DE60311367T2

DE60311367T2 - Verfahren zur Reinigung eines Werkzeugs während der Behandlung einer grösseren Anzahl von Proben

Info

Publication number: DE60311367T2
Application number: DE60311367T
Authority: DE
Inventors: George Robert Atkinson; Alysia Hallam
Original assignee: Genetix Ltd
Current assignee: Molecular Devices New Milton Ltd
Priority date: 2002-08-07
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: DE60311367D1; US7247429B2; EP1391243A1; EP1391243B1; US20040029235A1

Description

HINTERGRUND
Die Erfindung betrifft die Vervielfältigung von Nukleinsäuren, insbesondere die biochemische Vervielfältigung, und insbesondere die Art und Weise der Ausführung einer solchen Vervielfältigung in automatisierter Form unter Verwendung von Kolonieaufnahmerobotern und Well-Platten.
Wie gut bekannt ist, erfordern Sequenzierungsverfahren, wie die Gelkapillarelektrophorese, große Zahlen von Kopien des interessierenden genetischen Materials. Es ist daher notwendig, ein effizientes Vervielfältigungsverfahren zum Replizieren einer kleinen Probe des interessierenden genetischen Materials bereitzustellen.
Traditionelle Vervielfältigungsverfahren basieren auf dem Einbringen einer Probe der interessierenden Nukleinsäure, z.B. eines DNA- oder RNA-Fragments, in Bakterienplasmide oder künstliche Chromosome und dem anschließenden Rücküberführen des so erhaltenen rekombinanten Materials in einen Bakterien- oder Hefewirt. Die Bakterienteilung oder die Hefeteilung wird dann durch Züchten von Kolonien der Bakterien oder der Hefe in Kultur gefördert, um die gewünschte Vervielfältigung, d.h. mehrfaches Kopieren, bereitzustellen. Eine typische Kultivierungszeit beträgt 24 Stunden. Nach der Vervielfältigung werden die Proben vor der Sequenzierung gereinigt.
In jüngerer Zeit sind biochemische Vervielfältigungsverfahren verfügbar geworden, die beispielsweise das Enzym aus dem Bakteriophagen phi29, vermarktet unter dem Handelsnamen "TempliPhi" von Amersham Biosciences, verwenden. Biochemische Vervielfältigungsverfahren umfassen solche Verfahren, die auf der Vervielfältigung nach dem Rolling-Circle-Prinzip (RCA), z.B. des Bakteriophagen phi29, basieren, und solche Verfahren, die auf Polymerasekettenreaktion (PCR) basieren, wie z.B. von Taq-Polymerase oder eine andere thermostabile DNA-Polymerase.
Prinzipiell bietet die biochemische Vervielfältigung mehrere Vorteile gegenüber einer Vervielfältigung in einem Bakterien- oder Hefewirt.
Erstens kann der Vervielfältigungsprozeß, der eher ein im wesentlichen chemischer als biologischer Prozeß ist, beschleunigt werden, da er nicht von Kultivierung abhängig ist. Beispielsweise können DNA-Sequenzen direkt aus Bakterienkolonien bestimmt werden, was die Notwendigkeit des Züchtens von Kolonien in Kultur umgeht.
Zweitens kann die vervielfältigte Probe direkt sequenziert werden, ohne daß eine zwischengeschaltete Reinigungsstufe erforderlich ist.
Wenigstens einige biochemische Vervielfältigungsverfahren sind jedoch aufgrund von Kontaminationsproblemen mit Kolonieaufnahmerobotern nicht kompatibel. Die Kontamination stellt bei biochemischen Vervielfältigungsprodukten ein spezielles Problem dar, da sie überaus empfindlich gegenüber einer nicht-spezifischen Vervielfältigung sind. Um das Kontaminationsproblem bei der Verwendung von Kolonieaufnahmerobotern verständlich zu machen, wird der grundlegende Betrieb eines Kolonieaufnahmeroboters kurz beschrieben.
Ein Kolonieaufnahmeroboter verwendet einen Nadelkopf, umfassend ein Array von Nadeln, von denen jede pneumatisch "abgefeuert" werden kann, wobei Abfeuern verwendet wird, um das pneumatisch angetriebene Ausfahren und Zurückziehen jeder Nadel in eine und aus einer ausgefahrenen Position zu beschreiben. Die Nadeln sind in einem Array angeordnet, welches auf standardmäßige Abmessungen von Well-Platten abgestimmt ist. Beispielsweise ist ein 12 × 8-Nadelkopf üblich, wobei die Nadeln in einem viereckigen Raster angeordnet sind, das auf eine Well-Platte mit 96 Wells abgestimmt ist. Der Nadelkopf kann unter Verwendung hochpräziser xyz-Positionierer über das Bett des Roboters bewegt werden. Eine einzelne Kolonie wird aufgenommen, indem der Aufnahmekopf über die interessierende Kolonie, die in einer am Bett des Roboters angeklemmten Kulturschale oder Kulturplatte enthalten sein kann, bewegt wird, so daß sich eine bis dahin unbenutzte Nadel oberhalb der Kolonie befindet. Die Nadel wird dann in Richtung nach unten abgefeuert, so daß sie die Kolonie berührt und dabei eine Probe von der Kolonie aufnimmt. Die Nadel wird dann zurückgezogen. Der Nadelkopf wird dann zu einer Well-Platte bewegt, in der die Probe abgesetzt werden soll. Die die Probe tragende Nadel wird über dem ausgewählten Well der Well-Platte, der die Probe aufnehmen soll, plaziert, und die Nadel wird erneut abgefeuert, so daß der Nadelkopf in die im Ziel-Well enthaltene Lösung (d.h. Puffer) eingetaucht wird, wodurch die Probe in den Well abgegeben (d.h. inokuliert) wird.
