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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren zur Inhibition der
pathologischen Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-κB (nukleärer Faktor κB) unter
Verwendung von Aminobenzothiophen-Verbindungen. Solche Verfahren
sind insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen nützlich,
an denen eine Aktivierung von NF-κB
implizit beteiligt ist. Genauer gesagt können diesen Verfahren verwendet
werden um die IKK-β (IκB-Kinase-β, auch bekannt
als IKK-2) Phosphorylierung von IκB
(inhibitorisches Protein κB)
zu inhibieren, was einen darauffolgenden Abbau und Aktivierung von
NF-κB-Dimeren verhindert.
Solche Verfahren sind für die
Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen nützlich, die mit einer NF-κB-Aktivierung
assoziiert sind, einschließlich
entzündlicher
und Gewebsreparaturstörungen,
insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher
Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit),
Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose
einschließlich
Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten
Hautschäden,
Autoimmunerkrankungen einschließlich
systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer
Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher
Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis,
Krebs einschließlich
der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten
Entzündung und
bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom
(AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
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Hintergrund der Erfindung
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Kürzliche
Fortschritte in der Wissenschaft bezüglich Mediatoren, die an akuten
und chronischen entzündlichen
Erkrankungen und Krebs beteiligt sind, haben zu neuen Strategien
bei der Suche nach effektiven Therapeutika geführt. Traditionelle Ansätze beinhalteten
direkte Zielinterventionen, wie zum Beispiel die Verwendung spezifischer
Antikörper,
Rezeptorantagonisten oder Enzyminhibitoren. Ein Durchbruch der letzten Zeit
bei der Aufklärung
regulatorischer Mechanismen, die an der Transkription und Translation
einer Vielzahl von Mediatoren beteiligt sind, haben zu einem gestiegenen
Interesse an den therapeutischen Ansätzen geführt, die auf das Niveau der
Gentranskription gerichtet sind.
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Der
nukleäre
Faktor κB
(NF-κB)
gehört
zu einer Familie von eng verwandten dimeren Transkriptionsfaktorkomplexen,
die aus verschiedenen Kombinationen der Rel/NF-κB-Familie von Polypeptiden gehören. Die
Familie besteht aus fünf
individuellen Genprodukten bei Säugern
RelA (p65), NF-κB1
(p50/p105), NF-κB2 (p49/p100),
c-Rel und RelB, von denen alle Hetero- oder Homodimere bilden können. Diese
Proteine teilen sich eine hoch homologe 300 Aminosäure-"Rel Homologiedomäne", die die DNA-Bindung
und Dimerisierungsdomänen
enthält.
Am extremen C-Terminus der Rel-Homologiedomäne befindet sich eine nukleäre Translokationssequenz,
die beim Transport von NF-κB
vom Cytoplasma zum Kern wichtig ist. Zusätzlich besitzen p65 und cRel
starke Transaktivierungsdomänen
an ihren C-terminalen Enden.
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Die
Aktivität
von NF-κB
wird durch seine Wechselwirkung mit einem Mitglied der Inhibitor
IκB-Familie von
Proteinen reguliert. Diese Interaktion blockiert effektiv die nukleäre Lokalisierungssequenz
der NF-κB-Proteine und verhindert
so eine Migration des Dimers zum Kern. Eine breite Vielzahl von
Stimuli aktiviert NF-κB über was
vermutlich multiple Signaltransduktionswege sind. Beinhaltet sind
bakterielle Produkte (LPS), einige Viren (HIV-1, HTLV-1), entzündliche
Cytokine (TNFα,
IL-1), Umweltund oxidativer Streß und DNA-schädigende Mittel.
Offensichtlich ist allen Stimuli jedoch die Phosphorylierung und
der darauffolgende Abbau von IκB
gemeinsam. IκB
wird an zwei N-terminalen Serinen durch die kürzlich identifizierten IκB-Kinasen
(IKK-α und IKK-β) phosphoryliert.
Ortsgerichtete Mutagenesestudien zeigen an, daß diese Phosphorylierungen
für die
darauffolgende Aktivierung von NF-κB darin kritisch sind, daß sie sobald
sie phosphoryliert sind, das Protein für einen Abbau über den
Ubiquitin-Proteasomen
Weg markiert ist. Frei von IκB
sind die aktiven NF-κB-Komplexe dazu
in der Lage sich zum Kern zu translozieren, wo sie auf selektive
Weise an bevorzugte genspezifische Enhancersequenzen binden. Beinhaltet
in den durch NF-κB
regulierten Genen ist eine Anzahl von Cytokinen und Chemokinen,
Zelladhäsionsmolekülen, Akutphasenproteine,
immunregulatorische Proteine, Eicosanoid-metabolisierende Enzyme
und anti-Apoptose Gene.
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Es
ist wohlbekannt, daß NF-κB eine Schlüsselrolle
bei der regulierten Expression einer großen Anzahl von pro-inflammatorischen
Mediatoren einschließlich
Cytokinen spielt, wie z.B. TNF, IL-1β, IL-6 und IL-8, Zelladhäsionsmolekülen wie
ICAM und VCAM und der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS). Es
ist bekannt, daß solche
Mediatoren eine Rolle bei der Anziehung von Leukozyten zu Entzündungsstellen
spielen und im Fall von iNOS kann dies zu einer Organzerstörung bei
einigen entzündlichen
und Autoimmunerkrankungen führen.
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Die
Wichtigkeit von NF-κB
bei entzündlichen
Störungen
wird weiter durch Studien von Luftwegentzündungen einschließlich dem
Asthma gestärkt,
wobei gezeigt wurde, daß NF-κB aktiviert
wurde. Diese Aktivierung könnte
der erhöhten
Cytokinproduktion wie auch den Leukozyteninfiltrationseigenschaften
dieser Störungen
zugrunde liegen. Es ist zusätzlich
bekannt, daß inhalierte
Steroide die Luftwegshyperreaktivität reduzieren und die entzündliche
Reaktion in den asthmatischen Luftwegen unterdrücken. Im Lichte der kürzlichen
Feststellungen im Hinblick auf die Glucocorticoid-Inhibition von NF-κB kann man
spekulieren, daß diese
Wirkungen durch eine Inhibition von NF-κB vermittelt werden.
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Weitere
Hinweise auf eine Rolle von NF-κB
bei entzündlichen
Störungen
ergeben sich aus Studien der rheumatoiden Gelenkhaut. Obwohl NF-κB normalerweise
als inaktiver cytoplasmatischer Komplex vorliegt, haben kürzliche
immunhistochemische Studien angezeigt, daß NF-κB in den Kernen vorliegt und
daher in den Zellen aktiv ist, die die rheumatoide Gelenkhaut umfassen.
Weiterhin wurde gezeigt, daß NF-κB in menschlichen
Synovialzellen als Reaktion auf eine Stimulierung mit TNF-α oder Il-1β aktiviert
wird. Eine solche Verteilung kann der zugrundeliegende Mechanismus
für die
erhöhte
Cytokin- und Eicosanoid-Produktionseigenschaften dieses Gewebes
sein. Siehe Roshak, A.K. et al., J. Biol. Chem. 271, 31496–31501 (1996).
Die Expression von IKK-β wurde
in Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis dargestellt
und Gentransferstudien haben die zentrale Rolle von IKK-β in der stimulierten
entzündlichen
Mediatorproduktion dieser Zellen demonstriert. Siehe Aupperle et
al., J. Immunology 1999, 163: 427–433 und Aupperle et al., J.
Immunology 2001; 166: 2705–11.
In der letzteren Zeit wurde gezeigt, daß die intraartikuläre Verabreichung
eines Wildtyp-IKK-β-Adenovirus-Konstrukts
ein Anschwellen der Pfoten auslöst,
während
eine intraartikuläre
Verabreichung von dominant-negativem IKK-β die Adjuvans-induzierte Arthritis
bei der Ratte inhibierte. Siehe Tak et al., Arthritis and Rheumatism
2001; 44: 1897–1907.
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Es
ist auch wahrscheinlich, daß die
NF-κB/Rel-
und IκB-Proteine
eine Schlüsselrolle
bei der neoplastischen Transformation und Metastase spielen. Familienmitglieder
sind mit einer Zelltransformation in vitro und in vivo als Ergebnis
einer Überexpression,
Genamplifikation, Genumanordnungen oder Translokationen assoziiert.
Zusätzlich
wird eine Umanordnung und/oder Amplifikation der Gene, die diese
Proteine codieren bei 20 bis 25 % bestimmter menschlicher Lymphoidtumoren
beobachtet. Weiterhin wird NF-κB
durch onkogene Ratten aktiviert, dem häufigsten Defekt bei menschlichen
Tumoren und eine Blockade der NF-κB-Aktivierung
inhibiert eine rasvermittelte Zelltransformation. Zusätzlich wurde über eine
Rolle von NF-κB
bei der Regulation der Apoptose berichtet, was die Rolle dieses
Transkriptionsfaktors bei der Regulation der Tumorzellproliferation
unterstreicht. TNF, ionisierende Strahlung und DNA-schädigende
Mittel aktivieren ebenfalls erwiesenermaßen NF-κB, was wiederum zu der hochregulierten
Expression etlicher Anti-Apoptoseproteine führt. Demgegenüber wurde
gezeigt, daß die
Inhibition von NF-κB
das apoptotische Abtöten
durch diese Mittel bei etlichen Tumorzelltypen verstärkt. Da
dies vermutlich einen Hauptmechanismus der Tumorzellresistenz gegenüber einer Chemotherapie
repräsentiert,
können
Inhibitoren der NF-κB-Aktivierung
nützliche
Chemotherapeutika entweder einzeln oder in einer Hilfsmitteltherapie
sein. Kürzliche
Berichte haben NF-κB
als Inhibitor der Skelettzelldifferenzierung wie auch als Regulator
des Cytokin-induzierten Muskelschwunds impliziert (Guttridge et
al., Science; 2000; 289; 2363–2365),
was das Potential der NF-κB-Inhibitoren
al neue Krebstherapie weiter unterstützt.
