DE60303603T2

DE60303603T2 - Benzolsulfonatsalz eines morpholinharnstoff-derivats zur verwendung als ccr-3 antagonist bei der behandlung von entzündlichen erkrankungen

Info

Publication number: DE60303603T2
Application number: DE60303603T
Authority: DE
Inventors: John Spencer Stevenage Cook; Robert Philip Stevenage Landon; Andrew John Stevenage Walker; Mark Stevenage Wilkinson
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2023-03-28
Also published as: MXPA04009456A; US7531651B2; IS7432A; EP1487456A1; GB0207432D0; BR0308480A; CN1642554A; JP2005526808A; CA2479912A1; WO2003082293A1; PL372623A1; NO20044323L; KR20040099375A; RU2004126948A; ZA200407463B; US20060089497A1; ES2258724T3; IL163847A0; AR039179A1; ATE317698T1

Description

Diese Erfindung betrifft eine neue chemische Verbindung, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Formulierungen und ihre Verwendung in der Therapie.
Die gleichzeitig anhängige internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB01/04350, Veröffentlichungsnummer WO 02/26723 (Glaxo Group Limited), betrifft bestimmte Morpholinharnstoff-Derivate, die die Wanderung/Chemotaxis von Eosinophilen blockieren.
Es wurde jetzt überraschend festgestellt, daß eine spezifische Verbindung, die in Formel (I) aus PCT/GB01/04350 fällt, besonders vorteilhafte physikochemische Eigenschaften hat, die geeigneter für die Herstellung von Mengen im großen Maßstab und zur Verwendung in der Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen sind. Insbesondere ist die Verbindung kristallin und nicht-hygroskopisch, stabil und zeigt gute Löslichkeitsprofile.
Spezifisch ist die kristalline Natur der Verbindung ideal zur Isolierung und Reinigung und ist ausreichend stabil zur Verwendung in herkömmlichen pharmazeutischen Formulierungen. Diese Vorteile verleihen signifikante Formulierungs- und Handhabungsvorzüge.
So wird gemäß einem Aspekt der Erfindung eine Verbindung der Formel (I) bereitgestellt:
worin
A^– das Benzolsulfonat-(Besylat)-anion darstellt;
R H oder C_1-6-Alkyl darstellt; und
n eine Zahl von 0,8 bis 2,2 ist.
Bevorzugt stellt R H dar.
Bevorzugt stellt n eine Zahl zwischen 1,1 und 2,1 dar, besonders bevorzugt ca. 2.
In einem bevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung deshalb 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat bereit.
Die Verbindung 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid wird in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung PCT/GB01/04350 offenbart, jedoch wurde das Besylatsalz zuvor nicht offenbart. Wir haben festgestellt, daß die Verbindung 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid nicht leicht Salze bildet, die zur pharmazeutischen Verwendung geeignet sind.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) bereitgestellt, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel (IA):
mit einer Quelle für das Besylatanion und einem geeigneten C_1-6-Alkanol und Wasser umfaßt.
Geeignete Quellen für das Besylatanion sind Benzolsulfonsäure und Besylatsalze wie Ammoniumbesylat. Eine bevorzugte Quelle für das Besylatanion ist Benzolsulfonsäure.
Typischerweise wird die Verbindung der Formel (IA) in einem geeigneten C_1-6-Alkanol, geeigneterweise Ethanol oder Isopropylalkohol, und Wasser bei erhöhter Temperatur, geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 45°C, suspendiert. Eine Lösung der Quelle für das Besylatanion, bevorzugt Benzolsulfonsäure, in Wasser wird hinzugegeben. Ein geeignetes Antilösungsmittel, in geeigneter Weise Isopropylacetat, wird gegebenenfalls zur Lösung gegeben und die Mischung auf 0 bis 25°C abgekühlt. Ein geeignetes unpolares Lösungsmittel wie ein aliphatischer Kohlenwasserstoff, z.B. Cyclohexan, kann gegebenenfalls hinzugegeben werden. Die Mischung kann gegebenenfalls mit Kristallen der Verbindung der Formel (I) geimpft werden. Die Mischung wird auf einer reduzierten Temperatur für einen ausreichenden Zeitraum gehalten, um die Kristallisation des Produkts zu erlauben, und dieses durch Filtration isoliert. Geeignete Impfkristalle der Verbindung der Formel (I) können durch spontane Kristallisation einer Mischung aus der Verbindung der Formel (IA) und Benzolsulfonsäure aus wäßrigen C_1-6-Alkanolmischungen bei reduzierter Temperatur, geeigneterweise 0 bis 25°C, hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (IA) kann durch Umsetzen der Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon
mit einer Verbindung der Formel (III) oder einem Salz davon:
in Gegenwart eines geeigneten Amin-Kupplungsmittels wie N,N'-Carbonyldiimidazol hergestellt werden.
Typischerweise wird eine Verbindung der Formel (II) in einem geeigneten ersten Lösungsmittel mit N,N'-Carbonyldiimidazol im gleichen Lösungsmittel bei reduzierter Temperatur umgesetzt, geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich von –10 bis 20°C über einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 5 bis 60 Minuten. Geeignete Lösungsmittel schließen Tetrahydrofuran, Dichlormethan, C_3-4-Alkanol, Isopropylacetat, N-Methylpyrrolidinon und N,N-Dimethylformamid ein. Die Mischung wird auf eine geeignete Temperatur erwärmt, in geeigneter Weise 5 bis 30°C, und bei dieser Temperatur für einen geeigneten Zeitraum gehalten, zum Beispiel 10 bis 60 Minuten. Ein geeignetes Lösungsmittel, in geeigneter Weise Isopropylalkohol, wird bei einer geeigneten Temperatur hinzugegeben, in geeigneterweise 20-30°C, und auf dieser Temperatur für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 15 bis 60 Minuten, gehalten. Die Verbindung der Formel (III) wird dann hinzugegeben, die Mischung auf eine geeignete erhöhte Temperatur, zum Beispiel eine Temperatur im Bereich von 40 bis 65°C, erwärmt und für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 60 bis 360 Minuten, gerührt. Die Reaktion wird dann auf eine geeignete Temperatur abgekühlt und ein geeignetes zweites Lösungsmittel, zum Beispiel Isopropylacetat, hinzugegeben, gefolgt von einer wäßrigen Lösung eines geeigneten sauren Salzes, wie zum Beispiel Kaliumdihydrogenphosphat, oder einer geeigneten Säure wie Essigsäure. Die untere wäßrige Schicht wird entfernt und die obere organische Schicht mit weiterer Lösung von Säure oder saurem Salz gefolgt von Wasser gewaschen. Die organische Phase wird bei Atmosphärendruck zur Entfernung des ersten Lösungsmittels und zum Zurücklassen einer Aufschlämmung oder Lösung der Verbindung der Formel (IA) im zweiten Lösung destilliert. Dies kann dann direkt zur Herstellung der Verbindung der Formel (I) verwendet oder filtriert werden, um die Verbindung der Formel (IA) zu ergeben.
Die Verbindung der Formel (I) kann auch in situ durch Reaktion einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon mit einer Verbindung der Formel (III) oder einem Salz davon, gefolgt von Zugabe von Benzolsulfonsäure, geeigneterweise einer wäßrigen Lösung von Benzolsulfonsäure, hergestellt werden, das heißt ohne Isolierung der Verbindung der Formel (IA).