Sobald alle Nadeln verwendet wurden und somit "verschmutzt" sind, wird der Nadelkopf zum Reinigen zu einer Waschstation bewegt. Die Waschstation weist ein oder mehrere Bäder auf. Beispielsweise kann eine Waschstation ein einzelnes Ethanolbad aufweisen. Ein weiteres Beispiel besteht im Vorsehen zweier Bäder, von denen eines Ethanol enthält und das andere eine Mischung aus Bleichmittel und destilliertem Wasser enthält. Alle Nadeln in dem Nadelkopf werden in die Reinigungsflüssigkeit abgefeuert und gewaschen. Das Waschen kann durch Montieren des Bades auf einem Schüttler unterstützt werden.
Nach dem Waschen und anschließendem Trocknen sind die Nadeln in dem Nadelkopf sauber und stehen für die weitere Kolonieaufnahme und Inokulierung zur Verfügung.
Bei der traditionellen Vervielfältigung in einem Bakterien- oder Hefewirt, wobei es sich im wesentlichen um einen biologischen Prozeß handelt, ist es lediglich erforderlich, jegliche auf den Nadelköp fen vorhandenen Bakterien- oder Hefewirte während der in der Waschstation durchgeführten Reinigungsstufe abzutöten. Unter der Voraussetzung, daß der Wirt abgetötet wurde, kann er sich nicht teilen, so daß eine Vervielfältigung nicht stattfinden kann. Im Kontext eines Aufnahmeroboters bedeutet dies, daß, selbst wenn totes Wirtsmaterial nach der Reinigung an einer Nadel zurückbleibt, die Kontamination einer Probe in einem anderen Well durch die Hinzufügung von etwas totem Wirtsmaterial aus einem früheren Aufnahmevorgang zu dieser Probe den Prozeß nicht in nachteiliger Weise beeinflußt, da das kontaminierende Material nicht vervielfältigt werden kann. Die Vervielfältigung einer Kontaminante wird als nicht-spezifische Vervielfältigung bezeichnet. In der Praxis wurde herausgefunden, daß bei Verwendung von Kolonieaufnahmerobotern eine nicht-spezifische Vervielfältigung mit Bakterien- oder Hefewirten ohne Schwierigkeiten durch gründliches Waschen vermieden werden kann.
Andererseits ist es bei der biochemischen Vervielfältigung, die im wesentlichen ein chemischer Prozeß ist, relevant, daß die Nadelköpfe nach der Reinigung keinerlei chemisch aktive Rückstände einer vorherigen Probe tragen. Der Übergang von einem biologischen zu einem chemischen Prozeß erlegt der Reinigung der Nadeln daher viel strengere Anforderungen auf. Insbesondere wurde herausgefunden, daß es aufgrund von Kreuzkontaminationen und resultierender nicht-spezifischer Vervielfältigung nicht machbar ist, Prozesse mit einem (bio)chemischen Vervielfältigungsverfahren unter Verwendung des Bakteriophagen phi29 in einem Kolonieaufnahmeroboter mit standardmäßigen Waschprotokollen durchzuführen.
ZUSAMMENFASSUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Reinigen eines Werkzeugs zwischen der Behandlung einer Mehrzahl von Proben oder Chargen von Proben, welche Nukleinsäure enthalten, die einem Vervielfältigungsprozeß unterzogen werden, bereitgestellt, gekennzeichnet durch Aussetzen des Werkzeugs an UV-Licht zwischen der Behandlung von verschiedenen einzelnen Proben oder Chargen der Proben, um eine Kreuzkontamination durch nicht-spezifische Vervielfältigung zu unterdrücken.
Beispielsweise ist die Vermeidung einer Kreuzkontamination von Nukleinsäureproben besonders bei der Behandlung von genomischer DNA, insbesondere für die Vervielfältigung ganzer Genome und die anschließende Verwendung für SNP-Analyse, Genotypisierung, forensische Analyse oder differentielle Hybridisierung, wichtig. Die Erfindung ist nicht auf DNA-Proben beschränkt, sondern kann auch auf RNA und andere Typen von Nukleinsäurematerial angewandt werden.
Es wird angenommen, daß das Bestrahlen der Nukleinsäureprobe mit UV-Licht die Probe durch eine photoinduzierte Reaktion chemisch modifiziert. Wie bekannt ist, beeinflußt UV-Licht Nukleinsäureproben, indem es dazu führt, daß sich Pyrimidindimere und andere Photoprodukte bilden, die eine anschließende Polymerasereplikation verhindern. Da die Dimere und andere Photoprodukte die normale Replikation stören, obwohl Rückstände auf den Nadeln zurückgeblieben sein können, wird sie inaktiviert, da das Vervielfältigungsprodukt keinen auf diese Weise geschädigten Basenpaarabschnitt vervielfältigen kann. Die neuartige Verwendung einer Aussetzung an UV-Licht als Teil des Werkzeugreinigungsvorgangs bei der Verwendung biochemischer Vervielfältigungsverfahren nutzt diesen bekannten Effekt somit auf eine neue Weise aus und ermöglicht dadurch die Verwendung biochemischer Vervielfältigungsverfahren in Kolonieaufnahmerobotern ohne Probleme aufgrund nicht-spezifischer Vervielfältigung.
Es sei angemerkt, daß ein Kolonieaufnahmeroboter mit UV-Bestrahlungseinrichtung im Stand der Technik verwendet wurde, um Hefesporen durch Erhitzen abzutöten. Es wird jedoch nicht davon ausgegangen, daß die Bestrahlung mit UV-Licht bislang im Zusammenhang mit biochemischen Vervielfältigungsverfahren verwendet wurde, um photochemische Reaktionen zu induzieren, so daß die anschließende Replikation und Transkription gehemmt wird, wie es durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagen wird, um nicht-spezifische Vervielfältigung zu verhindern.
