DE60314857T2 - Ice1, ein regulator des kälteinduzierten transcriptoms und der gefriertoleranz bei pflanzen - Google Patents

Ice1, ein regulator des kälteinduzierten transcriptoms und der gefriertoleranz bei pflanzen Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung und Frosttoleranz bei Pflanzen.
  • Diskussion des Hintergrunds
  • Kälte ist ein Umweltfaktor, der die geographische Verbreitung und die Vegetationszeit von vielen Pflanzenarten einschränkt und oftmals die Erntequalität und -produktivität nachteilig beeinflusst (Thomashow 1999). Die meisten Pflanzen aus gemäßigten Klimazonen erlangen eine Kältetoleranz gegenüber frostigen Temperaturen durch einen Prozess, der als Kälteakklimatisierung bekannt ist und bei dem eine Toleranz gegenüber niedrigen nichtfrostigen Temperaturen durch eine vorherige Exposition entsteht (Guy 1990; Hughes und Dunn 1996; Browse und Xin 2001). Pflanzen tropischen und subtropischen Ursprungs jedoch sind zur Kälteakklimatisierung nicht fähig und sind als solche empfindlich gegenüber kühlen Temperaturen (0-10°C). Zahlreiche Untersuchungen haben darauf hingedeutet, dass eine kälteregulierte Genexpression in Pflanzen sowohl für die Kühltoleranz (Gong et al. 2002; Hsieh et al. 2002), als auf für die Kälteakklimatisierung (Thomashow 1999; Knight et al. 1999; Tahitiharyu und Palva 2001) entscheidend ist. Kälteresponsive Gene codieren eine verschiedenartige Anzahl von Proteinen, wie Enzyme, die an der Respiration und am Metabolismus von Kohlenhydraten, Lipiden, Phenylpropanoiden und Antioxidantien beteiligt sind, molekularen Chaperonen, Frostschutz-Proteinen und anderen mit einer vermuteten Funktion einer Toleranz gegen Dehydrierung als Folge von Frost (Thomashow 1999 Guy 1990; Mohapatra et al. 1989).
  • Viele der kälte- und dehydrierungsresponsiven Gene habe eine oder mehrere Kopien des DER/CRT cis-Elements in ihren Promotoren, das die Kernsequenz CCGAC hat (Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki 1994; Stockinger et al. 1997). Eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die als CBFs oder DREB1s bekannt sind, bindet an dieses Element und aktiviert die Transkription der stromabwärts liegenden kälte- und dehydrierungresponsiven Genen (Stockinger et al. 1997; Liu et al 1998). Interessanterweise werden die CBF/DREB1-Gene selbst durch niedrige Temperaturen induziert. Diese Induktion ist transient und geht der Induktion der stromabwärts liegenden Gene mit dem DRE/CRT cis-Element voraus (Thomashow 1999). Somit ergibt sich eine Transkriptionskaskade, die unter Kältestress zu der Expression der DER/CRT-Genklasse führt. Eine ektopische Expression von CBFs/DREB1s in Pflanzen schaltet die stromabwärts liegenden kälteresponsiven Gene auch bei warmen Temperaturen an und verleiht eine verbesserte Frosttoleranz (Jagglo-Ottosen et al. 1998; Liu et al. 1998).
  • Da CBF-Transkripte innerhalb von 15 Minuten, nachdem die Pflanze Kälte ausgesetzt wurde, anfangen zu akkumulieren, schlugen Gilmour et al (1998) vor, dass in der Pflanze bereits bei normalen Wachstumstemperaturen ein Transkriptionsfaktor vorhanden ist, der die CBF-Promotoren erkennt und nach einer Kältestressexposition eine CBF-Expression induziert. Gilmour et al (1998) nannte den(die) unbekannten Aktivator(en) „ICE"-Protein (Inducer of CBF Expression) und vermutete, dass nach einer Kältestressexposition, die Modifikation von entweder ICE oder eines assoziierten Proteins es ICE ermöglichen würde, an CBF-Promotoren zu binden und eine CBF-Trankription zu aktivieren.
  • Eine genetische Analyse von Arabidopsis-Pflanzen, die das Leuchtkäferluciferase-Reportergen exprimieren, was durch den CRT/DRE-Element enthaltenden RD29A-Promoter veranlasst wird, (Ishitani et al. 1997) hat mehrere Mutanten mit einer deregulierten kälteresponsiven Geneexpression identifiziert. Die hos1-Mutante (high expression of osmotically responsive genes) zeigt eine verbesserte Kälteinduktion von CBFs und ihren stromabwärts liegenden kälteresponsiven Genen (Ishitani et al. 1998). HOS1 codiert ein RING-Finger-Protein, das bei normalen Wachstumstemperaturen im Cytoplasma vorhanden ist, aber nach einer Kältebehandlung im Zellkern akkumuliert. Da von vielen RING-Finger-Proteinen bekannt ist, als Ubiquitin-E3-Ligasen zu fungieren, wurde für HOS1 vorgeschlagen, dass es funktioniert, indem es an (einen) bestimmte(n) positive(n) CBF-Regulator(en) für Ubiquitinierung und Degradation bindet (Lee et al. 2001). Die Transkription von CBF-Genen unterliegt auch einer Feedback-Hemmung durch ihr eigenes Genprodukt oder ihrer stromabwärts liegenden Zielgenprodukte. Dies wurde durch Untersuchungen der los1-Mutante, deren translationales Elongationsfaktor-2-Gen geschädigt ist, gezeigt (Guo et al. 2002). Die los1-Mutation blockiert die Kälteinduktion von Genen mit dem CRT/DER-Element, aber verursacht eine Superinduktion der CBF-Gene. Es wurde gezeigt, dass eine Proteinsynthese in los1-Pflanzen spezifisch in der Kälte unterbrochen wird. Somit können kälteinduzierte CBF-Transkripte nicht translatiert werden, um stromabwärts liegende Gene zu aktivieren und eine Feedback-Hemmung kann nicht stattfinden, was zu einer Superinduktion von CBF-Transkripten führt (Guo et al. 2002).
  • Eine weitere Arabidopsis-Mutation, los2, beeinträchtigt ebenfalls die Kälteinduktion von CRT/DER-Element enthaltenden Genen (Lee et al. 2002). LOS2 codiert eine bifunktionale Enolase, die an den ZAT10-Promotor, einen Zinkfinger-Trankriptionsrepressor, binden kann. Eine ZAT10-Expression wird im Wildtyp schnell und transient durch Kälte induziert und diese Induktion ist in der los2-Mutante stärker und dauert länger an. Deshalb kann LOS2 die Expression von verzögerten kälteresponsiven Genen über eine Transkriptionsrepression von ZAT10 kontrollieren (Lee et al. 2002). Der Arabidopsis LOS4-Lokus ist bei der Akkumulation von CBF-Transkripten während einer Kältebehandlung beteiligt (Gong et al. 2002). los4-1 Pflanzenmutanten sind empfindlich gegenüber Kühlstress und die Kühlempfindlichkeit kann durch eine ektopische Expression von CBF3 erhalten werden (Gong et al. 2002). LOS4 codiert eine DEAD-Box-RNA-Helikase und lässt vermuten, dass ein RNA-Stoffwechsel an Kälteantworten beteiligt sein könnte.
  • Da Umweltfaktoren wie Kälte die geographische Verbreitung und Vegetationszeit von vielen Pflanzenarten einschränken und oftmals die Erntequalität und -produktivität nachteilig beeinflussen, bleibt ein anhaltender entscheidender Bedarf bestehen, die Kälteakklimatisierung bei Pflanzen, insbesondere bei den Pflanzen die vorteilhafterweise als Nutzpflanzen nützlich sind, zu verbessern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung bei Pflanzen zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung Pflanzen und Pflanzenzellen, die eine verbesserte Kälteakklimatisierung haben, zur Verfügung zu stellen.
  • Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung und andere Aufgaben, können mit einem Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung bei Pflanzen, umfassend eine Überexpression von ICE1 in der Pflanze, gelöst werden.
  • Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung können auch mit einem Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung in einer Pflanzenzelle, umfassend eine Überexpression von ICE1 in der Pflanzenzelle, gelöst werden.
  • Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung können auch mit einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, die mit einer ICE1-codierenden Nukleinsäure transformiert wurden, gelöst werden.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden:
    ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Pflanze oder Pflanzenzelle, durch Transformieren einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle mit einer ICE1-codierenden Nukleinsäure;
    ein isoliertes und gereinigtes ICE1 mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
    ein Verfahren zum Herstellen des oben beschriebenen ICE1, umfassend Kultivieren von Wirtszellen, die mit einer ICE1-codierenden Nukleinsäure unter Bedingungen unter denen ICE1 exprimiert wird, transformiert wurden, und Isolieren von ICE1;
    ein isoliertes und gereinigtes Enzym mit einer ICE1-Transkriptionsaktivator-Aktivität, wobei die Aminosäuresequenz des Enzyms eine Homologie von 70% bis weniger als 100% gegenüber SEQ ID NO: 2 hat;
    ein Verfahren zum Herstellen des beschriebenen Enyzms, umfassend Kultivieren von Wirtszellen, die mit einer Nukleinsäure, die das Enzym codiert, unter Bedingungen unter denen das Enyzm exprimiert wird, transformiert wurden, und Isolieren des Enyzms.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung von Kälteakklimatisierung in einer Pflanze zur Verfügung, umfassend eine Überexpression eines ICE1-Transkriptionsaktivators in der Pflanze.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung in einer Pflanze durch Steigerung der Expression von einem oder mehreren zusätzlichen Transkriptionsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem CBF-Transkriptionsfaktor und einem DREB 1-Transkriptionsfaktor und/oder durch die Steigerung der Expression von einem oder mehreren kälteresponsiven Genen, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung wurde unter Verwendung eines genetischen Screens (Chinnusamy et al. 2002) durchgeführt, um Kälte signalisierende Komponenten die stromaufwärts von den CBF-Proteinen liegen, zu identifizieren. Eine kälteresponsive biolumineszente Arabidopsis-Pflanze wurde gentechnisch bearbeitet, so dass sie die Leuchtkäferluciferase (LUC) codierende Sequenz, die unter der Kontrolle des CBF3-Promotors steht, exprimiert. Homozygote CBF-LUC-Pflanzen wurden chemisch mutiert und eine Lumineszenzmessung isolierte Mutanten mit einer veränderten kälteinduzierten CBF3-LUC-Expression. In der vorliegenden Erfindung beschreiben die Erfinder die ice1-Mutante (für inducer of CBF expression 1), die beeinträchtigt ist, was die Kälteinduktion von CBF3-LUC betrifft und defizient bezüglich der Kälteakklimatisierung ist. ICE1 codiert einen MYC-artigen basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsaktivator, der an den CBF3-Promotor bindet. Somit spielt ICE1 eine Schlüsselrolle in der Regulation von kälteresponsiver Genexpression und Kältetoleranz in Arabidopsis.
  • Die oben genannten Aufgaben heben bestimmte Aspekte der Erfindung hervor. Zusätzliche Aufgaben, Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung finden sich in der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Eine umfassendere Würdigung der Erfindung und viele der damit einhergehenden Vorteile werden, sowie diese durch den Verweis auf die folgenden Figuren in Verbindung mit der untenstehenden ausführlichen Beschreibung besser verständlich werden, leicht zugänglich sein.
  • 1. Die ice1-Mutation blockiert die Kälteinduktion von CBF3 und beeinträchtigt die Expression von anderen kälteresponsiven Genen. (A) Morphologie (links) und CBF3-LUC-Luminsezenzabbildungen (rechts) von Wildtyp- und ice1-Keimlingen. Lumineszenzabbildungen der Pflanzen wurden nach 12 h Kältebehandlung (0°C) aufgenommen. (B) Quantifizierung der Lumineszenzintensitäten von Wildtyp-Keimlingen (geschlossene Kreise) und ice1-Keimlingen (offene Kreise) als Antwort auf verschiedene Kältebehandlungszeitspannen. (C) Transkriptionsniveaus von CBFs und ihrer stromabwärts liegenden Zielgene in Wildtyp- und ice1-Pflanzen, als Antwort auf eine Kältebehandlung. Die Keimlinge waren entweder unbehandelt (0 h) oder für die angegebenen Zeitspanne (h) mit Kälte behandelt. Das Tubulingen wurde als Ladekontrolle verwendet. WT, Wildtyp.
  • 2. Morphologie, und Frost- und Kühlempfindlichkeit von ice1-mutierten Pflanzen. (A) Wildtyp- und ice1-Keimlinge in Nährmedium auf Agar unter normalen Wachstumsbedingungen. (B) Wildtyp- und ice1-Pflanzen auf Erde unter normalen Wachstumsbedingungen. (C) ice1-Pflanzen, die defizient bezüglich einer Kälteakklimatisierung sind. Zehn Tage alte Keimlinge, die bei 22°C gewachsen waren, wurden vor einer Gefrierbehandlung bei –12°C, für 4 Tage bei 4°C an Licht inkubiert. Die Aufnahme wurde 3 Tage nach der Frostbehandlung gemacht. (D) Vergleich der Überlebensraten nach Frostbehandlungen bei den angegebenen Temperaturen. Offene Kreise und offene Dreiecke repräsentieren Wildtyp beziehungsweise ice1-Pflanzen. (E) ice1-Pflanzen sind empfindlich gegenüber anhaltender Kühlbehandlung. Nach einer Keimung bei 22°C, wurden die Pflanzen bei 4°C für 6 Wochen wachsen lassen. (F) Vergleich von Überlebensraten nach 6 Wochen Kühlstress.
  • 3. Bestätigung der ICE1-Genklonierung durch Exprimieren des dominanten ice1-Mutantenallels in Wildtyppflanzen. (A) Expression eines genomischen Fragments im Wildtyp, das die ice1-Mutation enthält, wiederholt den ice1-Mutantenphänotyp. Sieben Tage alte, auf MS Agarmedium gewachsene Keimlinge des Wildtyps, von ice1 und des Wildtyps, der mit dem mutierten ice1-Gen transformiert war, wurden nach 12 h Kältestress (0°C) Lumineszenzmessungen unterworfen. (B) Quantifizierung der CBF3-LUC- Biolumineszenzniveaus nach 12 h Kältestress (0°C) im Wildtyp (WT), ice1 und im WT, der mit dem mutierten ice1-Gen transformiert war.