Entsprechend wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) bereitgestellt, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon mit einer Verbindung der Formel (III) oder einem Salz davon, gefolgt von Zugabe von Benzolsulfonsäure oder einer wäßrigen Lösung davon umfaßt, um eine Verbindung der Formel (I) bereitzustellen.
Typischerweise wird eine Verbindung der Formel (II) in einem geeigneten ersten Lösungsmittel mit N,N'-Carbonyldiimidazol im gleichen Lösungsmittel bei reduzierter Temperatur, in geeigneter Weise einer Temperatur im Bereich von –10 bis 20°C, über einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 5 bis 60 Minuten, umgesetzt. Geeignete Lösung schließen Tetrahydrofuran, Dichlormethan, C_3-4-Alkanol, Isopropylacetat, N-Methylpyrrolidinon und N,N-Dimethylformamid ein. Die Mischung wird auf eine geeignete Temperatur erwärmt, geeigneterweise 5 bis 30°C, und auf dieser Temperatur für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 10 bis 60 Minuten, gehalten. Ein geeignetes Lösungsmittel, geeigneterweise Isopropylalkohol, wird bei einer geeigneten Temperatur, geeigneterweise 5 bis 30°C, hinzugegeben und auf dieser Temperatur für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 15 bis 60 Minuten, gehalten. Die Verbindung der Formel (III) wird dann hinzugegeben, die Mischung auf eine geeignete erhöhte Temperatur erwärmt, zum Beispiel eine Temperatur im Bereich von 40 bis 65°C, und für einen geeigneten Zeitraum, zum 60 bis 360 Minuten, gerührt. Die Reaktion wird dann auf eine geeignete Temperatur abgekühlt, und ein geeignetes zweites Lösungsmittel, zum Beispiel Isopropylacetat, wird hinzugegeben, gefolgt von einer wäßrigen Lösung eines geeigneten sauren Salzes, wie zum Beispiel Kaliumdihydrogenphosphat, oder einer geeigneten Säure wie Essigsäure. Die Lösung wird nach Bedarf geklärt, die untere wäßrige Schicht entfernt und die obere organische Schicht mit weiterer Lösung von Säure oder saurem Salz, gefolgt von Wasser gewaschen. Die organische Phase wird bei Atmosphärendruck auf ein geringes Volumen destilliert, ein geeignetes Lösungsmittel, geeigneterweise Isopropylalkohol, wird hinzugegeben, und der Konzentrationsschritt wird wiederholt. Eine Lösung von Benzolsulfonsäure in Wasser wird bei einer geeigneten Temperatur, geeigneterweise 15 bis 45°C, hinzugegeben, gefolgt von Zugabe eines geeigneten Antilösungsmittels, geeigneterweise Isopropylacetat. Die Mischung kann gegebenenfalls mit Kristallen der Verbindung der Formel (I) geimpft werden. Weiteres Antilösungsmittel kann hinzugegeben werden, die Mischung wird auf 0 bis 10°C abgekühlt und auf einer reduzierten Temperatur für einen geeigneten Zeitraum gehalten. Die Mischung wird dann filtriert, um die Verbindung der Formel (I) zu ergeben.
Eine Verbindung der Formel (II) kann entweder durch Reaktion (a), Reaktion (b) oder Reaktion (c) hergestellt werden.
Reaktion (a). Reaktion der Verbindung der Formel (IV) mit einer Verbindung der Formel (V):
worin A eine geschützte Amino-Gruppe ist, geeigneterweise Phthalimido, um eine Verbindung der Formel (IIAR) zu ergeben:
worin A wie zuvor definiert ist, gefolgt von Entschützen der Amino-Gruppe, um eine Verbindung der Formel (IIR) zu ergeben:
gefolgt von Auftrennung der resultierenden Enantiomere der Verbindung der Formel (IIR); oder
Reaktion (b). Reaktion einer Verbindung der Formel (IV) wie hier zuvor definiert mit einer Verbindung der Formel (VA):
worin A wie hier zuvor für Formel (V) definiert ist, um eine Verbindung der Formel (IIA) zu ergeben:
worin A wie zuvor definiert ist, gefolgt von Entschützen der Amino-Gruppe, um die Verbindung der Formel (II) zu ergeben.
Reaktion (c). Hydrolyse der Verbindung der Formel (VI):
gefolgt von Auftrennung der resultierenden Enantiomere einer Verbindung der Formel (IIR).
Für beide Reaktionen (a) und (b) wird die Reaktion zwischen der Verbindung der Formel (IV) und einer Verbindung der Formeln (V) oder (VA) typischerweise unter den Mitsonobu-Bedingungen wie folgt durchgeführt:
Typischerweise wird eine Mischung aus der Verbindung der Formel (IV) und der Verbindung der Formel (V) oder der Formel (VA) in einem geeigneten Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran oder Toluol gerührt, geeigneterweise für 2 bis 36 Stunden bei einer geeigneten Temperatur, geeigneterweise der Rückflußtemperatur der Mischung, unter einer inerten Atmosphäre, geeigneterweise einer Stickstoffatmosphäre. Weiteres Lösungsmittel, geeigneterweise Toluol oder Tetrahydrofuran, wird dann hinzugegeben und die Mischung abgekühlt, geeigneterweise auf 0 bis 40°C. Ein Phosphin, geeigneterweise Triphenylphosphin, wird hinzugegeben und die Mischung gerührt. Ein Azodicarboxylat, geeigneterweise Diisopropylazodicarboxylat, wird dann über einen Zeitraum hinzugegeben, geeigneterweise 5 bis 120 min, während die Temperatur auf <40°C gehalten wird. Man läßt die Mischung erwärmen, geeigneterweise auf 20–40°C. Nach Bedarf können weitere Phosphin- und Azodicarboxylat-Reagentien hinzugegeben werden. Nach einem weiteren Zeitraum wird die Reaktion annähernd zur Trockene aufkonzentriert. Ein geeigneter Alkohol, geeigneterweise Propan-2-ol oder Methanol, wird hinzugegeben und der Konzentrationsschritt wiederholt. Dies kann nach Bedarf wiederholt werden. Weiterer Alkohol wird dann hinzugegeben und die Mischung kann auf eine Temperatur von geeigneterweise 55 bis 75°C erwärmt werden. Nach einem geeigneten Zeitraum, geeigneterweise 20 bis 45 Minuten, wird die resultierende Aufschlämmung abgekühlt, geeigneterweise auf 15 bis 25°C, und dann stehengelassen, geeigneterweise für 1,5 bis 3 Stunden, worauf das Produkt durch Filtration isoliert wird. Das Filterbett wird mit weiterem Alkohol gewaschen und dann im Vakuum bei 35 bis 45°C getrocknet, um die Verbindung der Formel (IIAR) bzw. der Formel (IIA) zu liefern.
Die Entfernung der Schutzgruppe wird typischerweise durch Erwärmen einer Lösung der Verbindung der Formel (IIAR) oder der Formel (IIA) in einem geeigneten polaren Lösungsmittel, geeigneterweise Wasser, in Gegenwart einer Mineralsäure, geeigneterweise konzentrierter Schwefelsäure, durchgeführt. Die Mischung wird auf erhöhte Temperaturen, geeigneterweise die Rückflußtemperatur der Mischung, für einen geeigneten Zeitraum, geeigneterweise 8 bis 24 Stunden, erwärmt. Die Mischung wird dann abgekühlt, mit einem geeigneten apolaren Lösungsmittel, geeigneterweise Dichlormethan, behandelt und mit einer Base, geeigneterweise 0,88 G wäßrigem Ammoniak, behandelt, wobei die Temperatur auf unter 25°C gehalten wird. Die wäßrige Phase wird mit weiterem apolarem Lösungsmittel extrahiert, und die vereinigte organische Phase wird mit Wasser gewaschen. Die Verbindung der Formel (IIR) oder (II) wird durch Eindampfen zur Trockene isoliert.
Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (IIAR) oder der Formel (IIA) kann auch in zwei Stufen vorgenommen werden, worin eine intermediäre Verbindung der Formel (IIBR) bzw. der Formel (IIB) isoliert wird:
worin A wie hier für die Formeln (V) und (VA) zuvor definiert ist. Typischerweise wird eine Mischung der Verbindung der Formel (V) und einer Verbindung der Formel (V) oder der Formel (VA) in einem geeigneten Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, C_3-4-Alkanol, Toluol, N-Methylpyrrolidinon und N,N-Dimethylformamid gerührt, geeigneterweise für 2 bis 36 Stunden bei einer geeigneten Temperatur, geeigneterweise der Rückflußtemperatur der Mischung unter einer inerten Atmosphäre, geeigneterweise einer Stickstoffatmosphäre. Weitere Verbindung der Formel (V) wird nach Bedarf hinzugegeben und die Mischung auf eine geeignete Temperatur, geeigneterweise die Rückflußtemperatur der Mischung, unter einer inerten Atmosphäre, geeigneterweise einer Stickstoffatmosphäre, für einen geeigneten Zeitraum erwärmt. Die Reaktionsmischung wird dann abgekühlt, geeigneterweise auf 20 bis 25°C, und die Verbindung mittels Zugabe eines geeigneten Verschnittmittels, geeigneterweise Diisopropylether, ausgefällt. Die Verbindung der Formel (IIBR) bzw. der Formel (IIB) wird durch Filtration isoliert, mit weiterem Verschnittmittel gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Eine Verbindung der Formel (IIAR) oder der Formel (IIA) kann dann aus einer Verbindung der Formel (IIBR) bzw. der Formel (IIB) unter Verwendung der Bedingungen hergestellt werden, die für die Reaktion zwischen der Verbindung der Formel (IV) und den Verbindungen der Formeln (V) und (VA) hier zuvor beschrieben wurden.
Reaktion (c) wird typischerweise durch Rühren einer Lösung der Verbindung der Formel (VI) in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel einer Mischung aus Methanol und Wasser, und Zugeben einer geeigneten Base, zum Beispiel Kaliumcarbonat, durchgeführt. Die Mischung wird bei einer geeigneten Temperatur gerührt, zum Beispiel derjenigen im Bereich von 20 bis 25°C für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 16 bis 20 Stunden, gefolgt von Entfernung des organischen Lösungsmittels im Vakuum. Wasser wird dann hinzugegeben und die Mischung mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Ethylacetat, extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, bevor sie über einem geeigneten Trocknungsmittel, zum Beispiel Natriumsulfat, getrocknet und filtriert werden und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft wird. Das Rohprodukt wird dann durch Flash-Chromatographie gereinigt.
Die Auftrennung der Verbindung der Formel (II) aus dem racemischen Produkt, d.h. der Verbindung der Formel (IIR), kann unter Verwendung von den Fachleuten allgemein bekannten Techniken erfolgen, zum Beispiel durch präparative chirale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (chirale HPLC) oder durch fraktionierte Kristallisation von diastereomeren Salzen.
Die Verbindung der Formel (VI) kann durch Reaktion der Verbindung der Formel (VII):
mit 3,4-Dichlorbenzylchlorid hergestellt werden.
Die Reaktion zwischen der Verbindung der Formel (VII) und 3,4-Dichlorbenzylchlorid wird typischerweise in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel N,N-Dimethylformamid, unter einer inerten Atmosphäre, zum Beispiel einer Stickstoffatmosphäre, unter Zugabe einer geeigneten Base, zum Beispiel Kaliumcarbonat, und eines geeigneten Aktivierungsmittels wie Natriumiodid durchgeführt. Die Mischung wird dann bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel einer Temperatur im Bereich von 20 bis 25°C, für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 16 bis 20 Stunden, vor der Entfernung der flüchtigen Komponenten im Vakuum gerührt.
Die Verbindung der Formel (VII) wird durch Behandeln einer Lösung von Morpholin-2-ylmethylamin in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Methanol, unter einer inerten Atmosphäre, zum Beispiel einer Stickstoffatmosphäre, mit einer Lösung aus Ethyl-α,α,α-trifluoracetat in einem geeigneten wasserfreien organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Diethylether, hergestellt. Die Mischung wird dann für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel 20 bis 40 Minuten, bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel einer Temperatur im Bereich von 20 bis 25°C, gerührt und die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird dann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Methanol, gelöst und die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt.
Es wird erwogen, daß die Verbindungen der Formeln (IIA), (IIBR) und (IIB) neu sind und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung bilden.
Die Verbindung der Formel (IIR) ist bekannt (J. Med. Chem., 1991, 34(2), 616-624).
Morpholin-2-ylmethylamin, Ethyl-α,α-α-trifluoracetat, die Verbindungen der Formeln (IV) und (V) und die Enantiomere einer Verbindung der Formel (V) sind bekannte, handelsübliche Verbindungen oder können durch Analogie zu bekannten Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel zu denjenigen, die in Standardlehrbüchern der synthetischen Methodik offenbart werden, wie z.B. J. March, Advanced Organic Chemistry, 3. Auflage (1985), Wiley Interscience.
Geeignete Schutzgruppen in jeder der oben genannten Reaktionen sind diejenigen, die herkömmlich auf diesem Gebiet verwendet werden. Die Verfahren zur Bildung und Entfernung solcher Schutzgruppen sind diejenigen herkömmlichen Verfahren, die für das zu schützende Molekül angemessen sind, zum Beispiel diejenigen Verfahren, die in Standardlehrbüchern der synthetischen Methodik erörtert werden, wie zum Beispiel P.J. Kocienski, Protecting Groups (1994), Thieme.
In jedem der oben beschriebenen synthetischen Verfahren können herkömmliche Verfahren zum Erwärmen und Abkühlen eingesetzt werden, zum Beispiel elektrische Heizmäntel bzw. Eis/Salz-Bäder.
Die Stabilität der Verbindung der Erfindung kann unter Verwendung herkömmlicher quantitativer analytischer Verfahren bestimmt werden: Zum Beispiel kann die Stabilität der Verbindung in fester Form durch Verwendung beschleunigter Stabilitätsuntersuchungen wie die Differential-Rasterkalorimetrie (DSC), thermogravimetrische Analyse (TGA) und isothermale Untersuchung bei erhöhten Temperaturen bestimmt werden, einschließlich herkömmlicher Lagerversuche, worin die Testverbindung unter kontrollierten Bedingungen von Temperatur und Feuchtigkeit über bekannte Zeiträume gelagert wird. Eine quantitative Analyse der Testverbindungen gegen geeignete Referenzstandards vor, während und nach dem Lagerzeitraum erlaubt die Bestimmung der Stabilität der Testverbindung. Zum Beispiel zeigte die Verbindung der Erfindung keinen signifikanten Abbau in den folgenden Untersuchungen: 40°C/20 % relative Feuchtigkeit, 25 Tage; 40°C/75 % relative Feuchtigkeit, 25 Tage; 50°C/Umgebungsbedingungen, 25 Tage; Lichtkammer, Umgebungsbedingungen, 14 Tage.
