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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der Resonanz-Spektroskopie
für die
Analyse von statistischen Eigenschaften von Proben.
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Ein
Beispiel eines Verfahrens zum Feststellen der Eigenschaften einer
untersuchten Mischung durch Resonanzspektroskopie findet sich in
C.S. Johnson, „Diffusion
ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy: principles and
applications", in
Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 34 (1999), 203-256.
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Resonanzspektroskopie,
insbesondere NMR-Spektroskopie ist ein leistungsstarkes Werkzeug
zur Untersuchung von Proben (Ref./4/,/5/). Die Präsenz und
Konzentration von Elementen oder Verbindungen kann z.B. mittels
Resonanzspektroskopie bestimmt werden. Im Allgemeinen werden die
Konzentrationen von Elementen oder Verbindungen durch Suchen nach
charakteristischen Resonanzlinien in den gemessenen Spektren und
Messen der Intensität
dieser Linien bestimmt.
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Bei
einigen Anwendungen müssen
große
Probenmengen untersucht werden, um Proben zu klassifizieren. Eine
solche Klassifizierung kann z.B. eine Trennung des Qualitätsanteils
von Produkten in einem industriellen Herstellungsprozess sein oder
eine Klassifizierung von Blutproben in der Medizin in gesund/nicht gesund.
Bei diesen Anwendungen kann eine statistische Datenanalyse ausgeführt werden,
insbesondere eine Mustererkennung (Ref./1/,/3/), um die Analyse
zu beschleunigen.
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Gemäß dem Stand
der Technik wird der Realteil jedes zu untersuchenden Spektrums
einem Punkt in einem n-dimensionalen Raum (oder Punktmenge) zugeordnet,
wobei n eine Anzahl von Parametern ist, die jedem Spektrum entnommen
wurden. Diese Parameter können
z.B. Intensitätswerte
bei bestimmten Frequenzen in den Resonanzspektren sein. Alle Punkte
werden dann im n-dimensionalen Raum angezeigt. Die Punkte der Spektren,
die zu den Proben derselben Klassifizierung gehören, können typischerweise in einem
geschlossenen Bereich des n-dimensionalen Raums gefunden werden.
Somit kann durch Prüfen
der Position eines Punkts im n-dimensionalen Raum die entsprechende
Probe im Prinzip klassifiziert werden.
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Typische
Spektren enthalten jedoch zahlreiche Spektrallinien, und wenn die
Dimension n der Punktmenge zu groß ist, ist es schwierig, Unterschiede
zwischen den Proben (bzw. ihren Spektren) zu erkennen. Zum Glück sind
normalerweise Änderungen
in unterschiedlichen Bereichen der Spektren miteinander korreliert.
In dieser Situation kann eine Hauptkomponenten-Analyse ausgeführt werden,
um die Dimensionalität
des relevanten Parameterraums zu reduzieren. Sobald die relevanten
Hauptkomponenten (typischerweise eine, zwei oder drei) bekannt sind,
können
die Punkte, die die Spektren darstellen, in eine Hauptkomponentenbasis transformiert
werden und eine Klassifizierung der Proben ist dann relativ einfach.
Ein Modell zum Klassifizieren von Proben mittels Hauptkomponentenanalyse
ist in E. Holmes et al „Development
of a model for classification of toxin-induced lesions using 1H NMR spectroscopy of urine combined with
pattern recognition" offenbart.
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Im
Prinzip gibt es im Stand der Technik alle Werkzeuge für eine automatisierte
Messung der Spektren und die nachfolgende statistische Analyse.
Eine automatisierte Informationsaufnahme wäre sehr schnell und nicht teuer.
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Die
Zuverlässigkeit
einer solchen automatischen Informationserfassung gemäß dem Stand
der Technik ist jedoch unzureichend aufgrund von zufallsbedingten
Messabweichungen in den aufgenommenen physischen Spektren, insbesondere
in den Realteilen der Spektren. Drei dieser Abweichungen sind besonders wichtig.
Erstens entsteht ein Fehler aufgrund mangelhafter Basislinienkorrektur.
Zweitens kann es sein, dass die dominierenden, jedoch unerwünschten
Resonanzen der Proben (insbesondere der Unterdrückung von Lösungsmitteln in NMR) nicht
vollständig
unterdrückt
werden. Und vor allem gibt es Phasenfehler in den aufgezeichneten
Resonanzspektren, welche die Spektren verzerren.
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Diese
drei Quellen von unbeabsichtigten Varianzen in den Spektren überlagern
die relevanten Varianzen in den Spektren aufgrund von Varianzen
in den Eigenschaften der Proben. Relevante Varianzen können fälschlicherweise
als unbeabsichtigte statistische Varianzen angesehen werden oder
unbeabsichtigte statistische Varianzen können fälschlicherweise als eine Informationen
enthaltende Varianz angesehen werden. Tatsächlich sind die relevanten
(d.h. Informationen enthaltenden) Varianzen durch die unbeabsichtigten
Varianzen so überdeckt,
dass eine automatische Analyse der Spektren unmöglich wird. Im Stand der Technik
gibt es kein zuverlässiges
Werkzeug für
eine automatische Korrektur oder Kompensation von Basislinienfehlern,
mangelhafter Unterdrückung
von dominanten jedoch unerwünschten
Resonanzen und/oder Phasenfehlern. Korrekturen müssen manuell vorgenommen werden.