  • 4. ICE1 codiert ein bHLH-Protein. (A) Domänengesamtstruktur des ICE1-Proteins. Ein mutmaßliche saure Domäne (sauer), eine serinreiche (S-reich), eine bHLH-Domaine und eine mögliche Zipperregion (ZIP) sind angezeigt. Die Pfeile zeigen den geänderten Aminosäurenrest in der ice1-Mutante. (B) Sequenzalignment der bHLH-Domänen und ZIP-Regionen von ICE1 und anderen pflanzlichen und tierischen bHLH-Proteinen. Identische und ähnliche Reste sind in schwarz beziehungsweise in grau gezeigt. Eine durchgezogene Linie zeigt die basische Region und offene Kästchen, die mit einem Loop verbunden sind, zeigen die Helix-Loop-Helix-Domäne. Die Zipperregion ist als gestrichelte Linie dargestellt. DDJB/EMBUGenBank Zugangsnummern und Aminosäurenummern (in Klammern) sind: ICE1 (SEQ ID NO: 2), AY195621 (300-398), At1g12860 (SEQ ID NO: 3), NM_101157 (638-731); At5g65640 (SEQ ID NO: 4), NM_125962.1 (171-269); At5g10570 (SEQ ID NO: 5), NM_121095.2 (144-242); rd22BP (SEQ ID NO: 6), AB000875 (446-544); ATR2 (SEQ ID NO: 7), NM_124046.1 (409-507); Mais R-Gen (SEQ ID NO: 8), M26227 (410-508); TT8 (SEQ ID NO: 9), AJ277509 (357-455); PIF3 (SEQ ID NO: 10), AF100166 (254-352); PIF4 (SEQ ID NO: 11), AJ440755 (255-353); MAX (SEQ ID NO: 12), P52161 (21-107); c-myc (SEQ ID NO: 13), 1001205A (354-435). Ein Sternchen zeigt MAX-Aminosäurereste, von denen bekannt ist, dass sie mit Nukleotiden reagieren (Grandore et al. 2000).
  • 5. Expression des ICE1-Gens und subzelluläre Lokalisierung des ICE1-Proteins. (A) Durch einen ICE1-Promotor angetriebenes GUS-Expressionsmuster in einem Wldtypkeimling. (B) ICE1-Promotor-GUS-Expression in verschiedenen Pflanzengeweben und die entsprechenden ICE1-Transkriptionsniveaus, die durch eine RT-PCR-Analyse bestimmt wurden. Das Tubulingen wurde als eine interne Kontrolle in der RT-PCR verwendet. (C) RNA-Blot-Analyse einer ICE1-Expression in Wildtypsetzlingen unter verschiedenen abiotischen Stressfaktoren. Es sind Pflanzen mit den folgenden Behandlungen gezeigt: Kontrolle, nur MS-Salz; NaCl, 300 mM NaCl für 5 h; ABA, 100 μM Abscisinsäure für 5 h; Kälte, 0°C für 2 h; Dehydrierung, Lufttrocknung für 30 min. (D) Lokalisierung des GFP-ICE1-Fusionsproteins im Kern. Die Abbildungen (a)-(c) zeigen konfokale Abbildungen von Wurzelzellen in GFP-ICE1 transgenen Pflanzen, wobei Abbildung (d) die durch Propidiumfärbung kenntlich gemachte Lokalisierung der Kerne zeigt.
  • 6. Das ICE1-Protein bindet an die MYC-Erkennungselemente im CBF3-Promotor. (A) Sequenzen und Positionen von Oligonukleotiden innerhalb des CBF3-Promotors, die für ein EMSA verwendet werden. Fette Buchstaben kennzeichnen Sequenzen des MYC-Erkennungsmotivs in MYC-1 (SEQ ID NO: 38), MYC-2 (SEQ ID NO: 37), MYC-3 (SEQ ID NO: 36), MYC-4 (SEQ ID NO: 35) und MYC-5 (SEQ ID NO: 34). Fette Buchstaben im P1-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 39) sind ein vermeindliches MYB-Erkennungsmotiv. Die mit P2, MYC-2 (wt) und MYC-2 (M) markierten Sequenzen, entsprechen (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41) beziehungsweise (SEQ ID NO: 42). (B) Wechselwirkung zwischen ICE1-Protein und 32P-markierten MYC-1 bis MYC-4-DNA-Fragmenten. (C) ICE1 bindet an das MYC-2-DNA-Fragment stärker als an die anderen DNA-Fragmente. (D) Konsensusnukleotidreste im MYC-Erkennungsmotiv sind wichtig für die Wechselwirkung zwischen ICE1 und dem MYC-2-DNA-Fragment. (E) Die ice-Proteinmutante bindet auch an das MYC-2-DNA-Fragment. Die in jedem Experiment verwendeten markierten Oligonukleotide sind oberhalb jeder Abbildung angegeben. Dreiecke deuten die zunehmenden Mengen von unmarkierten Oligonukleotiden für eine Kompetition in (B), (C) und (D) an, die dem 50-, 100- und 250-fachen Überschuss einer jeden Sonde entsprechen.
  • 7. ICE1 ist ein Transkriptionsaktivator und seine Überexpresssion verstärkt in der Kälte das CBF-Regulon und verbessert die Frosttoleranz. (A) Schematische Darstellung der in dem transienten Expressionsassay verwendeten Reporter- und Effektorplasmide. Ein GAL4-responsives Reportergen wurde in diesem Experiment verwendet. Nos bezeichnet das Terminatorsignal des Nopalin-Synthase-Gens. Ω bezeichnet den Translationsenhancer des Tabakmosaikvirus. GAL4 DB ist die DNA-Bindungsdomäne des Hefe- Transkriptionsfaktors GAL4. (B) Relative Luciferaseaktivitäten nach Transfektion mit GAL4-LUC und 35S-GAL4-ICE1 oder 35S-GAL4-ice1. Um die nach jeder Transfektion erhaltenen Werte zu normalisieren, wurde ein Luciferasegen von Renilla als interne Kontrolle verwendet. Luciferaseaktivität wird in beliebige Einheiten relativ zur Aktivität von Renilla-Luciferase (wie beschrieben in Ohta et al. 2001) ausgedrückt. Die Werte sind Durchschnittswerte von drei Bombardements und Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen an. (C) RNA-Blot-Analyse von ICE1 und kälteresponsiver Genexpression in Wildtyp und ICE1-überexprimierenden transgenen (Super-ICE1)-Pflanzen. Die Keimlinge waren entweder unbehandelt (0 h) oder für 3 oder 6 h mit niedrigen Temperaturen (0°C) behandelt. Ethidiumbromid-gefärbte rRNA-Banden sind als Ladekontrolle gezeigt. (D) CBF3-LUC-Expression (gezeigt als Lumineszenzintensität) in Wildtyp und ICE1-überexprimierenden transgenen (Super-ICE1)-Pflanzen. (E) Gesteigerte Überlebensrate von ICE1-überexprimierenden transgenen (Super-ICE1)-Pflanzen nach einer Frostbehandlung.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Falls nicht anders angegeben, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Bezeichnungen dieselbe Bedeutung wie sie im Allgemeinen durch einen Fachmann der Biochemie, Zellbiologie und Molekularbiologie verstanden wird.
  • Alle Methoden und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, können, für die Anwendung oder das Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei geeignete Methoden und Materialien hier beschriebenen werden. Auf alle Publikationen, Patentanmeldungen, Patente und andere hier verwendete Referenzen wird hier vollinhaltlich Bezug genommen. Im Konfliktfall, wird die vorliegende Spezifizierung, einschließlich der Definitionen, maßgebend sein. Weiterhin sind die Materialien, Methoden und Beispiele ausschließlich illustrativ und sind, falls nicht anders angegeben, nicht als einschränkend gedacht.
  • Es werden Referenzen zu Standardtextbüchern der Molekularbiologie gemacht, die Definitionen und Verfahren und Hilfsmittel zum Ausführen von grundlegenden Methoden enthalten, die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden. Siehe, zum Beispiel, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1982) und Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989) Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., Eds., Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1995); Arabidopsis, Meyerowitz et al, Eds., Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1994) und die verschiedenen darin zitierten Referenzen.
  • Der Begriff „Pflanze" schließt ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (z.B. Blätter, Stengel, Wurzeln, etc.), Samen und Pflanzenzellen und deren Nachkommen mit ein. Die Pflanzenklasse, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist im Allgemeinen so breit wie die Klasse höherer Pflanzen, die zugänglich für Transformationsmethoden ist, einschließlich monokotyledoner als auch dikotyledoner Pflanzen. Bevorzugte Pflanzen schließen Reis, Mais, Weizen, Baumwolle, Erdnuss und Sojabohne mit ein.
  • Somit kann in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die Kälteakklimatisierung durch Erhöhen der verfügbaren Proteinmenge in der Pflanze, vorzugsweise durch die Steigerung des ice1-Gens in der Pflanze, gesteigert oder verbessert werden.
  • Somit verwendet eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Pflanzenzellen, die Polynukleotide, die nützlich in der vorliegenden Erfindung sind, enthalten und vorzugsweise transgene Pflanzen, die die isolierten Polynukleotide, die nützlich in der vorliegenden Erfindung sind, enthalten.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Steigerung" eine Erhöhung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen in einer Pflanzenzelle und/oder Pflanze, die durch die entsprechende DNA codiert sind. Eine Steigerung kann mit Hilfe von verschiedenen Manipulationen der bakteriellen Zelle erreicht werden. Um eine Verbesserung zu erreichen, insbesondere eine Überexpression, kann die Kopienzahl des entsprechenden Gens erhöht werden, ein starker Promotor verwendet werden, oder die Promotor- und Regulationsregion oder die ribosomale Bindungsstelle, die stromaufwärts bezogen auf das Strukturgen gelegen ist, kann mutiert werden. Expressionskassetten, die stromaufwärts bezogen auf das Strukturgen enthalten sind, können auf die gleiche Art und Weise funktionieren. Zusätzlich ist es möglich, die Expression durch das Verwenden von induzierbaren Promotoren zu erhöhen. Es kann auch ein Gen verwendet werden, das ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert. Die Expression kann auch durch Mittel zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA verbessert werden. Darüber hinaus erhöht die Verhinderung des Enyzmabaus die Enyzmaktivität als ganzes. Außerdem können diese Maßnahmen optional auf jede beliebige Art und Weise kombiniert werden. Diese und andere Verfahren zur Veränderung der Genaktivität in Pflanzen sind wie beschrieben bekannt, z.B. in Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al, Eds., Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1995).
  • Eine wie hier verwendete „Expressionskassette", schließt einen Promotor mit ein, der in einer Pflanzenzelle funktional ist, funktionsfähig mit einer isolierte Nukleinsäure verknüpft ist, die ein ICE1-Protein von SEQ ID NO: 2 codiert, wobei eine gesteigerte Expression des Proteins in einer Pflanzenzelle der Pflanzenzelle eine gesteigerte Kälteakklimatisierung vermittelt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem viralen Hüllproteinpromotor, einem gewebespezifischen Promotor, einem monokotylen Promotor, einem Ubiquitinpromotor, einem stressinduzierbaren Promotor, einem CaMV 35S-Promotor, einem CaMV 19S-Promotor, einem Aktinpromotor, einem Cab-Promotor, einem Sucrosesynthasepromotor, einem Tubulinpromotor, einem Napin-R-Genkomplex-Promotor, einem Tomaten-E8-Promotor, einem Pataninpromotor, einem Mannopinsynthasepromotor, einem Soyabohnensamen-Glycininpromotor, einem Vegetativen-Speicherprotein-Promotor aus Sojabohnen, einem Bakteriophage-SP6-Promotor, einem Bakteriophage-T3-Promotor, einem Bakteriophage-T7-Promotor, einem Ptac-Promotor, einem Wurzellzellenpromotor, einem ARA-induzierbaren Promotor und einen turgorinduzierbaren Promotor.
  • Es kann auch ein Gen verwendet werden, dass ein korrespondierendes oder abweichendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert. Vorzugsweise hat das korrespondieren Enzym eine höhere Aktivität als die native Enzymform, bevorzugt wenigstens im Bereich von 5, 10, 25% oder 50% mehr Aktivität, insbesondere bevorzugt mehr als zweimal mehr Aktivität als das native Enzym.
  • Im Kontext der vorliegenden Anmeldung, ist eine Polynukleotidsequenz „homolog" mit der erfindungsgemäßen Sequenz, wenn wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%, insbesondere bevorzugt wenigstens 90% ihrer Basenzusammensetzung und Basensequenz der erfindungsgemäßen Sequenz entspricht. Erfindungsgemäß umfasst ein „homologes Protein" Proteine, die eine Aminosäurensequenz enthalten, wovon wenigstens 70%, wovon vorzugsweise wenigstens 80%, wovon insbesondere bevorzugt wenigstens 90% der Aminosäurensequenz entsprechen, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist oder die durch das ice1-Gen (SEQ ID NO: 1) codiert ist, wobei korrespondieren, bedeutet, dass die korrespondierenden Aminosäuren entweder identisch oder gegenseitig homologe Aminosäuren sind. Der Ausdruck „homologe Aminosäuren" bezeichnet diejenigen, die korrespondierende Eigenschaften haben, insbesondere im Hinblick auf ihre Ladung, hydrophoben Charakter, sterische Eigenschaften, etc. Somit kann das Protein von 70% bis zu weniger als 100% SEQ ID NO: 2 homolog sein.
  • Homologie, Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität von Nukleotid- oder Aminosäurensequenzen können konventionell durch Verwendung bekannter Software oder Computerprogrammen wie BestFit- oder Gap-Programmen für einen paarweisen Vergleich (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711) bestimmt werden. BestFit verwendet den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), um das beste Identitäts- oder Ähnlichkeitssegment zwischen zwei Sequenzen zu finden. Gap führt globale Alignments durch: die gesamte eine Sequenz mit der gesamten anderen Sequenz unter Verwendung der Methode von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970). Wenn ein Sequenzalignmentprogramm wie BestFit verwendet wird, um das Ausmaß der Sequenzhomologie, -ähnlichkeit oder -identität zu bestimmen, kann die Standardeinstellung verwendet werden oder es kann eine geeignete Scoring-Matrix ausgewählt werden, um die Identität, Ähnlichkeit oder Homologie-Scores zu optimieren. Es ist ähnlich, wenn ein Programm wie BestFit verwendet wird, um die Sequenzidentität, -ähnlichkeit oder -homologie zwischen zwei verschiedenen Aminosäurensequenzen zu bestimmen, es können die Standardeinstellungen verwendet werden oder es kann eine geeignete Scoring-Matrix, wie blosum45 oder blosum80 ausgewählt werden, um Identitäts- Ähnlichkeits- oder Homologie-Scores zu optimieren.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet auch Polynukleotide, die das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz, die SEQ ID NO: 1 oder Fragmenten davon entspricht, enthalten und die durch Screenen durch die Mittel der Hybridisierung einer korrespondierenden Genbank mit einer Sonde, die die Sequenz des Polynukleotids enthält, die SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon entspricht, erhalten werden können und Isolierung der DNA-Sequenz.