Einige Ausführungsformen der Erfindung verwenden die Vervielfältigung nach dem Rolling-Circle-Prinzip (RCA). Andere Ausführungsformen verwenden die Vervielfältigung mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). Das RCA-Verfahren kann ein Bakteriophagenenzym verwenden. Insbesondere wurde herausgefunden, daß das Verfahren der Erfindung mit dem Bakteriophagen phi29 gut zu funktionieren scheint.
Die PCR kann verwendet werden, um genomische oder cDNA-Bibliotheken hinsichtlich des Vorhandenseins eines bestimmten Gens zu screenen, um Enden von Klonen, z.B. BACs, zu identifizieren, um einander überlappende Klone zu finden, um Mutationen, z.B. durch AFLP (Längen-Polymorphismus amplifizierter Fragmente) oder durch das Vorhandensein/Nichtvorhandensein von Banden, zu finden, bei der Genkartierung, um DNA für die Anordnung auf Nylonmembranen oder Glasmikroarrays zu vervielfältigen oder um PCR-Fragmente für die DNA-Sequenzierung herzustellen.
Die RCA-Technik ist für eine rasche Vervielfältigung von DNA-Matrizen zur direkten Verwendung bei der Sequenzierung ohne das Erfordernis einer weiteren Reinigung ausgestaltet. Diese Vervielfältigung in vitro beseitigt die Notwendigkeit einer Kultivierung von Zellen über Nacht und konventioneller Plasmidherstellungen.
Es ist vorgesehen, daß die Erfindung mit Kolonieaufnahmerobotern und anderen Probenbehandlungsrobotern verwendet wird, die einen Kopf beinhalten, welcher eine Mehrzahl von Nadeln oder Spitzen umfaßt. Eine Bestrahlung mit UV-Licht wird auf den Kopf aufgebracht, welcher somit das oben genannte "Werkzeug" darstellt.
Die Bestrahlung mit UV-Licht kann in geeigneter Weise durch eine oder mehrere Halogenlampen bereitgestellt werden. Die Halogenlampe oder die andere Lichtquelle kann auch dazu dienen, eine Bestrahlung mit Infrarot-(IR-)Licht bereitzustellen, um die Reinigung des Werkzeugs weiter zu fördern.
Das Verfahren kann verbessert werden, indem man das Werkzeug, z.B. die Nadeln eines Nadelkopfs, einem Gasfluß aussetzt, um die Kühlung während und/oder nach der Bestrahlung mit UV-Licht zu fördern. Der Gasfluß ist typischerweise ein Luftstrom oder ein Strom eines kostengünstigen Gases, wie Stickstoff.
Die Bestrahlung mit UV-Licht kann zusammen mit dem konventionellen Waschen des Werkzeugs verwendet werden. Das Waschen kann vor oder nach der Bestrahlung mit UV-Licht stattfinden. Es können konventionelle Waschbäder aus Ethanol und/oder Bleichmittel und Wasser verwendet werden.
Die Erfindung liefert weiterhin die Verwendung eines Roboters, der einen Kopf mit einer Mehrzahl von Nadeln, Spitzen oder dergleichen umfaßt, wobei die Verwendung umfaßt, daß eine Mehrzahl von Proben oder eine Mehrzahl von Chargen von Proben, welche Nukleinsäure enthalten, jeweils einem Vervielfältigungsprozeß unterzogen werden sollen und wobei die Nadeln oder Spitzen zwischen der Behandlung verschiedener einzelner Proben oder Chargen der Proben an UV-Licht ausgesetzt werden, um eine Kreuzkontamination durch nicht-spezifische Vervielfältigung zu unterdrücken.
Die Nadeln oder Spitzen können massiv oder hohl sein.
Ein Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren, wobei das Verfahren umfaßt, daß eine erste Probe oder Charge von Proben, die Nukleinsäure enthält, mit einem Werkzeug behandelt wird, daß eine zweite Probe oder Charge von Proben, die Nukleinsäure enthält, mit dem Werkzeug behandelt wird, wobei das Werkzeug zwischen der Behandlung der Proben oder der Chargen von Proben ultraviolettem (UV) Licht ausgesetzt wird, um eine Kreuzkontamination durch nicht-spezifische Vervielfältigung zu unterdrücken, und daß die behandelten Proben oder Chargen von Proben einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Für ein besseres Verständnis der Erfindung und um zu zeigen, wie diese ausgeführt werden kann, wird nun beispielhalber auf 1 als begleitende Zeichnung Bezug genommen, die schematisch in der Draufsicht einen Roboter für die Ausführung von Verfahren gemäß der Erfindung zeigt.