Wie angegeben ist die Verbindung der Erfindung stabiler in Wasser als die entsprechende freie Base. So beinhaltet ein herkömmliches Verfahren zur Bestimmung der Stabilität der Verbindungen der Erfindung in wäßriger Lösung die Bestimmung der Verunreinigungsprofile einer wäßrigen Lösung der Testverbindung bei bekannten Bedingungen der Temperatur und über bekannte Zeiträume. Wir haben festgestellt, daß die Verbindung der Formel (I) eine gute wäßrige Stabilität in Gegenwart und Abwesenheit von Licht über 8 Tage bei einem pH im Bereich von 2 bis 10 zeigt.
Die quantitative Analyse der Verunreinigungsprofile der Verbindung der Erfindung in den oben genannten Untersuchungen kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, allgemein chromatographischer Verfahren wie Hochleistungsflüssigkeitschramatographie (HPLC).
Die Verbindung der Erfindung kann auf biologische Aktivität in vitro und in vivo gemäß den folgenden Tests untersucht werden:
(a) CCR-3-Bindungstest
Ein kompetitiver CCR-3-Bindungs-SPA (Szintillationsproximitäts-Assay) wurde verwendet, um die Affinität von neuen. Verbindungen für CCR-3 zu bewerten. Aus stabil CCR-3 exprimierenden K562-Zellen hergestellte Membranen (2,5 μg/Vertiefung) wurden mit 0,25 mg/Vertiefung Weizenkeim-Agglutinin-SPA-Perlen (Amersham) vermischt und in Bindungspuffer (HEPES 50 mM, CaCl₂ 1 mM, MgCl₂ 5 mM, 5 % BSA) bei 4°C für 1,5 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden 20 pM [¹²⁵I]-Eotaxin (Amersham) und zunehmende Konzentrationen von Verbindung (1 pM bis 30 μM) hinzugegeben und in einer Platte mit 96 Vertiefungen für 2 h bei 22°C inkubiert und dann an einem Mikrobeta-Plattenzähler gezählt. Das gesamte Testvolumen betrug 100 μl. Kompetitive Bindungsdaten wurden durch Anpassen der Daten mit einer logistischen Gleichung mit vier Parametern analysiert. Die Daten werden als mittlere pIC₅₀-Werte (negativer Logarithums der Konzentration der Verbindung, die die [¹²⁵I]-Eotaxin-Bindung um 50 % inhibiert) aus wenigstens zwei Experimenten dargestellt.
(b) Eosinophil-Chemotaxis-Test
Verbindungen wurden auf ihre inhibitorische Wirkung auf die Eosinophil-Chemotaxis ausgewertet. Eosinophile wurde aus humanem peripherem Blut durch Standarddepletion von CD16-Zellen unter Verwendung einer Miltenyi-Zellseparationssäule und eines magnetischen Super Macs-Magneten wie zuvor beschrieben gereinigt (Motegi & Kita, 1998; J. Immunology, 161:4340-6). Die Zellen wurden in RPMI 1640/10 % FCS-Lösung resuspendiert und mit Calcein-AM (Molecular Probes) bei 37°C für 30 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden Eosinophile mit 400 g für 5 min zentrifugiert und in RPMI/FCS mit 2,2 Millionen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden dann in Gegenwart zunehmender Konzentrationen der Verbindungen (1 pM bis 30 μM) bei 37°C für 30 min inkubiert. Für Kontrollreaktionen wurden die Zellen mit nur RPMI/FCS inkubiert. Der Agonist Eotaxin (entweder eine Konzentrations-Reaktions-Kurve oder für die funktionellen Inhibierungskurven eine EC₈₀-Konzentration) wurde in die untere Kammer einer Chemotaxis-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben (5 μm-Filter: Receptor Technologies). Eosinophile (50 μl von 2 Millionen/ml Zellen) wurden zur oberen Kammer der Filterplatte gegeben und bei 37°C für 45 min inkubiert. Oben auf dem Chemotaxis-Filter verbleibende Zellen wurden entfernt, und die Anzahl der Eosinophile, die gewandert waren, wurde durch Auslesen der Platte in einem Fluoreszenzplattenlesegerät quantifiziert. Inhibierungskurven für die Wirkung der Verbindungen auf die Eosinophil-Chemotaxis wurden durch Anpassen der Daten mit einer logistischen Gleichung mit vier Parametern analysiert. Funktionelle pK_i-Werte (fpK_i) wurden unter Verwendung der nachfolgenden Gleichung erzeugt (Lazareno & Birdsall, 1995, Br. J. Pharmacol. 109:1110-9).
(c) Meerschweinchen-Ovalbumin-Modell
Inhibierung der Eosinophil-Infiltration und Hyperreaktivität im Meerschweinchen
In einem Verfahren auf Basis desjenigen, das von Danahay et al., 1997 beschrieben wurde, wurden Ovalbumin-sensibilisierte Meerschweinchen mit Mepyramin (30 mg/kg i.p.) dosiert, um sie gegen anaphylaktischen Bronchospasmus zu schützen. In 10 % DMSO und 90 % PEG200 gelöste Testverbindungen wurden auf dem oralen Weg 30 Minuten vor der Ovalbumin-Exposition verabreicht (10 Minuten Atmen eines aus einer 0,5%igen Lösung von Ovalbumin erzeugten Aerosols). Hyperreaktivität der Atemwege gegen das Thromboxan-Mimetikum U46619 wurde 24 Stunden nach der Ovalbumin-Exposition in nicht-unterdrückten Tieren unter Verwendung eines Ganzkörper-Plethysomgraphen (Buxco Ltd., USA) gemessen. Die Meerschweinchen wurden dann getötet und die Lugen gespült. Vollständige und differentielle Leukozytenzahlen wurden dann für die bronchoalveolare Spülflüssigkeit erhalten und die prozentuale Reduzierung der Eosinophilanreicherung bestimmt (Sanjar et al., 1992). Die Daten wurden als inhibitorische Wirkung der angegebenen Dosis dargestellt, ausgedrückt als Prozentwert der Träger-Kontrollreaktion.
Beispiele für krankheitszustände, in denen die Verbindung der Erfindung potentiell vorteilhafte antiinflammatorische Wirkungen hat, schließen Krankheiten der Atemwege ein, wie Bronchitis (einschließlich chronischer Bronchitis), Bronchiektasie, Asthma (einschließlich Allergeninduzierter asthmatischer Reaktionen), chronisch-obstruktive Lungenkrankheit (COPD), Mukoviszidose, Sinusitis und Rhinits. Andere relevante Krankheitszustände schließen Krankheiten des Magen-Darm-Traktes wie intestinale inflammatorische Krankheiten, einschließlich entzündlicher Darmkrankheit (z.B. Morbus Crohn oder ulzeröse Kolitis), und intestinale inflammatorische Krankheiten nach Strahlungskontakt oder Allergenkontakt ein.