  • Polynukleotidsequenzen, die in dieser Erfindung nützlich sind, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um diejenigen cDNAs oder Gene zu isolieren, die einen höheren Ähnlichkeitsgrad mit der Sequenz des ice1-Gens, insbesondere des ice1-Gens mit der SEQ ID NO: 1, zeigen.
  • Polynukleotidsequenzen, die in dieser Erfindung nützlich sind, sind auch als Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Herstellung von DNA, die ein Enyzm mit ICE1-Transkriptionsaktivatoraktivität codiert, geeignet.
  • Oligonukleotide wie diese, die als Sonden oder als Primer fungieren, können mehr als 30, insbesondere bis 30, vorzugsweise bis 20, bevorzugt wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide enthalten. Oligonukleotide mit einer Länge von wenigstens 40 oder 50 Oligonukleotiden sind ebenfalls geeignet.
  • Der Ausdruck „isoliert" bedeutet getrennt von seiner natürlichen Umgebung. Der Ausdruck „Polynukleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide und kann eine unmodifizierte RNA oder DNA oder eine modifizierte RNA oder DNA bezeichnen.
  • Der Ausdruck „Polypeptide" bedeutet Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, die über Peptidbindungen verbunden sind.
  • Die Polypeptide, die in dieser Erfindung nützlich sind, schließen Polypeptide, die der SEQ ID NO: 2 entsprechen, mit ein, insbesondere diejenigen mit der biologischen Aktivität eines ICE1-Transkriptionsaktivators, und schließen auch diejenigen mit ein, wovon wenigstens 70%, wovon insbesondere wenigstens 80% mit dem Polypeptid, das der SEQ ID NO: 2 entspricht, homolog sind, und vorzugsweise diejenigen, die eine Homologie von wenigstens 90% bis 95% mit dem Polypeptid zeigen, das SEQ ID NO: 2 entspricht und die die angeführte Aktivität haben. Somit können die Polypeptide eine Homologie von 70% bis zu 100% bezogen auf SEQ ID NO: 2 haben.
  • Die Erfindung verwendet auch codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID NO: 1 durch Degeneration des genetischen Codes ergeben. Auf die gleiche Art und Weise, verwendet die Erfindung ferner DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 1 oder Teilen von SEQ ID NO: 1 hybridisieren. Darüber hinaus ist sich der Fachmann auch bewusst, dass ein konservativer Aminosäurenaustausch, wie der Austausch von Glycin durch Alanin oder von Asparaginsäure durch Glutaminsäure in Proteinen „Sense- Mutationen" sind, die in keiner grundlegenden Änderung in der Aktivität des Proteins resultieren, d.h. die funktionell neutral sind. Es ist auch bekannt, dass Änderungen im N- und/oder C-Terminus eines Proteins nicht wesentlich deren Funktion beeinträchtigen und sogar die Funktion stabilisieren könnten.
  • Auf die gleiche Art und Weise verwendet die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 1 oder mit Teilen von SEQ ID NO: 1 hybridisieren. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die durch eine Polymerasekettenreation (PCR) unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die sich aus SEQ ID NO: 1 ergeben, hergestellt werden. Oligonukleotide dieser Art haben typischerweise eine Länge von wenigsten 15 Nukleotiden.
  • Die Ausdrücke „stringente Bedingungen" oder „stringente Hybridisierungsbedingungen" schließen eine Bezugnahme zu Bedingungen unter denen ein Polynukleotid in einem detektierbaren größeren Ausmaß als andere Sequenzen (z.B. wenigstens 2-fach höher als der Untergrund) an seine Zielsequenz hybridisieren wird, mit ein.
  • Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich. Durch Kontrollieren der Stringenz der Hybridisierung und/oder der Waschbedingungen, können Zielsequenzen identifiziert werden, die zu 100% der Sonde komplementär sind (homologes Sondieren). Alternativ können Stringenzbedingungen angepasst werden, um etwas Mismatching in den Sequenzen zu erlauben, so dass niedrigere Ähnlichkeitsgrade detektiert werden (heterologes Sondieren).
  • Typischerweise werden stringente Bedingungen diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration niedriger als 1,5 M Na-Ionen ist, typischerweise ungefähr 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 und die Temperatur wenigstens bei ungefähr 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und wenigstens bei ungefähr 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nukleotide) liegt. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie Formamid erhalten werden. Beispielhafte wenig stringente Bedingungen schließen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung mit 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und Waschen in 1× bis 2× SSC (20× SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C mit ein. Beispielhafte moderat stringente Bedingungen schließen eine Hybridisierung in 40 bis 45% Fromamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,5× bis 1× SSC bei 55 bis 60°C mit ein. Beispielhafte hoch stringente Bedingungen schließen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,1× SSC bei 60 bis 65°C mit ein.
  • Spezifität ist typischerweise die Funktion von Posthybridisierungswäschen, wobei die Ionenstärke und die Temperatur der finalen Waschlösung die kritischen Faktoren sind. Für DNA-DNA-Hybriden kann die Tm über die Gleichung von Meinkoth und Wahl Anal. Biochem., 138:267-284 (1984): Tm = 81.5°C + 16.6 (logM) + 0.41 (%GC) – 0.61 (% form) – 500/L abgeschätzt werden; wobei M die Molarität der monovalenten Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin- und Cytosinnukleotiden in der DNA ist, % form der prozentuale Formamidanteil in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und pH) bei der 50% einer komplementären Zielsequenz an eine vollkommen passende Sonde hybridisiert. Die Tm wird für jedes 1% Mismatching um ungefähr 1°C reduziert; somit können Tm, Hybridisierung und/oder Waschbedingungen angepasst werden, um an Sequenzen mit der gewünschten Identität zu hybridisieren. Werden beispielsweise Sequenzen mit ungefähr 90% Identität gesucht, so kann die Tm um 10°C gesenkt werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie bei definierter Ionenstärke und pH für die spezifische Sequenz und ihren Komplementärstrang ungefähr 5°C niedriger sind, als der thermale Schmelzpunkt Tm. Jedoch können für hoch stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 1, 2, 3, oder 4°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) verwendet werden; für moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C niedriger als der Schmelzpunkt Tm verwendet werden; für wenig stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15, oder 20°C niedriger als der Schmelzpunkt verwendet werden. Durch Verwenden der Gleichung, der Hybridisierung und der Waschlösungszusammensetzungen und der gewünschten Tm, wird der Fachmann verstehen, dass Variationen der Stringenz der Hybridisierung und/oder Waschlösungen an sich beschrieben sind. Falls das gewünschte Ausmaß an Mismatchingergebnissen in einer Tm von weniger als 45°C (wässriger Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration so zu erhöhnen, dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann.
  • Eine ausführliche Anleitung für die Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel, et al, Eds., Greene Publishing und Wiley-Intersciene, New York (2000).
  • Somit kann der Fachmann mit der vorangehenden Information Polynukleotide identifizieren und isolieren, die im Wesentlichen den vorliegenden Nukleotiden ähnlich sind. Indem auf diese Weise ein solches Polynukleotid isoliert wird, kann das Polynukleotid als das vorliegende Polynukleotid verwendet werden, um beispielsweise die Kälteakklimatisierung einer Pflanze zu verbessern.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Screeningverfahren für Polynukleotide, die eine wesentliche Homologie zu den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung haben, vorzugsweise zu den Polynukleotiden, die ein Protein mit einer ICE1-Transkriptionsaktivatoraktivität codieren.
  • Die Poylnukleotidsequenzen die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können in einem oder mehreren geeigneten Plasmidvektoren enthalten sein, wie aus dem Stand der Technik für Pflanzen oder ähnlichem bekannt ist.
  • In einer Ausführungsform kann es vorteilhaft sein, das Polynukleotid zu vermehren, damit es in einem Bakterien- oder Pilzstamm mit dem geeigneten Vektor, der für den Zelltyp geeignet ist, enthalten ist. Gängige Verfahren, um in diesen Zelltypen Oligonukloetide zu vermehren und Proteine herzustellen sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982) und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989) beschrieben.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynukleotid die SEQ ID NO: 1, Polynukleotide die SEQ ID NO: 1 komplementär sind, Polynukleotide die wenigstens 70%, 80% und 90% identisch mit SEQ ID NO: 1 sind; oder die Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit SEQ ID NO: 1 hybridisieren, die stringenten Bedingungen umfassen Waschen in 5× SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C. Somit kann das Polynukleotid von 70% bis zu weniger als 100% identisch mit SEQ ID NO: 1 sein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform befinden sich die Polynukleotide, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, in einem ein Vektor und/oder einer Wirtszelle. Vorzugsweise sind die Polynukleotide in einer Pflanzenzellen oder einer transgenen Pflanze. Vorzugsweise ist die Pflanze Arabidopsis thaliana oder ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Weizen-, Mais-, Erdnuss-, Baumwolf-, Hafer- und Sojabohnenpflanzen. In einer bevorzugten Ausführungsform, sind die Polynukleotide funktionsfähig mit einem Promotor, vorzugsweise einem induzierbaren Promotor verknüpft.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden:
    Verfahren zum Screening von Polynukleotiden, die ein Protein mit ICE1-Transkriptionsaktivatoraktivität codieren, umfassend Hybridisieren des Polynukleotids der Erfindung an das zu screenende Polynukleotid; Exprimieren des Polynukleotids um ein Protein herzustellen; und Detektieren des Vorliegens oder Fehlens von ICE1-Transkriptionsaktivatoraktivität im Protein;
    Verfahren zum Detektieren einer Nukleinsäure mit wenigstens 70% Homologie zur Nukleotid SEQ ID NO: 1, Sequenzen die SEQ ID NO: 1 komplementär sind und/oder die ein Protein, das die Aminosäurensequenz in SEQ ID NO: 2 hat, codieren, umfassend Kontaktieren einer Nukleinsäurenprobe mit einer Sonde oder einem Primer, umfassend wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide des entsprechenden Komplementärstrangs;
    Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure mit wenigstens 70% Homologie zu den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung, umfassend Kontaktieren einer Nukleinsäurenprobe mit einem Primer, umfassend wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide des entsprechenden Komplementärstrangs;
    ein Verfahren zum Herstellen von ICE1-Proteins, umfassend Kultivieren der Wirtszelle, die die Polynukleotide der Erfindung für eine gewisse Zeit und unter Bedingungen, die für die Expression von ICE1 geeignet sind, enthält, und Sammeln des ICE1;
    ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze, umfassend das Einschleusen der erfindungsgemäßen Polynukleotide in die Pflanze.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung einer Pflanze, die dies benötigt, zur Verfügung, umfassend Einschleusen des erfindungsgemäßen Polynukleotids in die Pflanze.
  • Verfahren, Vektoren und Zusammensetzung zum Transformieren von Pflanzen und Pflanzenzellen, die in der Erfindung nützlich sind, sind dem Fachmann bekannt und unterliegen keiner besonderen Beschränkung. Für eine anschauliches Beispiel siehe Karimi et al., TRENDS in Plant Science, Vol. 7, NO: 5, Mai 2002, Seiten 193-195, auf das hier Bezug genommen wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, umfassend die Aminosäurensequenz in SEQ ID NO: 2 oder diejenigen Proteine, die wenigstens 70%, insbesondere 80%, bevorzugt 90% und besonders bevorzugt 95% Identität mit SEQ ID NO: 2 haben, wobei die Polypeptide ICE1-Transkriptionsaktivatoraktivität haben. Somit hat das Enzym eine Homologie von 70% bis weniger als 100% Homologie zu SEQ ID NO: 2.
  • In einer weiteren Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung in einer Pflanze zur Verfügung, umfassend Überexpression eines ICE1-Transkriptionsaktivators in der Pflanze.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Verbesserung der Kälteakklimatisierung in einer Pflanze durch Erhöhung der Expression von einem oder mehreren zusätzlichen Transkriptionsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem CBF-Transkriptionsfaktor und einem DREB1-Transkriptionsfaktor und/oder durch Steigerung der Expression von einem oder mehreren kälteresponsiven Genen, zur Verfügung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließt der Ausdruck „kälteresponsive Gene" Gene mit ein, die ein Protein codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym, das an Kohlenhydratrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Kohlenhydratmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Lipidrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Lipidmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Phenylpropanoidrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Phenylpropanoidmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Antioxidansrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Metabolismus von Antioxidanzien beteiligt ist, einem molekularen Chaperon, einem Frostschutzprotein und einem Protein, das an Toleranz gegen Dehydrierung als Folge von Frost beteiligt ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Verwendung eines genetischen Screens (Chinnusamy et al. 2002) durchgeführt, um Kälte signalisierende Proteine, die stromabwärts bezogen auf die CBF-Proteine liegen, zu identifizieren. Eine Kälte responsive biolumineszente Arabidopsis-Pflanze wurde genetisch bearbeitet, so dass sie die Leuchtkäferluciferase-(LUC) kodierende Sequenz unter der Kontrolle des CBF3-Promotors exprimiert. Homozygote CBF3-LUC-Pflanzen wurden chemisch mutiert und Lumineszenzmessungen isolierten Mutanten mit einer veränderten kälteinduzierten CBF3-LUC Expression. In der vorliegenden Erfindung, beschreiben die Erfinder die ice1 (for inducer of CBF expression 1)-Mutante, die in der Kälteinduktion von CBF3-LUC beeinträchtigt ist und geschädigt bezüglich einer Kälteakklimatisierung ist. ICE1 codiert einen MYC-artigen basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsaktivator, der an den CBF3-Promotor bindet. Somit spielt ICE1 eine Schlüsselrolle beim Regulieren von kälteresponsiver Genexpression und Kältetoleranz in Arabidopsis.
  • Diskussion
  • Kalte Temperaturen lösen die Transkription der CBF-Transkriptionsfaktorenfamilie aus, die ihrerseits die Transkription von Genen, die das DRE/CRT-Promotorelement enthalten, aktivieren (Thomashow 1999). Die CBF-Zielgene schließen vermutlich einige Transkriptionsfaktoren mit ein (Fowler und Thomashow 2002). Somit erfordert das Signalisieren von Kälte für die Frosttoleranz eine Kaskade von Transkriptionsregulationen. In der vorliegenden Untersuchung haben wir ICE1 identifiziert, einen sehr weit stromaufwärts gelegenen Faktor dieser Kaskade. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ICE1 ein positiver Regulator von CBF3 ist und eine entscheidenden Rolle in der Kälteakklimatisierung einnimmt. ICE1 codiert einen MYC-artigen bHLH-Transkriptionsfaktor. Im CBF3-Promotor gibt es fünf mögliche MYC-Erkennungssequenzen, während CBF1- und CBF2-Promotoren jeweils ein derartiges Element enthalten (Shinwari et al. 1998). Dies ist konsistent mit der Tatsache, dass CBF3 stärker von der ice1-Mutation betroffen ist, als es CBF1 oder CBF2 sind. DNA-Bindungsassays haben gezeigt, dass ICE1 spezifisch an die MYC-Erkennungssequenzen auf dem CBF3-Promotor, aber nicht an eine putative MYB-Erkennungssequenz binden kann (6). Die ice1-Mutation hebt die CBF3-Expression auf und reduziert die Expression von CBF-Zielgenen in der Kälte. Konsistent mit seiner Rolle in der kälteresponsiven Genregulation, ist ICE1 wichtig für die Kühl- und Frosttoleranz von Arabidopsis-Pflanzen.
