spalten von Stiften 14 in
Kontakt zu stehen, wodurch die bestimmten Reihen und Spalten unabhängig von
den anderen Stiften 14 erwärmt und gekühlt werden. Analog dazu kann
ein Ultraschallhorn 36 selektiv nur mit spezifizierten
Stiften 14 in Kontakt stehen, wobei nur die flüssigen Proben,
in die die unteren Enden 18 der spezifizierten Stifte 14 eingetaucht
sind, beschallt werden. Für
selektive elektrische Ladungstrennung kann eine elektrische Ladung
an spezifizierte Stifte 14 angelegt werden, während eine
unterschiedliche Ladung an andere der Stifte 14 angelegt
wird. Proben in unterschiedlichen Mulden 6 einer einzelnen
Muldenplatte 2 können
daher getrennt manipuliert und unterschiedlichen Vorgängen unterzogen
werden.
-
Die
The Society for Biomolecular Screening (SBS) hat eine Standardkonfiguration
für die
Muldenplatte 2 für
eine Muldenplatte 2 mit 1536 Mulden 6 vorgeschlagen,
die ermöglichen
wird, dass 1536 flüssige
Proben 4 gleichzeitig manipuliert werden. Die Gesamtabmessungen
der vorgeschlagenen Standard-Muldenplatte 2 mit 1536 Mulden
sind: 85,48 mm in der Breite, 127,76 mm in der Länge und 14,35 mm in der Höhe. Der
Mittenabstand zwischen den Mulden auf der 1536er Muldenplatte 2 beträgt 2,25
mm. Andere Muldenplatten 2, die weit verbreitet genutzt werden,
sind unter anderem Muldenplatten 2 mit 96 Mulden 6 und
Muldenplatten 2 mit 384 Mulden 6. Die Muldenplatte 2 mit
384 Mulden 6 hat einen Mulden-Mittenabstand von 4,5 mm.
-
Die
Muldenplatten 2 der vorliegenden Erfindung entsprechen
dem vorgeschlagenen SBS-Standard in allen Aspekten mit Ausnahme
der Positionierungsschlitze 40 (3) zur Aufnahme
und Fixierung des verstifteten Deckels 10 (2A).
Die Positionierungsschlitze 40 sind auf beiden kurzen Seiten
der Muldenplatte 2 so vorhanden, dass der verstiftete Deckel 10 direkt
auf der Platte 2 positioniert werden kann, ohne dass die
Stifte 14 mit den Seitenwänden der Mulden 6 in
Kontakt kommen. Der Deckel 10 umfasst wenigstens zwei Kunststoffösen 42.
Diese Kunststoffösen 42 passen
mit den Positionierungsschlitzen 40 zusammen und positionieren
den Deckel 10 dergestalt auf der Platte 2, dass
ein jeder Stift 14 direkt in seine entsprechende Mulde 6 eingeführt wird.
Die Ösen 40 dienen
dem Schutz der Stifte 14 gegen Verschmutzung und gegen
mögliche
Beschädigung.
-
Mehrere
Muldenplatten 2, die flüssige
Proben 4 in den Mulden 6 enthalten und die verstiftete Deckel 10 aufweisen,
können
durch eine automatisierte Vorrichtung 44 manipuliert werden.
Die automatisierte Vorrichtung 44 kann von einer Muldenplatte
bis zu sechs Muldenplatten 2, die flüssige Proben 4 und
verstiftete Deckel 10 umfassen, aufnehmen. Muldenplatten 2 mit
einer beliebigen Anzahl von Mulden 6 können verwendet werden, einschließlich von Muldenplatten 2,
die gegenwärtig
mit 96, 384 oder 1536 Mulden 6 verfügbar sind. Wenn sie mit sechs 1536er
Muldenplatten 2 vollständig
beladen ist, kann die automatisierte Vorrichtung 44 mehr
als 9000 Proben 4 auf einmal verarbeiten. Das Tablett 46,
auf das die Platten 2 verbacht werden, enthält ein Verriegelungssystem,
das eine jede Platte 2 präzise positioniert. Dieses Tablett 46 kann
entweder manuell oder durch einen Roboter mit Muldenplatten 2,
die flüssige Probe 4 in
den Mulden 6 und einen verstifteten Deckel 10 aufweisen,
beladen werden. Wenn das Tablett 46 in die automatisierte
Vorrichtung 44 eingegeben wird, können die Peltier-Einrichtung 34,
das Schallhorn 36 oder die elektrische Ladungsvorrichtung 48 (in 12 schematisch dargestellt) in Kontakt
mit dem Deckel 10 gebracht werden. Die Abfolge des Betriebes
und der Betriebsparameter der Peltier-Einrichtung 34, des
Schallhorns 36 beziehungsweise der elektrischen Ladungsvorrichtung 48 werden
von dem Anwender ausgewählt,
um die Anforderungen der gewünschten
Manipulation der flüssigen Proben 4 zu
erfüllen.