Eine automatische Analyse erweist sich als nicht ausreichend. Selbst
wenn manuelle Korrekturen vorgenommen werden, bringen unterschiedliche
menschliche Anwender immer noch Abweichungen unter den korrigierten
Spektren ein, die nicht von den physischen Eigenschaften der entsprechenden
Proben verursacht werden. Bekannte Verfahren der Phasenkorrektur
sind in den Referenzen /6/-/9/ veröffentlicht.
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Resonanz-Spektroskopieverfahren
vorzustellen, welches die oben beschriebenen unbeabsichtigten Messvarianzen
in den aufgezeichneten Resonanzfrequenzspektren, insbesondere die
durch Phasenfehler bewirkten, toleriert und eine zuverlässige automatische
Spektralanalyse ermöglicht.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein resonanzspektroskopisches Verfahren zur Untersuchung von
statistischen Eigenschaften von Messproben, umfassend folgende Schritte:
- a) Aufnahme eines komplexen Resonanz-Frequenzspektrums
jeder Messprobe mittels phasenempfindlicher Quadraturdetektion;
- d) Zuordnung von Fingerprints zu Punkten einer n-dimensionalen
Punktmenge, wobei n die Zahl der Parameter ist, die von jedem Spektrum
erhalten wird;
- e) Durchführung
einer Musteranalyse der so gewonnenen Punkte zum Charakterisieren
der statistischen Eigenschaften der Messproben durch Prüfen der
Position der Punkte innerhalb des n-dimensionalen Spektrums, dadurch
gekennzeichnet, dass zwischen Schritt a) und Schritt d) die folgenden
Schritte ausgeführt werden.
- b) numerische Differentiation der aufgenommenen komplexen Resonanz-Frequenzspektren
nach der Frequenz; und
- c) Erfassung des Fingerprints durch Bestimmung des Absolutbetrages
jedes der differenzierten komplexen Resonanz-Frequenzspektren=Fingerabdruck.
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Die
Grundidee der Erfindung besteht darin, ein komplexes Resonanzfrequenzspektrum
aufzuzeichnen und beide Teile des Spektrums zu verwenden. Zuerst
wird die erste Ableitung in Bezug auf die Frequenz berechnet und
dann wird der absolute Wert des differenzierten komplexen Spektrums
berechnet. Dieser absolute Wert wird Fingerabdruck des Spektrums
bzw. der entsprechenden Probe genannt.
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Dieser
Fingerabdruck ist dem Realteil eines manuell gut korrigierten Spektrums
sehr ähnlich
und als Funktion der Frequenz trägt
es im Wesentlichen dieselben Informationen. Diese Ähnlichkeit
wird durch die mathematischen Eigenschaften der Lorentz-Linien verständlich:
Durch Differenziation einer Lorentz-Linie und anschließender Berechnung
des absoluten Werts dieser ersten Ableitung wird der Realteil der
ursprünglichen Lorentz-Linie
reproduziert. Der Fingerabdruck hat jedoch eine reduzierte, unbeabsichtigte
Varianz aufgrund eines Phasenfehlers, Basislinienfehlers, oder Fehlers
bei der Unterdrückung
von dominanten, jedoch unerwünschten
Resonanzen. Durch Berechnen des absoluten Werts als Zwischenschritt
wird die absolute Phase des aufgezeichneten Spektrums irrelevant
und der Phasenfehler wird vollständig
eliminiert. Varianzen aufgrund eines Basislinienfehlers oder einer
mangelhaften Unterdrückung
von dominanten, jedoch unerwünschten
Resonanzen resultiert typischerweise in deutlichen Verzerrungen
in dem aufgezeichneten Spektrum. Durch Berechnen der ersten Ableitung
wird der Einfluss dieser Verzerrungen reduziert und in dem Fingerabdruck
sind der Einfluss des Basislinienfehlers und der Unterdrückungsfehler
von dominanten, aber unerwünschten
Resonanzen auf eine vernachlässigbare
Höhe reduziert.
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Die
Erfindung ermöglicht
eine vollkommen automatische Analyse der aufgezeichneten Spektren.