Außerdem kann die Verbindung der Erfindung zur Behandlung von Nephritis, Hautkrankheiten wie Psoriasis, Ekzem, allergischer Dermatitis und Überempfindlichkeitsreaktionen und Krankheiten des zentralen Nervensystems, die eine inflammatorische Komponente haben (z.B. Alzheimer-Krankheit, Meningitis, multiple Sklerose), HIV- und AIDS-Demenz verwendet werden.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch von Nutzen in der Behandlung von Nasenpolypen, Konjunktivitis oder Pruritis sein.
Weitere Beispiele für Krankheitszustände, in denen die Verbindung der Erfindung potentiell vorteilhafte Wirkungen hat, schließen kardiovaskuläre Zustände wie Atherosklerose, periphere Gefäßkrankheit und idiopathisches hypereosinophiles Syndrom ein. Andere Krankheiten, für die die erfindungsgemäße Verbindung vorteilhaft sein kann, sind andere hypereosinophile Krankheiten wie Churg-Strauss-Syndron. Zusätzlich wird Eosinophilie häufig bei parasitischen Krankheiten gefunden, speziell Wurmkrankheiten, und somit kann die erfindungsgemäße Verbindung nützlich in der Behandlung von Entzündung sein, die aus hypereosinophilen Krankheitszuständen wie Hydatidenblase (Echinococcus sp.), Bandwurminfektionen (Taenia sp.), Blutegeln (Schistosomiasis) und Nematodeninfektionen (Spulwürmer) hervorgeht, wie z.B. Hakenwurm (Ancylostoma sp.), Ascaris, Strongyloides, Trichinella und insbesondere lymphatische Filariasis, einschließlich Onchocerca, Brugia, Wucheria (Elephantiasis).
Die Verbindung der Erfindung kann nützlich als immunsuppressives Mittel sein und somit Nutzen in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten wie Allotransplantatgewebeabstoßung nach Transplantation, rheumatoider Arthritis und Diabetes haben. Verbindungen der Erfindung können auch nützlich in der Inhibierung von Metastase sein.
Krankheiten von prinzipiellem Interesse schließen Asthma, COPD und inflammatorische Krankheiten der oberen Atemwege ein, die saisonale und andauernde Rhinitis involvieren.
Bevorzugte Krankheiten von prizipiellem Interesse schließen Asthma und inflammatorische Krankheiten der oberen Atemwege ein, die saisonale und andauernde Rhinitis involvieren.
Weitere Krankheiten, die auch von prinzipiellem Interesse sind, schließen inflammatorische Krankheiten des Magen-Darm-Trakts wie entzündliche Darmkrankheit ein.
Die Fachleute werden einsehen, daß sich hier Verweise auf die Behandlung oder Therapie auf die Prophylaxe sowie auf die Behandlung von etablierten Zuständen erstrecken.
Wie oben erwähnt, ist die Verbindung der Formel (I) nützlich als Therapeutikum.
Somit wird als ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verbindung der Formel (I) zur Verwendung als Therapeutikum bereitgestellt, insbesondere in der Behandlung von Patienten mit inflammatorischen Zuständen, zum Beispiel Asthma oder Rhinitis.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung der Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von inflammatorischen Zuständen, zum Beispiel Asthma oder Rhinitis, bereitgestellt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Verabreichung in jeder zweckmäßigen Weise formuliert werden, und die Erfindung schließt deshalb in ihrem Umfang pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die die Verbindung der Formel (I) umfassen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Verdünnungsmitteln oder Trägern.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Formulierung bereitgestellt, daß das Vermischen der Bestandteile umfaßt.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann zum Beispiel zur oralen, inhalierten, intranasalen, bukkalen, parenteralen oder rektalen Verabreichung formuliert werden, bevorzugt zur oralen Verabreichung.
Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können herkömmliche Exzipienten wie Bindemittel enthalten, zum Beispiel Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Tragacanth, Schleim von Stärke, Cellulose oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, zum Beispiel Lactose, mikrokristalline Cellulose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat oder Sorbit; Schmiermittel, zum Beispiel Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Polyethylenglykol oder Kieselerde; Tablettensprengmittel, zum Beispiel Kakrtoffelstärke, Croscarmellose-Natrium oder Natriumstärkeglykolat; oder Benetzungsmittel wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können gemäß allgemein fachbekannten Verfahren überzogen werden. Orale flüssige Zubereitungen können in Form von zum Beispiel wäßrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren sein, oder können als trockenes Produkt zur Herrichtung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung angeboten werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Additive wie Suspendiermittel enthalten, zum Beispiel Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte eßbare Fette; Emulgatoren, zum Beispiel Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummi arabicum; nicht-wäßrige Träger (die eßbare Öle einschließen können), zum Beispiel Mandelöl, fraktioniertes Kokosöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Ethylalkohol; oder Konservierungsmittel, zum Beispiel Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure. Die Zubereitungen können auch Puffersalze, Aromen, Farbmittel und/oder Süßungsmittel (z.B. Mannit) nach Bedarf enthalten.
Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschtabletten annehmen, die in herkömmlicher Weise formuliert werden.
Die Verbindung kann auch als Suppositorien formuliert werden, die z.B. herkömmliche Suppositorienbasen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch zur parenteralen Verabreichung durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion formuliert werden und kann in Einheitsdosisform angeboten werden, zum Beispiel als Ampullen, Fläschchen, kleinvolumige Infusionen oder vorgefüllte Spritzen, oder in Mehrfachdosisbehältern mit einem zugegebenen Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen in wäßrigen oder nicht-wäßrigen Trägern annehmen und können Formulierungsmittel wie Antioxidantien, Puffermittel, antimikrobielle Mittel und/oder Mittel zur Einstellung der Tonizität enthalten. Alernativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Herrichtung mit einem geeigneten Träger, zum Beispiel sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung sein. Die trockene feste Darreichung kann durch aseptisches Einfüllen eines sterilen Pulvers in individuelle sterile Behälter oder durch aseptisches Einfüllen einer sterilen Lösung in jeden Behälter und Gefriertrocknen hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung und pharmazeutische Zusammensetzungen können auch in Kombination mit anderen Therapeutika verwendet werden, zum Beispiel Antihistaminika, Anticholinergika, entzündungshemmenden Mitteln (wie Kortikostereoide (z.B. Fluticasonpropionat, Beclomethasondipropionat, Mometasonfuroat, Triamcinolonacetonid oder Budesonid) oder NSAIDs (z.B. Natriumcromoglycat, Nedocromil-Natrium, PDE-4-Inhibitoren, Leukotrien-Antagonisten, iNOS-Inhibitoren, Tryptase- und Elastase-Inhibitoren, beta-2-Integrin-Antagonisten und Adenosin-2a-Agonisten)) oder beta-adrenergen Mitteln (wie Salmeterol, Salbutamol, Formoterol, Fenoterol oder Terbutalin und Salze davon), Antihistaminika (z.B. Methapyrilen oder Loratadin) oder infektionsverhindernden Mitteln (z.B. Antibiotika, antivirale Mittel).
Man wird einsehen, daß dann, wenn die erfindungsgemäße Verbindung in Kombination mit anderen Therapeutika verabreicht wird, die normalerweise auf dem inhalierten oder intranasalen Weg verabreicht werden, die resultierende pharmazeutische Zusammensetzung auf dem inhalierten oder intranasalen Weg verabreicht werden kann.