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Etliche
NF-κB-Inhibitoren
werden bei C. Wahl et al., J. Clin. Invest. 101(5), 1163–1174 (1998),
R.W. Sullivan et al., J. Med. Chem. 41, 413–419 (1998), J.W. Pierce et
al., J. Biol. Chem. 272, 21096–21103
(1997) beschrieben.
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Das
marine natürliche
Produkt Hymenialdisin inhibiert bekanntlich NFκB. Roshak, A. et al., JPET,
283, 955–961
(1997), Breton, J.J. und Chabot-Fletcher,
M.C., JPET, 282, 459–466
(1997).
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Zusätzlich wurden
Patentanmeldungen im Hinblick auf Aminothiophen-Inhibitoren von IKK-2 eingereicht, siehe
Callahan, et al., WO 2002030353; Baxter et al., WO 2001058890, Faull
et al., WO 2003010158; Griffith et al., WO 2003010163; Fancelli
et al., WO 200198290; Imidazol-Inhibitoren von IKK-2, siehe Callahan et
al., WO 200230423; Anilinophenylpyrimidin-Inhibitoren von IKK-2, siehe Kois et
al., WO 2002046171; β-Carbolin-Inhibitoren von IKK-2,
siehe Ritzeler et al., WO 2001068648, Ritzeler et al.,
EP 1134221 ; Nielsch et al.,
DE 19807993 ; Ritzeler et
al.,
EP 1209158 ; Indol-Inhibitoren
von IKK-2, siehe Ritzeler et al., WO 2001030774; Benzimidazol-Inhibitoren
von IKK-2, siehe Ritzeler et al.,
DE
19928424 ; Ritzeler et al., WO 2001000610; Aminopyridin-Inhibitoren
von IKK-2, siehe Lowinger et al., WO 2002024679; Murata et al.,
WO 2002024693; Murata et al., WO 2002044153; Pyrazolachinazolin-Inhibitoren
von IKK-2, siehe Beaulieu et al., W0 2002028860; Burke et al., WO
2002060386, Burke et al.,
US
20030022898 ; Chinolin-Inhibitoren von IKK-2, Browner et
al., WO 2002041843, Browner et al.,
US 20020161004 und Pyridylcyanoguanidin-Inhibitoren von IKK-2,
siehe Bjorkling et al., WO 2002094813, Binderup et al., WO 2002094322
und Madsen et al., WO 200294265. Die natürlichen Produkte Staurosporin,
Quercetin, K252a und K252b sind erwiesenermaßen IKK-2-Inhibitoren, siehe
Peet, G.W. und Li, J.J. Biol. Chem. 274, 32655–32661 (1999) und Wisniewski,
D. et al., Analytical Biochem. 274, 220–228 (1999). Synthetische Inhibitoren
von IKK-2 wurden ebenfalls beschrieben, siehe Burke et al., J. Biol.
Chem, 278, 1450–1456
(2003) und Murata et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 913–198 (2003) haben
2KK-2-Inhibitoren beschrieben.
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Das
US-Patent Nr. 3,963,750 beschreibt die Herstellung bestimmter Aminothiophene.
Die
EP 0747052 beschreibt
Modulatoren des NF-κB-Transkriptionsfaktors
mit einem Benzothiophen-Bestandteil.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung involviert neue Verbindungen und ein neues
Verfahren zur Inhibition der Aktivierung des Transkriptionsfaktor
NF-κB unter
Verwendung der vorliegenden Verbindungen.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung
von Erkrankungen bereitzustellen, die durch Veränderung der Aktivität des Transkriptionsfaktors
NF-κB therapeutisch
modifiziert werden können.
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Dementsprechend
stellt diese Erfindung in einem ersten Aspekt eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, umfassend eine Verbindung gemäß Formel
(I).
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Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung
von Erkrankungen bereit, worin die Erkrankungspathologie therapeutisch
durch Inhibition der Phosphorylierung und dem darauffolgenden Abbau
von IκB
durch IKK-β modifiziert
werden kann.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren
zur Behandlung von Erkrankungen bereit, wobei die Erkrankungspathologie
therapeutisch durch Inhibition der pathologischen Aktivierung von NF-κB modifiziert
werden kann.
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In
einem besonderen Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zur Behandlung
einer Vielzahl von Erkrankungen bereit, die mit einer NF-κB-Aktivierung assoziiert
sind, einschließlich
entzündlichen
und Gewebsreparaturstörungen,
insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher
Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit),
Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose
einschließlich
Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten
Hautschäden,
Autoimmunerkrankungen einschließlich
systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer
Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher
Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis,
Krebs einschließlich
der Hodgkin-Krankheit,
Cachexie, einer mit Infektion assoziierten Entzündung und bestimmten viralen
Infektionen einschließlich
dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), dem Atemnotsyndrom
beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden aus Formel (I) unten
gewählt:
R
1 bedeutet
CONH
2;
R
2 bedeutet
NR
4R
5;
R
3 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus H, CN, CF
3, Halogen, Aryl, Heteroaryl,
Alkyl, O-Alkyl und S-Alkyl und kann an entweder C
4,
C
5, C
6 oder C
7 angebunden sein;
R
4 bedeutet
H oder Alkyl; und
R
5 ist ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus H, CO-Alkyl, SO
2-Alkyl,
CONH
2, CONH-Alkyl, CONH-Aryl, CONH-Heteroaryl,
CSNH
2, CSNH-Alkyl, CSNH-Aryl, CSNH-Heteroaryl, SO
2NH
2, SO
2NH-Alkyl,
SO
2NH-Aryl und SO
2NH-Heteroaryl,
oder
ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
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Bevorzugte
Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
beinhalten: 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
und 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid.
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Diese
Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen
bereit, die mit einer NF-κB-Aktivierung
assoziiert sind, einschließlich
entzündlichen
und Gewebsreparaturstörungen,
insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher
Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit),
Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose
einschließlich
Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten
Hautschäden,
Autoimmunerkrankungen einschließlich
systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer
Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher
Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis,
Krebs einschließlich
der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten
Entzündung
und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom
(AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
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Definitionen
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet alle Hydrate, Solvate und Komplexe
sowie Prodrugs der Verbindungen dieser Erfindung. Prodrugs sind
jegliche kovalent gebundenen Verbindungen, die das aktive Elternarzneimittel
gemäß Formel
(I) in vivo freisetzen. Wenn ein chirales Zentrum oder eine andere
Form eines isomeren Zentrums in einer Verbindung der vorliegenden
Erfindung vorliegt, sollen alle Formen eines solchen Isomers oder
von Isomeren, einschließlich
Enantiomeren und Diastereomeren hier mit umfaßt sein. Erfinderische Verbindungen,
die ein chirales Zentrum enthalten, können als racemische Mischung
verwendet werden, als enantionmer angereicherte Mischung oder die
racemische Mischung kann unter Verwendung wohlbekannter Techniken
getrennt werden und ein individuelles Enantiomer kann allein verwendet
werden. In den Fällen,
in denen die Verbindungen ungesättigte
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen aufweisen liegen sowohl
die cis-(Z)- als auch trans-(E)-Isomeren im Umfang dieser Erfindung.
In den Fällen,
in denen die Verbindungen in tautomeren Formen existieren können, wie
z.B. Keto-Enol-Tautomere, ist jede tautomere Form als in dieser Erfindung
beinhaltet umfaßt,
egal ob sie im Gleichgewicht oder vorherrschend in einer Form existiert.
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Die
Bedeutung von jedem Substituenten bei jedem Auftreten in Formel
(I) oder irgendeiner Unterformel davon ist unabhängig von seiner Bedeutung oder
irgendeiner anderen Bedeutung eines Substituenten bei einem anderen
Auftreten, falls nicht anders angegeben.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich "Alkyl" auf eine optional
substituierte Kohlenwasserstoff-Gruppe, gebunden durch einzelne
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen und mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
die miteinander verbunden sind. Die Alkylkohlenwasserstoff-Gruppe
kann linear, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein.
Substituenten an optional substituiertem Alkyl werden aus der Gruppe
gewählt,
bestehend aus Aryl, OH, O-Alkyl, CO, Halogen, CF3 und
OCF3.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich "Aryl" auf eine optional
substituierte aromatische Gruppe mit mindestens einem Ring mit einem
konjugierten pi-Elektronensystem, enthalten bis zu zwei konjugierte
oder kondensierte Ringsysteme. Aryl beinhaltet carbocyclische Aryl-
und Biaryl-Gruppen,
die alle optional substituiert sein können. Substituenten werden
aus der Gruppe gewählt,
bestehend aus Halogen, C1-4-Alkyl, NH2, OCF3, CF3, O-Alkyl, S-Alkyl, CN, CHO, SO2-Alkyl
und NO2.