Der Roboter umfaßt ein Hauptbett 10. Auf dem Hauptbett 10 ist eine Waschstation 20 mit Raum für drei Bäder angeordnet, wobei in der Darstellung darin zwei Bäder vorgesehen sind. Ein erstes Bad 21, welches Ethanol enthält, und ein zweites Bad 22, welches ein Gemisch aus Bleichmittel und destilliertem Wasser enthält, sind gezeigt. Die Waschstation 20 wird verwendet, um die Nadeln eines Nadelkopfs zwischen Inokulierungsvorgängen zu reinigen und so eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu vermeiden. In dem Hauptbett 10 ist auch eine Beleuchtungs- und Trockenstation 24 aufgenommen, die entlang der Waschstation 20 angeordnet ist. Die Beleuchtungs- und Trockenstation 24 hat die Form einer Einheit, die um ungefähr 10 cm (4 Zoll) unterhalb der Ebene des Hauptbetts zurückgesetzt ist und die mit einer Lichtquelle 26 ausgestattet ist, um aus der Nische heraus leuchten zu können. In der Figur sind drei einzelne Glühbirnen 26 gezeigt, was einer derzeitigen Implementierung der Erfindung entspricht, die drei Halogenlampen verwendet. Die Nische der Beleuchtungs- und Trockenstation 24 ist mit einer Luftleitung (nicht gezeigt) verbunden, die unter dem Hauptbett der Vorrichtung verläuft und durch die Luft aus der Nische herausgeblasen wird, um das Trocknen und Kühlen des oberhalb der Nische gehaltenen Nadelkopfs zu fördern. Nach der Waschstufe ist Trocknen erforderlich. Eine Kühlung ist im Hinblick darauf erforderlich, daß die Nadeln Strahlungsenergie von der Lichtquelle absorbieren, was dazu führt, daß sich die Temperatur der Nadeln auf bis zu 200°C erhöht. Es versteht sich, daß es wichtig ist, die Nadeln auf Umgebungstemperatur zu kühlen, ehe sie für weiteres Aufnehmen und Inokulieren verwendet werden. Die in der derzeitigen Implementierung der Erfindung verwendeten Halogenlampen sind standardmäßige Quarz-Linearlampen mit 300 W des Typs R7, z.B. Osram Haloline 64701 oder Philips Plusline. Die Beleuchtungs- und Trockenstation 24 wird verwendet, um die Nadeln eines Nadelkopfs nach dem Waschen in der Waschstation 20 zu bestrahlen und zu trocknen und so den Nadelreinigungsvorgang abzuschließen, wie unten ausführlicher beschrieben wird.
Das Hauptbett 10 ist auch mit einer Anzahl von Schüttlern 30 ausgestattet, von denen zwei veranschaulicht sind. Diese sind so geformt und bemessen, daß sie standardmäßige Well-Platten (z.B. standardmäßige Well-Platten mit 384 Wells) aufnehmen können, und weisen Motorantriebe auf, die unterhalb des Hauptbetts liegen, um die Well-Platten schnell zu drehen und so ein Vortexen in den Wells zu induzieren. In dem Hauptbett 10 ist auch ein Leuchttisch 40 eingebaut. Der Leuchttisch 40 umfaßt eine Milchglasplatte, die bündig mit dem Hauptbett 10 der Vorrichtung montiert ist, wobei eine Weißlichtquelle unterhalb der Ebene des Hauptbetts 10 angeordnet ist, um die Glasplatte von unten zu beleuchten. Wenn ein Behälter mit einer biologischen Probe auf dem Leuchttisch 40 plaziert wird, ermöglicht die Beleuchtung es einem Sichtsystem auf Basis einer oberhalb des Hauptbetts gehaltenen Kamera, die Position und die Größe von Kolonien in dem Behälter mit biologischen Proben für die anschließende Aufnahme zu identifizieren.
Wie es in der Darstellung gezeigt ist, ist an der oberen Seite des Hauptbetts 10 des Roboters eine automatische Zuführvorrichtung 50 für Behälter biologischer Proben angebracht. Die Behälter- Zuführvorrichtung 50 beinhaltet ein "hotel"-artiges Behälterlager (nicht gezeigt) mit fünfundzwanzig Fächern, die durch einen Motor aufwärts und abwärts verfahren werden können, um irgendeines der Fächer mit einer Beförderungsvorrichtung auszurichten, die verwendet wird, um die Behälter von dem Behälterlager (dem "Hotel") zu dem Hauptbett der Vorrichtung auszuliefern. Jedes Fach kann ein einzelnes Q-Tray, ein in einem Q-Tray-förmigen Träger gehaltenes Omnitray oder vier in einem Q-Tray-förmigen Träger gehaltene Petrischalen tragen. Die Beförderungsvorrichtung basiert auf einem Paar von Schienen (nicht gezeigt), die die Behälter durch einen Deckelabnahme-/Deckelaufbringungsmechanismus (nicht gezeigt) zum Entfernen und Wiederaufbringen der Behälterdeckel, wenn die Behälter zu dem Hauptbett transportiert bzw. wieder zu dem Behälterlager zurückgebracht werden, auf den Leuchttisch 40 lenken. Beispielsweise zeigt die Zeichnung vier Petrischalen 2, die zu dem Leuchttisch 40 transportiert wurden. Der Kürze halber wird die mechanische Ausgestaltung der Behälter-Zuführvorrichtung nicht näher veranschaulicht oder beschrieben. Für weitere Einzelheiten der Behälter-Zuführvorrichtung wird auf die US-Patentanmeldung Nr. US 20020133904 verwiesen.
Wie es in der Darstellung zu sehen ist, ist am linken Ende des Hauptbetts 10 eine automatische Zuführvorrichtung 60 für Well-Platten angebracht. Die Well-Platten-Zuführvorrichtung weist eine bis drei Zuführspuren (in diesem Beispiel zwei) auf, entlang welcher die Well-Platten zu und von dem Hauptbett durch einen Deckelabnahme-/Deckelaufbringungsmechanismus (nicht gezeigt) befördert werden, um die Deckel der Well-Platten zu entfernen und wieder aufzubringen, während die Well-Platten hindurchgeführt werden. Beispielsweise sind zwei Well-Platten 4 am Ende ihrer Zuführspuren gezeigt. Jede Zuführspur wird von einem Zuführanschluß 61 aus beliefert, an den eine mit Well-Platten gefüllte Kassette angeschlossen ist. Jeder Zuführanschluß 61 weist einen Zuführmechanismus auf, der eine Well-Platte nach der anderen auf der Zuführspur absetzt. Hinter jedem der Zuführanschlüsse ist ein Umordnungsanschluß 62 angeordnet, der einen pneumatisch betriebenen Hebemechanismus aufweist, um Well-Platten, die von dem Hauptbett der Vorrichtung zurückgebracht wurden, in eine weitere Kassette einzusetzen. Bei ihrer Rückkehr passieren die Well-Platten die Zuführanschlüsse 61, ehe sie die Umordnungsanschlüsse 62 erreichen. Der Kürze halber wird die mechanische Ausgestaltung der Well-Platten-Zuführvorrichtung nicht näher veranschaulicht oder beschrieben. Für weitere Einzelheiten der Well-Platten-Zuführvorrichtung wird auf die US-Patentanmeldung Nr. US 20030133904 verwiesen.