Die Verbindung der Erfindung kann zweckmäßig in Mengen von zum Beispiel 0,001 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden, bevorzugt 0,01 bis 500 mg/kg Körpergewicht, besonders bevorzugt 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht, 1- bis 4-mal täglich. Die genaue Dosis wird natürlich vom Alter und Zustand des Patienten und dem besonderen gewählten Verabreichungsweg abhängen.
Biologische Daten
Die Verbindung der Formel (I) wurde in den CCR-3-Bindungs- und/oder Eosinophil-Chemotaxis-Tests (Tests (a) und (b)) untersucht. Die im CCR-3-Bindungstest untersuchte Verbindung der Erfindung besaß einen pIC50-Wert von mehr als 5. Die im CCR-3-Eosinophil-Chemotaxistest untersuchte Verbindung der Erfindung besaß einen fpKi-Wert von mehr als 5.
Durchgehend in der Beschreibung und in den Ansprüchen, wenn der Zusammenhang nichts anderes erfordert, verstehen sich das Wort "umfassen" und Variationen wie "umfaßt" und "umfassend" so, daß sie den Einschluß einer angegebenen ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von ganzen Zahlen implizieren, aber nicht den Ausschluß jeder anderen ganzen Zahl oder jedes anderen Schrittes oder jeder anderen Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, aber beschränken sie in keiner Weise.
Beschreibung der Figuren
1 ist ein Röntgenbeugungsmuster für ein Dihydrat einer Verbindung der Formel (I).
2 ist eine kombinierte Spur von thermogravimetrischer Analyse/Differentialrasterkalorimetrie für ein Dihydrat einer Verbindung der Formel (I).
3 ist eine Differentialrasterkalorimetrie-Spur für ein Dihydrat einer Verbindung der Formel (I).
4 ist eine Spur einer thermogravimetrischen Analyse für ein Dihydrat einer Verbindung der Formel (I).
Allgemeine experimentelle Einzelheiten
NMR
Kernresonanzspektren (NMR) wurden unter Verwendung eines Instruments Bruker DPX250 oder DPX400 aufgenommen.
IR
Infrarotspektren wurden unter Verwendung eines Instruments Nicolet Avatar 360 unter Verwendung einer Germanium-ATR-Sonde aufgenommen.
LC/MS-System A
Das folgenden Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie-(LCMS)-System wurde verwendet: 3 mm ABZ+PLUS-Säule (3,3 cm × 4,6 mm Innendurchmesser) unter Elution mit den Lösungsmitteln: A – 0,1 % Ameisensäure + 0,077 % G/V Ammoniumacetat in Wasser; und B – 95:5 Acetonitril:Wasser + 0,05 % V/V Ameisensäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml pro Minute. Das folgende Gradientenprofil wurde verwendet: 100 % A für 0,7 min; A + B-Mischungen, Gradientenprofil 0–100 % B über 3,5 min; Halten bei 100 % B für 1,1 min; Zurückkehren auf 100 % A über 0,2 min.
LC/MS-System B
3 μm Phenomenex Luna-Säule (50 × 2 mm Innendurchmesser) unter Elution mit den Lösungsmitteln: A – 0,05 % Trifluoressigsäure in Wasser, B – 0,05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril bei 40°C und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute. Der folgende lineare Gradient wurde verwendet: 0 bis 95 % B über 8 Minuten.
Analytische HPLC-Säule, Bedingungen und Elutionsmittel
Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie wurde unter Verwendung einer Luna 3 mm C18(2)-Säule (50 × 2,0 mm Innendurchmesser) und Elution mit den folgenden Lösungsmitteln durchgeführt: A – 100 % Wasser, 0,05 % TFA; und B – 100 % Acetonitril, 0,05 % TFA, bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute und bei 60°C. Das folgende Gradientenprofil wurde verwendet: 0–95 % B über 2,00 min, Zurückkehren auf 0 % B über 0,01 min.
Beispiel 1: 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat
4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid (15 g) wurde in Ethanol (60 ml) und Wasser (7,5 ml) bei 40°C suspendiert. Eine Lösung aus Benzolsulfonsäure (6,0 g) in Wasser (7,5 ml) wurde hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von weiterem Wasser (15 ml). Isopropylacetat (300 ml) wurde bei 40°C hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von Ethanol (40 ml). Die Mischung wurde auf 0°C abgekühlt, mit Cyclohexan (10 ml) verdünnt und mit reinem 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonathydrat geimpft. Die Mischung wurde auf 0°C über 1 Stunde abgekühlt, mit Cyclohexan (100 ml) über 15 min versetzt und die Mischung bei 0°C gereift. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltration isoliert, mit Isopropylacetat (2 × 30 ml) gewaschen und im Vakuum bei 25 ± 5°C getrocknet, um die Titelverbindung als weißen Feststoff (16,44 g) zu ergeben.
NMR (DMSO d-6): 2,18 δ (1H) breit t; 3,0–3,4 δ (5H) m; 3,67 δ (2H) m; 4,02 δ (1H) d von d, J=12,7Hz, 2,5Hz; 4,25 δ (1H) d, 5,9Hz; 4,37 δ (2H), m; 6,24 δ (1H), t, J=5,6Hz; 6,58 δ (1H), t, J=5,9Hz; 7,3 δ (6H), m; 7,48 δ (1H) d von d, J=8,3Hz, 2,0Hz; 7,61 δ (2H) m [Benzolsulfonat]; 7,75 δ (1H) d, J=8,3Hz; 7,81 δ (1H) d, 2,0Hz; 7,82 δ (2H) m; 7,91 δ (1H) breit s; 9,85 (1H) breit s [NH⁺].
Beispiel 2: 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat
Die Aufschlämmung aus Beschreibung 9 wurde auf 50 ± 3°C abgekühlt und mit Isopropanol (30 ml) versetzt, gefolgt von einer wäßrigen Lösung von Benzolsulfonsäure (32 % G/V, 10 ml). Die Mischung wurde auf 22 ± 3°C über ca. 1 h abgekühlt, mit reinem 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidhydrat geimpft und bei 22 ± 3°C für 72 h gereift. Die Mischung wurde auf 0 ± 3°C über 1 h abgekühlt und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einer 4:1:0,1-Mischung aus Isopropylacetat/Isopropylalkohol/Wasser (2,5 ml) gewaschen und im Vakuum bei 25 ± 5°C getrocknet, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben (6,9 g).
Beispiel 3: 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat
Eine Lösung aus 1-[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin (60 g) in Tetrahydrofuran (120 ml) wurde zu einer Suspension aus Carbonyldiimdazol (38,8 g) in Tetrahydrofuran (600 ml) über 25 min bei 0-5°C gegeben. Die Mischung wurde auf 10–15°C erwärmt und für 15 min gehalten. Isopropanol (30 ml) wurde über 10 min hinzugegeben, und die Mischung wurde für weitere 45 min bei 10–15°C gerührt. 4-Aminomethylbenzamid (35,9 g) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde auf 55–60°C erwärmt und für 90 min gehalten. Tetrahydrofuran (240 ml) wurde durch Destillation entfernt, und die Mischung wurde auf 20–25°C abgekühlt. Die Mischung wurde mit Isopropylacetat (480 ml) und 5%igem wäßrigem Kaliumdihydrogenphosphat (480 ml) behandelt, und die wäßrige Phase wurde entfernt. Die organische Phase wurde mit weiterem 5%igem wäßrigem Kaliumdihydrogenphosphat (2 × 480 ml) und schließlich mit Wasser (480 ml) gewaschen.