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Wie
hier verwendet bezieht sich "Heteroaryl" auf eine optional
substituierte aromatische Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein
konjugiertes pi-Elektronensystem aufweist, enthaltend bis zu zwei
konjugierte oder kondensierte Ringsysteme und 1 bis 3 Heteroatome,
gewählt
aus O, S und N. Heteroaryl beinhaltet carbocyclische Heteroarylaryl-,
Arylheteroaryl- und Biheteroarylaryl-Gruppen, die alle optional
substituiert sein können. Ein
bevorzugtes Aryl beinhaltet Phenyl und Naphthyl. Ein noch bevorzugteres
Aryl beinhaltet Phenyl. Bevorzugte Substituenten werden gewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Halogen, C1-4-Alkyl,
NH2, OCF3, CF3, O-Alkyl, S-Alkyl, CN, CHO, SO2-Alkyl
und NO2. Beispiele für Heteroarylringe beinhalten
Pyrrol, Furan, Thiophen, Indol, Isoindol, Benzofuran, Isobenzofuran,
Benzothiophen, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Chinolizin, Pyrazol,
Imidazol, Isoxazol, Oxazol, Isothiazol, Thiazol, Pyridazin, Pyrimidin
und Pyrazin.
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Wie
hier verwendet bezieht sich "Halogen" auf F, Cl, Br und
I.
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Herstellungsverfahren
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Die
folgenden Verfahren und Beispiele sollen die vorliegende Erfindung
illustrieren jedoch auf keine Weise begrenzen.
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Die
allgemeine Herstellung von Analogen von 2-Aminobenzothiophen-3-carbonsäureamid
ist in Schema I dargestellt.
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Die
Synthese beginnt mit kommerziell erhältlichem Ethyl-2-amino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiophen-3-carboxylat
(1). Der Schutz der Amino-Gruppe
mit Acetylchlorid (AcCl) und eine Oxidation mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon
(DDQ) stellt Benzothiophen 3 bereit. Die Entfernung der Schutzgruppe
des Acetamids, gefolgt von einer Bromierung mit N-Bromsuccinimid
(NBS) stellt 2-Aminobenzothiophen 5 bereit. Ein Palladium(0)-vermittelte
Suzuki-Kreuzkupplung mit Boronsäure/Ester
ergibt dann 6. Einen neuerlichen Schutz der Amino-Gruppe mit Di-tert-butyldicarbonat
[(Boc)2O] und eine Hydrolyse der Ester-Gruppe
erzeugt die Säure
8. Die resultierende Säure
wird mit 1,1'-Carbonyldiimidazol
(CDI) aktiviert, gefolgt von einer Umsetzung mit Ammoniumhydroxid
und einer Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA), um dann 2-Amino-benzothiophen-3-carbonsäureamid
10 zu ergeben. Verbindung 10 kann einfach in den primären Harnstoff
11 durch Umsetzung mit Chlorsulfonylisocyanat umgewandelt werden
oder in substituierten Harnstoff 12 durch Isocyanate (Schema II).
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Harnstoff
15 wird aus 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonitril (13, Schema III)
unter Verwendung eines zweistufigen Verfahrens synthetisiert; eine
Nitrilhydrolyse gefolgt von einer Harnstoffbildung. Schema
III
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Die
folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren
jedoch auf keine Weise begrenzen.
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Beispiele und Versuchsmaterialien
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Allgemein
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Die
kernmagnetischen Resonanzspektren wurden mit entweder 250, 300 oder
400 MHz unter Verwendung von entweder einem Bruker AM 250-, Bruker
ARX 300- oder Bruker AC 400-Spektrometer aufgezeichnet. CDCl3 ist Deuteriochloroform, DMSO-d6 ist
Hexadeuteriodimethylsulfoxid und CD3OD ist
Tetradeuteriomethanol. Chemische Shifts werden als Teile pro Million
(d) feldabwärts
von dem inneren Standart Tetramethylsilan berichtet. Abkürzungen
für die
NMR-Daten sind wie folgt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett,
q = Quartett, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, dt = Dublett
von Tripletts, app = anscheinend, br = breit. J zeigt die NMR-Kupplungskonstante,
gemessen in Hertz, an. Kontinuierliche Wellen-Infrarot (IR)-Spektren
wurden auf einem Perkin-Elmer 683 Infrarotspektrometer aufgezeichnet
und die Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektren wurden auf einem
Nicolet Impact 400 D Infrarot-Spektrometer aufgezeichnet. Die IR-
und FTIR-Spektren wurden im Transmissionsmodus aufgezeichnet und
die Bandenpositionen wurden als inverse Wellenzahlen (cm –1)
angegeben. Die Massenspektren wurden auf entweder einem VG 70 FE-,
PE Syx API III- oder VG ZAB HF-Instrument unter Verwendung von Fast-Atom-Bombardment
(FAB) oder Elektrospray-(ES)-Ionisierungstechniken genommen. Die
Elementaranalysen wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer 240C-Elementaranalysators
erhalten. Die Schmelzpunkte wurden auf einem Thomas-Hoover-Schmelzpunktapparat
genommen und sind nicht korrigiert. Alle Temperaturen werden in
Grad Celsius angegeben.
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Analtech
Silica Gel GF und E. Merck Silica Gel 60 F-254-Dünnschichtplatten wurden für die Dünnschichtchromatographie
verwendet. Sowohl Flash als auch Schwerkraftchromatographie wurden
auf E. Merck Kieselgel 60 (230–400
mesh) Silicagel durchgeführt.
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Wo
angegeben, wurden bestimmte Materialien von Aldrich Chemical Co.,
Milwaukee, Wisconsin, TCI America, Portland, OR, erworben.
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Beispiel 1
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Herstellung von 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-2-carbonsäureamid
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1a) 2-Acetylamino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiophen-3-carbonsäureethylester
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Zu
einer Lösung
aus Ethyl-2-amino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiophen-3-carboxylat (16 g,
71,1 mmol) in THF (100 ml) wurden 4-(Dimethylamino)pyridin (434
mg, 3,55 mmol) und Acetylchlorid (6,1 ml, 85,3 mmol) zugefügt. Nach
zweistündigem
Rühren
bei Raumtemperatur wurde die Lösung
mit Solelösung
(500 ml) verdünnt
und mit Ethylacetat (500 ml, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert,
um die Titelverbindung (18,3 g, 96 %) als hellgelben Feststoff bereitzustellen:
MS
(ES) m/z 268 (M+H)+.
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1b) 2-Acetylamino-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
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Eine
Lösung
aus 1a (3,0 g, 11,24 mmol) in Benzol (100 ml) wurde mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon
(3,8 g, 16,85 mmol) vermischt. Die resultierende Mischung wurde
im Rückfluß 2 h erwärmt, mit
gesättigter
NaHCO3-Lösung
(300 ml) verdünnt
und mit Ethylacetat (300 ml, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 8:1) ergab dann die
Titelverbindung (1,06 g, 35 %) als gelben Feststoff:
MS (ES)
m/z 264 (M+H)+;
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1c) 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
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Zu
einer Lösung
aus 1b (1,06 g, 4,03 mmol) in Toluol (100 ml) wurde Pyrrolidin (5
ml) zugefügt.
Die resultierende Mischung wurde 8 h auf 100°C erwärmt, mit Solelösung (200
ml) verdünnt
und mit Ethylether (300 ml, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die
Titelverbindung (0,76 g, 85 %) als gelben Feststoff:
MS (ES)
m/z 222 (M+H)+;
1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ: 8,14 (d, J = 8,0 Hz, 1H),
7,53 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,28 (m, 1H), 7,04 (m, 1H), 6,51 (brs,
2H), 4,45 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 1,50 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
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1d) 2-Amino-6-Brom-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
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Zu
einer Lösung
aus 1c (760 mg, 3,44 mmol) in CHCl3 (10
ml) wurde N-Bromsuccinimid (673 mg, 3,78 mmol) zugefügt. Die
resultierende Mischung wurde 1 h gerührt, dann mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
(100 ml) vermischt und mit Methylenchlorid (100 ml, 3×) extrahiert.
Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet,
gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat,
4:1) ergab dann die Titelverbindung (930 mg, 90 %) als gelben Feststoff:
MS
(ES) m/z 300 (M+H)+;
1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ: 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H),
7,63 (s, 1H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,52 (brs, 2H), 4,42 (q,
J = 7,2 Hz, 2H), 1,48 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
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1e) 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
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Zu
einer Lösung
von 1d (200 mg, 0,67 mmol) in 1,4-Dioxan/Wasser (40 ml, 3:1) wurde
4-Fluorphenylboronsäure
(209 mg, 1,34 mmol), NaHCO3 (225 mg, 2,68
mmol) und Pd(PPh3)4 (9
% Pd, 79 mg, 0,067 mmol) zugefügt.