Die oben erwähnten
unbeabsichtigten Varianzen werden so effektiv unterdrückt, dass
die relevanten Varianzen zuverlässig
erkannt und automatisch analysiert werden können. Deshalb ist eine Vorrichtung
zum automatischen Ausführen
des erfindungsgemäßen resonanzspektroskopischen
Verfahrens Teil der vorliegenden Erfindung.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann auch einen Schritt der Integration des aufgezeichneten komplexen
Resonanzfrequenzspektrums über
kleine Frequenzintervalle beinhalten, wodurch die Digitalisierungs-Rasterdichte
in dem integrierten Spektrum relativ zu dem aufgezeichneten Spektrum
reduziert wird. Das integrierte Spektrum kann dann bei den weiteren
Berechnungen verwendet werden, wodurch nachfolgende Berechnungen
beschleunigt werden. Z.B. kann ein ursprünglich aufgezeichnetes komplexes
Resonanzfrequenzspektrum mit 65536 Frequenzkanälen auf ein integriertes komplexes
Resonanzfrequenzspektrum von 256 Frequenzkanälen reduziert werden durch
Aufsummieren der Intensitätswerte
von jeweils 256 Kanälen. Weiterhin
können
irrelevante Spektralbereiche vor der Musteranalyse ausgeschlossen
werden.
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Bei
einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die
Musteranalyse eine Principal Component Analysis (=PCA) und/oder
eine Cluster-Analyse
und/oder eine multidimensionale Skalierung (=Multidimensional Scaling)
und/oder K-Nearest-Neighbor-Analysis (=KNN). PCA dient zum Erkennen der
Anzahl an Einflussgrößen in einem
Probensatz.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Variante weist die Musteranalyse ein
Regressionsverfahren auf, insbesondere eine Multivariate Least Squares
Regression (=MLR), Reduced Rank Regression (=RRR), Principal Component
Regression (=PCR) oder Partial Least Squares Regression (=PLS).
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Weiterhin
bevorzugt ist eine Variante, bei welcher die Musteranalyse eine
Diskriminanzanalyse und/oder eine Canonical Correlation Analysis
(=CCA) und/oder die Verwendung neuronaler Netze und/oder genetischer
Algorithmen umfasst.
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Ebenfalls
bevorzugt ist eine Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, dass
die Musteranalyse eine SIMCA-Klassifizierung aufweist.
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Alle
diese Verfahren der Musteranalyse wirken gut zusammen mit dem erfindungsgemäßen resonanzspektroskopischen
Verfahren.
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Bei
einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zuordnung
jedes Fingerabdrucks zu einem Punkt mit einem Wavelet-Prozess ausgeführt.
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Bei
einer höchst
bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, stammen die
Proben von einem einzigen Testobjekt, wobei die Proben zu unterschiedlichen
Zeitpunkten genommen werden.
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Ein
Testobjekt kann z.B. ein Tier sein und Blutproben von diesem Tier
werden in gleichen Zeitabständen
genommen. Damit kann das Fortschreiten einer Krankheit oder Vergiftung
untersucht werden. Proben können
auch in Zeitabständen
von einem Mischbehälter
für Chemikalien
genommen werden, z.B. um die Zusammensetzung der Mischung zu untersuchen.
Somit kann eine mögliche
und vorteilhafte Anwendung dieser Variante eine Prozesssteuerung
oder Prozessoptimierung sein. Es ist ebenfalls möglich, eine identische Probe zu
unterschiedlichen Zeitpunkten zu untersuchen, z.B. zum Überwachen
des Verfalls einer chemischen Substanz in der Probe.
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Bei
einer weiteren höchst
bevorzugten Variante stammen die Proben jeweils von unterschiedlichen Testobjekten.
Diese Variante kann z.B. für
ein Screening verwendet werden. Wiederum können Menschen die Testobjekte
sein. Insbesondere kann die Gesundheit von unterschiedlichen Menschen
untersucht werden. Dies kann hilfreich sein, um Informationen über angeborene
Krankheiten eines Neugeborenen zu erhalten, welches sofortige medizinische
Behandlung braucht, um dauerhafte Schäden zu vermeiden. Gemäß der Erfindung
können
auch Proben von einer Mehrzahl von Testobjekten genommen werden,
wobei eine Mehrzahl von Proben von jedem Testobjekt zu unterschiedlichen
Zeitpunkten genommen wird.
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Ebenfalls
erfindungsgemäß ist ein
resonanzspektroskopisches Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften
einer Probe, umfassend folgende Schritte:
- a') Aufnahme eines
komplexen Resonanz-Frequenzspektrums der Messprobe mittels phasenempfindlicher Quadraturdetektion;
- d') Phasenkorrektur
des komplexen Resonanz-Frequenzspektrums unter Verwendung eines
Fingerprints als Zielfunktion für
den Realteil des komplexen Resonanz-Frequenzspektrums, dadurch gekennzeichnet, dass
zwischen Schritt
- a') und Schritt
d') die folgenden
Schritte ausgeführt
werden:
- b') numerische
Differentiation des aufgenommenen komplexen Resonanz-Frequenzspektrums
nach der Frequenz;
- c') Erfassung
des Fingerprints durch Bestimmung des Absolutbetrages jedes differenzierten
komplexen Resonanz-Frequenzspektrums.