Der Roboter weist einen Bearbeitungskopf 70 auf, der durch x-, y- und z-Positionierer 72, 74 bzw. 76 über das Hauptbett der Vorrichtung bewegt werden kann. Der Bearbeitungskopf 70 wird von dem z-Positionierer getragen, welcher wiederum von dem y-Positionierer getragen wird, welcher wiederum von dem x-Positionierer getragen wird. Diese Teile sind schematisch mit gestrichelten Linien gezeigt. Benachbart zu dem Bearbeitungskopf 70 ist an dem z-Positionierer 76 eine Kamera für maschinelle Beobachtung (nicht gezeigt) angebracht. Die Kamera kann verwendet werden, um Kolonien zu identifizieren und um Strichcodes auf den Well-Platten und/oder Behältern von biologischen Proben zu lesen. Benachbart zu dem Bearbeitungskopf 70 kann an dem z-Positionierer 76 auch ein Well-Platten-Greifer (nicht gezeigt) angeordnet sein, um ein Bewegen von Well-Platten auf dem Hauptbett der Vorrichtung zu ermöglichen. Der Bearbeitungskopf 70 ist lösbar an dem z-Positionierer 76 montiert, so daß der Kopftyp verändert werden kann. Für die Aufnahme von Kolonien würde man einen Nadelkopf verwenden. Für die Behandlung von Flüssigkeiten in Well-Platten, wie z.B. die Übertragung von Flüssigkeit zwischen Well-Platten oder das Befüllen von Well-Platten mit einer Pufferlösung, einem Grundgemisch usw., würde man einen Flüssigkeitsbehandlungskopf mit einem Array von Mikropipettenspitzen verwenden. Falls es gewünscht ist, kann auch ein Gelkernkopf angebracht werden. In der Zeichnung wird davon ausgegangen, daß der Kopfaustausch manuell erfolgt, jedoch könnte auch ein automatischer Kopfaustausch bereitgestellt werden. Für weitere Einzelheiten zur Ausgestaltung des Kopfs und zum automatischen Kopfaustausch wird auf die gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung Nr. US 20020144763 verwiesen.
Nun wird die Auswirkung der Lichtquelle auf den Nadelreinigungsprozeß diskutiert. Bei der Implementierung mit Halogenlampen wurde herausgefunden, daß das Bestrahlen eines oberhalb der Beleuchtungs- und Trockenstation gehaltenen Nadelkopfs für eine Zeitdauer von 4-30 Sekunden ausreichend ist, um Probleme aufgrund von Kreuzkontamination zu beseitigen, wenn es allein oder, was üblicher ist, zusätzlich zu einem konventionellen Waschvorgang mit Ethanol verwendet wird. Aus ersten Versuchen wird angenommen, daß die vorteilhafte Wirkung der Lichtquelle in dem Nadelreinigungsprozeß von der Bereitstellung von UV-Strahlung abhängig ist. Unter der Annahme, daß dies korrekt ist, ist es wichtig, daß, ganz gleich welche Lampen verwendet werden, diese keine UV-Licht blockierenden Ummantelungen oder Beschichtungen aufweisen. Darüber hinaus wird angenommen, daß es wichtig ist, daß die Lichtquelle eine Komponente von Infrarot-(IR-)Strahlung emittiert, um das Aufheizen der Nadeln zu fördern. Die Lichtquelle sollte daher so ausgewählt werden, daß es sich um eine Lichtquelle ohne UV-Licht blockierende oder IR-Strahlung reflektierende Ummantelungen oder Beschichtungen handelt.
Es wird angenommen, daß ein Aussetzen der Matrize (d.h. der Probe von DNA oder RNA, die durch das Vervielfältigungsverfahren vervielfältigt werden soll) an UV-Licht diese durch eine photoinduzierte Reaktion chemisch modifiziert. Wie bekannt ist, beeinflußt UV-Licht DNA, indem es dazu führt, daß sich Pyrimidindimere und andere Photoprodukte bilden, die eine Replikation von DNA-Polymerase durch sie verhindern. Pyrimidindimere können sich durch kovalente Bindung zwischen zwei Pyrimidinbasen (T oder C), die auf einem DNA- oder RNA-Strang nebeneinander liegen, bilden. Da die Dimere und andere Photoprodukte die normale Transkription und Replikation stören, obwohl Rückstände auf den Nadeln zurückgeblieben sein können, wird sie inaktiviert, da das Enzym, welches das RCA- oder PCR-Verfahren antreibt, einen auf diese Weise geschädigten Basenpaarabschnitt nicht vervielfältigen kann. Die neue Verwendung einer Aussetzung an UV-Licht als Teil des Nadelreinigungsprozesses bei Verwendung von RCA- oder PCR-Vervielfältigung nutzt die sen bekannten Effekt daher aus und ermöglicht die Verwendung solcher Vervielfältigungsprodukte in Kolonieaufnahmerobotern ohne nicht-spezifische Vervielfältigung.