Die resultierende Mischung wurde 1 h auf 110°C erwärmt, mit Solelösung (50
ml) verdünnt
und mit Ethylacetat extrahiert (50 ml, 3×). Die kombinierten organischen
Phasen wurden über
MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die
Titelverbindung (190 mg, 90 %) als klebriges rosa Öl:
MS
(ES) m/z 316 (M+H)+;
1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ: 8,16 (d, J = 8,4 Hz, 1H),
7,69 (s, 1H), 7,62 (m, 2H), 7,50 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,15 (m, 2H),
6,58 (brs, 2H), 4,46 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 1,50 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
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1f) 2-tert-Butoxycarbonylamino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
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Zu
einer Lösung
aus 1e (190 mg, 0,603 mmol) in THF (10 ml) wurde 4-(Dimethylamino)pyridin
(7,4 mg, 0,06 mmol) und Di-tert-butyldicarbonat (158 mg, 0,724 mmol)
zugefügt.
Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, es
wurde mit Solelösung
(50 ml) verdünnt
und mit Ethylacetat (50 m, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash- Chromatographie
(Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die Titelverbindung (200 mg,
80 %) als gelben Feststoff:
MS (ES) m/z 416 (M+H)+.
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1g) 2-tert-Butoxycarbonylamino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäure
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Eine
Lösung
aus 1f (80 mg, 0,193 mmol) in Ethanol/Wasser (1:1, 10 ml) wurde
mit KOH (21,6 mg, 0,39 mmol) vermischt. Die resultierende Mischung
wurde für
1 h auf 60°C
erwärmt,
mit HCl (30 ml, 1N) verdünnt und
mit Ethylacetat (30 ml, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert,
um die Titelverbindung (62 mg, 84 %) als weißen Feststoff zu ergeben:
MS
(ES) m/z 388 (M+H)+.
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1h) [3-Carbamoyl-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-2-yl]carbaminsäure-tert-butylester
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Zu
einer Lösung
aus 1 g (150 mg, 0,38 mmol) in DMF (3 ml) wurde 1,1'-Carbonyldiimidazol (125 mg, 0,78 mmol)
zugefügt.
Die resultierende Lösung
wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt
und mit Ammoniumhydroxid (37 %, 5 ml) vermischt. Die Mischung wurde
mit Solelösung
(10 ml) verdünnt
und mit Ethylacetat (20 ml, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash-Chromatographie
(Hexan/Ethylacetat, 1:1) ergab dann die Titelverbindung (48 mg,
32 %) als weißen
Feststoff.
MS (ES) m/z 387 (M+H)+;
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11,14 (s,
1H), 7,94 (s, 1H), 7,85 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 7,61 (m, 3H), 7,18
(m, 2H), 5,87 (brs, 2H), 1,59 (s, 9H).
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1i) 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
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Eine
Lösung
aus 1h (20 mg, 0,051 mmol) in CH2Cl2 (5 ml) wurde mit Trifluoressigsäure (0,5
ml) vermischt. Die resultierende Lösung wurde eine Stunde bei
Raumtemperatur gerührt,
dann mit gesättigter NaHCO3-Lösung
(30 ml) vermischt und mit Ethylacetat (30 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten
organischen Phasen wurden über
MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 1:1) ergab die Titelverbindung
(8 mg, 55 %) als weißen
Feststoff:
MS (ES) m/z 287 (M+H);
1H-NMR
(400 MHz, CD3OD) δ: 7,73 (s, 1H), 7,63–7,50 (m,
3H), 7,42 (m, 1H), 7,08 (m, 2H).
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Beispiel 2
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Herstellung von 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
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2a) 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
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Eine
Lösung
aus 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonitril (50 mg, 0,29 mmol) in
konzentrierter H2SO4 (1,5
ml) wurde für
2 h auf 60°C
erwärmt.
Die Lösung
wurde in Eiswasser (5 ml) gegossen, mit gesättigter NaHCO3-Lösung (30 ml) vermischt und
mit Ethylacetat (30 ml, 3×)
extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert.
Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat 1:1) ergab dann die
Titelverbindung (23 mg, 41 %) als weißen Feststoff:
MS (ES)
m/z 193 (M+H)+.
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2b) 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
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Zu
der Mischung aus 2a (20 mg, 0,104 mmol) in CH2Cl2 (10 ml) wurde Chlorsulfonylisocyanat (15 μl, 0,15 mmol)
zugefügt.
Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und
mit Wasser (0,5 ml) vermischt. Eine Trennung über eine Umkehrphasen-HPLC
ergab die Titelverbindung (10 mg, 40 %) als weißen Feststoff:
MS (ES)
m/z 236 (M+H)+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6) δ: 10,77 (s, 1H), 7,84 (m, 2H),
7,56 (brs, 3H), 7,20 (m, 1H), 7,08 (m, 1H), 6,98 (brs, 1H).
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Diese
Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die
eine Verbindung gemäß Formel
(I) umfaßt
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel
oder ein Exzipienz. Dementsprechend können die Verbindungen der Formel
(I) bei der Herstellung eines Medikaments verwendet werden. Pharmazeutische
Zusammensetzungen der Verbindungen der Formel (I) wie vorher beschrieben
hergestellt können
als Lösungen
oder lyophilisierte Pulver für
die parenterale Verabreichung formuliert werden. Pulver können durch
Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels
oder eines anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägers vor der Verwendung rekonstituiert
werden. Die flüssige
Formulierung kann eine gepufferte, isotonische, wäßrige Lösung sein.
Beispiele für
geeignete Verdünnungsmittel
sind normale isotonische Salzlösung,
Standard 5 % – Dextrose
in Wasser oder gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetat-Lösung. Solche
Formulierungen sind insbesondere für die parenterale Verabreichung
geeignet, können
jedoch auch für die
orale Verabreichung verwendet werden, oder in einem eingeteilten
Dosisinhalator oder Zerstäuber
für das Einatmen
enthalten sein. Es kann wünschenswert
Exzipienten wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose,
Akazin, Polyethylenglykol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat
zuzufügen.
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Alternativ
können
diese Verbindungen verkapselt, tablettiert oder als Emulsion oder
Sirup für
die orale Verabreichung hergestellt werden. Pharmazeutisch annehmbare
feste oder flüssige
Träger
können
zugefügt werden
um die Zusammensetzung zu verstärken
oder zu stabilisieren oder um die Herstellung der Zusammensetzung
zu erleichtern. Feste Träger
beinhalten Stärke,
Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Terra alba, Magnesiumstearat oder
Stearinsäure,
Talk, Pectin, Acazin, Agar oder Gelatine. Flüssige Träger beinhalten Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Salzlösung und
Wasser. Die Träger
können
auch ein Material zur verzögerten
Freisetzung beinhalten wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat,
allein oder mit einem Wachs. Die Menge an festem Träger variiert,
wird jedoch vorzugsweise zwischen ungefähr 20 mg und ungefähr 1 g pro
Dosierungseinheit liegen. Die pharmazeutischen Präparationen
werden folgend den konventionellen Techniken der Pharmazie hergestellt,
die ein Mahlen, Vermischen, Granulieren und Komprimieren involvieren,
falls nötig
für Tablettenformen;
oder ein Mahlen, Vermischen und Befüllen für Hartgelatinekapselformen.
Wenn ein flüssiger
Träger
verwendet wird, wird sich die Präparation
in Form eines Sirups, Elixiers, einer Emulsion oder einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Suspension
befinden. Eine solche flüssige
Formulierung kann direkt p.o. verabreicht werden oder in eine Weichgelatinekapsel
gefüllt
werden.
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Typische
Zusammensetzungen für
die Inhalation befinden sich in Form eines trockenen Pulvers, einer Lösung, einer
Suspension oder Emulsion. Die Verabreichung kann beispielsweise
durch einen Trockenpulverinhalator geschehen (wie zum Beispiel einen
Einheitsdosis- oder Multidosisinhalator, z.B. wie beschrieben im
US-Patent 5590645 oder durch Zerstäubung oder in Form eines Druckaerosols).
Trockene Pulverzusammensetzungen verwenden typischerweise einen
Träger
wie Lactose, Trehalose oder Stärke.
Zusammensetzungen für
die Zerstäubung
verwenden typischerweise Wasser als Vehikel. Unter Druck stehende
Aerosole verwenden typischerweise ein Treibmittel wie zum Beispiel
Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan oder noch bevorzugter
1,1,1,2-Tetrafluorethan, 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluor-n-propan oder
Gemische davon. Unter Druck stehende Aerosolformulierungen können sich
in Form einer Lösung
befinden (die möglicherweise
ein löslichmachendes
Mittel wie Ethanol verwendet) oder einer Suspension, die frei von
Exzipienten sein kann oder Exzipienten verwendet, einschließlich Tensiden
und/oder Co-Lösungsmitteln
(z.B. Ethanol). In Trockenpulverzusammensetzungen und Suspensionsaerosolzusammensetzungen
wird der Wirkstoff vorzugsweise eine für die Inhalation geeignete
Größe aufweisen
(typischerweise mit einem mittleren Massedurchmesser (MMD) von weniger
als 20 μm,
z.B. 1–10,
insbesondere 1–5 μm). Eine
Größenreduktion
des Wirkstoffs kann beispielsweise durch Mikronisierung nötig sein.
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Unter
Druck stehende Aerosolzusammensetzungen werden allgemein in Behälter gefüllt, die
mit einem Ventil ausgerüstet
sind, insbesondere einem Dosierventil. Die Behälter können optional mit Kunststoffmaterialien
beschichtet sein, z.B. einem Fluorkohlenstoff-Polymer wie in WO
96/32150 beschrieben. Die Behälter können in
ein Betätigungsglied
eingepaßt
sein, das für
die bukkale Zufuhr angepaßt
ist.