  • Die ice1-Mutation beeinflusst auch die Kälteinduktion von CBF1 und CBF2; ihre Expression ist in der Kälte leicht reduziert, aber zu späteren Zeitpunkten ist die Expression nicht reduziert. Stattdessen ist die Expression von CBF2 in der ice1-Mutatante nach 6 und 12 Stunden Kältebehandlung sogar erhöht. Von der CBF-Genexpression ist bekannt, dass sie durch ihre eigenen Genprodukte oder den Produkten der eigenen stromabwärts liegenden Zielgenen unterdrückt wird (Guo et al 2002). Die Korrelation zwischen der reduzierten CBF3-Expression und erhöhter CBF2-Induktion deutet an, dass CBF3 die CBF2-Expression unterdrücken könnte. Wenn ein CBF2-Gen unterbrochen wird, zeigen CBF1 und CBF3 eine länger anhaltende Induktion in der Kälte (Julio Salinas, persönliche Mitteilung), was andeutet, dass CBF2 die Expression von CBF1 und CBF3 unterdrücken könnte. Die potentielle gegenseitige negative Regulation zwischen den CBF-Transkriptionsfaktorgenen könnte für die Gewährleistung, dass ihre Expression transient und eng kontrolliert ist, wichtig sein.
  • Von den drei CBF-Genen wird im Allgemeinen angenommen, dass sie funktionell redundant sind. Ihr individueller Beitrag wurde noch nicht durch eine loss-of-function-Analyse untersucht. Obwohl die ice1-Mutation nur die Expression von CBF3 blockiert, sind stromabwärts liegende Gene wie RD29A, COR15A und COR47 wesentlich betroffen. Dies deutet an, dass CBF3 eine entscheidende Rolle in der Kälteregulation dieser Gene spielt. Im Vergleich dazu ist die Kälteregulation von KIN1 von der ice1-Mutation weniger beeinträchtigt. Somit ist es möglich, dass jedes der drei CBF-Gene seinen eigenen Satz von bevorzugten Zielgenen haben könnte.
  • ICE1 wird in allen Geweben konstitutiv exprimiert (5A und 5B) und wird von Kälte nur wenig hochreguliert (5C). Konsistent mit dem was für „ICE1"-Proteine spekuliert wurde (Gilimour et al. 1998), scheinen eine kälteinduzierte Modifikation des ICE1-Proteins oder eines Transkriptionscofaktors für ICE1 notwendig zu sein, um die Expression von CBFs zu aktivieren. Unsere Anhaltspunkte unterstützen dies, da ICE1 konstitutiv exprimiert wird und im Zellkern lokalisiert ist, aber die CBF-Expression eine Kältebehandlung erfordert; und transgene Linien, die ICE1 konstitutiv überexprimieren, zeigen keine CBF3-Expression bei warmen Temperaturen, haben aber ein höheres CBF3-Expressionsniveau bei kalten Temperaturen. Die Fähigkeit von Transkriptionsfaktoren eine Gentranskription zu aktivieren, kann im Cytoplasma oder im Zellkern durch Proteinphosphorylierung und -dephosphorylierung reguliert werden (berichtet von Liu et al. 1999). Die ice1-Mutation liegt sehr nah an potentiellen Serinphosphorylierungsstellen (Ser243 und Ser245) was somit die Phosphorylierung/Dephosphorylierung von ICE1 beeinflussen könnte.
  • Es ist bekannt, dass MYC-ähnliche bHLH-Transkriptionsfaktoren MYB-Kotranskriptionsfaktoren und/oder WD-Repeat enthaltende Faktoren zur Trankriptionsaktivierung von Zielgenen benötigen (Spelt et al. 2000; Walker et al. 1999). Die CBF-Promotoren enthalten sowohl MYC als auch potentielle MYB-Erkennungssequenzen (Shinwari et al. 1998), was andeutet, dass ein MYC-ähnlicher Transkriptionsfaktor auch an der Kälteinduktion von CBFs beteiligt sein könnte. Die ice1-Mutation, in der Arg236 mit His substituiert ist, kann durch eine Heterooligomerbildung zwischen ICE und einem ICE1-artigen Protein oder einem MYB zugehörigen Kofaktor interferieren. Alternativ könnte der vermeindliche dominante Negativeffekt von ice1 eine Folge einer ice1-Interferenz mit potentieller ICE1-Homooligomerbildung, Proteinstabilität, Kernlokalisation oder kälteinduzierter posttranslationaler Modifikation von ICE1 sein.
  • Nach einem allgemeinen Beschreiben dieser Erfindung, kann weiteres Verständnis durch Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele gewonnen werden, die hier ausschließlich zum Zweck der Veranschaulichung zur Verfügung gestellt werden, und sofern nicht anders beschrieben, nicht als einschränkend gedacht sind.
  • Beispiele
  • Materialien und Methoden
  • Pflanzenmaterialien und Mutantenisolierung:
  • Der CBF3-Promotor, eine Region von 1126 bis 100 bp stromaufwärts gelegen, bezogen auf des Startkodon, wurde unter Verwendung des folgenden Primerpaars: 5'-TCATGGATCCACCATTTGTTAATGCATGATGG-3' (SEQ ID NO: 14) und 5'-GCTCAAGCTTTCTGTTCTAGTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 15) durch eine Polymerasekettenreation (PCR) erhalten. Dieser Promotor wurde in einem Pflanzentransformationsvektor vor die Leuchtkäferluciferase-(LUC) codierende Sequenz platziert (Ishitani et al. 1997). Ein Arabidopsis thaliana Columbia Ökotyp (mit der glabrous1-Mutation) wurde mit Agrobacterium tumefaciens transformiert, die dieses CBF3-LUC-Konstrukt über das Blütentransformationsverfahren erhalten hatten.
  • Pflanzen, die homozygot bezüglich des CBF3-LUC-Transgens waren, wurden aus der zweiten Generation nach Transformation ausgewählt. Eine solche Pflanze mit einer einzelnen Kopie des CBF3-LUC-Transgens wurde für die nachfolgenden Experimente ausgewählt (hier als Wildtyp bezeichnet). Diese Wildtyppflanze zeigte während des Wachstums bei normalen Wachstumsbedingungen keinerlei Biolumineszenz, aber emittierte Biolumineszenz, wenn sie Kältestress ausgesetzt war. Die CBF3-LUC-Pflanzensamen wurden mit Ethylmethansulfonat (EMS) mutiert. Für das Screenen über Lumineszenzmessungen für Mutanten, die defizient in einer kälteregulierten CBF3-LUC-Expression sind, wurden Keimlinge der M2-Generation verwendet. Sieben Tage alte Keimlinge, die auf 0,6% Agarplatten, enthaltend 3% Sucrose und 1× Murashige und Skoog (MS) Salze (JRH Biosciences), gewachsen waren, wurden auf eine deregulierte Luciferaseexpression als Antwort auf eine Behandlung mit niedrigen Temperaturen bei 0°C für 12 Stunden, unter Verwendung eines Restlicht-TV-Bildgebungssystems (Princeton Instruments) gescreent. Lumineszenzintensitäten von individuellen Keimlingen wurden mit der WINVIEW-Software quantifiziert, die von dem Kamerahersteller (Princeton Instruments) zur Verfügung gestellt wurde (Chinnusamy et al. 2002).
  • Kühl- und Frosttoleranzassays:
  • Die Kühlempfindlichkeit von ice1 und Wildtyppflanzen wurde durch Exponieren der Keimlinge unmittelbar nach dem Hervorkommen der Keimwurzel getestet. Nach 2 Tagen Stratifikation bei 4°C, wurden Mutanten- und Wildtypsamen bei 22°C auf MS-Nährmedium, enthaltend 3% Sucrose und 1,2% Agar, keimen lassen. Die Keimlinge wurden durch Inkubieren bei 4 ± 1°C mit 30 ± 2 μmol Photonen m–2 s–1 Licht Kühlstress ausgesetzt. Die Frosttoleranz wurde wie beschrieben bestimmt (Xin und Browse, 1998). In Kürze, es wurden Wildtyp- und ice1-Samen auf Agarplatten (0,9%), enthaltend Gamborg Basalsalze und 1,5% Sucrose, ausgesät. Nach 2 Tagen Stratifikation bei 4°C wurden die Platten bei 22°C unter 30 ± 2 μmol Photonen m–2 s–1 kontinuierlichem Licht aufbewahrt. Zehn Tage alte Keimlinge wurden bei 4 ± 1°C mit 50 ± 2 μmol Photonen m–2 s–1 Licht für 4 Tage kälteakklimatisiert. Die Pflanzen auf Petrischalen wurden auf Eis in einer Gefrierkammer platziert (Percival Scientific), die für 16 h auf –1 ± 0,1°C eingestellt war. Bevor die Kammer programmiert wurde, mit 1°C h–1 herunterzukühlen, wurden Eiswürfel über die Pflanzen verteilt. Pflanzenpetrischalen wurden, falls nicht anders angegeben, nachdem sie für zwei Stunden bei den gewünschten Temperaturen eingefroren waren, entfernt, bei 4°C für 12 Stunden im Dunkeln aufgetaut und dann bei 22°C unter 50 ± 2 μmol Photonen m–2 s–1 kontinuierlichem Licht aufbewahrt. Die Überlebensrate der Keimlinge wurde nach zwei Tagen visuell ausgewertet.
  • Genexpressionsanalyse:
  • Für eine RNA-Analyse wurden zehn Tage alte Keimlinge der Wildtyp- und ice1-Pflanzen, die auf getrennten Hälften derselben MS-Agarplatte gewachsen waren, verwendet. Die aus Kontrollen und gestressten Pflanzen extrahierte Gesamt-RNA wurde mittels RNA-Blotting, wie von Liu und Zhu (1997) beschrieben, analysiert. Die RD29A-genspezifische Sonde war aus der 3' nichtcodierenden Region (Liu und Zhu 1997). COR15A und COR47 cDNAs (Gilmour et al. 1992; Lin und Thomashow 1992) wurden freundlicherweise von M. F. Thomashow (Michigan State University) zur Verfügung gestellt. Die CBF2- und CBF3-genspezifischen Sonden wurden durch PCR mit den folgenden Primerpaaren hergestellt: CBF2-Vorwärtsprimer, 5'-TTCGATTTTTATTTCCATTTTTGG-3' (SEQ ID NO: 16); CBF2-Rückwärtsprimer, 5'-CCAAACGTCCTTGAGTCTTGAT-3' (SEQ ID NO: 17); CBF3-Vorwärtsprimer, 5'-TAAAACTCAGATTATTATTTCCATTT-3' (SEQ ID NO: 18); CBF3-Rückwärtsprimer, 5'-GAGGAGCCACGTAGAGGGCC-3' (SEQ ID NO: 19). Die Sonde für KIN1 (Kurkela und Franck, 1990) war ein 0,4 kb EcoRI-Fragment des Arabidopsis EST-Klons YAP368T7. Das β-Tubulingen wurde als Ladekontrolle verwendet und wurde durch eine PCR mit den folgenden Primerpaaren amplifiziert: Vorwärtsprimer (5'-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3' (SEQ ID NO: 20)) und Rückwärtsprimer (5'-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3' (SEQ ID NO: 21)).
  • Für eine Affymetrix GeneChip Arrayanalyse wurden 20 μg Gesamt-RNA aus den Wildtyp- und ice1-Keimlingen mit und ohne Kältebehandlung (6 Stunden bei Licht) unter Verwendung des RNeasy Plan Mini Kits (Quiagen) extrahiert und zur Herstellung von Biotin-markierten cRNA-Zielen verwendet. Es wurden die Affymetrix Arabidopsis ATH1 Genomarray GenChips verwendet, welche mehr als 22500 Sondensets enthalten, die ungefähr 24000 Gene repräsentieren und Hybridisierung, Waschen und Färben wurden durchgeführt, wie in der Bedienungsanleitung des Herstellers angegeben. Die Microarraydaten wurden aus den gescannten GeneChip-Abbildungen extrahiert und mit der Microarray Suite Version 5.0.1. (Affymetrix) analysiert.
  • Kartieren und Klonen des ICE1-Lokus:
  • Eine genetische Analyse von F1- und F2-Nachkommen der ice1-Kreuzung mit WT, zeigte, dass ice1 eine dominante Mutation ist. Folglich wurde, um ICE1 zu klonen, eine homozygote ice1-Pflanze mit dem Arabidopsis Landsberg erecta (Ler) Ökotyp gekreuzt und die F2-Nachkommen von selbstbefruchteten F1 wurden verwendet, um Kartierungsproben mit dem Wildtypphänotyp auszuwählen. Genomische DNA, die aus diesen Keimlingen extrahiert wurde, wurden für ein PCR-basiertes Kartieren mit Simple Sequence Polymorphism Markern und Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Markern verwendet. Neue SSLP-Kartierungsmarker auf F16J4, MTC11, MLJ15, MDJ14, K17E12 und T32N15 BAC Klonen wurden basierend auf Insertion/Deletionen, die aus dem Cereon Arabidopsis Polymorphismus und der Ler Sequenzkollektion identifiziert wurden (http://www.arabidopsis.org), entwickelt. Genomische DNA, die Kandidatengenen entspricht, wurde aus ice1-mutierten- und Wildtyppflanzen durch PCR amplifiziert und sequenziert, um die ice1-Mutation zu identifizieren.