Die automatisierte Vorrichtung 44 kann Beschallung unter
Verwendung des Schallhorns 36 bereitstellen, um genetisches
Material freizugeben, gefolgt von Wärme-Kälte-Zyklus unter Verwendung
der Peltier-Einrichtung 34 für DNA-Verstärkung, gefolgt von elektrischer
Ladungstrennung unter Verwendung der elektrischen Ladungsvorrichtung 48.
Umgekehrt kann von dem Anwender eine beliebige Betriebsreihenfolge
ausgewählt
werden.
-
Wenn
die Peltier-Einrichtung 34, das Schallhorn 36 oder
die elektrische Ladungsvorrichtung 48 auf eine Muldenplatte 2 angewendet
werden, wenden die Peltier-Einrichtung 34,
das Schalhorn 36 oder die elektrische Ladungsvorrichtung 48 einen
geringfügigen
Druck auf den Deckel 10 aus. Der auf den Deckel 10 angewendete
Druck drückt
die Dichtung 26 um eine jede der Mulden 6 zusammen
und macht somit eine jede der Mulden 6 hinreichend luftdicht und
flüssigkeitsdicht,
um den Inhalt einer jeden Mulde 6 hinreichend von dem Inhalt
einer jede anderen Mulde 6 zu isolieren und um Verdampfung
zu verhindern, entsprechend den Anforderungen des Arbeitsvorganges.
-
Die
Anwendung von Druck durch die Peltier-Einrichtung 34, das
Schallhorn 36 oder die elektrische Ladungsvorrichtung 48 dient
weiterhin dazu, zu ermöglichen,
dass die Peltier-Einrichtung 34, das Schallhorn 36 oder
die elektrische Ladungsvorrichtung 48 wirkend mit dem oberen
Ende 16 eines jeden der Stifte 14 in Kontakt kommen.
Ein jeder der Stifte 14 ist in einem Loch 20 durch
den Deckel 10 angebracht und wird von einer elastischen
Schicht 30 getragen. Die Anwendung von Druck durch die
Peltier-Einrichtung 34,
das Schallhorn 36 oder die elektrische Ladungsvorrichtung 48 drückt das
obere Ende 16 der Stifte 14 in die elastische
Schicht 30, wodurch ermöglicht
wird, dass alle Stifte 14 in direktem Kontakt mit der Peltier-Einrichtung 34,
dem Schallhorn 36 oder der elektrischen Ladungsvorrichtung 48 stehen
und geringfügige
Unterschiede in der Höhe der
Stifte 14 überwunden
werden.
-
Der
verstiftete Deckel 10 kann für den Wärme-Kälte-Zyklus der flüssigen Proben 4 in
den Mulden 6 einer Muldenplatte verwendet werden. Die Stifte 14 in
dem verstifte ten Deckel 10 sind aus einem wärmeleitenden
Material beschaffen. Die Temperaturen der oberen Enden 16 der
Stifte 14 werden eingestellt, indem eine herkömmliche
Peltier-Einrichtung 34 verwendet
wird. Alternativ dazu können
andere Mittel zum Erwärmen
und Abkühlen
des oberen Endes 16 der Stifte 14 verwendet werden,
wie zum Beispiel das Leiten eines erwärmten oder gekühlten Luftstromes über das
obere Ende 16 der Stifte 14 oder das Anwenden
eines herkömmlichen
Wärme-/Kälteblockes
auf das obere Ende 16 der Stifte 14. Wärme wird über die
Länge des
Stiftes 14 und in die flüssige Probe oder aus der flüssigen Probe 4 übertragen,
wobei die Temperatur der flüssigen
Probe 4 kontrolliert wird. Das untere Ende 18 des
Stiftes 14 kann für
den Wärme-Kälte-Zyklus
in die flüssige Probe 4 eingetaucht
werden, oder das untere Ende 18 des Stiftes 14 kann
sich in unmittelbarer Nähe
der flüssigen
Probe 4 befinden.