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Typische
Zusammensetzungen für
die nasale Zufuhr beinhalten die oben erwähnten für die Inhalation und beinhalten
weiterhin nicht unter Druck stehende Zusammensetzungen in Form einer
Lösung
oder Suspension in einem inerten Vehikel wie zum Beispiel Wasser,
optional in Kombination mit konventionellen Exzipienten wie Puffern,
antimikrobiellen Mitteln, die Tonizität modifizierenden Mitteln und
die Viskosität
modifizierenden Mitteln, die von einer nasalen Pumpe verabreicht
werden können.
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Für die rektale
Verabreichung können
die Verbindungen dieser Erfindung auch mit Exzipienten wie Kakaobutter,
Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglykolen kombiniert werden und
zu einem Suppositorium geformt werden.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhalten die topisch inhalierte
und Intrakolon-Verabreichung der Verbindungen der Formel (I). Unter
topischer Verabreichung wird eine nicht-systemische Verabreichung
verstanden, einschließlich
einer Anwendung einer Verbindung der Erfindung extern auf die Epidermis, der
Bukkalhöhlung
und das Eintröpfeln
einer solchen Verbindung in das Ohr, das Auge und die Nase, wobei die
Verbindung den Blutstrom nicht signifikant betritt. Unter systemischer
Verabreichung wird eine orale, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung
verstanden. Die Menge einer Verbindung der Erfindung (hiernach als
Wirkstoff bezeichnet), die für
eine therapeutische oder prophylaktische Wirkung bei topischer Verabreichung
nötig ist,
wird natürlich
je nach dieser gewählten
Verbindung, der Art und Schwere der zu behandelnden Bedingung und
dem die Behandlung durchmachenden Tier variieren und befindet sich
schlußendlich
in der Entscheidungsgewalt des behandelnden Arztes.
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Während es
möglich
ist, daß ein
Wirkstoff allein als Rohchemikalie verabreicht wird, wird es bevorzugt ihn
als pharmazeutische Formulierung zu präsentieren. Der Wirkstoff kann
für die
topische Verabreichung 0,01 bis 5,0 Gew.% der Formulierung umfassen.
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Die
topischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung, sowohl für veterinärmedizinische
als auch für
die humanmedizinische Verwendung umfassen einen Wirkstoff zusammen
mit einem oder mehr annehmbaren Trägern hierfür und optional irgendwelchen
anderen therapeutischen Bestandteilen. Der Träger muß in dem Sinne "annehmbar" sein, daß er mit
den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und sich auf
den Empfänger
nicht nachteilig auswirkt.
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Für die topische
Verabreichung geeignete Formulierungen beinhalten flüssige oder
halbflüssige
Präparationen,
wie die für
die Durchdringung der Haut zu der Stelle, an der eine Behandlung
nötig ist
geeignet sind, wie zum Beispiel: Einreibemittel, Lotionen, Cremes,
Salben oder Pasten und für
die Verabreichung in das Auge, Ohr oder die Nase geeignete Tropfen.
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Die
Tropfen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
sterile wäßrige oder ölige Lösungen oder
Suspensionen umfassen und können
hergestellt werden, indem der Wirkstoff in einer geeigneten wäßrigen Lösung eines
bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder irgendeinem anderen
geeigneten Konservierungsmittel gelöst wird und beinhalten vorzugsweise
ein Tensid. Die resultierende Lösung
kann dann durch Filtration aufgeklärt, in einen geeigneten Behälter übertragen
werden, der dann versiegelt wird und durch Autoklavieren sterilisiert
werden oder indem sie für
eine halbe Stunde bei 90-100°C
gehalten werden. Alternativ kann die Lösung durch Filtration sterilisiert
werden und durch aseptische Verfahren in den Behälter übertragen werden. Beispiele
für bakterizide
und fungizide Mittel, die zum Einschluß in die Tropfen geeignet sind,
sind Phenylmercurinitrat oder -acetat (0,002 %), Benzalkoniumchlorid
(0,01 %) und Chlorhexidinacetat (0,01 %). Geeignete Lösungsmittel
für die
Herstellung einer öligen
Lösung
beinhalten Glycerin, verdünnten
Alkohol und Propylenglykol.
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Lotionen
gemäß der vorliegenden
Erfindung beinhalten diejenigen die für die Anwendung auf die Haut oder
ins Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wäßrige Lösung umfassen,
die optional ein Bakterizid enthält
und kann durch Verfahren hergestellt werden, die denjenigen für die Herstellung
von Tropfen ähnlich
sind. Lotionen oder Einreibemittel für die Anwendung auf die Haut
können
auch Mittel beinhalten, um das Austrocknen zu beschleunigen und
die Haut zu kühlen,
wie zum Beispiel einen Alkohol oder Aceton und/oder ein Anfeuchtungsmittel
wie Glycerin oder ein Öl
wie Castoröl
oder Arachinöl.
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Cremes,
Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden
Erfindung sind halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs für die externe
Anwendung. Sie können
durch Vermischen des Wirkstoffs in fein verteilter oder pulverförmiger Form,
allein oder in Lösung
oder Suspension in einem wäßrigen oder
nicht-wäßrigen Fluid
hergestellt werden, unter Zuhilfenahme einer geeigneten Maschinerie,
mit fettiger oder nichtfettiger Basis. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe
umfassen, wie zum Beispiel hartes, weiches oder flüssiges Paraffin,
Glycerin, Bienenwachs, eine metallische Seife, ein Mucilago, ein Öl von natürlichem
Ursprung, wie zum Beispiel Mandelöl, Maisöl, Arachisöl, Castoröl oder Olivenöl, Wollfett
oder seine Derivate oder eine Fettsäure wie zum Beispiel Stearin-
oder Ölsäure zusammen
mit einem Alkohol wie Propylenglykol oder Macrogole. Die Formulierung kann
jedes geeignete Tensid wie zum Beispiel anionische, kationische
oder nichtionische Tenside wie Sorbitanester oder Polyoxyethylen-Derivate
davon beinhalten. Suspendiermittel wie natürliche Kautschuks, Cellulose-Derivate
oder anorganische Materialien wie kieselförmige Siliciumoxide und andere
Bestandteile wie Lanolin können
ebenfalls beinhaltet sein.
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Verwendbarkeit der vorliegenden Erfindung
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Die
Verbindungen der Formel I sind als Inhibitoren der IKK-β-Kinasephosphorylierung
von IκB
geeignet und sind als solche Inhibitoren der NFκB-Aktivierung. Das vorliegende
Verfahren verwendet Zusammensetzungen und Formulierungen der Verbindungen,
einschließlich
pharmazeutischer Zusammensetzungen und Formulierungen der Verbindungen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt insbesondere Verfahren zur Behandlung
von Erkrankungen bereit, die mit einer nicht richtigen NF-κB-Aktivierung assoziiert
sind, wobei die Verfahren die Verabreichung von ein oder mehr Verbindungen
der Formel (I) an ein Tier, insbesondere einen Säuger, insbesondere einen Menschen,
die dessen bedürfen,
umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Verfahren zur Behandlung
von entzündlichen
und Gewebsreparaturstörungen
bereit, insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher
Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit),
Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose
einschließlich
Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten
Hautschäden,
Autoimmunerkrankungen einschließlich
systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer
Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher
Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis, Krebs
einschließlich
der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten
Entzündung
und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom
(AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
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Für die akute
Therapie ist eine parenterale Verabreichung von ein oder mehr Verbindungen
der Formel (I) nützlich.
Eine intravenöse
Infusion der Verbindung in 5 % Dextrose in Wasser oder normaler
Salzlösung oder
eine ähnliche
Formulierung mit geeigneten Exzipienten ist besonders effektiv,
obwohl eine intramuskuläre Bolusinjektion
auch nützlich
ist. Typischerweise wird die parenterale Dosis bei ungefähr 0,01
bis ungefähr
50 mg/kg liegen; vorzugsweise zwischen 0,1 und 20 mg/kg auf eine
Weise um die Konzentration eines Arzneimittels im Plasma bei einer
effektiven Konzentration zur Inhibition von IKK-beta und daher einer
Aktivierung von NF-κB
zu erhalten. Die Verbindungen werden ein- bis viermal täglich auf
einem Niveau verabreicht, um eine gesamte tägliche Dosis von 0,4 bis ungefähr 80 mg/kg/Tag
zu erreichen. Die präzise
Menge der in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Verbindung,
die therapeutisch effektiv ist, und die Art und Weise, durch die
die Verbindung am besten verabreicht wird, wird durch den Fachmann
auf dem Gebiet einfach bestimmt, indem das Blutniveau des Mittels
mit der nötigen
Konzentration für
einen therapeutischen Effekt verglichen wird.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
dem Patienten auch oral verabreicht werden, auf eine Weise, daß die Konzentration
des Arzneimittels ausreicht um IKK-beta und daher die Aktivierung
von NF-κB
zu inhibieren oder um irgendeine andere therapeutische Indikation
wie hier offenbart zu erreichen. Typischerweise wird eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die die Verbindung enthält, mit einer oralen Dosis
von ungefähr
0,1 bis ungefähr
50 mg/kg auf eine Weise verabreicht, die dem Zustand des Patienten
entspricht. Vorzugsweise würde
die orale Dosis bei ungefähr
0,5 bis ungefähr
20 mg/kg liegen.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
dem Patienten auch topisch verabreicht werden, auf eine Weise, daß die Konzentration
des Arzneimittels ausreicht um IKK-beta und daher die Aktivierung
von NF-κB zu
inhibieren oder um irgendeine andere therapeutische Indikation wie
hier offenbart zu erreichen. Typischerweise wird eine pharmazeutische
Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung in einer topischen Formulierung
mit ungefähr
0,01 bis ungefähr
5 % G/G verabreicht.