  • Für eine ice1-Mutantenkomplementierung, wurde das MLJ15.14-Gen, einschließend 2583 bp stromaufwärts vom Startkodon und 615 bp abwärts vom Stopkodon mit LA-Taq-Polymerase (Takara) unter Verwendung von genomischer ice1-Mutanten-DNA durch PCR amplifiziert. Die verwendeten Primer waren: Vorwärtsprimer: 5'-AGGGATCCGGACCACCGTCAATAACATCGTTAAGTAG-3' (SEQ ID NO: 22); Rückwärtsprimer: 5'-CGAATTCTAACCGCCATTAACTATGCTCTCCTCTCTATCTC-3' (SEQ ID NO: 23). Das resultierende 5035 bp Fragment wurde in den pCR2.1 TOPO-Vektor (Invitrogen) T-A kloniert und dann in pCAMBIA1200 zwischen die BamHI- und EcoRI-Schnittstellen subkloniert. Dieses und alle anderen hier beschriebenen Konstrukte wurden vollständig sequenziert, um sicherzustellen, dass sie keine PCR- oder Klonfehler enthalten. Das binäre Konstrukt wurde dann in den Agrobacterium Stamm GV3101 eingeschleust und in CBF3-LUC Columbia Wildtyppflanzen transformiert. Hygromycin-resistente transgene Pflanzen wurden selektiert und ihre T2-Nachkommen wurden auf eine CBF3-LUC-Expression als Antwort auf Kältestress getestet.
  • Analyse von ICE1-Expression:
  • Die Promotorregion (2589 bp stromaufwärts vom Startkodon) des ICE-Genes wurde mit dem folgenden Primerpaar PCR-amplifiziert: Vorwärtsprimer, 5'-AGGGATCCGGACCACCGTCAATAACATCGTTAAGTAG-3' (SEQ ID NO: 24); Rückwärtsprimer, 5' CGAATTCGCCAAAGTTGACACCTTTACCCCAAAG-3' (SEQ ID NO: 25). Das resultierende Fragment wurde mit BamHI und EcorRI verdaut und in den binären pCAMBIA1391-Vektor insertiert. Dieses ICE1-Promotor-GUS-Konstrukt wurde in den Agrobakterium Stamm GV1301 eingeschleust und in Wildtyp Arabidopsis transformiert. Transgene T2-Linien, die Hygromycin-resistent waren, wurden auf eine ICE-Promotor angetriebene GUS-Expression analysiert. Für das GUS-Färben wurden auf MS-Agarplatten gewachsene T2-Keimlinge mit X-Gluc bei 37°C für 12 h inkubiert und anschließend mit 70% (v/v) Ethanol bei 70°C gewaschen, um das Chlorophyll zu entfernen. Die ICE-Expression wurde auch durch eine quantitative RT-PCR-Analyse von RNA, die aus Wildtypwurzeln, -blättern, -stengeln und -bluten isoliert wurde, untersucht. Die ICE1-cDNA wurde durch RT-PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: Vorwärtsprimer: 5'-GCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3' (SEQ ID NO: 26) und Rückwärtsprimer 5'-TCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3' (SEQ ID NO: 27). Das Tubulingen wurde in der RT-PCR-Analyse als interne Kontrolle verwendet. Tubulin-cDNA wurde unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: Vorwärtsprimen: 5'-GTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3' (SEQ ID NO: 28) und Rückwärtsprimer 5'-TCACCTTCTTGATCCGCAGTT-3' (SEQ ID NO: 29).
  • Überexpression von ICE1:
  • Die ICE1-cDNA wurde aus Arabidopsis-RNA (Ökotyp Columbia) durch RT-PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: Vorwärtsprimer: 5'-GCTCTAGAGCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3' (SEQ ID NO: 30) und Rückwärtsprimer 5'-GGGGTACCTCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3' (SEQ ID NO: 31). Das PCR-Produkt wurde mit XbaI und KpnI verdaut und in den pBIB-Vektor unter der Kontrolle des Superpromotors kloniert, der aus drei Kopien der stromaufwärts aktivierenden Sequenz der Oktopinsynthase, die vor dem Manopinsynthasepromotor liegt, besteht (Li et al. 2001). Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101, der dieses binäre Konstrukt enthält, wurde verwendet, um Arabidopsispflanzen zu induzieren. Transformanten wurden auf Hygrommycin (30 mg/l) enthaltendem MS-Medium selektiert.
  • Expression und Lokalisierung des GFP-ICE1-Fusionsproteins:
  • Die Full-length-ICE1-DNA wurde aus Wildtyppflanzen durch RT-PCR unter Verwendung der folgenden Primer erhalten: Vorwärtsprimer: 5'-AGGAATTCGCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3' (SEQ ID NO: 32) und Rückwärtsprimer 5'-CTGGATCCTCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3' (SEQ ID NO: 33). Das resultierende DNA-Fragment wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und in den binären pEGD-Vektor stromabwärts vom CaMV 35S-Promotor kloniert. Dieses GFP-ICE1-Konstrukt wurde in den Agrobakterium Stamm GV3101 eingeschleust und in Wildtyp-Arabidopsis transformiert. Transgene Basta-(Glufosinat)resistente T2-Linien, wurden selektiert und auf GFP-Expression analysiert. Um den Zellkern zu visualisieren, wurden Wurzelgewebe mit Propidiumiodid (1 μg/mL) gefärbt. Grünfluoreszenzanalysen (GFP-Expression) und Rotfluoreszenzanalysen (Propidiumiodidfärbung) von transgenen Pflanzen wurden mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop durchgeführt.
  • DNA-Bindugsassay:
  • Die Wildtyp- und mutierten ICE1-cDNAs wurden durch RT-PCR amplifiziert und zwischen die NdeI und BamHI-Schnittstellen in den pET14B-Expressionsvektor (Novagen) insertiert. Wildtyp- und mutierte His-ICE1-Fusionsproteine wurden entsprechend der Gebrauchsanleitung des His-Bind Buffer Kits (Novagen) aus E.coli-Zellen (BL21 DE3) isoliert. Der Elektrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) wurde wie beschrieben durchgeführt (Hao et al. 1998). Die folgenden doppelsträngigen Oligonukleotide, die in 6A aufgelistet sind (MYC-1, MYC-2, MYC-3, MYC-4 und MYC-5) wurden als Sonden und Kompetitoren in EMSAs verwendet. Die Nukleotidsequenzen P1 (-949 bis -930) und P2 (-909 bis 890) wurden ebenfalls als Kompetitoren verwendet. P1 enthält eine putative MYB-Erkennungsstelle. P2 enthält keine typischen cis-Elemente. DNA-Sonden wurden mit [γ-32P]dCTP unter Verwendung des Klenowfragments endmarkiert und über eine Sephadex G-50-Säule aufgereinigt. Die markierten Sonden (ca. 0,02 pmol) wurden für 20 min bei Raumtemperatur mit 2,3 μg aufgereinigtem HIS-ICE1-Fusionsprotein in 1× Bindungspuffer (Hao et al 1998), der mit 20 pmol poly(dI-dC) versetzt war, inkubiert. Die resultierenden DNA-Protein-Komplexe wurden durch Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel in 0,5× TBE-Puffer aufgetrennt und über Autoradiographie visualisiert. Für Kompetitionsexperimente wurden unmarkierte Kompetitoren mit dem His-ICE1-Fusionsprotein vor der Zugabe der markierten Sonden, für 30 min auf Eis inkubiert.
  • Transienter Expressionsassay:
  • Die Wildtyp (ICE1)-cDNAs und die mutierten (ice)-cDNAs wurden durch RT-PCR amplifiziert, mit SalI verdaut und zwischen SmaI- und SalI-Schnittstellen des 35S-GAL4-DB-Pflanzenexpressionsvektors insertiert (Ohta et al. 2000). Die Plasmid-DNA des resultierenden Effektors, GAL4-ICE1, und ein GAL4-responsiver Reporter, GAL4-LUC, (Ohta et al. 2000) wurden in Arabidopsisblätter durch Partikelbombardement eingeschleust (Ohta et al. 2001).
  • Experimentelles Beispiel
  • Identifikation des ICE1-Lokus:
  • Unter Verwendung des oben beschriebenen genetischen Screens, emittierten Arabidopsis-Pflanzen, die das CBF3-LUC-Transgen enthielten, als Antwort auf Kältestress Biolumineszenz (1A und 1B). Die homozygoten CBF3-LUC-Pflanzen (hier als Wildtyp bezeichnet) wurden mit Ethylmalonatsulfonat mutiert und die resultierenden M2-Populationen wurden unter Verwendung eines Restlicht-Bildgebungssystems auf Mutanten, die unter Kältestress abweichende Biolumineszenzantworten zeigten, gescreent (Chinnusamy et al. 2002). Mehrere Mutanten, die eine abnorme Kälteregulation der CBF3-LUC-Expression zeigten, wurden wiedergewonnen. Eine dieser mutierten Linien, die als ice1 bezeichnet ist, ist was die CBF3-LUC-Expression in der Kälte betrifft, praktisch blockiert (1A und 1B). Als Antwort auf eine Behandlung bei 0°C, zeigten Wildtyppflanzen eine starke Luminsezenz, während die ice1-Mutante eine nur sehr geringe Induktion von Lumineszenz während der Dauer der Kältebehandlung zeigte (1A und 1B). Nach 12 Stunden Kältebehandlung, zeigten ice1-Pflanzen fast 10 mal weniger Lumineszenz als Wildtyppflanzen, und sind offensichtlich defizient in der Kälteregulierung der CBF3-LUC-Expression (1B).
  • Die ice1-mutierte Pflanze wurde mit CBF3-LUC-Wildtyppflanzen gekreuzt und die resultierenden F1-Pflanzen wurden nach 12 Stunden Kältebehandlung bei 0°C auf eine CBF3-LUC-Expression untersucht. Wie durch Lumineszenzmessungen bestimmt, zeigten alle F1-Pflanzen eine reduzierte kälteinduzierte CBF3-LUC-Expression, die der von ice1 ähnlich war. Eine F2-Population von den selbstbestäubten F1 segregierte in einem Verhältnis von ungefähr 3 zu 1 zwischen Mutante zu Wildtyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass ice1 eine dominante Mutation in einem einzelnen Zellkerngen ist.
  • ice1-mutierte Pflanzen zeigen eine gestörte kälteregulierten Genexpression:
  • Um die Wirkung der ice1-Mutation auf die Transkriptionsniveaus von endogenen CBFs und deren kältestressresponsiven Zielgene zu analysieren, wurde eine RNA-Blot-Analyse durchgeführt. Konsistent mit den bildgebenden Ergebnissen, war die Kälteinduktion des endogenen CBF3-Gens in ice1-mutierten Pflanzen (1C) stark beeinträchtigt (fast nicht mehr vorhanden). Wildtyppflanzen zeigten eine CBF3-Induktion nach einer Stunde Kältestress und die Expression erreichte ihren Höhepunkt nach 6 Stunden. Im Gegensatz dazu, war die CBF3-Induktion in ice1-Pflanzen fast nicht mehr vorhanden (1C). Während das CBF1-Induktionsniveau in der ice1-Mutante nach ein und drei Stunden Kältestress niedriger war als das des Wildtyps, so ähnelte das Induktionsniveau nach 6 und 12 Stunden dem des Wildtyps. Das CBF2-Induktionsniveau war nach einer Stunde Kältebehandlung in ice1 leicht niedriger, wobei nach 6 und 12 Stunden, die Induktionsniveaus in der Mutante höher waren (1C). Wir untersuchten auch die Kälteinduktion der stromabwärts gelegenen CBF-Zielgene. Die Expressionsniveaus von RD29A, COR15A und COR47A unter Kältestress waren in ice1 niedriger als im Wildtyp, wobei die Induktion von KIN1 in ice1 erst nach 48 Stunden Kältestress niedriger war.
  • Konsistent mit diesen RNA-Blot-Ergebnissen, zeigte eine Microarrayanalyse mit Affymetrix Genchips, die annähernd das ganze Genom enthielten, dass von 306 Genen, die im Wildtyp durch eine sechsstündige Kältebehandlung dreifach oder noch stärker induziert werden, 217 in der ice1-Mutante entweder nicht induziert werden oder ihre Induktion 50% oder weniger bezogen auf den Wildtyp beträgt (Tabelle 1A). Zweiunddreißig davon codieren putative Transkriptionsfaktoren, was andeutet, dass ICE1 viele kälteresponsive Regulons kontrollieren könnte. Für 87 der 306 kälteinduzierten Gene unterscheiden sich ihre Induktionsniveaus im Wildtyp und in ice1 um weniger als das zweifache (Tabelle 1B). Interessanterweise zeigen 2 Gene in der ice-Mutante höhere Kälteinduktionsniveaus (Tabelle 1C).
  • Tabelle 1. Kälteresponsive Genexpression im Wildtyp und in ice1
  • Für eine Kältebehandlung wurden Wildtyp und ice1-Keimlinge bei 0 ± 1°C für 6 Stunden an Licht aufbewahrt. Eine Affymetrix GeneChip Analyse wurde wie in Materialien und Methoden beschrieben, durchgeführt. Die Genexpressionveränderungen wurden durch Vergleichen von Werten einer kältebehandelten Probe mit den Werten einer Kontrollprobe eines jeden Genotyps analysiert. ,Fold Change'-Werte von +1 oder –1 bedeuten keine Änderungen in der Genexpression. Eine Hochregulierung oder Herunterregulierung wird entweder mit + oder – in den ,Fold Change'-Werten angegeben. Kälteresponsive Gene wurden im Wildtyp durch folgende Standards bestimmt; 1) Signalintensitäten einer kältebehandelten Probe waren höher als der Untergrund (z.B. Gene mit ,Present' Calls, die mit dem Affymetrix Microarray Suite Programm in einer kältebehandelten Probe bestimmt wurden); 2) mit dem Affymetrix Microarray Suite erzeugte Change' Calls waren im paarweisen Vergleich ,i' (für ,increase'); 3) der ,Fold Change' war im paarweisen Vergleich dreifach oder höher. Die Expression der resultierenden 306 Gene wurde weiter analysiert und mit der der ice-Mutante verglichen. Um die Gene zu kategorisieren, wurde ein zweifacher Unterschied zwischen Änderungen im Wildtyp und ice1 als Schwellenwert verwendet. Transkriptionsfaktoren sind als graue Blöcke gezeigt. Für die RNA-Hybridisierung verwendete Gene sind fett markiert. Für 22 Gene von kältebehandeltem ioe1 wurden die ,Fold Change' Werte nicht bestimmt (ND, not determined), da ihre Signalintensität ähnlich hoch wie der Hintergrundwert war (z.B.