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Der
Fingerabdruck eines nicht phasenkorrigierten Spektrums liefert eine
Annäherung
an den Realteil desselben, jedoch richtig phasenkorrigierten (=phasierten)
Spektrums. Dies bedeutet, dass eine automatische Phasenkorrekturroutine
erstellt werden kann, so dass die Phase automatisch abgestimmt wird,
bis der Realteil des abgestimmten Spektrums am besten zum Fingerabdruck
passt. Als Beispiel ergibt sich die beste Anpassung durch Suchen
der besten Kovarianz zwischen Fingerabdruck und abgestimmtem Spektrum
ggf. unter Berücksichtigung
der Phasen von nullter und erster Ordnung. Dann kann das gemäß dem beschriebenen
Algorithmus korrigierte Spektrum direkt in einer automatisierten
Musteranalyse verwendet werden, insbesondere, wenn die Probleme
aufgrund der Basislinienkorrektur und mangelhaften Unterdrückung von
dominanten, jedoch unerwünschten
Resonanzen, eher gering sind.
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Während das
anfangs beschriebene erfindungsgemäße Verfahren den Fingerabdruck
als Ersatz für den
Realteil des Spektrums in der Musteranalyse verwendet, zeigt das
direkt zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren einen Weg, um
das Echtphasen-korrigierte Spektrum von dem aufgezeichneten Spektrum zu
erhalten.
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Solange
die Annahme gilt, dass die Spitzen in dem aufgezeichneten Spektrum
ungefähr
eine Lorentzform haben, ist der Fingerabdruck eine gute Näherung für einen
phasenkorrigierten Realteil des Spektrums. Deshalb stellt der Fingerabdruck
eine hervorragende objektive Funktion zur Beseitigung des Phasenfehlers
in dem aufgezeichneten Resonanzfrequenzspektrum dar.
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So
wie das phasenkorrigierte Spektrum gemäß der oben beschriebenen Erfindung
bestimmt wird, kann ein Basislinien-korrigiertes Spektrum bestimmt
werden. Das unkorrigierte Spektrum wird unter Berücksichtigung
unterschiedlicher möglicher
Basislinien abgestimmt und das abgestimmte Spektrum, das am besten zu
dem Fingerabdruck passt, wird für
die endgültige
Basislinienkorrektur verwendet. Das letztgenannte Verfahren funktioniert
besonders gut bei geringer Resonanzliniendichte.
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Weiterhin
bevorzugt ist eine Variante der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren,
wobei das resonanzspektroskopische Verfahren ein Fourier-Spektroskopie-Verfahren
ist.
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Bei
einer höchst
bevorzugten Variante der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
umfasst das resonanzspektroskopische Verfahren ein Kernspinresonanz(=NMR)-Verfahren,
insbesondere ein hochauflösendes
NMR-Verfahren, oder
ein Elektronenspinresonanz(=ESR)-Verfahren oder ein Ionen-Zyklotron-Resonanz(=ICR)-Verfahren.
Diese sind leistungsstarke Verfahren für die chemische Analyse und/oder Identifikation
von chemischen Bindungen.
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Bei
einer alternativen Variante stellt das resonanzspektroskopische
Verfahren akustische oder elektrische oder magnetische Resonanzen
fest. Mechanische Resonanzspektroskopie kann verwendet werden, um Risse
oder andere Schäden
in Testobjekten wie Fahrzeugen, Flugzeugen, Waschmaschinen und dergleichen während des
Betriebs zu identifizieren.
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Eine
besonders bevorzugte Variante der erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass
die Probe oder die Proben biologische Flüssigkeiten, insbesondere Urin,
Blut, Rückenmarksflüssigkeit oder
Pflanzenextrakte und/oder biologisches halbfestes Material, insbesondere
Gewebe und/oder biologischen Feststoff, insbesondere Knochen umfasst
bzw. umfassen. Bei biologischen Proben kommen sehr oft natürliche Konzentrationsvarianzen
vor, so dass eine Analyse der statistischen Eigenschaften der Proben
erwünscht
ist. Die Handhabung einer großen
Anzahl von Proben und eine schnelle automatisierte Analyse sind normalerweise
erforderlich, so dass die Vorteile der Erfindung vollständig genutzt
werden.
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Bei
einer Variante des Verfahrens, die ebenfalls bevorzugt ist, weist/weisen
die Probe/n Nahrungsmittel und/oder Zwischenprodukte von Nahrungsmitteln
auf, z.B. Früchte
oder Fruchtsaft. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführte Analyse
kann verwendet werden, um die Herkunft des Nahrungsmittels zu identifizieren
oder das Nahrungsmittel auf Unreinheiten zu untersuchen.
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Eine
weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Materialtests
und/oder Kriminologie verwendet, insbesondere zum Detektieren von
Drogen und/oder Bestimmen der Herkunft von Drogen und/oder zum Analysieren
von Kraftstoffen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders
zuverlässig
und kosteneffektiv, insbesondere, wenn es automatisch ausgeführt wird.
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Weitere
Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden
Zeichnung. Die oben und im Folgenden genannten Merkmale können erfindungsgemäß entweder
einzeln oder miteinander in beliebiger Kombination verwendet werden.