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Es
werden keine nicht-akzeptablen toxikologischen Wirkungen erwartet,
wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß der vorliegenden
Erfindung verabreicht werden.
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Die
Fähigkeit
der hier beschriebenen Verbindungen, die Aktivierung von NF-κB zu inhibieren
wird deutlich durch ihre Fähigkeit
belegt, die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments von IκB-α durch IKK-β zu inhibieren
(siehe Tabelle 1 für
die Beispiele). Diese Verbindungen blockieren auch den Abbau von
IκB-α und die
nukleäre
Translokation von NF-κB in menschliche
Monozyten und andere Säugerzellen
bei Aktivierung der Zellen mit proinflammatorischen Stimuli (z.B.
TNF-α, LPS
usw.). Zusätzlich
inhibieren diese Verbindungen eine proinflammatorische Mediatorproduktion
von LPS-stimulierten menschlichen Monozyten und stimulierten menschlichen
primären
Synovialfibroblasten. Die Verwendbarkeit der gegenwärtigen NF-κB-Inhibitoren bei der Therapie
von Erkrankungen wird durch die Wichtigkeit der NF-κB-Aktivierung
bei einer Vielzahl von Erkrankungen vorhergesagt.
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NF-κB spielt
eine Schlüsselrolle
bei der regulierten Expression einer großen Anzahl von proinflammatorischen
Mediatoren einschließlich
Cytokinen wie TNF, IL-1β,
IL-6 und IL-8 (Mukaida et al., 1990; Libermann und Baltimore, 1990;
Matsusaka et al., 1993), Zelladhäsionsmolekülen wie
ICAM und VCAM (Marui et al., 1993; Kawai et al., 1995; Ledebur and
Parks, 1995) und der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) (Xie
et al., 1994; Adcock et al., 1994). (Vollständige Referenzzitate befinden
sich am Ende dieses Abschnitts). Von sochen Mediatoren ist bekannt,
daß sie
eine Rolle bei dem Anziehen von Leukozyten an Entzündungsstellen spielen
und im Fall von iNOS zu einer Organzerstörung bei einigen entzündlichen
und Autoimmungerkrankungen führen
können
(McCarney-Francis et al., 1993; Kleemann et al., 1993).
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Beweise
für die
Wichtigkeit der Rolle von NF-κB
bei entzündlichen
Störungen
werden bei Studien asthmatischer Patienten erhalten. Bronchialbiopsien,
die von mild atopischen Asthmatikern entnommen wurden, zeigen einen
signifikanten Anstieg der Zahl von Zellen in der Submucosa-Färbung für aktiviertes
NF-κB, Gesamt-NF-κB und NF-κB-regulierte
Cytokine, wie zum Beispiel GM-CSF und TNFα im Vergleich mit Biopsien von
normalen nichtatopischen Kontrollen (Wilen et al., 1998). Weiterhin
ist der Prozentsatz an Gefäßen, die eine
NF-κB-Immunreaktivität exprimieren
erhöht,
wie die IL-8-Immunreaktivität im Epithel
der Biopsieproben (Wilson et al., 1998). Als solche würde vorhergesagt
werden, daß die
Inhibition der IL-8-Produktion durch Inhibition von NF-κB, wie durch
diese Verbindungen demonstriert, für Luftwegsentzündungen
günstig
sein würde.
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Kürzliche
Studien legen nahe, daß NF-κB auch eine
kritische Rolle bei der Pathogenese von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen (IBD) spielen kann. Aktiviertes NF-κB wird Kolonbiopsieproben
der Morbus Chron und Patienten mit ulzerativer Kolitis beobachtet
(Ardite et al., 1998; Rogler et al., 1998; Schreiber et al., 1998).
Eine Aktivierung ist in der entzündeten
Mucosa evident jedoch nicht in der nicht entzündeten Mucosa (Ardite et al.,
1998; Rogler et al., 1998) und ist mit einer erhöhten IL-8 mRNA-Expression an
denselben Stellen assoziiert (Ardite et al., 1998). Weiterhin inhibiert
die Kortikosteroidbehandlung die intestinale NF-κB-Aktivierung deutlich und reduziert die
Kolonentzündung
(Ardite et al., 1998; Schreiber et al., 1998). Wiederum würde vorhergesagt
werden, daß die
Inhibition der IL-8-Produktion durch Inhibition von NF-κB, wie durch
diese Verbindungen demonstriert für chronisch entzündliche
Darmerkrankungen nützlich
sein würde.
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Tiermodelle
der gastrointestinalen Entzündung
stellen weitere Stützen
für NF-κB als Schlüsselregulator
der Colonentzündung
bereit. Eine erhöht
NF-κB-Aktivität wird in
Lamina propria-Makrophagen bei einer 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)-induzierten
Kolitis bei Mäusen
beobachtet, wobei p65 ein Hauptbestandteil der aktivierten Komplexe
ist (Neurath et al., 1996; Neurath und Pettersson, 1997). Eine lokale
Verabreichung von p65-Antisense hebt die Zeichen der etablierten
Kolitis bei den behandelten Tieren ohne Zeichen einer Toxizität auf (Neurath
et al., 1996; Neurath und Pettersson, 1997). Als solches würde man
vorhersagen, daß kleine
Molekülinhibitoren
von NF-κB
bei der Behandlung von IBD nützlich
sein würden.
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Weitere
Beweise für
eine Rolle von NF-κB
bei entzündlichen
Störungen
ergeben sich aus Studien der rheumatoiden Gelenkhaut. Obwohl NF-κB normalerweise
als inaktiver Cytoplasmakomplex vorliegt, haben kürzliche
immunhistochemische Studien angezeigt, daß NF-ĸB in den Kernen vorliegt
und daher in Zellen aktiv ist, umfassend die menschliche rheumatoide
Gelenkhaut (Handel et al., 1995; Marok et al., 1996; Soud et al, 1998)
und bei Tiermodellen der Erkrankung (Tsao et al., 1997). Die Färbung ist
mit Wildtyp A-Synoviozyten und
vaskulärem
Endothel assoziiert (Marok et al., 1996). Weiterhin wird eine konstitutive
Aktivierung von NF-κB
bei kultivierten Synoviozyten beobachtet (Roshak et al., 1996; Miyazawa
et al., 1998) sowie auch bei Synovialzellkulturen, die mit IL-1β oder TNFα stimuliert
wurden (Roshak et al., 1996; Fujisawa et al., 1996; Roshak et al.,
1997). So kann die Aktivierung von NF-κB der erhöhten Cytokinproduktion und
der Leukozyteninfiltrationseigenschaft der entzündeten Gelenkhaut zugrunde
liegen. Die Fähigkeit
dieser Verbindungen NF-κB
zu inhibieren und dadurch die Erzeugung von proinflammatorischen
Mediatoren (z.B. Cytokine und Prostanoide) durch diese Zellen, sollten
sie damit für
die rheumatoide Arthritis günstig
erscheinen lassen.
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Biologische Assays
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Die
Verbindungen dieser Erfindung können
in einem von etlichen biologischen Assays getestet werden um die
Konzentration der Verbindung zu bestimmen, die nötig ist, um einen gegebenen
pharmakologischen Effekt zu erreichen.
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Die
NF-κB-Aktivität kann auch
in einem Elektrophoresemobilitäts-Shiftassay (EMSA)
gemessen werden um die Gegenwart von NF-κB-Protein im Kern zu bewerten.
Die Zellen von Interesse werden auf eine Dichte von 1 × 106 Zellen/ml kultiviert. Die Zellen werden
durch Zentrifugation geerntet, in PBS ohne Ca2+ und Mg2+ gewaschen und in PBS mit Ca2+ und
Mg2+ bei 1 × 107 Zellen/ml
resuspendiert. Um die Wirkung der Verbindung auf die Aktivierung
von NF-κB
zu überprüfen, werden
die Zellsuspensionen mit verschiedenen Konzentrationen von Arzneimittel
oder Vehikel (DMSO, 0,1 %) für
30 min bei 37°C
vor der Stimulierung mit TNF-α (5,0
ng/ml) für
zusätzliche
15 min behandelt. Zelluläre
und nukleäre
Extrakte werden wie folgt hergestellt. Kurz gefaßt werden nach Ende der Inkubationszeitspanne
die Zellen (1 × 107 Zellen) 2× in PBS ohne Ca2+ und
Mg2+ gewaschen. Die resultierenden Zellpellets
werden in 20 μl
Puffer A (10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2,
0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 % NP-40) resuspendiert und 10
min auf Eis inkubiert. Die Kerne werden durch Mikrozentrifugation
bei 3500 Upm 10 min bei 4°C
pelletisiert. Der resultierende Überstand
wird als zellulärer
Extrakt gesammelt und das Kernpellet wurde in 15 μl Puffer
C (20 mM Hepes (pH 7,9), 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2,
25 % Glycerin, 0,2 M EDTA, 0,5 mM DTT und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF))
resuspendiert. Die Suspensionen werden vorsichtig 20 min bei 4°C gemischt
und dann bei 14000 Upm für
10 min bei 4°C
mikrozentrifugiert. Der Überstand
wird gesammelt und auf 60 μl
mit Puffer D (20 mM Hepes (pH 7,9), 50 mM KCl, 20 % Glycerin, 0,2
mM EDTA, 0,5 mM DTT und 0,5 mM PMSF) verdünnt. Alle Proben werden bei – 80°C gelagert
bis sie analysiert werden. Die Proteinkonzentration der Extrakte
wird gemäß dem Verfahren
von Bradford (Bradford, 1976) mit BioRad-Reagentien bestimmt.