  • Gene mit ,Absent' Calls in kältebehandelten ice1). Diese 22 Gene waren im Wildtyp alle kälteinduziert. Somit wurden sie in die Kategorie der Gene aufgenommen, die eine niedrigere Induktion in ice1 als im Wildtyp haben. Tabelle 1A: Kälteresponsive Gene mit niedrigerer ice1-Induktion
    Sondenset AGI ID Genname Fold Change
    WT ice1
    254074_at At4g25490 CBF1/DREB1B 445,7 64,0
    254066_at At4g25480 CBF3/DREB1A 78,8 29,9
    258325_at At3g22830 putativer Hitzeschock-Transkriptionsfaktor1 42,2 5,7
    246432_at At5g17490 RGA-artiges Protein 34,3 ND
    261648_at At1g27730 Salztoleranz-Zinkfingerprotein 24,3 6,5
    247655_at At5g59820 Zinkfingerprotein Zat12 19,7 7,0
    248160_at At5g54470 CONSTANS B-box Zinkfingerfamilie-Protein 19,7 9,8
    250781_at At5g05410 DRE bindendes Protein (DREB2A) 14,9 4,9
    251745_at At3g55980 Zn-Finger-Transkriptionsfaktor (PE11) 3,9 3,0
    258139_at At3g24520 Hitzeschock-Transkriptionsfaktor HSF1, putativ 13,9 3,7
    245711_at At5g04340 putativer c2h2 Zinkfinger-Transkriptionsfaktor 11,3 5,3
    245250_at At4g17490 Ethylen-responsives Element bindender Faktor 6 (AtERF6) 8,6 4,3
    252214_at At3g50260 EREBP-3 Homolog 8,6 2,1
    261613_at At1g49720 Abscisinsäure-responsive Elemente bindender Faktor 7,0 3,5
    245078_at At2g23340 putativerAP2-Domäne-Transkriptionsfaktor 5,7 1,4
    263379_at At2g40140 putatives CCCH-type Zinkfingerprotein 5,7 2,6
    253405_at At4g32800 Transkriptionsfaktor TINY, putativ 5,3 ND
    245807_at At1g46768 AP2-Domäne-Protein RAP2,1 4,9 1,9
    259432_at At1g01520 myb-Familie-Transkriptionsfaktor 4,9 2,3
    252278_at At3g49530 NAC2-artiges Protein 4,6 2,0
    253485_at At4g31800 WRKY-Familie-Transkriptionsfaktor 4,6 –1,2
    251272_at At3g61890 Homeobox-Leucin-Zipperprotein ATHB-12 4,3 1,3
    261470_at At1g28370 Ethylen-responsives Element bindender Faktor 11 (AtERF11) 4,3 1,7
    261892_at At1g80840 WRKY-Familie-Transkriptionsfaktor 4,3 1,2
    263783_at At2g46400 WRKY-Familie-Transkriptionsfaktor 4,3 1,4
    257022_at At3g19580 Zinkfingerprotein, putativ 3,7 1,4
    267252_at At2g23100 CHP-reiches Zinkfingerprotein, putativ 3,7 ND
    249746_at At5g24590 NAC2-artiges Protein 3,5 1,6
    256093_at At1g20823 putatives RING-Zinkfingerprotein 3,5 1,4
    252009_at At3g52800 Zinkfinger-artiges Protein 3,2 1,3
    256185_at At1g51700 Dof-Zinkfingerprotein 3,2 1,6
    260763_at At1g49220 RING-H2-Finger-Protein RHA3a, putativ 3,2 ND
    245749_at At1g51090 prolinreiches Protein, putativ 73,5 7,5
    264217_at At1g60190 hypothetisches Protein 68,6 26,0
    246467_at At5g17040 UDP Glucose:Flavonoid 3-o-Glucosyltransferase-artiges Protein 29,9 ND
    251793_at At3g55580 Regulator der Chromosomkondesation-artiges Protein 27,9 6,1
    262452_at At1g11210 exprimiertes Protein 27,9 7,0
    264661_at At1g09950 hypothetisches Protein 27,9 ND
    258947_at At3g01830 exprimiertes Protein 26,0 2,5
    246178_s_at At5g28430 putatives Protein 19,7 7,0
    253104_at At4g36010 Thaumatin-artiges Protein 19,7 2,5
    257391_at At2g32050 hypothetisches Protein 19,7 ND
    245627_at At1g56600 Wasserstress-induziertes Protein, putativ 18,4 ND
    247208_at At5g64870 Nodulin-artig 18,4 1,2
    256114_at At1g16850 exprimiertes Protein 18,4 2,6
    256356_s_at At1g66500 hypothetisches Protein 18,4 3,0
    250098_at At5g17350 putatives Protein 17,1 3,2
    264758_at At1g61340 späte Embryogenese abundantes Protein, putativ 17,1 5,3
    246099_at At5g20230 blaues Kupfer bindendes Protein 16,0 1,3
    257280_at At3g14440 9-cis-Epoxycarotenoid-Dioxygenase (Neoxanthinspaltung-Enzym) (NC1) (NCED1), putativ 16,0 1,0
    251336_at At3g61190 putatives Protein 13,9 3,0
    260264_at At1g68500 hypothetisches Protein 13,9 3,0
    263497_at At2g42540 COR15a 13,9 3,5
    248337_at At5g52310 RD29A/COR78/LTI78 13,0 4,6
    248959_at At5g45630 putatives Protein 13,0 2,0
    259977_at At1g76590 exprimiertes Protein 13,0 2,5
    260399_at At1g72520 putative Lipoxygenase 13,0 1,5
    259879_at At1g76650 putatives Calmodulin 12,1 2,8
    265290_at At2g22590 putative Anthocyanidin-3-Glucosid-Rhamnosyltransferase 12,1 ND
    267411_at At2g34930 Krankheitsresistenz-Proteinfamilie 12,1 1,1
    250648_at At5g06760 späte Embryogenese abundantes Protein LEA-artig 11,3 1,9
    257876_at At3g17130 hypothetisches Protein 11,3 2,3
    260727_at At1g48100 Polygalacturonase, putativ 11,3 2,3
    246125_at At5g19875 exprimiertes Protein 10,6 2,0
    251603_at At3g57760 putatives Protein 10,6 1,1
    256017_at At1g19180 exprimiertes Protein 10,6 1,5
    264617_at At2g17660 unbekanntes Protein 10,6 ND
    264787_at At2g17840 putatives Seneszenz-assoziiertes Protein 12 10,6 3,5
    245757_at At1g35140 phosphatinduziertes (phi-1) Protein, putativ 9,8 1,6
    252346_at At3g48650 hypothetisches Protein 9,8 2,0
    253643_at At4g29780 exprimiertes Protein 9,8 3,2
    254667_at At4g18280 glycinreiche-Zellwand-Protein-artig 9,8 1,2
    264389_at At1g11960 unbekanntes Protein 9,8 1,7
    266545_at At2g35290 hypothetisches Protein 9,8 1,4
    266720_s_at At2g46790 exprimiertes Protein 9,8 4,9
    245251_at At4g17615 Calcineurin B-artiges Protein 1 9,2 3,0
    247431_at At5g62520 putatives Protein 9,2 1,5
    248964_at At5g45340 Cytochrom p450 Familie 9,2 3,0
    252368_at At3g48520 Cytochrom p450, putativ 9,2 1,3
    262164_at At1g78070 exprimiertes Protein 9,2 4,3
    252102_at At3g50970 Dehydrin Xero2 8,6 4,0
    262359_at At1g73070 leucinreicher Repeat Proteinfamilie 8,6 ND
    262731_at At1g16420 hypothetisches Protein Allgemeinfamilie 8,6 2,8
    245677_at At1g56660 hypothetisches Protein 8,0 2,8
    245734_at At1g73480 Lysophospholipasehomolog, putativ 8,0 2,6
    247177_at At5g65300 exprimiertes Protein 8,0 3,7
    250053_at At5g17850 kaliumabhängiges Natrium-Calcium-Exchanger-artiges Protein 8,0 2,0
    254120_at At4g24570 mitochondrialer Carrier Proteinfamilie 8,0 3,0
    254926_at At4g11280 ACC Synthase (AtACS-6) 8,0 2,3
    263789_at At2g24560 putative GDSL-Motiv Lipase/Hydrolase 8,0 ND
    245346_at At4g17090 Glycosylhydrolasefamilie 14 (beta-Amylase) 7,5 2,6
    253425_at At4g32190 putatives Protein 7,5 3,2
    254085_at At4g24960 abscisinsäureinduziert-artiges Protein 7,5 2,3
    259076_at At3g02140 exprimiertes Protein 7,5 1,1
    260227_at At1g74450 exprimiertes Protein 7,5 2,0
    260915_at At1g02660 exprimiertes Protein 7,5 1,7
    262677_at At1g75860 unbekanntes Protein 7,5 2,6
    266532_at At2g16890 putative Glucosyltransferase 7,5 3,0
    247925_at At5g57560 Xyloglucan-Endotransglycosylase (TCH4) 7,0 2,1
    252563_at At3g45970 putatives Protein 7,0 1,2
    254850_at At4g12000 putatives Protein 7,0 2,3
    260744_at At1g15010 exprimiertes Protein 7,0 1,7
    263931_at At2g36220 exprimiertes Protein 7,0 3,0
    245306_at At4g14690 exprimiertes Protein 6,5 2,6
    246495_at At5g16200 putatives Protein 6,5 1,7
    248870_at At5g46710 putatives Protein 6,5 2,6
    253292_at At4g33985 exprimiertes Protein 6,5 2,0
    253872_at At4g27410 putatives Protein 6,5 1,5
    258792_at At3g04640 exprimiertes Protein 6,5 3,0
    259516_at At1g20450 exprimiertes Protein 6,5 3,2
    262050_at At1g80130 exprimiertes Protein 6,5 1,2
    245427_at At4g17550 putatives Protein 6,1 1,2
    253859_at At4g27657 exprimiertes Protein 6,1 ND
    261187_at At1g32860 Glycosylhydrolasefamilie 17 6,1 1,4
    262448_at At1g49450 En/Spm-artiges Transposonprotein, putativ 6,1 ND
    266757_at At2g46940 unbekanntes Protein 6,1 1,3
    252131_at At3g50930 BCS1 Protein-artiges Protein 5,7 1,6
    255795_at At2g33380 RD20 Protein 5,7 –1,3
    258321_at At3g22840 early light-induziertes Protein 5,7 2,3
    262496_at At1g21790 exprimiertes Protein 5,7 2,0
    265119_at At1g62570 flavinenthaltende Monooxygenase, putativ 5,7 2,0
    246018_at At5g10695 exprimiertes Protein 5,3 1,7
    248820_at At5g47060 putatives Protein 5,3 1,7
    249918_at At5g19240 putatives Protein 5,3 1,9
    253830_at At4g27652 exprimiertes Protein 5,3 1,7
    246490_at At5g15950 S-Adenosylmethionin-Decarboxylase (adoMetDC2) 4,9 2,1
    253284_at At4g34150 putatives Protein 4,9 1,9
    253323_at At4g33920 putatives Protein 4,9 2,5
    253614_at At4g30350 putatives Protein 4,9 1,5
    264655_at At1g09070 exprimiertes Protein 4,9 1,9
    245533_at At4g15130 putative Phosphocholin-Cytidylyltransferase 4,6 2,1
    246831_at At5g26340 Hexosetransporter-artiges Protein 4,6 2,0
    247137_at At5g66210 calciumabhängige Proteinkinase 4,6 1,4
    247226_at At5g65100 putatives Protein 4,6 ND
    250467_at At5g10100 Trehalose-6-Phosphatphosphatase-artiges Protein 4,6 ND
    252414_at At3g47420 putatives Protein 4,6 1,9
    252997_at At4g38400 putatives Pollenallergen 4,6 1,1
    253595_at At4g30830 putatives Protein 4,6 ND
    253832_at At4g27654 exprimiertes Protein 4,6 1,3
    258188_at At3g17800 exprimiertes Protein 4,6 1,4
    259479_at At1g19020 exprimiertes Protein 4,6 1,7
    261405_at At1g18740 exprimiertes Protein 4,6 2,0
    262881_at At1g64890 exprimiertes Protein 4,6 2,1
    264000_at At2g22500 mitochondrialer Carrier Proteinfamilie 4,6 2,0
    265668_at At2g32020 putative Alaninacetyltransferase 4,6 2,3
    265797_at At2g35715 exprimiertes Protein 4,6 ND
    248686_at At5g48540 33 kDa sekretorisches Protein-artig 4,3 1,6
    250676_at At5g06320 harpininduziertes Protein-artig 4,3 1,6
    251259_at At3g62260 Proteinphosphatase 2C (PP2C) 4,3 2,1
    254300_at At4g22780 Translationsfaktor EF-1 alpha-artiges Protein 4,3 –1,1
    261356_at At1g79660 unbekanntes Protein 4,3 1,6
    264636_at At1g65490 exprimiertes Protein 4,3 1,4
    246468_at At5g17050 UDP Glucose:Flavonoid 3-o-Glucosyltransferase-artiges Protein 4,0 2,0
    248607_at At5g49480 NaCl-induzierbares Ca2+-bindendes Protein-artig; Calmodulin-artig 4,0 1,5
    250279_at At5g13200 ABA-responsives Protein-artig 4,0 1,2
    252053_at At3g52400 Syntaxin SYP122 4,0 1,9
    256633_at At3g28340 unbekanntes Protein 4,0 2,0
    258207_at At3g14050 putative GTP Pyrophosphokinase 4,0 1,7
    258805_at At3g04010 Glycosylhydrolasefamilie 17 4,0 1,3
    261912_s_at At1g66000 hypothetisches Protein 4,0 ND
    264989_at At1g27200 exprimiertes Protein 4,0 1,6
    265276_at At2g28400 hypothetisches Protein 4,0 –1,1
    267261_at At2g23120 exprimiertes Protein 4,0 1,7
    247693_at At5g59730 putatives Protein 3,7 1,9
    253113_at At4g35985 putatives Protein 3,7 1,4
    253165_at At4g35320 putatives Protein 3,7 1,9
    253879_s_at At4g27570 UDP Rhamnose-Anthocyanidin-3-Glucosid 3,7 1,2
    Rhamnosyltransferase-artiges Protein
    253915_at At4g27280 putatives Protein 3,7 1,9
    259426_at At1g01470 hypothetisches Protein 3,7 1,6
    259445_at At1g02400 Dioxygenase, putativ 3,7 1,9
    260410_at At1g69870 putativer Peptidtransporter 3,7 1,1
    261581_at At1g01140 Serine-Threonine-Kinase, putativ 3,7 1,5
    262113_at At1g02820 späte Embryogenese abundantes Protein, putativ 3,7 1,1