Nachdem der Roboter, der verwendet wird, um Verfahren gemäß der Erfindung auszuführen, beschrieben wurde, werden nun auch einige beispielhafte Verfahren unter Verwendung des Bakteriophagen phi29 als Beispiel eines Produkts einer Rolling-Circle-Vervielfältigung (RCA) und von Taq-Polymerase als ein Beispiel eines Produkts einer Vervielfältigung mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) beschrieben.
Beispiel 1: Bakteriophage Phi29 (TempliPhi^TM)
Im folgenden werden die Hauptteile des Protokolls kursiv wiedergegeben, während ihre Implementierung hinsichtlich der genau erforderlichen Handlungen normal gedruckt ist.

1. Eine Well-Platte mir V-förmigem Boden mit 384 Wells, im folgenden bezeichnet als die Ziel-Well-Platte, wird bereitgestellt. Im Kontext des Roboters wird die Ziel-Well-Platte durch die Well-Platten-Zuführvorrichtung 60 über die untere Transportspur zum Hauptbett der Vorrichtung befördert.
2. Die Wells der Zielplatte werden mit 10 μl Probenpuffer befüllt. Dies wird bewerkstelligt, indem man einen Flüssigkeitsbehandlungskopf an dem Roboter anbringt, wobei der Flüssigkeitsbehandlungskopf ein 12 × 8-Array von Mikropipettenspitzen aufweist. Der Flüssigkeitsbehandlungskopf wird über einen Puffertank bewegt und abgesenkt. Die Mikropipettenspitzen werden mit Puffer befüllt. Der Flüssigkeitsbehandlungskopf wird angehoben und zu einem Punkt oberhalb der Ziel-Well-Platte bewegt, so daß sich die 12 × 8 Mikropipettenspitzen über einem ersten Quadranten der 384 Wells enthaltenden Ziel-Well-Platte befinden. Die Mikropipettenspitzen werden in den ersten Quadranten abgesenkt. 10 μl Puffer werden in jeden der Wells des ersten Quadranten abgegeben. Der Flüssigkeitsbehandlungskopf wird angehoben, zu einem zweiten Quadranten hinüberbewegt und in die Wells abgesenkt. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis in allen vier Quadranten Puffer abgegeben wurde, so daß alle 384 Wells je 10 μl Puffer enthalten.
3. Kolonien werden von Agar in einem Quellenbehälter mit biologischen Proben in Form einer Petrischale (oder einem anderen Behälter für biologische Proben) aufgenommen. Der Flüssigkeitsbehandlungskopf wird gegen einen Nadelkopf für die Kolonieaufnahme ausgetauscht, in dem ein 12 × 8-Array von Nadeln entsprechend den Abständen auf einer Standard-Well-Platte angeordnet ist. Eine Petrischale 2, die in Agar gezüchtete Kolonien enthält, wird unter Verwendung der Zuführvorrichtung 50 für Behälter mit biologischen Proben in einem Q-Tray-förmigen Träger auf den Leuchttisch 40 auf dem Hauptbett der Vorrichtung befördert. Die Beleuchtung des Leuchttischs wird aktiviert. Der Kopf 70 wird über die Petrischale bewegt und sein integriertes Sichtsystem kartiert die Kolonien auf der Petrischale nach ihrer Position (x- und y-Koordinaten), ihrer Größe (Durchmesser) oder anderen vom Benutzer gewählten Kriterien, wie es angemessen ist. Die von dem Sichtsystem identifizierten Kolonien 1-96 werden durch abwechselndes pneumatisches Ausfahren und Zurückziehen jeder der Nadeln von einzelnen Nadeln in dem Nadelkopf aufgenommen, wobei sich das xyz-Positionierungssystem in geeigneter Weise bewegt. Der Nadelkopf 70 wird dann zu der Ziel-Well-Platte hinüberbewegt, um ihn über einem ersten Quadranten der 384 Wells zu positionieren. Die aufgenommenen Kolonien werden dann in den ersten Quadranten der Ziel-Well-Platte inokuliert, indem die Nadeln in die Pufferlösung, mit der die Wells zuvor befüllt wurden, abgesenkt werden. Dann wird der Nadelkopf angehoben und zur Waschstation 20 hinüberbewegt. Die Nadeln werden in dem Bad aus Bleichmittel/destilliertem Wasser gewaschen, in einem Bad mit destilliertem Wasser gespült und dann in einem Ethanolbad gewaschen. Das Waschen erfolgt durch Eintauchen der Nadeln und Schütteln, falls die Waschstation auf einem eigenen Schüttler montiert ist. Dann wird der Nadelkopf 70 zu der Beleuchtungs- und Trockenstation 24 hinüberbewegt. Die Halogenlampen werden eingeschaltet. Die Nadeln werden für eine Zeitdauer, typischerweise für 4-30 Sekunden, dem Licht der Halogenlampe ausgesetzt. Die Halogenlampen werden abgeschaltet. Das Luftgebläse wird dann für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um ein Abkühlen der Nadeln auf Umgebungstemperatur zu ermöglichen, typischerweise für 5-50 Sekunden, eingeschaltet, wobei bei längeren Zeitdauern der Bestrahlung mit UV-Licht längere Zeitdauern verwendet werden. Der Nadelkopf ist nun sauber und kann mit dem Inokulieren der Ziel-Well-Platte fortfahren. Nun werden die durch das Sichtsystem identifizierten Kolonien 97-192 aufgenommen, und der Nadelkopf wird über den zweiten Quadranten der Ziel-Well-Platte bewegt, dessen Wells dann inokuliert werden. Dann wird der Nadelkopf erneut mit einer Kombination aus Waschen, Bestrahlen mit UV-Licht und Trockenföhnen/Kühlen gereinigt. Dann werden die Kolonien 193-288 aufgenommen und in die Ziel-Well-Platte inokuliert. Der Nadelkopf wird erneut gereinigt. Die Kolonien 289-384 werden aufgenommen und inokuliert, und der Nadelkopf wird erneut gereinigt. Wenn weitere Kolonien identifiziert werden, die inokuliert werden müssen, wird der Vorgang mit einer oder mehreren weiteren Ziel-Well-Platten wiederholt, wie es erforderlich ist. Der Einfachheit halber wird in der nachfolgenden Beschreibung davon ausgegangen, daß es nur eine einzige Ziel-Well-Platte gibt.