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Die
Wirkung der Verbindungen auf die Transkriptionsfaktoraktivierung
wird in einem Elektrophoresemobilitäts-Shiftassay (EMSA) unter
Verwendung von Kernextrakten von behandelten Zellen wie oben beschrieben
bewertet. Die Doppelstrang-NF-κB-Konsensusoligonukleotide
(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') werden mit T4-Polynukleotidkinase und [g-32P]ATP
markiert. Die Bindungsmischung (25 μl) enthält 10 mM Hepes-NaOH (pH 7,9),
4 mM Tris-HCl (pH 7,9), 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol,
10 % Glycerin, 0,3 mg/mol Rinderserumalbumin, und 1 μg Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC).
Die Bindungsmischungen (10 μg
Kernextraktprotein) werden 20 min bei Raumtemperatur mit 0,5 ng 32P-markiertem Oligonukleotid (50 000–100 000
cpm) in Gegenwart oder Abwesenheit von nicht-markiertem Kompetitor
inkubiert, woraufhin die Mischung auf ein 4%iges Polyacrylamidgel
geladen wird, hergestellt in 1X Trisborat/EDTA und werden bei 200 V
2 h elektrophoretisch aufgetrennt. Folgend auf die Elektrophorese
werden die Gels getrocknet und belichtet, um einen Nachweis der
Bindungsreaktion zu ermöglichen.
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Die
Wirkung der Verbindungen auf die Phosphorylierung von IκB können in
einem Western-Blot überwacht
werden. Zelluläre
Extrakte werden in einer Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophores (SDS-PAGE)
auf 10 % Gelen (RioRad, Hercules, CA) unterworfen und die Proteine
auf Nitrocellulosesheets (HybondTM-ECL,
Amersham Corp., Arlington Heights, IL) übertragen. Immunoblot-Assays
werden unter Verwendung eines polyklonalen Kanichen-Antikörpers gegen
IκBα oder IκBβ durchgeführt, gefolgt
von einem Peroxidase-konjugierten Esel-Antikaninchen-sekundären-Antikörper (Amersham
Corp., Arlington Heights, IL). Immunreaktive Banden werden unter
Verwendung des Enchanced Chemiluninescence (ECL)-Assaysystems (Amersham
Corp., Arlington Heights, IL) nachgewiesen.
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Die
Assays im Hinblick auf IκB-Kinasen
wurden wie folgt durchgeführt:
IKK-α wurde
als Hexahistidin-Tag-versehenes Protein in Baculovirusinfizierten
Insektenzellen exprimiert und über
eine Ni-NTA-Affinitätssäule gereinigt.
Die Kinaseaktivität
wurde unter Verwendung von 50 ng gereinigtem Protein in Assaypuffer
(20 mM Hepes, pH 7,7, 2 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 10 mM β-Glycerophosphat,
10 mM NaF, 10 mM PNPP, 0,3 mM Na3VO4, 1 mM Benzamidin, 2 μM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin,
1 μg/ml
Pepstatin, 1 mM DTT), enthaltend verschiedene Konzentrationen der
Verbindung oder DMSO-Vehikel
und ATP wie angegeben (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ) überprüft. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 200 ng IκB-GST (Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Santa Cruz, CA) in einem Gesamtvolumen von 50 μl begonnen.
Man ließ die
Reaktion bei 30°C
1 h fortschreiten, woraufhin sie durch Zugabe von EDTA auf eine
Endkonzentration von 20 mM beendet wurde. Die Kinaseaktivität wurde
durch einen dissoziationsverstärkten
Lanthanid-Fluoreszenz-Immunoassay
(Wallac Oy, Turku, Finnland) unter Verwendung eines Phospho-IκB-α-(Ser32)-Antikörpers (New
England Biolabs, Inc., Beverly, MA) und eines Eu3+-markierten
Antikaninchen-IgG (Wallac Oy, Turku, Finnland) bestimmt. Die Platten
wurden in einem VICTOR 1420 Multilabel Counter (Wallac) abgelesen,
wobei ein Standard-Europiumprotokoll (Anregung 340 nm, Emission
615 nm; Fluoreszenz gemessen für
400 μs nach
einer 400 μs-Verzögerung)
verwendet wurde. Die Daten sind als Fluoreszenz (cps)-Einheiten ausgedrückt.
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IKK-β wurde als
GST-tag-Protein exprimiert und seine Aktivität in einem Szintillations-Proximitätsassay
mit 96 Vertiefungen (SPA) bewertet. Kurz gefaßt wurde IKK-β in einem
Assaypuffer wie oben beschrieben (Endkonzentration 20 nM) mit verschiedenen
Konzentrationen von Verbindung oder DMSO-Vehikel, 240 nM ATP und
200 nCi [γ-33P]-ATP (10 mCi/ml, 2000 Ci/mmol; NEN Life
Science Products, Bosten, MA) verdünnt. Die Reaktion wurde durch
Zugabe eines biotinylierten Peptids begonnen, umfassend die Aminosäuren 15–46 von
IκB-α (American
Peptide) auf eine Endkonzentration von 2,4 μM in einem Gesamtvolumen von
50 μl. Die Probe
wurde eine Stunde bei 30°C
inkubiert, gefolgt von Zugabe von 150 μl Stoppuffer (PBS w/o Ca2+, Mg2+, 0,1 % Triton
X-100 (V/V), 10 mM EDTA), enthaltend 0,2 mg Streptavidinbeschichtete
SPA PVT-Kügelchen (Amersham
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Die Probe wurde gemischt, 10
min bei Raumtemperatur inkubiert, zentrifugiert (1000 × g, 2 Minuten)
und auf einer Hewlett-Packard-TopCount gemessen.
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Zusätzlich wird
die IKK-β-
oder IKK-α-Aktivität durch
Phosphorylierung von rekombinantem GST-IkappaBalpha unter Verwendung
eines zeitaufgelösten
Fluoreszenzresonanzenergietransfers (TR-FRET) in Mikrotiterplatten
mit 384 Vertiefungen gemessen. Kurz gefaßt wird IKK-β oder IKK-α in Assay-Puffer (50 mM HEPES,
pH 7,4, enthaltend 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM CHAPS, 1 mM DTT
und 0,01 % G/V BSA) auf eine 5 nM-Endkonzentration verdünnt. Dies
wird zu verschiedenen Konzentrationen der Verbindung oder DMSO-Vehikel
zugefügt
und die Reaktion durch Zugabe von 25 nM GST-IkappaBalpha und 1 μM ATP in
Assaypuffer auf ein Volumen von 30 μl begonnen. Nach 30-minütiger Inkubation
bei Umgebungstemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von 50 mM
EDTA (15 μl)
pH 7,4 beendet. Der Nachweis des phosphorylierten Produkts wurde
durch Zugabe eines LANCE-Europium-Chelat-markierten spezifischen
Antiphosphoserin-monoklonalen Antikörpers mit einer Endkonzentration
von 0,5 nM (Cell signalling Technology via Perkin Elmer) und Allophycocyaninmarkierten
Anti-GST-Antikörper
mit einer Endkonzentration von 10 nM (Prozyme) zum Erhalt eines
Endvolumens von 60 μl
erreicht. Nach weiterer Inkubation von mindestens 30 min bei Umgebungstemperatur
wurde das Signal auf einem Perkin Elmer Discovery-Fluorimeter abgelesen.
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Die
Wirkung von IKK-β-Inhibitoren
auf die primäre
Synovial-Fibroblasten-Mediatorproduktion
wurde wie folgt bewertet: Primäre
Kulturen von humanem RSF wurden durch enzymatischen Verdau von Gelenkhaut, erhalten
von erwachsenen Patienten mit rheumatoider Arthritis wie vorher
beschrieben (Roshak et al., 1996b) erhalten. Die Zellen wurden in
Earl's Minimal Essential
Medium (EMEM) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 100
Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml
Streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY) enthielt, und zwar bei 37°C und 5 %
CO2. Die Kulturen wurden in den Passagen
4 bis 9 verwendet um eine einheitlichere Typ B-Fibroblastenpopulation
zu erhalten. Aus einigen Studien wurden die Fibroblasten mit 5 × 104 Zellen/ml in 16 mm (Durchmesser) Platten
mit 24 Vertiefungen ausplattiert (Costar, Cambridge, MA). Die Zellen
(70–80 %
Konfluenz) wurden gegenüber
IL-1β (1
ng/ml) (Genzyme, Cambridge, MA) für eine bestimmte Zeitspanne ausgesetzt.