-
Der
verstiftete Deckel 10 wird verwendet, um Schallenergie
auf eine flüssige
Probe 4 zu übertragen
oder diese zu „beschallen". Die wichtigsten
Anwendungen von Beschallung unter Verwendung des verstifteten Deckels 10 sind
das Scheren großer
Moleküle,
wie zum Beispiel von Nukleinsäuren
oder Proteinen, in kleinere Moleküle oder das Aufbrechen von Bakterien,
von Pilzzellen, von Säugetierzellen
oder von anderen Zellen, um dadurch den Inhalt der Zellen in die
flüssige
Probe 4 abzugeben oder freizusetzen. Beschallung durch
Verwendung des verstifteten Deckels 10 kann auch zur Unterstützung der
Solubilisierung von Feinstaub, wie zum Beispiel organischen oder
anorganischen Molekülen,
oder zur Förderung einer
chemischen Reaktion verwendet werden.
-
Um
Schallenergie auf eine flüssige
Probe 4 in der Mulde einer Muldenplatte 2 zu übertragen,
wird ein herkömmliches
Schallhorn 36 oder eine andere herkömmliche Vorrichtung in physikalischen
Kontakt mit dem oberen Ende 16 des Stiftes 14 gebracht, dessen
unteres Ende 18 in eine flüssige Probe 4 eingetaucht
ist. Das Schallhorn 36 wird eingeschaltet, wobei Schallenergie
erzeugt wird. Die Schallenergie von dem Horn 36 wird zu
dem Stift 14 in dem Deckel 10 übertragen, wodurch bewirkt
wird, dass der Stift 14 mit Ultraschall schwingt. Der schwingende
Stift 14 beschallt die flüssige Probe 4.
-
Die
Verwendung eines verstifteten Deckels 10 zur Beschallung
der flüssigen
Proben 4 in den Mulden 6 einer Muldenplatte 2 weist
mehrere Vorteile gegenüber
der Alternative eines Schallhorns 36 mit mehreren Spitzen
zum Einführen
in die Mulden 6 auf. Da erstens die Muldenplatten 2 in
unterschiedlichen Höhen
von etwa 3 mm bis größer als
45 mm handelsüblich
sind, ist es relativ unkompliziert und kostengünstig, verstiftete Deckel 10 unterschiedlicher
Größen herzustellen,
die betriebsfähig
mit einer beabsichtigten Muldenplatte 2 zusammenpassen.
Während
die Herstellung eines Schallhorns 36 mit mehreren Spitzen
zum Einführen
in die Mulden 6 einer Muldenplatte 2 möglich wäre, würde ein
solches Schallhorn 36 kostspielig sein. Zusätzlich vermeidet
die Verwendung eines verstifteten Deckels 10 den Aufwand
und die Kosten der Herstellung von mehreren Schallhörnern 36,
da lediglich ein Schallhorn 36 erforderlich ist, um die
unterschiedlichen Höhen
und Formate der Muldenplatte 2 (Muldenplatten 2 mit
96 Mulden, mit 384 Mulden oder mit 1536 Mulden) aufzunehmen.
-
Ein
zweiter Vorteil der Verwendung eines verstifteten Deckels 10 zur
Beschallung besteht darin, dass der verstiftete Deckel 10 vollständig verfügbar ist
und dass somit keine Notwendigkeit der Reinigung eines Hornes 36 mit
mehreren Spitzen zwischen den Anwendungen mit einer möglichen
Querkontamination besteht. Der verstiftete Deckel 10 verhindert
weiterhin luftgetragene Kontamination der flüssigen Proben 4 während der
Beschallung. Wenn eine Probe 4 beschallt wird, werden Kleinstteilchen von
Fluid durch die Luft übertragen.
Mit einem Schallhorn 36 mit mehreren Spitzen wäre es schwierig,
die Kleinstteilchen von Fluid innerhalb der Grenzen einer einzelnen
Mulde 6 der Muldenplatte 2 zu kontrollieren oder
einzudämmen.
Da der verstiftete Deckel 10 eine Dichtung 26 enthält, wird
eine jede Mulde 6 der Muldenplatte 2 von allen
anderen Mulden 6 isoliert.