Die genannten Ausführungsformen
sind nicht als abschließende
Aufzählung zu
verstehen, sondern haben beispielhaften Charakter zum Beschreiben
der Erfindung.
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Die
Erfindung ist in den Zeichnungen gezeigt:
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1 zeigt
den Realteil einer Lorentz-Linie;
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2a zeigt
den Realteil und den imaginären
Teil einer Lorentz-Linie;
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2b zeigt
die erste Ableitung der Lorentz-Linie von 2a;
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2c zeigt
den Absolutwert der komplexen ersten Ableitung der Lorentz-Linie
von 2b, die dem Realteil der Lorentz-Linie von 2a überlagert
ist;
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3a zeigt
eine Überlagerung
von sechs Lorentz-Linien, beeinflusst von einem Phasenfehler;
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3b zeigt
den phasenkorrigierten Realteil des Spektrums von 3a (oben)
und den Absolutwert der ersten Ableitung des nicht phasenkorrigierten
komplexen Spektrums von 3a (unten);
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4 zeigt
zwei Lorentz-Linien (oberes Diagramm) und die Überlagerung der zwei Lorentz-Linien
(unteres Diagramm, obere Kurve) und eine manipulierte Kurve der Überlagerung
nach Differentiation und Berechnung des absoluten Werts (unteres
Diagramm, untere Kurve);
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5a zeigt
eine Überlagerung
von sechs Lorentz-Linien, beeinflusst von einem Phasenfehler, mit
einem zusätzlichen,
sehr stark phasenverzerrten Lorentz-Hintergrundsignal und linearem Versatz;
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5b zeigt
den phasenkorrigierten Realteil des Spektrums von 5a (oben)
und den Absolutwert der ersten Ableitung des nicht phasenkorrigierten
komplexen Spektrums von 5a (unten);
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6a zeigt
eine Überlagerung
von zwei Lorentz-Linien von gleicher Linienbreite mit einem großen Spitze-zu-Spitze
Abstand (oberes Diagramm) und die Überlagerung der zwei Lorentz-Linien
(unteres Diagramm, obere Kurve) und eine manipulierte Kurve der Überlagerung
nach Differenziation und Berechnung des Absolutwerts (unteres Diagramm,
untere Kurve);
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6b zeigt
Kurven entsprechend 6a, jedoch mit einem geringen
Spitze-zu-Spitze
Abstand, wobei der Abstand ca. 1/2.5 mal größer ist als der Abstand in 6a;
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7 zeigt
drei Diagramme, welche jeweils zwei Lorentz-Linien von gleicher
Linienbreite mit unterschiedlichen Spitze-zu-Spitze Abständen zeigen,
sowie ihre Überlagerung
(links), und ein Diagramm, in welchem die Intensitätsänderung
des Absolutbetrags der abgeleiteten Spektren (entsprechend den linken Diagrammen)
gegenüber
der Intensität
der rechten Lorentz-Linie aufgetragen ist, welche von Null bis zur
doppelten Intensität
der linken Lorentz-Linie variiert;
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8 zeigt
Kurven entsprechend 7, wobei jedoch die zwei Lorentz-Linien
in jedem Schaubild links unterschiedliche Linienbreiten haben;
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9 zeigt
eine Hauptkomponentenanalyse von Bucket-Tabellen, die von einem
Satz Spektren von Apfelsaft- und Birnensaftmischungen stammen; die
zwei oberen Schaubilder zeigen Darstellungen der Hauptkomponente
2 (PC2) gegenüber
der Hauptkomponente 1 (PC1); die zwei unteren Darstellungen zeigen
PC1 aufgetragen gegenüber
der Konzentration von Birnensaft; die linken Schaubilder sind von
bekannten Bucketing und die rechten Schaubilder beziehen sich auf
ein erfindungsgemäßes Bucketing.
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10 zeit
ein manuell phasenkorrigiertes NMR-Spektrum von Apfelsaft (oben)
und den Absolutwert der ersten Ableitung des entsprechenden komplexen
Spektrums, d.h. den entsprechenden Fingerabdruck (unten);
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11 zeigt
ein phasenverschobenes NMR-Spektrum von Apfelsaft (oben) und den
entsprechenden Fingerabdruck (unten);
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12 zeigt
ein NMR-Spektrum von Rattenurin mit mangelhafter Wasserunterdrückung (oben)
und den entsprechenden Fingerabdruck (unten);
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13 zeigt
ein NMR-Spektrum von Rattenurin mit Phasenfehler (oben) und den
entsprechenden Fingerabdruck.
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Die
Erfindung bietet eine alternative Strategie zum Handhaben von Spektren,
die von Phasen- und Basislinienfehlern beeinflusst sind, als Eingabe
für multivariable
Statistik.