4. Die Proben werden kräftig gevortext. Unter Verwendung des Well-Platten-Greifers an dem Kopf 70 wird die Ziel-Well-Platte an einem der Schüttler 30 angebracht, welcher dann eingeschaltet wird, um die Proben Vortexmischen zu unterziehen. Das V-förmige Profil des Bodens der Wells fördert ein stabiles Vortexmischen und verhindert einen Verlust an Probe durch Verspritzen.
5. Eine Menge von 5 μl Probe, d.h. eine Hälfte der Probe, wird für die TempliPhi-RCA-Reaktion in eine separate Well-Platte überführt, die im folgenden als die zweite Well-Platte bezeichnet wird. (Anstelle der Well-Platte könnte auch ein Rohrstreifen verwendet werden.) Um dies mit dem Roboter zu implementieren, wird zunächst eine Well-Platte über die obere Transportspur der Well-Platten-Zuführvorrichtung 60 zum Hauptbett der Vorrichtung transportiert. Dann wird die Probe von der Ziel- Well-Platte zu der zweiten Well-Platte überführt, indem der Flüssigkeitsbehandlungskopf wieder an dem Roboter angebracht wird und verwendet wird, um 5 μl Flüssigkeit aus jedem der Wells in dem ersten Quadranten der Ziel-Well-Platte aufzuziehen und sie in die Wells eines korrespondierenden Quadranten abzugeben. Dann werden die Mikropipettenspitzen entlang einer Abfallrutsche (nicht gezeigt) ausgestoßen und ein frischer Satz wird auf einem Amboß (nicht gezeigt) angebracht. Dann wird der zweite Quadrant bearbeitet und so weiter, bis alle vier Quadranten der zweiten Well-Platte befüllt wurden.
6. Die Proben in der zweiten Well-Platte werden für eine stabile Lagerung auf 4°C gekühlt. Dies erfolgt typischerweise durch Übertragen der zweiten Well-Platte in einen Inkubator, und zwar entweder manuell oder per Roboter. Im Falle einer Übertragung per Roboter kann der Inkubator benachbart zu dem Hauptbett der Vorrichtung angeordnet und mit einem automatischen Well-Platten-Zuführmechanismus ausgestattet sein.
8. Die Proben in der zweiten Well-Platte werden durch Erhitzen der zweiten Well-Platte auf 95°C und Halten auf dieser Temperatur für 3 Minuten denaturiert. Dies wird in einem Inkubator oder einer anderen geeigneten Vorrichtung, z.B. einem Heizblock oder einem Thermozykler, durchgeführt.
9. Dem Protokoll des Herstellers für TempliPhi folgend werden 5 μl Reaktionspuffer mit 0,2 μl Enzymgemisch zu jedem der Wells in der zweiten Well-Platte zugegeben. Um diese Stufe auszuführen, wird die zweite Platte zu dem Hauptbett des Roboters zurückgebracht und es wird ein Flüssigkeitsbehandlungskopf verwendet.
10. Die Proben werden kurz mittels Vortexmischen gemischt. Dieser Vorgang verwendet einen der Schüttler 30.
11. Die Proben in der zweiten Well-Platte werden für wenigstens 12 Stunden bei 30°C inkubiert. Um dies durchzuführen, wird die zweite Well-Platte zu dem Inkubator zurück überführt, und zwar entweder manuell oder per Roboter.
12. Die Proben in der zweiten Well-Platte werden für 10 Minuten auf 65°C erhitzt und auf 4°C gekühlt, um das Enzym zu inaktivieren. Dieser Thermozyklus wird in dem Inkubator durchgeführt.
13. 4 μl des Reaktionsvolumens aus jedem Well in der zweiten Well-Platte werden direkt in eine Sequenzierungsreaktion eingebracht. Dann kann jedes gewünschte Sequenzierungsprotokoll befolgt werden.

Variationen, z.B. direkte Aufnahme in dem TempliPhi-Reaktionspuffer, können in Betracht gezogen werden.
Es versteht sich, daß das obige Protokoll mit einer geeigneten Variation der thermischen Parameter auch auf andere RCA-Produkte anwendbar ist, die für Kolonieaufnahmeanwendungen geeignet sind, sobald und wenn diese verfügbar werden.
Beispiel 2: Taq Polymerase-PCR
Der Kürze halber beschreibt dieses Verfahren nur die Hauptverfahrensstufen. Wie diese Stufen hinsichtlich Roboter- und manueller Handlungen implementiert werden können, ergibt sich aus dem vorherigen Beispiel.

1. Eine Anzahl von 384-Well-PCR-Platten wird mit dem PCR-Puffer oder mit komplettem Grundgemisch befüllt.
2. Unter Verwendung eines Nadelkopfs mit 96 Nadeln werden Gruppen von 96 Kolonien aus einem Quellenbehälter, wie einem Q-Tray, unter Verwendung des Roboters aufgenommen.