-
Um
dien Nutzen des verstifteten Deckels 10 für die Beschallung
von flüssigen
Proben 4 in einer Muldenplatte 2 nachzuweisen,
wurde der folgende Versuch durchgeführt. Ein Bakterienstamm von
Kolibakterien (E. coli), DH10B, wurde über Nacht gezüchtet, um
in Kulturlösung
LB aufzulaufen. 500 μl dieses
Mediums wurden zentrifugiert, um die Bakterien aufzukonzentrieren,
und das Bakterienpellet wurde drei Mal mit 200 μl TAE-Pufferlösung gewaschen.
Nach dem letzten Waschen wurden die Bakterien in 200 μl TAE-Pufferlösung suspendiert.
10 μl dieser
Bakterienlösung
wurden danach in eine jede Mulde 6 einer 384er Muldenplatte 2 gegeben,
und ein verstifteter Deckel 10 wurde auf die Platte 2 angebracht.
Ein Schallhorn 36 mit den Abmessungen von 85 mm Mal 120
mm wurde danach in Kontakt mit dem verstifteten Deckel 10 gebracht,
und 10 Mal 1-Sekunden-Impulse wurden auf den Deckel 10 angewendet.
Die Beschallungsvorrich tung war ein 1500-Watt-System, das bei einer
Amplitude von 50% verwendet wurde. Nach der Beschallung der Proben 4 wurden
die Proben 4 von 10 μl
entnommen und zentrifugiert, um unlösbares Material zu pelletieren. Auf
die Lyse der Bakterien folgte die Freisetzung von bakterieller DNA
in eine Lösung über horizontale Gelelektrophorese.
Die Beschallung der bakteriellen Lösung führte nicht nur zur Lyse der
Bakterien, wie sie durch die Freisetzung von DNA in die Lösung beobachtet
wurde, sondern führte
auch zum Scheren der bakteriellen DNA in kleinere Fragmente. Bakterielle
Chromosomen-DNA
ist ein kreisförmiger
Strang, der etwa 20 kB enthält.
Nach der Beschallung wird eine kleine Menge von ungespaltener DNA
an der Grenzfläche
Mulde/Gel beobachtet, was zeigt, dass die ungespaltene DNA nicht
in das Gel eintreten konnte. Der größte Teil der DNA wurde zu kleinen 2-kB-Fragmenten
geschert. Die Kontrollspur, die auf gleiche Weise behandelt wurde,
außer
dass sie keiner Beschallung ausgesetzt wurde, zeigt keine Freisetzung
von DNA in die Lösung.
Die Beschichtung der beschallten bakteriellen Probe und der bakteriellen
Kontrollprobe auf LB-Agar zeigte eine 108-fache Reduzierung
der Anzahl der nach Beschallung vorliegenden Bakterien. Diese Ergebnisse
deuten an, dass der verstiftete Deckel 10 erfolgreich verwendet
werden kann, um Schallenergie von einem Schallhorn 36 in
eine Probe 4 zu übertragen,
die in den Mulden 6 einer Muldenplatte 2 enthalten
ist. Zusätzlich
zeigten diese Versuche, dass 100% der Mulden 6 einer 384er Muldenplatte 2 unter
Verwendung dieser Technologie beschallt werden können.
-
Der
verstiftete Deckel 10 kann verwendet werden, um Material
in einer flüssigen
Probe 4 in einer Mulde 6 einer Muldenplatte 2 zu
reinigen. Zum Beispiel kann eine positive oder eine negative elektrische
Ladung auf die Oberfläche
der Stifte 14 in einem verstifteten Deckel 10 angelegt
werden. Die elektrische Ladung kann durch eine herkömmliche elektrische
Ladungsvorrichtung 48 übertragen
oder erzeugt werden, welche eine herkömmliche Gleichstromquelle sein
kann oder die eine herkömmliche Quelle
elektrostatischer Aufladung sein kann. Wenn eine positive Ladung
an die Stifte 14 angelegt wird, ziehen die Stifte 14 negativ
geladene Moleküle
in der flüssigen
Probe 4, in der die Stifte 14 platziert sind, an.
Je stärker
negativ das Molekül
geladen ist, umso größer ist
die Bindungsaffinität
des negativ geladenen Moleküls
zu dem positiv geladenen Stift 14. Der Deckel 10 und
die Stifte 14 mit den an die Stifte 14 gebundenen
negativ geladenen Molekülen
können danach
aus der ursprünglichen
flüssigen
Probe 4 entnommen und in eine neue flüssige Probe 4 gegeben werden,
und die elektrische Ladung an dem Stift 14 kann geändert werden,
wodurch die Moleküle
in die neue flüssige
Probe 4 übertragen werden.