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Die
Qualität
der Ergebnisse der multivariablen statistischen Analyse von NMR-Spektren hängt stark von
der Qualität
der Referenzierung, der Unterdrückung
des Lösungsmittels,
dem Shimmen, der Phasen- und Basislinien-Korrektur ab. Wenn ein
oder mehrere dieser Aspekte nicht richtig behandelt werden, kann
es sein, dass die statistische Analyse vollständig verdorben wird und buchstäblich unbrauchbare
Ergebnisse erzielt. Insbesondere Phasen- und Basislinienfehler sind
bekannt dafür,
dass sie automatisches NMR-Screening erschweren. Obwohl die Automatisierung
von Phasen- und Basislinien-Korrektur das Thema von mehreren Studien
war, steht derzeit keine perfekt zuverlässige Strategie zur Verfügung. Andererseits
ist manuelle Phasierungs- und Basislinien-Korrektur ein mühsames und
zeitaufwändiges
Verfahren und kann nicht realistisch für einen Automationskontext
in Betracht gezogen werden. Im Folgenden wird eine Alternative zur
Phasen- und Basislinien-Korrektur vorgestellt, welche zumindest
halbquantitative, multivariable statistische Ergebnisse geben kann.
Obwohl das theoretische Konzept auf der Basis der Annahme der Lorentz-Linienformen
abgeleitet ist, sollten die Ergebnisse selbst dann gelten, wenn
die Linienformannahme nicht im engen Sinn gilt.
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Im
Folgenden betrachten wir Spektren, die aus Überlagerungen von Lorentz-Linien bestehen.
Rein mathematisch ist die Lorentz-Linienform definiert durch
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1 zeigt
den Realteil der Lorentzlinie. Der Mittelpunkt ist bei x=0 und seine
Linienbreite ist 1.
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Die
erste Ableitung von s(x) ist gegeben durch
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Der
Absolutbetrag der ersten Ableitung ist gleich dem Realteil der Lorentz-Linienform, d.h.
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Als
Wiederholung: Dieser Vorgang (1. Berechnung der ersten Ableitung
des komplexen Spektrums und 2. Bestimmung des Absolutwerts, d.h.
Größenberechnung)
reproduziert den Realteil der Lorentz-Linie.
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Dies
ist in 2 gezeigt. 2 zeigt
den Realteil und den imaginären
Teil einer Lorentz-Linie a) und ihrer ersten Ableitungen b). Bei
c) ist der Absolutwert der komplexen ersten Ableitung mit der ursprünglichen Realteil-Linienformfunktion überlagert.
Die Funktionen sind identisch. Es ist zu beachten, dass die Phasenfehler
nicht den Absolutwert der komplexen ersten Ableitung beeinträchtigen.
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Folglich
wird der Realteil eines Spektrums, das aus einer Anzahl an nicht überlappenden
Lorentz-Linien von ähnlicher
Linienbreite besteht, durch den Absolutwert seiner ersten Ableitung
beinahe perfekt reproduziert. Es ist keine Phasierung erforderlich,
um den Realteil zu erhalten. Experimentelle Beispiele sind in den unten
beschriebenen 10 bis 13 gegeben.
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3 zeigt eine Überlagerung von 6 Lorentz-Linien
a), behaftet mit einem Phasenfehler. Bei b) ist das Ergebnis des
Absolutwerts der ersten Ableitung des nicht phasenkorrigierten komplexen
Spektrums zusammen mit dem phasenkorrigierten Realteil-Spektrum
(oben) aufgetragen.
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Die
Situation ist komplexer
- (a) wenn Linien von
unterschiedlicher Linienbreite im Spektrum koexistieren und/oder
- (b) wenn Linien sich stark überlappen
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Fall
(a) soll zuerst betrachtet werden, wobei wir von einer Spektrallinie
mit Halbwertsbreite Δω ausgehen
welche
auf eins normiert ist. Dann ist der Absolutbetrag der ersten Ableitung
der komplexen Spektrallinie gegeben durch:
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Das
Ergebnis ist proportional zu dem Realteil der ursprünglichen
Linie, jedoch skaliert durch das Inverse der Linienbreite. Das bedeutet,
dass durch die Manipulation (Differenzierung + Berechnung des Absolutbetrags)
die Intensität
der breiten Linien im Vergleich zur Intensität der schmalen Linien geschwächt ist:
je breiter die Linien, umso stärker
die Abschwächung.
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4 zeigt
die Wirkung der Linienbreite auf das Ergebnis einer Manipulation über Differenziation
und Berechnung des Absolutbetrags. Zwei Lorentz-Linien (oben) sind
einander überlagert.
Das resultierende Spektrum und das Ergebnis der Manipulation sind
in dem unteren Teil der Figur gegeben.
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Dieser
Abschwächungseffekt
kann problematisch sein, wenn genaue Intensitätsverhältnisse erforderlich sind.
Jedoch besteht der Vorteil darin, dass jegliche Verzerrungen aufgrund
von Basislinienproblemen oder mangelhafter Wasser-Unterdrückung nicht
in den Absolutbetrag der Ableitung des Spektrums, d.h. in den Fingerabdruck, übertragen
werden.