Die Arzneimittel in DMSO-Vehikel (1 %) wurden den Zellkulturen 15
Minuten vor Zugabe von IL-1 zugefügt. Die Studien wurden 3- bis
4-mal unter Verwendung von Synovialzellen von unterschiedlichen
Spendern durchgeführt.
Die RSF-Zellextrakte wurden aus Zellen, die wie oben beschrieben
behandelt wurden, hergestellt. Kurz gefaßt wurden menschliche RSF durch
Trypsin/EDTA entfernt, gewaschen und durch Zentrifugation geerntet.
Zellextrakte wurden wie vorher beschrieben hergestellt (Dignam et
al., 1983; Osborn et al., 1989). Kurz gefaßt wurden nach Ende der Inkubationszeitspanne
die Zellen (1 × 107 Zellen) zweimal in PBS ohne Ca2+ und
Mg2+ gewaschen. Die resultierenden Zellpellets
wurden in 20 μl-Puffer
A (10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2,
0,5 mM) resuspendiert.
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Die
Wirkung der IKK-β-Inhibition
auf menschliche Monozytenstimulierte Eicosanoid- und Cytokinproduktion
wurde wie folgt bewertet: die Monozyten wurden aus mit Heparin behandeltem
Gesamtblut durch Doppelgradientenzentrifugation wie vorher beschrieben
isoliert. Isolierte Monozyten-angereicherte PBMCs wurden dann an
Kulturplatten mit 24 Vertiefungen bei 2 × 106 Zellen/ml
in RPMI 1640 10 % FBS (Hyclone, Logan, Utah) für 2 h angehaftet, um die Monozytenpopulation
weiter anzureichern. Daraufhin wurden die Medien entfernt, die Zellen
einmal mit RPMI 1640 gewaschen und 1 ml RPMI 1640, 10 % FBS wurde
den Vertiefungen zugefügt.
Die Testverbindungen wurden den Vertiefungen mit einer endgültigen Vehikelkonzentration
von 0,05 % DMSO zugefügt.
Die Monocyten wurden durch Zugabe von 200 ng/ml Endotoxin (LPS;
E. coli Serotyp 0,26:B6) (Sigma, St. Louis, MO) aktiviert und 24
h inkubiert. Zellfreie Überstände wurden
durch ELISA für
TNF-α (EIA entwickelt
bei SB), PGE2 (Cayman Chemical, Ann Arbor,
MI) und IL-8 und IL-6 (Biosource International, Camarillo, CA) analysiert.
Die Lebensfähigkeit
der Zellen wurde durch einen Trypan-Blau-Ausschluß bestimmt.
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Die
Wirkung der IKK-β-Inhibitoren
auf die Phorbolester-induzierte Entzündung wurde wie folgt bewertet:
Die entzündliche
Reaktion, die durch kutane Anwendung von Phorbolester (PMA) auf
die externen Pinnae von Balb/c-Mäusen induziert
wurde, hat sich als nützliches
Modell zur Untersuchung der multifaktoriellen entzündlichen
Zellinfiltration und entzündlichen
Veränderung
der Epidermis erwiesen. Die intensive entzündliche Läsion wird durch Neutrophilen-Infiltration
dominiert, die einfach durch Messung der Gewebekonzentration der Myeloperoxidase
quantifiziert werden kann, einem azurophilen granulären Enzym,
das in Neutrophilen vorliegt. Zusätzlich kann die Gesamtintensität der entzündlichen
Reaktion durch Bestimmung der Ohrdicke gemessen werden. Balb/c-Mäusen (n=6/Gruppe)
wurde die Arzneimittelbehandlung oder das Vehikel, gefolgt von PMA
(4 μg/Ohr)
verabreicht. Die Mäuse
wurden 4 h später
geopfert, die Ohrdicke bestimmt und die NF-κB-Aktivierung durch IκBα-Western- oder EMSA-Analyse überwacht.
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Die
Wirkung der IKK-β-Inhibitoren
auf ein Ratten-Carrageenaninduziertes Pfotenödem wurde wie folgt bewertet:
Männliche
Lewis-Ratten (Charles River, Raleigh, NC) wurden in Käfigen gehalten
und man erlaubte ihnen freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Wasser
und sie wogen zwischen 200 und 275 g für jedes Experiment. Verbindung
oder Vehikel (0,5 % Tragacanth (p.o.) oder 10 % DMSO, 5 % DMA, 30
% Cremophor (i.p.)) wurde 30 Minuten bis 1 Stunde vor der Carrageenan-Injektion
verabreicht. Das Ödem
wurde durch Injektion von 1 % Carrageenan in sterilem dH2O (0,05 ml/Pfote) induziert und zwar in
die plantare Oberfläche
der rechten Hinterpfote. Die Pfotendicke wurde vor der Verabreichung
von Verbindung oder Vehikel und wiederum nach 3 Stunden gemessen,
um die Veränderung
des Pfotenvolumens zu bestimmen. Die Ratten wurden durch CO2-Inhalation getötet und der rechte Hinterfuß wurde
entfernt, sofort in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei –80°C für die Analyse
gelagert.
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Um
die Wirkungen eines IKK-2-Inhibitors auf das Maus-Collageninduzierte
Arthritis (CIA)-Modell zu bestimmen, wurden 12 männliche DBA/1- Mäuse (20–22 g) pro Behandlungsgruppe
am Tag 0 mit einer Gesamtmenge von 100 μl komplettem Freund-Adjunvas
(CFA), enthaltend 200 μg
bovines Typ II-Collagen
immunisiert. Am Tag 21 wurden die Mäuse mit 100 μl Phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS), enthaltend 200 μg
bovines Typ II-Collagen (die 100 μl
Collagen/CFA oder Collagen/PBS wurden subkutan in den Schwanz injiziert) einem
Antigen ausgesetzt. Der IKK-2-Inhibitor im Vehikel oder das Vehikel
allein wurde intraperitoneal zweimal täglich an den Tagen 1 bis zum
Tag 40 verabreicht (die Erkrankungssymptome werden beginnend an
den Tagen 25–28
deutlich). Zwei zusätzliche
Behandlungsgruppen beinhalten die Positivkontrolle Etanercept (Enbrel) (4
mg/kg, intraperitoneal, jeden zweiten Tag) und das Etanercept-Vehikel
(PBS). Die Mäuse
wurden täglich nach
einem Punktesystem eingeteilt, bis zum Tag 50 und zwar im Hinblick
auf klinische Symptome (siehe unten) und die Pfotendicken wurden
gemessen. Zusätzlich
zu den 12 Mäusen
pro Behandlungsgruppen, die während
des Experiments überwacht
wurden, wurden an etlichen Zeitpunkten während des Verlaufs der Erkrankung
Satellitenmäuse
(3–5 pro
Behandlungsgruppe), die wie oben beschrieben behandelt wurden, verwendet
um die Cytokin/Chemokin-Niveaus
und p65-Niveaus in der Pfote zu messen, die ex vivo Antigen-Recall-Reaktion durch Drainage
der Lymphknoten.
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Induktion von Arthritis
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AIA
wird durch eine Einzelinjektion von 0,75 mg Mycobacterium butyricum
(Difco, Detroit, MI), suspendiert in Paraffinöl in die Basis des Schwanzes
von männlichen
Lewis-Ratten im Alter von 6–8
Wochen (160–180
g) induziert. Hinterpfotenvolumina werden durch das Wasserersatzverfahren
am Tag 16 und/oder Tag 20 gemessen. Die Testverbindungen werden
in einem geeigneten Vehikel homogenisiert und durch einen geeigneten
Weg verabreicht. Den Kontrolltieren wird nur Vehikel verabreicht.
Zwei Dosierungsprotokolle werden allgemein verwendet: prophylaktische
Dosierung, die am Tag der Adjuvansinjektion begonnen wird und therapeutische
Verabreichung, begonnen am Tag 10, sobald die Entzündung etabliert
ist.
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Klinische Einteilung
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Jeder
Pfote wurde eine Bewertung von 0–4 zugeordnet, basierend auf
den folgenden Kriterien:
- 0
- = keine Entzündung
- 1
- = einzelner geschwollener
Zeh
- 2
- = etliche geschwollene
Zehen, leichtes Pfotenschwellen
- 3
- = etliche geschwollene
Zehen, moderates Pfotenschellen
- 4
- = alle Zehen geschwollen,
starkes Pfotenschwellen
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Die
obige Beschreibung offenbart die Erfindung einschließlich bevorzugter
Ausführungsformen
vollständig.
Modifikationen und Verbesserungen der spezifisch hier offenbarten
Ausführungsformen
liegen im Umfang der folgenden Ansprüche. Ohne weitere Ausführungen
wird angenommen, daß ein
Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung
die vorliegende Erfindung in ihrem breitesten Ausmaß verwenden
kann. Daher sollen die hier angefügten Beispiele nur illustrativ
sein und den Umfang der vorliegenden Erfindung auf keine Weise begrenzen.
Die Ausführungsformen
der Erfindung, worin ein exklusives Eigentum oder Privileg beansprucht
wird, sind wie folgt definiert.