3. Die Kolonien auf den Aufnahmenadeln werden in eine der PCR-Well-Platten inokuliert.
4. Die Aufnahmenadeln werden unter Verwendung von im wesentlichen dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gereinigt, nämlich durch Waschen in einer Reihe von Bädern, gefolgt von Bestrahlung mit UV-Licht mit Halogenlampen und Trockenföhnen/Kühlen.
5. Die Stufen 2-4 werden so oft wiederholt, wie es notwendig ist, bis die Inokulierung abgeschlossen ist.
6. Nach dem Inokulieren werden die PCR-Platten zum Thermozyklieren, wie es für die Vervielfältigung erforderlich ist, auf eine PCR-Maschine übertragen.

Es versteht sich, daß dieses Protokoll sich auch auf andere PCR-Produkte als Taq-Polymerase anwenden läßt, wie beispielsweise auf eine andere thermostabile DNA-Polymerase.
Beispiel 3: Variation von Beispiel 2
Eine Variation des Verfahrens von Beispiel 2 besteht darin, einen doppelten Aufnahmevorgang zu verwenden, wobei die Kolonien nicht nur in PCR-Well-Platten, sondern auch in eine zweite, Wach stumsmedium, wie z.B. Luria Bertani-(LB-)Brühe, enthaltende Well-Platte inokuliert werden, um so ein Well-Platten-Array von Kulturen entsprechend den PCR-Reaktionen zu erzeugen.
Es versteht sich, daß, obwohl die vorstehende Beschreibung eine detaillierte Beschreibung von Beispielen der Erfindung hinsichtlich spezifischer Größen von Well-Platten, Anzahlen von Nadeln usw. bereitgestellt hat, die Erfindung sich auf jede Art von Well-Platten oder andere Speichervorrichtungen für flüssige Proben einschließlich Pipettierungsausrüstung anwenden läßt. Es versteht sich auch, daß der durch UV-Licht unterstützte Reinigungsvorgang der Erfindung sich auf andere Werkzeuge als Nadeln oder andere Kolonieaufnahmewerkzeuge anwenden läßt. Beispielsweise kann er auf die Reinigung von Gelkernköpfen angewandt werden. Obwohl die Erfindung in Bezug auf aufgenommene Kolonien beschrieben wurde, versteht es sich, daß das Nukleinsäurematerial aus irgendeiner Quelle stammen kann, einschließlich Phagen- oder gereinigten DNA-Präparaten jedes Typs, beispielsweise von einem Plasmid, genomischer DNA, RNA oder einem PCR-Produkt.

Claims

Verfahren zum Reinigen eines Werkzeugs zwischen der Behandlung einer Mehrzahl von Proben oder Chargen von Proben, welche Nukleinsäure enthalten, die einem Vervielfältigungsprozeß unterzogen werden, gekennzeichnet durch Aussetzen des Werkzeugs an Licht mit einer Strahlung, die eine ultraviolette (UV) Komponente enthält, zwischen der Behandlung von verschiedenen einzelnen Proben oder Chargen der Proben, um eine Kreuzkontamination durch nicht-spezifische Vervielfältigung zu unterdrücken.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vervielfältigungsprozeß die Vervielfältigung nach dem Rolling-Circle-Prinzip (RCA) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die RCA ein Bakteriophagenenzym verwendet.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Bakteriophagenenzym phi29-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vervielfältigungsprozeß die Vervielfältigung durch Polymerasekettenreaktion (PCR) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die PCR-Vervielfältigung thermostabile DNA-Polymerase verwendet.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die thermostabile DNA-Polymerase Taq-Polymerase ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Werkzeug ein Kopf ist, der eine Mehrzahl von Nadeln umfaßt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Licht weiterhin eine Infrarot-(IR-)Komponente enthält.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Licht durch wenigstens eine Halogenlampe bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches weiterhin umfaßt, daß das Werkzeug einem Gasfluß ausgesetzt wird, um das Kühlen während und/oder nach der Beleuchtung zu fördern.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches weiterhin das Waschen des Werkzeugs umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Werkzeug in wenigstens einem von Ethanol und einem Bleiche/Wasser-Gemisch gewaschen wird.
Verwendung eines Roboters, der einen Kopf (70) mit einer Mehrzahl von Aufnahmewerkzeugen umfaßt, wobei die Verwendung umfaßt, daß eine Mehrzahl von Proben oder eine Mehrzahl von Chargen von Proben, welche Nukleinsäure enthalten, jeweils einem Vervielfältigungsprozeß unterzogen werden sollen, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmewerkzeuge des Kopfs zwischen der Behandlung verschiedener einzelner Proben oder Chargen der Proben an ultraviolettes (UV) Licht ausgesetzt werden, um eine Kreuzkontamination durch nicht-spezifische Vervielfältigung zu unterdrücken.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Aufnahmewerkzeuge des Kopfs zwischen der Behandlung verschiedener einzelner Proben oder Chargen der Proben zusätzlich Infrarot-(IR-)Licht ausgesetzt werden.
Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren, wobei das Verfahren umfaßt, daß eine erste Probe oder Charge von Proben, die Nukleinsäure enthält, mit einem Werkzeug behandelt wird, daß eine zweite Probe oder Charge von Proben, die Nukleinsäure enthält, mit dem Werkzeug behandelt wird, wobei das Werkzeug zwischen der Behandlung der Proben oder der Chargen von Proben ultraviolettem (UV) Licht ausgesetzt wird, um eine Kreuzkontamination durch nichtspezifische Vervielfältigung zu unterdrücken, und daß die behandelten Proben oder Chargen von Proben einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Werkzeug zwischen der Behandlung verschiedener einzelner Proben oder Chargen von Proben zusätzlich Infrarot-(IR-)Licht ausgesetzt werden.