Auf diese Weise können
negativ geladene Moleküle
rasch aus der ursprünglichen
Probe entfernt werden, was zu einer gereinigten flüssigen Probe 4 führt. Der
Stift 14 kann anfangs eine negative Ladung erhalten und kann
somit verwendet werden, um positiv geladene Moleküle aus der
anfänglichen
flüssigen
Probe 4 zu reinigen.
-
Eine
wichtige Anwendung der elektrischen Ladungstrennung ist die Reinigung
genetischer Materialien nach einem Ereignis von Nukleinsäureverstärkung. Nach
dem Abschluss des Schrittes des Wärme-Kälte-Zyklus einer geeigneten
Probe zur Verstärkung
der DNA in der Probe kann eine sehr hohe Ladungsdichte auf einem
Stift 14 des verstifteten Deckels 10 platziert
werden, indem das obere Ende des Stiftes in Kontakt mit einer Quelle
positiver elektrischer Ladung 48 gebracht wird. Die Oberfläche des unteren
Endes 18 des Stiftes 14 erlangt ebenfalls eine
sehr hohe positive Ladung 48. Anionen (einschließlich der
zu „reinigenden" Nukleinsäuren) binden
die Oberfläche
schnell an den Stift 14. Die auf den Stift 14 angewendete
Ladungsdichte wird danach verringert, bis Moleküle ausschließlich der
gewünschten
Ladung (Größe) an den
Stift 14 gebunden bleiben. Der verstiftete Deckel 10 wird
danach von der Muldenplatte 2 entfernt, wodurch der Stift 14 aus der
flüssige
Probe 4 entfernt wird. Der verstiftete Deckel 10 wird
auf eine zweite Muldenplatte 2 gegeben, die das untere
Ende 8 des Stiftes 14 in eine zweite Lösung eintaucht.
Die elektrische Ladung an dem Stift 14 stößt die negativ
geladene Nukleinsäure
ab, und die Nukleinsäure
wird freigesetzt und in die zweite Lösung ausgetrieben und von den
Reaktionsprodukten getrennt.
-
Als
Alternative und wenn der Stift 14 in die zweite Lösung gegeben
wird, kann die positive Netto-Oberflächenladung verringert und nicht
vollständig eliminiert
werden. Diese Verringerung der Ladungsdichte des Stiftes 14 bewirkt,
dass kleinere Nukleinsäurefragmente
von dem Stift 14 eluiert werden. Indem die Oberflächenladung
allmählich
verändert wird,
kann eine serielle Reinigung von Nukleinsäurefragmenten auf Basis ihrer
relativen Ladungsdichte (Größe) erzielt
werden.
-
Die
sehr hohe negative Nettoladung der durch die PCR-Reaktion verstärkten DNA
ermöglicht, dass
die DNA von den unverbrauchten Reaktionspartnern, anderen Produkten
und Oligonukleotiden in einem einzelnen Schritt getrennt werden
können. Dieses
Verfahren wird auch für
die Reinigung von Proteinen, DNA, RNS oder anderen Molekülen von Muldenplatten 2 mit
96, 384, 1536 Mulden oder anderer Formate ver wendet. Die positive
Nettoladung an dem Stift 14 kann durch den Anwender genau
reguliert werden, um die Bindung von Anionen an die Oberfläche des
Stiftes 14 zu steuern. Im Gegensatz zu herkömmlichen
Ionenaustauschharzen, die eine feststehende Netto-Oberflächenladung
aufweisen, kann die Netto-Oberflächenladung
auf dem Stift 14 von dem Anwender ausgewählt werden.
Bei einer sehr hohen Oberflächendichte
von positiver Ladung werden sich zahlreiche unterschiedliche Anionen
an den Stift 14 binden. Mit der Reduzierung der Oberflächendichte
von positiver Ladung werden die schwächer gebundenen Anionen in
die Lösung
freigesetzt werden. Indem die Netto-Oberflächendichte von positiver Ladung
verändert
wird, kann Reinigung der Nukleinsäure erzielt werden. Sehr genaue
Steuerung der Oberflächenladung
wird die Trennung von Nukleinsäuren
ermöglichen,
die sich in ihrer Nettoladung (Größe) nur geringfügig unterscheiden.