Die organische Phase wurde auf 250 ml durch Destillation aufkonzentriert, mit Isopropanol (850 ml) verdünnt und auf ein Endvolumen von 420 ml erneut aufkonzentriert. Die Mischung wurde auf 20–25°C abgekühlt, mit einer Lösung aus Benzolsulfonsäure (38,5 g) in Wasser (110 ml) behandelt und auf 35°C erwärmt. Isopropylacetat (720 ml) wurde hinzugegeben, die Mischung wurde auf 20–25°C abgekühlt und mit reinem 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat geimpft. Die Mischung wurde für 3 h bei dieser Temperatur gerührt, mit weiterem Isopropylacetat (180 ml) behandelt, für 30 min gerührt und auf 0–5°C abgekühlt. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltration isoliert, mit Isopropylacetat:Isopropanol:Wasser (6:1:0,1, 350 ml) gewaschen und im Vakuum bei 35 ± 5°C getrocknet, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben (115,6 g).
Beschreibungen
Beschreibung 1: 2,2,2-Trifluor-N-(morpholin-2-ylmethyl)acetamid
Zu einer gerührten Lösung aus Morpholin-2-ylmethylamin (3,1 g) in Methanol (70 ml) unter Stickstoff wurde eine etherische Lösung von Ethyl-α,α,α-trifluoracetat (5 ml in 20 ml Ether) gegeben, die mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet worden war. Die Mischung wurde für 30 min bei 22°C vor der Entfernung aller flüchtigen Stoffe im Vakuum gerührt. Der Rückstand wurde in Methanol (10 ml) gelöst und die flüchtigen Stoffe erneut im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung als weißen krispen Schaum (4,9 g) zu ergeben.
Thermospray-Massenspektrum m/z 213 [MH⁺].
Beschreibung 2: N-{[4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}-2,2,2-trifluoracetamid
Zu einer gerührten Lösung aus Beschreibung 1 (3,3 g) in N,N-Dimethylformamid (50 ml) unter Stickstoff wurden Kaliumcarbonat (2,46 g) und Natriumiodid (2,12 g) gegeben. Eine Lösung aus 3,4-Dichlorbenzylchlorid (2 ml) in N,N-Dimethylformamid (10 ml) wurden zur Mischung getropft. Die Mischung wurde bei 22°C für 18 h gerührt, bevor die flüchtigen Stoffe im Vakuum entfernt wurden. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan (100 ml) und gesättigter wäßriger Natriumcarbonat-Lösung (50 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde anschließend mit zusätzlicher gesättigter wäßriger Natriumcarbonat-Lösung (2 × 50 ml) und Wasser (50 ml) vor dem Trocknen über Magnesiumsulfat, Filtrieren und Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum gewaschen, um ein blaßgelbes Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch Biotage- Flash-Chromatographie an einer 90 g Kieselerde-Kartusche unter Elution mit 25 % Ethylacetat in Cyclohexan gereinigt, um die Titelverbindung als farbloses Öl zu ergeben (2,97 g).
LC/MS (System A) R_t 2,63 min,
Massenspektrum m/z 371 [MH⁺].
Beschreibung 3: [4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin
Zu einer gerührten Lösung aus Beschreibung 2 (2,97 g) in Methanol (15 ml) und Wasser (5 ml) wurde Kaliumcarbonat (5,53 g) gegeben. Die Mischung wurde bei 22°C für 18 h gerührt, bevor das Methanol im Vakuum entfernt wurde. Wasser (25 ml) wurde hinzugegeben und die Mischung mit Ethylacetat (3 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (5 ml) und gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung (10 ml) vor dem Trocknen über Natriumsulfat, Filtrieren und Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum gewaschen, um ein blaßgelbes Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch Biotage-Flash-Chromatographie an einer 90 g Kieselerde-Kartusche unter Elution mit 75:8:1 Dichlormethan/Ethanol/0,880 Ammoniak-Lösung gereinigt. Die erforderlichen Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft, um die Titelverbindung als farbloses Öl zu ergeben (1,85 g).
LC/MS (System A) R_t 1,77 min,
Massenspektrum m/z 275 [MH⁺]
Beschreibung 4: (4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin (alternative Synthese)
Eine Mischung aus 2-[(3,4-Dichlorbenzyl)amino]ethanol (0,980 g) und 2-(Oxiran-2-ylmethyl)-1H-isoindol-1,3(2H)-dion (1,10 g) wurde unter Stickstoff für 3 h auf 80°C erwärmt. Die resultierende feste Masse wurde mit konzentrierter Schwefelsäure (1,5 ml) behandelt und dann bei 150°C für 24 h gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser (100 ml) behandelt und dann mit Ethylacetat (2 × 100 ml) gewaschen. Die dunkle wäßrige Phase wurde unter Verwendung von 5M wäßrigem Natriumhydroxid auf ∼pH 12 basisch gemacht und dann mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum auf konzentriert, um die Titelverbindung als braunes Öl zu ergeben (1,02 g).
Beschreibung 5: 1-[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin
Beschreibung 3 (racemische Mischung, 8 g) wurde in ihre einzelnen Enantiomnere durch präparative chirale HPLC getrennt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer 2'' × 22 cm Chiralpak AD 20 μm-Säule, Merck Self Pack DAC-System, unter Elution mit 95:5:0,1 (V/V) Heptan:absolutes Ethanol:
Diethylamin durchgeführt (Fließgeschwindigkeit: 55 ml/min über 40 min, UV-Detektion 225 nm); Probenbeladungspräparation: 400 mg Probe in 20 ml 3:2 (V/V) absolutes Ethanol:System-Elutionsmittel.
Die Titelverbindung (2,49 g) wurde wie folgt erhalten: präparative HPLC, Retentionszeit 23,0 min.
Beschreibung 6: 1-[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methanaminsalz mit D-Weinsäure 1:1
Beschreibung 3 (0,613 g) wurde in Methanol (12,3 ml) gelöst. D-Weinsäure (0,335 g) wurde hinzugegeben, und die Aufschlämmung wurde für 50 min refluxiert. Die Mischung wurde auf 0–5°C abkühlen gelassen und die Ausfällung durch Filtration isoliert, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben (0,4 g).
Enantiomerenüberschuß: 76 % ee
Chirale analytische HPLC (Chiralpak AD-Säule, 4,6 × 250 mm, Elutionsmittel 50:50:0,1 MeOH:EtOH:Butylamin, Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min, UV-Detektion bei 220 nm), Rt 8,9 min.
Beschreibung 7: Herstellung von 2-{[(2R)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}-1H-isoindol-1,3(2H)-dion
Eine Mischung aus 2-[(3,4-Dichlorbenzyl)amino]ethanol (2,038 g) und (S)-2-(Oxiran-2-ylmethyl)-1H-isoindol-1,3(2H)-dion (2,032 g) in Tetrahydrofuran (3,3 ml) wurde unter Stickstoff gerührt und refluxiert. Nach 21,5 h wurde weiteres Tetrahydrofuran (12,5 ml) hinzugegeben und die Mischung auf 3°C abgekühlt. Triphenylphosphin (2,793 g) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde gerührt, bis sich der gesamte Feststoff aufgelöst hatte. Diisopropylazodicarboxylat (2,1 ml) wurde dann über 12 min hinzugegeben, wobei die Temperatur auf <7°C gehalten wurde. Nach 2,25 h wurde die Mischung auf 22°C erwärmen gelassen. Nach 5,3 h wurden weiteres Triphenylphosphin (121 mg) und Diisopropylazodicarboxylat (0,09 ml) hinzugegeben. Nach 22,5 h wurde die Reaktionsmischung annähernd zur Trockene aufkonzentriert. Propan-2-ol (12 ml) wurde hinzugegeben und das Aufkonzentrieren wiederholt, und dies wurde einmal mehr wiederholt. Weiteres Propan-2-ol (12 ml) wurde hinzugegeben und die Mischung auf 70°C erwärmt. Nach 0,5 h wurde die Aufschlämmung auf 22°C abgekühlt, und dann wurde das Produkt nach weiteren 2 h aufgefangen. Das Bett wurde mit Propan-2-ol (2 × 4 ml) gewaschen und dann im Vakuum bei 40°C getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben (2,622 g).