    262382_at At1g72920 Krankheitsresistenz-Protein (TIR-NBS class), putativ 3,7 1,9
    265665_at At2g27420 Cysteinproteinase 3,7 1,0
    267069_at At2g41010 unbekanntes Protein 3,7 1,2
    245450_at At4g16880 Krankheitsresistenz-RPP5-artiges Protein (Fragment) 3,5 ND
    246289_at At3g56880 putatives Protein 3,5 1,3
    249204_at At5g42570 exprimiertes Protein 3,5 1,5
    249622_at At5g37550 putatives Protein 3,5 1,4
    250335_at At5g11650 Lysophospholipase-artiges Protein 3,5 1,7
    251372_at At3g60520 putatives Protein 3,5 1,5
    254707_at At4g18010 putatives Protein 3,5 1,1
    257154_at At3g27210 exprimiertes Protein 3,5 1,5
    259705_at At1g77450 GRAB1-artiges Protein 3,5 1,3
    261037_at At1g17420 Lipoxygenase 3,5 1,2
    261937_at At1g22570 Peptidtransporter, putativ 3,5 1,6
    264024_at At2g21180 exprimiertes Protein 3,5 1,1
    264458_at At1g10410 unbekanntes Protein 3,5 1,2
    266799_at At2g22860 unbekanntes Protein 3,5 1,4
    247280_at At5g64260 phi-1-artiges Protein 3,2 1,6
    251356_at At3g61060 putatives Protein 3,2 1,5
    252316_at At3g48700 putatives Protein 3,2 1,3
    253824_at At4g27940 putatives Protein 3,2 1,1
    256526_at At1g66090 Krankheitsresistenz-Protein (TIR-NBS Klasse), putativ 3,2 1,4
    256595_x_at At3g28530 hypothetisches Protein 3,2 1,1
    265648_at At2g27500 Glycosylhydrolasefamilie 17 3,2 1,1
    266097_at At2g37970 exprimiertes Protein 3,2 1,6
    267335_s_at At2g19440 Glycosylhydrolasefamilie 17 3,2 1,6
    245699_at At5g04250 putatives Protein 3,0 1,2
    247467_at At5g62130 putatives Protein 3,0 1,5
    249583_at At5g37770 CALMODULIN-VERWANDTES PROTEIN 2, TOUCH-INDU ZIERT (TCH2) 3,0 1,1
    249626_at At5g37540 putatives Protein 3,0 1,2
    252474_at At3g46620 putatives Protein 3,0 1,3
    253628_at At4g30280 Xyloglucan-Endotransglycosylase, putativ 3,0 1,4
    253835_at At4g27820 Glycosylhydrolasefamilie 13,0 1,2
    254158_at At4g24380 putatives Protein 3,0 1,4
    254188_at At4g23920 UDP-Glucose-4-Epimerase-artiges Protein 3,0 1,2
    254634_at At4g18650 putatives Protein 3,0 ND
    254973_at At4g10460 putatives Retrotransposon 3,0 ND
    256763_at At3g16860 unbekanntes Protein 3,0 1,0
    257519_at At3g01210 RRM-enthaltendes Protein 3,0 –1,1
    258894_at At3g05650 Krankheitsresistenz-Proteinfamilie 3,0 1,4
    265841_at At2g35710 putatives Glycogenin 3,0 1,5
    266271_at At2g29440 Glutathiontransferase, putativ 3,0 1,2
    266316_at At2g27080 exprimiertes Protein 3,0 1,1
    267631_at At2g42150 hypothetisches Protein 3,0 1,1
    Tabelle 1B: Kälteresponsive Gene mit ähnlicher Wildtyp- und ice1-Induktion
    Sondenset AGI ID Genname Fold Change
    WT ice1
    254075_at At4g25470 CBF2/DREB1C 104,0 137,2
    261263_at At1g26790 Dof Zinkfingerprotein 68,6 55,7
    257262_at At3g21890 CONSTANS B-box Zinkfingerfamilie Protein 7,5 5,3
    259834_at At1g69570 Dof Zinkfingerprotein 7,0 5,7
    256430_at At3g11020 DREB2B 6,1 4,9
    248389_at At5g51990 DER-bindendes Protein 5,3 4,0
    257053_at At3g15210 AtERF4 5,3 2,8
    248744_at At5g48250 CONSTANS B-box-Zinkfingerfamilie Protein 4,9 3,0
    249606_at At5g37260 CCA1, putativ 4,9 9,2
    267028_at At2g38470 WRKY-Familie-Transkriptionsfaktor 4,9 3,0
    246523_at At5g15850 CONSTANS-LIKE 1 4,0 3,2
    248799_at At5g47230 AtERF5 4,0 3,5
    247452_at At5g62430 Dof-Zinkfingerprotein 3,7 3,7
    251190_at At3g62690 RING-H2 Zinkfingerprotein ATL5 3,7 2,1
    253722_at At4g29190 Zn-Fingerprotein, putativ 3,7 4,6
    259992_at At1g67970 putativer Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 3,7 2,3
    263252_at At2g31380 CONSTANS-artig B-box Zinkfingerprotein 3,7 3,7
    263739_at At2g21320 CONSTANS B-box Zinkfingerfamilie Protein 3,7 2,3
    252429_at At3g47500 Dof Zinkfingerprotein 3,5 4,3
    253140_at At4g35480 RING-H2-Finger-Protein RHA3b 3,5 2,0
    258742_at At3g05800 bHLH Protein 3,5 6,5
    265939_at At2g19650 CHP-reiches Zinkfingerprotein, putativ 3,5 2,8
    249415_at At5g39660 Dof Zinkfingerprotein 3,2 3,7
    259364_at At1g13260 DNA-bindendes Protein (RAV1) 3,2 2,1
    262590_at At1g15100 putatives RING-H2-Zinkfingerprotein 3,2 2,0
    263823_s_at At2g40350 AP2-Domäne-Transkriptionsfaktor 3,0 5,7
    264511_at At1g09350 putative Galactinolsynthase 17,1 12,1
    264314_at At1g70420 exprimiertes Protein 13,0 9,8
    247478_at At5g62360 DC1,2 Homolog-artiges Protein 11,3 11,3
    253322_at At4g33980 putatives Protein 11,3 8,0
    249741_at At5g24470 putatives Protein 8,0 6,5
    247047_at At5g66650 putatives Protein 7,0 4,3
    263495_at At2g42530 COR15b 6,5 9,8
    265536_at At2g15880 unbekanntes Protein 6,5 5,3
    249174_at At5g42900 putatives Protein 6,1 3,5
    249191_at At5g42760 putatives Protein 6,1 4,3
    264153_at At1g65390 Krankheitsresistenzprotein (TIR class), putativ 6,1 4,9
    250099_at At5g17300 exprimiertes Protein 5,7 7,5
    265725_at At2g32030 putative Alaninacetyltransferase 5,7 3,0
    246922_at At5g25110 Serin/Threonin Proteinkinase-artiges Protein 4,9 4,9
    251494_at At3g59350 Proteinkinase-artiges Protein 4,9 2,8
    246821_at At5g26920 Calmodulin-bindendes Protein 4,6 2,6
    255733_at At1g25400 exprimiertes Protein 4,6 3,0
    257650_at At3g16800 Proteinphosphatase 20 (PP2C) 4,6 2,5
    266832_at At2g30040 putatives Proteinkinase 4,6 2,8
    267357_at At2g40000 putatives Nematodenresistenz Protein 4,6 3,7
    249411_at At5g40390 Glycosylhydrolasefamilie 36 4,3 3,5
    256266_at At3g12320 exprimiertes Protein 4,3 4,0
    252956_at At4g38580 Kupferchaperon (CCH)-verwandt 4,0 2,3
    253455_at At4g32020 putatives Protein 4,0 2,6
    259570_at At1g20440 hypothetisches Protein 4,0 2,3
    262383_at At1972940 Krankheitsresistenzprotein (TIR-NBS Klasse), putativ 4,0 2,1
    247393_at At5g63130 unbekanntes Protein 3,7 3,2
    252661_at At3g44450 putatives Protein 3,7 2,5
    259990_s_at At1968050 F-Box-Protein FKF1/ADO3, AtFBX2a 3,7 2,3
    264213_at At1g65400 hypothetisches Protein 3,7 2,0
    245777_at At1g73540 unbekanntes Protein 3,5 2,5
    248745_at At5g48260 unbekanntes Protein 3,5 2,5
    248846_at At5g46500 putatives Protein 3,5 2,6
    249063_at At5g44110 ABC-Transporterfamilie Protein 3,5 2,1
    257654_at At3g13310 DnaJ-Protein, putativ 3,5 2,1
    257925_at At3g23170 exprimiertes Protein 3,5 1,9
    261048_at At1g01420 Flavonol 3-o-Glucosyltransferase, putativ 3,5 2,0
    263216_s_at At1g30720 FAD-bindende Oxidoreduktase Familie 3,5 2,3
    265184_at At1g23710 exprimiertes Protein 3,5 2,3
    245558_at At4g15430 hypothetisches Protein 3,2 3,5
    248164_at At5g54490 putatives Protein 3,2 2,5
    248502_at At5g50450 putatives Protein 3,2 4,3
    252010_at At3g52740 exprimiertes Protein 3,2 2,5
    253679_at At4g29610 Cytidindeaminase 6 (CDA6) 3,2 2,0
    256548_at At3g14770 exprimiertes Protein 3,2 1,9
    256577_at At3g28220 unbekanntes Protein 3,2 2,3
    257083_s_at At3g20590 nichtrassenspecifisches Krankheitsresistenzprotein, putativ 3,2 2,3
    260046_at At1g73800 exprimiertes Protein 3,2 2,0
    261958_at At1g64500 Peptidtransporter, putativ 3,2 2,6
    263352_at At2g22080 En/Spm-artiges Transposonprotein 3,2 1,9
    263452_at At2g22190 putative Trehalose-6-Phosphatphosphatase 3,2 2,3
    265093_at At1g03905 ABC-Transporterfamilie-Protein 3,2 1,7
    267293_at At2g23810 hypothetisches Protein 3,2 1,7
    245119_at At2g41640 exprimiertes Protein 3,0 2,6
    246270_at At4g36500 putatives Protein 3,0 3,0
    247793_at At5g58650 putatives Protein 3,0 1,7
    256442_at At3g10930 exprimiertes Protein 3,0 1,9
    256487_at At1g31540 Krankheitsresistenzprotein (TIR-NBS-LRR Klasse), putativ 3,0 2,1
    259428_at At1g01560 MAP-Kinase, putativ 3,0 1,7
    266834_s_at At2g30020 Proteinphosphatase 2C (PP2C) 3,0 2,6
    267364_at At2g40080 exprimiertes Protein 3,0 2,3
    Tabelle 1C: Kälteresponsive Gene mit höherer ice1-Induktion
    Fold Change
    Sondenset AGI ID Genname WT ice1
    261248 at At1g20030 Calreticulin, putativ 4,6 13,9
    258383 at At3g15440 hypothetisches Protein 4,3 9,2
  • Die ice1-Mutation beeinträchtigt die Kühl- und Frosttoleranz
  • Bei normalen Wachstumstemperaturen, waren ice1- und Wildtypkeimlinge ähnlich groß (2A). Obwohl ausgewachsene ice1-Pflanzen kleiner waren, unterschieden sie sich nicht sehr vom Wildtyp was Blütezeit und Fortpflanzungsfähigkeit betrifft (2B). Zehn Tage alte ice1- und Wildtypsetzlinge, die auf getrennten Hälften derselben Agarplatte gewachsen waren, wurden für 4 Tage bei 4°C kälteakklimatisiert und einem Frosttoleranzassay unterworfen. Die ice1-Mutante war bei allen Frosttemperaturen weniger frosttolerant als der Wildtyp (2C und 2D). Einfrieren bei –10°C für 2 Stunden tötete ungefähr 50% der ice1-mutierten Pflanzen, während weniger als 20% der Wildtyppflanzen bei dieser Temperatur abgetötet wurden (2D). Wenn neu gekeimte (bei 22°C) ice1- und Wildtypkeimlinge bei 4°C aufbewahrt wurden, (mit 30 ± 2 μmol Photonen m–2 s–1 Licht), wurden bei der Mutante nach 4 Wochen Kältebehandlung Kühlschäden (2E) sichtbar. Nach 6 Wochen Kühlstress, überlebten 100% der Wildtyppflanzen, aber nur 20% der ice1-mutierten Pflanzen (2F).
  • Positional Cloning von ICE1
  • Um die ice1-Mutation zu kartieren, wurde eine homozygote ice1-Mutante im CBF3-LUV Columbia Hintergrund mit Wildtyppflanzen des Ler Ökotyps gekreuzt. F1-Pflanzen der Kreuzung wurden selbstbestäubt, um F2-Samen zu erzeugen. Da die ice1-Mutation dominant ist, wählten wir für die Kartierung aus der segregrierenden F2-Population Keimlinge mit dem Wildtypphänotyp aus (basierend auf Pflanzengröße und -morphologie). Insgesamt 662 Wildtyppflanzen wurden ausgewählt und für die Kartierung mit Simple Sequence Lengt Polymorphism und Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Markern (siehe Materialien und Methoden für Details) verwendet, was ursprünglich ice1 auf die Mitte des Chromosoms 3 platzierte und dann seine Position auf eine 58 kb Region auf den MLJ15 und MDJ14 BAC Klonen einschränkte Von homozygoten ice1-Mutanten wurden Kandidatengene aus dieser Region amplifiziert und sequenziert. Diese Sequenzen wurden mit der veröffentlichten Sequenz von Arabidopsis Ökotyp Columbia verglichen und es wurde im hypothetischen MLJ15.14-Gen eine einzelne G zu A Mutation gefunden.
  • Um zu bestätigen, dass MLJ15.14 das ICE1-Gen ist, wurde das MLJ15.14-Gen von ice1-mutierten Pflanzen einschließend 2583 bp stromaufwärts vom Startkodon und 615 bp stromabwärts vom Stopkodon kloniert. Dieses Fragment wurde in einen binären Vektor insertiert und in CBF3-LUC Columbia Wildtyppflanzen durch Agrobacterium-vermittelte Transformation eingeschleust. Transgene Pflanzen wurden basierend auf ihrer Hygromycinresistenz selektiert und die kälteinduzierte Biolumineszenz in den T2-Linien wurde mit der des Wildtyps verglichen. Das MLJ15.14-Gen aus ice1 unterdrückte die kälteinduzierte Lumineszenz der Wildtyppflanzen (3A und 3B) und reduzierte die Pflanzenhöhe auf die der ice1-Mutante, was somit bestätigt, dass MLJ15.14 ICE1 ist.