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5 zeigt eine Überlagerung von 6 mit einem
Phasenfehler behafteten Lorentz-Linien
a) mit einem zusätzlichen,
sehr stark phasenverzerrten Lorentz-Hintergrundsignal und einem linearen
Versatz. In b) ist das Ergebnis des Absolutbetrags der ersten Ableitung
des nicht phasenkorrigierten komplexen Spektrums (unten) zusammen
mit dem phasenkorrigierten Realteilspektrum ohne Versatz und Hintergrundsignal
(oben) aufgetragen.
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Der
oben erwähnte
Fall (b) betrachtet die Komplikationen aufgrund von stark überlappenden
Linien. Genau gesagt, werden die Intensitätsverhältnisse und Linienformen von
zwei nahe zueinander angeordneten Linien durch eine Differenziation
und nachfolgende Berechnung des Absolutbetrags modifiziert.
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Dies
ist in 6 gezeigt. 6 zeigt
die Überlagerung
von zwei Lorentz-Linien von gleicher Linienbreite (oben). Bei a)
ist der Spitze-zu-Spitze Abstand 2.5 mal so groß wie die Linienbreite, wohingegen
er bei b) ein mal die Linienbreite beträgt. Der untere Teil der Figur
zeigt die resultierenden Spektren und die Ergebnisse der Manipulation.
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Probleme
treten nur in einem Zwischenbereich auf, wo Linienpositionen einerseits
nicht identisch sind und andererseits nicht zu weit voneinander
entfernt sind. Der Grad der Nicht-Linearität nach der Manipulation ist
in 7 gezeigt. Die Spektren werden durch Überlagerung
von zwei Linien von gleicher Linienbreite simuliert. Die Intensität einer
Linie bei Frequenz 0 (der Referenzlinie) wird konstant gehalten,
während
die Intensität der
zweiten Linie von null auf den doppelten Wert der Intensität der Referenzlinie
modifiziert wird. Die Änderung
der Intensität
des Absolutwerts des abgeleiteten Spektrums wird als Funktion der
Intensität
der zweiten Linie erstellt. Idealerweise würde man eine gerade Linie mit
Steigung 1 erwarten. Je enger jedoch die Linien liegen, umso größer ist
der Grad der Nicht-Linearität
bei niedrigeren Intensitätswerten
der zweiten Linie.
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7 zeigt
im Detail die Überlagerung
von zwei Lorentz-Linien von gleicher Linienbreite (links). Die Intensität der rechten
Linie (angedeutet durch einen Pfeil) ist von Null auf den doppelten
Wert der Intensität
der linken Linie modifiziert, welche auf einem konstanten Wert gehalten
ist.
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Die
rechte Darstellung zeigt die Modifikation der Intensität des Absolutbetrags
des abgeleiteten Spektrums als Funktion der Intensität der rechten
Linie.
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Bei
einer zweiten Simulation, gezeigt in 8, hatten
die zwei überlagerten
Linien keine ähnliche
Linienbreite. Stattdessen hatte die Testlinie mit variierender Intensität die doppelte
Linienbreite der Referenzlinie.
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8 zeigt
im Detail die Überlagerung
von zwei Lorentz-Linien von unterschiedlicher Linienbreite (links).
Die Intensität
der rechten Linie (angedeutet durch einen Pfeil) ist von Null auf
den doppelten Wert der Intensität
der linken Linie modifiziert, welche auf einem konstanten Wert gehalten
wird. Die rechte Darstellung zeigt die Modifikation der Intensität des Absolutwerts
des abgeleiteten Spektrums als Funktion der Intensität der rechten
Linie.
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Als
Folge dieses nicht-linearen Verlaufs sind Intensitätsschwankungen
von kleinen Linien bei niedrigen Intensitäten stärker betroffen als Schwankungen
von starken Intensitätslinien.
Bei dem linearen Limit werden Schwankungsintensitäten zu Intensitätsschwankungen
in dem entsprechenden Absolutbetrag der Ableitung, skaliert durch
das Inverse der Linienbreite, übertragen.
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Die
Nicht-Linearität
beeinträchtigt
die Ergebnisse der multivariablen Statistiken. Dies soll anhand
einer Analyse eines Satzes von Spektren von Mischungen aus Apfel-
und Birnensaft gezeigt werden, siehe 9. 60 Proben
wurden analysiert, wobei für
jeden Mischungsgrad mit einer Birnensaftkonzentration von 0, 10,
20, 30, 40 und 100 % 10 Proben hergestellt wurden. Bucketing wurde
zwei Mal ausgeführt,
zuerst mittels der reinen Realteil-Spektren (normaler Bucketing-Modus) und zweitens
unter Verwendung des Absolutbetrags der ersten Ableitung der komplexen
Spektren (spezieller Bucketing-Modus). Der Bucketingbereich betrug
0 bis 10ppm, die Bucket-Größe betrug
0,04ppm und der Wasserbereich wurde ausgeschlossen (4,5 bis 6ppm).
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde für jede Tabelle ausgeführt und
die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
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9 zeigt
im Detail eine Hauptkomponentenanalyse von Bucket-Tabellen, die
von einem Satz Spektren aus Apfelsaft und Birnensaft-Mischungen
stammen. Die oberen Darstellungen zeigen PC1-PC2 Auftragungen der
Auswertung. Die unteren Darstellungen zeigen die PC1 Werte der Auswertung
als Funktion der Birnensaftkonzentration c. Die linken Auftragungen
zeigen die Ergebnisse, die sich auf den normalen Bucketing-Modus
beziehen, wohingegen die rechten Auftragungen sich auf den neuen
speziellen Bucketing-Modus beziehen unter Verwendung des Absolutbetrags
der ersten Ableitung der komplexen Spektren. Die letzteren Ergebnisse
hängen
nicht von der Phasierung- und der Basislinien-Korrekturqualität ab.
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Es
ist klar, dass sich in beiden Fällen
die Mischungsgrade in den PC1-PC2 Auftragungen der Auswertung gut
unterscheiden. Interessant dabei ist, dass die Streubreite bei PC2
im normalen Bucketing-Modus größer ist.
Eine detaillierte Prüfung
zeigte, dass die Ausreißer
in der Auftragung der Auswertungen mit dem normalen Bucketing-Modus
auf beträchtliche
Basislinienfehler zurückzuführen sind.
Diese Sonderfälle
treten bei PCA in den Tabellen resultierend aus dem speziellen Bucketing-Modus
nicht auf. Der Grund ist offensichtlich: Basislinienfehler werden
in diesem Bucketing-Modus aufgrund der Eigenschaften erster Ableitungen
unterdrückt.
Wenn die PC1 Werte der Auswertungen als Funktion der Birnensaftkonzentration
dargestellt werden, zeigt sich, wie erwartet, ein rein linearer
Verlauf bei dem normalen Bucketing-Modus. Bei dem erfindungsgemäßen speziellen
Bucketing-Modus gibt es eine geringe Abweichung von dem linearen
Zusammenhang, was die oben diskutierte Nichtlinearität wiedergibt.
Jedoch sind beide Ergebnisse (d.h. Abhängigkeiten) gut definiert und
gleichermaßen
geeignet, um die Konzentrationsverhältnisse von neu eintreffenden
Proben vorauszusagen. Dies hängt
nur von der Qualität
der Modellerstellung ab, welche durch eine ausreichende Zahl an
Proben als Vorgabe für
die Modellerstellung optimiert werden kann. Es sollte klar sein,
dass die PCA-Ergebnisse,
die von dem speziellen Bucketing-Modus stammen, wie aus der obigen
Diskussion erwartet, nicht von der Qualität der Phasierung und Basislinienkorrektur
abhängen.
-
Im
Ergebnis wurde ein alternatives Verfahren zum Extrahieren von multivariablen
statistischen Informationen, die in schlecht phasierten und Basislinien-korrigierten
Spektren enthalten sind, eingeführt.
Bei der Hochauflösungs-NMR
gleichen die Vorteile des Verfahrens die Probleme, die aufgrund
von nicht-linearen Effekten entstehen, mehr als aus. Es muss jedoch
sorgfältig
vorgegangen werden, wenn das Shimmen nicht vollständig unter
Kontrolle ist. Bei nicht optimalem Shimmen würde dieselbe Resonanz zumindest
eine breitere Linie zur Folge haben. Der resultierende Absolutbetrag
der ersten Ableitung würde
künstlich
abgeschwächt. Das
bedeutet, wenn mehrere Spektren in demselben statistischen Zusammenhang
verwendet werden sollen, sollte die Shimqualität für alle gleich sein.
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10 bis 13 zeigen
experimentelle Daten, die die Vorteile der Erfindung zeigen.
-
10 zeigt
ein manuell phasenkorrigiertes Apfelsaftspektrum (oben) und den
Absolutbetrag der ersten Ableitung des entsprechenden komplexen
Spektrums (unten). Unterschiede zwischen beiden Funktionen sind
eher geringfügig.
-
11 zeigt
ein phasenverschobenes Apfelsaftspektrum (oben) und den Absolutbetrag
der ersten Ableitung des entsprechenden komplexen Spektrums (unten).
Die Qualität
des letzteren wird nicht durch den Phasenfehler beeinträchtigt.
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12 zeigt
ein Spektrum von Rattenurin (oben) und den Absolutbetrag der ersten
Ableitung des entsprechenden komplexen Spektrums (unten). Die Verzerrungen
aufgrund einer mangelhaften Wasserunterdrückung wurden nicht in die letztere
Funktion übertragen.
-
13 zeigt
Rattenurin (oben) ähnlich
wie in 12 und den Absolutbetrag der
ersten Ableitung des entsprechenden komplexen Spektrums (unten),
welches nicht durch Phasenfehler beeinträchtigt ist.
-
Referenzliste
-
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