  • ICE1 codiert einen konstitutiv exprimierten und im Zellkern lokalisierten MYC-artigen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor
  • Der offene Leserahmen von ICE1 (SEQ ID NO: 1) wurde durch Sequenzieren von durch RT-PCR erhaltenen cDNAs bestimmt. Der offene Leserahmen wurde bestimmt als:
    Figure 00380001
  • Für ICE1 ist vorhergesagt, ein Protein mit 494 Aminosäuren, mit einer geschätzten Molmasse von 53,5 kDa zu codieren (SEQ ID NO: 2):
    Figure 00380002
  • Datenbanksuchen zeigten, dass ICE1 eine MYC-artige Helix-Loop-Helix-Domäne (bHLH) in seiner C-terminalen Hälfte enthält (4A und 46). Über die gesamte Länge des Proteins hinweg zeigt ICE1 eine Aminsäuresequenzähnlichkeit zu einem unbekannten Arabidopsis-Protein (AtIg12860). Die ice1-Mutation ändert Arg236, das in diesen beiden Arabidopsis-Proteinen konserviert ist, zu His. Die ICE1-bHLH-Domäne zeigt eine hohe Aminosäureähnlichkeit zu der der bekannten MYC-zugehörigen bHLH-Transkriptionsfaktoren (4B). Alle MYC-bindenden Promotorelemente enthalten die CA-Nukleotide, die in der bHLH-Zipperdomäne von einer konservierten Glutaminsäure kontaktiert werden (Grandori et al., 2000). Dieser Glutaminsäurerest (Glu312) ist auch in der basischen DNA-Bindungsdomäne von ICE1 konserviert (4B). Eine saure Domäne in der Nähe des Aminoterminus charakterisiert die bHLH-Familie der Transkriptionsfaktoren und eine konservierte bHLH-DNA-Eindungs- und Dimerisierungsdomäne in der Nähe des Carboxylterminus (Purugganan und Wessler 1994). All diese Merkmale sind im ICE1-Protein vorhanden (4A).
  • Um das Expressionsmuster von ICE1 in verschiedenen Geweben zu analysieren, wurden T2-Linien von transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die ein ICE1 Promotor-GUS-Transgen exprimierten, analysiert. Eine GUS-Expression wurde in Wurzel- Blätter-, Stengel- und Blütenteilen detektiert. Eine semiquantitative RT-PCR-Analyse zeigte auch, dass ICE1 konstitutiv exprimiert wurde und dass die Expression in Blättern und Stengeln stärker war als in anderen Geweben (5A und 5B). Eine RNA-Blot-Analyse zeigte, dass das ICE1-Transkript durch Kälte, NaCl und ABA, aber nicht durch Dehydrierung leicht hochreguliert war (5C).
  • Um die subzelluläre Lokalisierung des ICE1-Proteins zu untersuchen, wurde ICE in frame mit der C-terminalen Seite des Grünfluoreszenzproteins (GFP) fusioniert und unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors exprimiert. Eine konfokale Bildgebung von GFP-Fluoreszenz in T2-transgenen Pflanzen zeigte, dass das GFP-ICE1-Fusionsprotein sowohl bei kalten als auch bei warmen Temperaturen im Zellkern vorhanden ist (5D).
  • ICE1 bindet an die MYC-Erkennungssequenzen im CBF3-Promotor
  • ICE1 hat eine basische Helix-Loop-Helix-Domäne (bHLH) und seine Aminosäurensequenz in der basischen Region ist in anderen bHLH-Proteinen hoch konserviert (4B), und somit kann es Promotorelemente, die den DNA-Bindungsstellen für bekannte bHLH-Proteine ähnlich sind, erkennen. Diese Proteine erkennen DNA mit der Konsensussequenz CANNTG (Meshi und Iwabuch 1995). In der Promotorregion von CBF3 gibt es innerhalb einer 1kb Region stromaufwärts von der Transkriptionsstartsequenz fünf potentielle MYC-Erkennungselemente (Shinawari et al. 1998). Diese möglichen MYC-Erkennungssequenzen, bezeichnet als MYC-1 bis MYC-5, zerfallen in vier Gruppen, da MYC-3 und MYC-5 die gleiche Konsensussequenz haben, CATTTG (6A). Somit wurde MYC-3 verwendet, um sowohl MYC-3 als auch MYC-5 zu repräsentieren. Um festzustellen, ob ICE1 an diese MYC-Erkennungssequenzen im CBF3-Promotor bindet, exprimierten und reinigten wir ein His-ICE1-Fusionsprotein aus E.coli. Vier DNA-Fragmente, umfassend jede mögliche MYC-Erkennungssequenz, wurden für die Wechselwirkung mit His-ICE1 in einem Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) verwendet.
  • Wenn ICE1 mit einem der vier DNA-Fragmente inkubiert wurde (MYC-1 bis MYC-4), wurden mehrere Komplexe beobachtet, was darauf hindeutet, dass ICE1 in der Lage ist, an diese Sequenzen zu binden (6B). Das MYC-2-Fragment bildete mit ICE1 einen Hauptkomplex, während die anderen DNA-Fragmente mehrere Komplexe mit ICE1 bildeten. Diese Komplexe verschwanden durch die Zugabe von zunehmenden Mengen von unmarkierten Kompetitoren mit der gleichen Sequenz, aber nicht mit P1 oder P2, die eine putative MYB-Erkennungssequenz und eine unabhängige Sequenz enthalten (6B). Die Spezifität der Kompetition stützt die Hypothese, dass für die Wechselwirkung zwischen DNA und ICE1 die MYC-Erkennungssequenzen notwendig sind. Wurde das MYC-2-Fragment als Sonde verwendet, so wurde der Komplex am effizientesten durch den unmarkierten MYC-2-Kompetitor verdrängt, was darauf hindeutet, dass ICE1 eine höhere Affinität für die MYC-2-Bindungsstelle hat, als für die anderen Bindungsstellen (6C). Der aus ICE1 und dem MYC-2-Fragment gebildete Komplex war von einem mutierten Kompetitor weniger betroffen, als von dem Wildtypkompetitor (6D). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass ICE1 spezifisch mit den MYC-Erkennungssequenzen im CBF3-Promotor wechselwirkt. Die ice1-Mutation scheint die ICE1-Wechselwirkung mit dem CBF3-Promotor nicht zu beeinträchtigen, da die Arg236His-ICE-Mutante ebenfalls in der Lage war an die MYC-Sonde zu binden (6E).
  • ICE1 ist ein Transkriptionsaktivator der die CBF-Expression positiv reguliert
  • Zur Bestimmung ob ICE1 als ein Transkriptionsaktivator oder -repressor wirkt, wurden transiente Expressionsassays durchgeführt. Ein Effektorplasmid wurde durch Fusionieren von ICE1 mit der DNA-bindenden Domäne des Hefe GAL4 Transkriptionsaktivators konstruiert (GAL4-ICE1, 7A). Nachdem das Wildtyp-GAL4-ICE1 und ein GAL4-responsives Reportergen, GAL4-LUC, in Arabidopsis-Blätter durch Partikelbombardement eingeschleust worden waren, nahm die Luciferaseaktivität relativ zu der Kontrolle mit oder ohne Effektorplasmid, enthaltend nur die GAL4-DNA-Bindungsdomäne, um das zwanzigfache zu (7B). Die Arg236His-mutierte Form von GAL4-ICE1 aktivierte auch die GAL4-responsive Transkription (7B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ICE1 ein Transkriptionsfaktor ist und dass die ice1-Mutation die Funktion der Trankriptionsaktivierungsdomäne nicht beeinträchtigt.
  • Ein Nullallel von ice1, hergestellt durch eine T-DNA-Insertion, zeigt keinerlei Phänotypen der dominanten ice1-Mutante, was darauf hindeutet, dass es eine funktionelle Redundanz in der ICE1-Genfamilie gibt. Wir überexprimierten ICE1 in Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen unter Verwendung des starken konstitutiven Superpromotors. Keine der Expressionslinien zeigte ice1-mutierte Phänotypen. Eine RNA-Blot-Analyse zeigte, dass eine ICE1-Überexpression die CBF3-Expression bei warmen Temperaturen nicht aktivierte. Eine ICE1-Überexpression steigerte jedoch in der Kälte sowohl die Expression des endogenen CBF3-Gens als auch die des CBF3-LUC-Reportergens (7C und 7D). Die Kälteinduktion von CBF2, RD29A und COR15A war in den Super-ICE transgenen Pflanzen ebenfalls gesteigert (7C). Nachdem die Super-ICE1 transgenen Pflanzen und Wildtypkontrollpflanzen nach 5 Tagen bei 4°C auf denselben Agarplatten kälteakklimatisert waren und dann für 4 Stunden einer Frostbehandlung bei –8°C ausgesetzt waren, zeigten die transgenen ICE1-Überexpressions-Keimlinge eine höhere Überlebensrate (75,9 ± 6,5%) als die Kontrollpflanzen (37,2 ± 12,6%) (7E). Die transgenen ICE-Überexpressions-Keimlinge zeigten keine sichtbaren Abnormalitäten im Wachstum oder in der Entwicklung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ICE1 ein positiver Regulator von CBF3 ist und dass die dominante Natur von ice1 wahrscheinlich durch eine dominante negative Wirkung der Mutation verursacht wird.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (39)

  1. Verfahren zum Verbessern der Kälteakklimatisierung einer Pflanze, die dies benötigt, umfassend das Einschleusen eines Polynukleotids in diese Pflanze, das für ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
  2. Verfahren zum Verbessern der Kälteakklimatisierung einer Pflanze, die dies benötigt, umfassend das Einschleusen des Polynukleotids von SEQ ID NO: 1 in die Pflanze.
  3. Verfahren zum Verbessern der Kälteakklimatisierung einer Pflanze, die dies benötigt, umfassend die Steigerung der Expression des ICE1-Gens von SEQ ID NO: 1 in der Pflanze.
  4. Verfahren zum Verbessern der Kälteakklimatisierung in einer Pflanze, umfassend die Überexpression eines ICE1-Transkriptionsaktivators in der Pflanze, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator ausgewählt ist aus: einem ICE1-Transkriptionsaktivator mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 70 % mit SEQ ID NO: 2 identisch ist; einem ICE1-Transkriptionsaktivator, der von einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Sequenz, die wenigstens 70 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist, codiert wird; einem ICE1-Transkriptionsaktivator, der von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplementärstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Waschen in 5 × SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68 °C umfassen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 codiert wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die eine Sequenz hat, die wenigstens 70 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die eine Sequenz hat, die wenigstens 90 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplementärstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Waschen in 5 × SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68 °C umfassen.
  10. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Aminosäuresequenz des ICE1-Transkriptionsaktivators eine Identität von wenigstens 80 % mit SEQ ID NO: 2 hat.
  11. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Aminosäuresequenz des ICE1-Transkriptionsaktivators eine Identität von wenigstens 90 % mit SEQ ID NO: 2 hat.
  12. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pflanze Arabidopsis thalania ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Weizen, Mais, Erdnuss, Baumwolle, Hafer und Sojabohne.
  14. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pflanze eine erhöhte Expression ein oder mehrerer weiterer Transkriptionsfaktoren zeigt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem CBF-Transkriptionsfaktor und einem DREB1-Transkriptionsfaktor.
  15. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pflanze eine erhöhte Expression ein oder mehrerer kälteinduzierbarer Gene zeigt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die kälteinduzierbaren Gene für ein Protein codieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym, das an Kohlenhydratrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Kohlenhydratmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Lipidrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Lipidmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Phenylpropanoidrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Phenylpropanoidmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Antioxidansrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Metabolismus von Antioxidanzien beteiligt ist, einem molekularen Chaperon, einem Frostschutzprotein und einem Protein, das an Toleranz gegen Dehydrierung als Folge von Frost beteiligt ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pflanze mit einem Vektor transformiert wird, der für den ICE1-Transkriptionsaktivator codiert, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator ausgewählt ist aus: einem ICE1-Transkriptionsaktivator mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 70 % mit SEQ ID NO: 2 identisch ist; einem ICE1-Transkriptionsaktivator, der von einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Sequenz, die wenigstens 70 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist, codiert wird; einem ICE1-Transkriptionsaktivator, der von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplementärstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Waschen in 5 × SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68 °C umfassen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 codiert wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die eine Sequenz hat, die wenigstens 70 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die eine Sequenz hat, die wenigstens 90 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplementärstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Waschen in 5 × SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68 °C umfassen.
  23. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz des ICE1-Transkriptionsaktivators eine Identität von wenigstens 80 % mit SEQ ID NO: 2 hat.
  24. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz des ICE1-Transkriptionsaktivators eine Identität von wenigstens 90 % mit SEQ ID NO: 2 hat.
  25. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanze Arabidopsis thalania ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Weizen, Mais, Erdnuss, Baumwolle, Hafer und Sojabohne.
  27. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanze eine erhöhte Expression ein oder mehrerer weiterer Transkriptionsfaktoren zeigt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem CBF-Transkriptionsfaktor und einem DREB1-Transkriptionsfaktor.
  28. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanze eine erhöhte Expression ein oder mehrerer kälteinduzierbarer Gene zeigt.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die kälteinduzierbaren Gene für ein Protein codieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym, das an Kohlenhydratrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Kohlenhydratmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Lipidrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Lipidmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Phenylpropanoidrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Phenylpropanoidmetabolismus beteiligt ist, einem Enzym, das an Antioxidansrespiration beteiligt ist, einem Enzym, das am Metabolismus von Antioxidanzien beteiligt ist, einem molekularen Chaperon, einem Frostschutzprotein und einem Protein, das an Toleranz gegen Dehydrierung als Folge von Frost beteiligt ist.
  30. Verfahren zum Erhöhen der Expression ein oder mehrerer kälteinduzierbarer Gene in einer Pflanzenzelle, umfassend Transformieren der Pflanze mit einem Vektor, der für einen ICE1-Transkriptionsaktivator in der Pflanze codiert, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator ausgewählt ist aus: einem ICE1-Transkriptionsaktivator mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 70 % mit SEQ ID NO: 2 identisch ist; einem ICE1-Transkriptionsaktivator, der von einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Sequenz, die wenigstens 70 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist, codiert wird; einem ICE1-Transkriptionsaktivator, der von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplementärstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Waschen in 5 × SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68 °C umfassen, und wobei die Pflanze verbesserte Kälteakklimatisierung zeigt.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 codiert wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die eine Sequenz hat, die wenigstens 70 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die eine Sequenz hat, die wenigstens 90 % identisch mit SEQ ID NO: 1 ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der ICE1-Transkriptionsaktivator von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplementärstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Waschen in 5 × SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68 °C umfassen.
  36. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Aminosäuresequenz des ICE1-Transkriptionsaktivators eine Identität von wenigstens 80 % mit SEQ ID NO: 2 hat.
  37. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Aminosäuresequenz des ICE1-Transkriptionsaktivators eine Identität von wenigstens 90 % mit SEQ ID NO: 2 hat.
  38. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Pflanzenzelle Arabidopsis thalania ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Pflanzenzelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Weizen, Mais, Erdnuss, Baumwolle, Hafer und Sojabohne.
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