NMR (DMSO d-6): 1,93 δ (1H), d von d, J=11,0Hz, 8,8Hz; 2,10 δ (1H), d von t, J=3,5Hz, 11,3Hz; 2,52 δ (1H) breit d, J=11,3Hz; 2,77 δ (1H) breit d, J=11,3Hz; 3,3–3,8 δ (7H), m; 7,31 δ (1H) d von d, J=8,2Hz, 1,9Hz; 7,55 δ (1H) d, J=1,9Hz; 7,68 δ (1H), d, J=8,2Hz; 7,86 δ (4H) m.
Beschreibung 8: Herstellung von [(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin
Eine Aufschlämmung aus Beschreibung 7 (1,00 g) in Wasser (8,5 ml) wurde auf 75°C erwärmt und dann tropfenweise mit konzentrierter Schwefelsäure (2,5 ml) behandelt. Die Mischung wurde dann refluxiert. Nach 23 h wurde die Reaktionsmischung auf 22°C abgekühlt und dann mit Dichlormethan (6 ml) behandelt. 880 Ammoniak-Lösung (7 ml) wurde dann unter Kühlung hinzugetropft. Weiteres Dichlormethan (10 ml) wurde hinzugegeben. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit weiterem Dichlormethan (10 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Wasser (5 ml) gewaschen und dann zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde erneut aus DCM eingedampft, um die Titelverbindung als Öl zu ergeben (662 mg).
NMR (DMSO d-6): 1,78 δ (1H) t, J=10,5Hz; 2,06 δ (1H) d von t, J=3,4Hz, 11,3Hz; 2,45–2,65 δ (3H) m; 2,73 δ (1H) d von t, J=11,3Hz, 1,7Hz; 3,38 δ (1H) m; 3,46 δ (2H) AB q; 3,51 δ (1H) d von d, J=11,3Hz, 2,5Hz; 3,77 δ (1H) d von m, J=11,3Hz; 7,31 δ (1H) d von d, J=8,3Hz, 2,0Hz; 7,55 δ (1H) d, J=2,0Hz; 7,58 δ (1H) d, J=8,3Hz.
Beschreibung 9: 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid
Eine Lösung aus (5 g) in THF (10 ml) wurde zu einer Aufschlämmung aus N,N'-Carbonyldiimidazol (3,2 g) in THF (30 ml) bei 5–10°C über ca. 10 min gegeben. Die Mischung wurde auf 15 ± 3°C erwärmt und auf dieser Temperatur für ca. 15 min gehalten. 4-Aminomethylbenzamid (3,0 g) wurde dann hinzugegeben, die Mischung auf 60 ± 3°C erwärmt und bei dieser Temperatur für 75 min gerührt.
Die Reaktion wurde auf 22 ± 3°C abgekühlt und mit Isopropylacetat (40 ml) versetzt, gefolgt von einer Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (5 % G/V, 40 ml). Die Lösung wurde durch Celite (2 g) filtriert, die untere wäßrige Schicht wurde entfernt und die obere organische Schicht mit Kaliumdihydrogenphosphat (5 % G/V, 2 × 40 ml) und dann Wasser (40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde bei Atmosphärendruck destilliert, um THF zu entfernen und eine Aufschlämmung von 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid in Isopropylacetat zurückzulassen (ca. 60 ml).
Die Aufschlämmung, die 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid enthält, kann direkt für das Verfahren von Beispiel 2 verwendet oder filtriert werden, um 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid in isolierter Form zur Verwendung im Verfahren von Beispiel 1 zu ergeben.
Beschreibung 10: 2-{(2R)-3-[(3,4-Dichlorbenzyl)(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropyl}-1H-isoindol-1,3(2H)-dion
Zu einer Lösung aus 2-[3,4-Dichlorbenzyl)amino]ethanol (2,8 g) in Tetrahydrofuran (6,2 ml) wird (S)-2-(Oxiran-2-ylmethyl)-1H-isoindol-1,3(2H)-dion (3,1 g) unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Die Mischung wurde über 1 h auf 90°C erwärmt und dann auf dieser Temperatur für 18 h gehalten. Weiteres 2-[3,4-Dichlorbenzyl)amino]ethanol (0,14 g) wird hinzugegeben und die Reaktion für weitere 5 h auf 90°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wird auf 22°C abgekühlt und mit Diisopropylether (21 ml) versetzt und das Produkt durch Vakuumfiltration isoliert. Der Filterkuchen wird mit Diisopropylether (3 ml) gewaschen und im Vakuum bei 40°C getrocknet, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben (4,79 g).
LC/MS (System B) R_t 3,85 min,
Massenspektrum m/z 423 [MH⁺].
Beschreibung 11: Herstellung von [(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin (alternatives Entschützen)
Eine Aufschlämmung aus Beschreibung 7 (70,00 g) in 40 % G/G wäßrigem Methylamin (560 ml) wurde auf 50–60°C erwärmt und für 3 h gehalten. Die Mischung wurde tropfenweise mit 10 N Natriumhydroxid (35 ml) behandelt, auf <25°C abgekühlt und dann mit Dichlormethan (210 ml) behandelt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit weiterem Dichlormethan (210 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Wasser (70 ml) gewaschen und dann zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde erneut aus DCM eingedampft, um die Titelverbindung als Öl zu ergeben (47,7 g).
Beschreibung 12: 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamid
Eine Mischung aus [(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methylamin, 1:1-Salz mit D-Weinsäure (20 g), Wasser (100 ml) und Dichlormethan (120 ml) wurde mit wäßrigem Ammoniak (10 ml) bei 15–25°C behandelt. Die Schichten wurden getrennt, die wäßrige Schicht wurde mit Dichlormethan (10 ml) gewaschen, und die vereinigten organischen Schichten wurden mit 2%igem wäßrigem Natriumchlorid (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde zu einem Öl aufkonzentriert und in THF (20 ml) aufgenommen. Diese Lösung wurde zu einer Aufschlämmung aus N,N'-Carbonyldiimidazol (7,8 g) in THF (80 ml) bei 0–5°C über ca. 10 min gegeben. Die Mischung wurde auf 15 ± 3°C erwärmt und auf dieser Temperatur für ca. 15 min gehalten. Isopropanol (6 ml) wurde hinzugegeben, und es wurde für weitere 5 min bei 15 ± 3°C gerührt. 4-Aminomethylbenzamid (7,2 g) wurde dann hinzugegeben, die Mischung auf 60 ± 3°C erwärmt und bei dieser Temperatur für 120 min gerührt.
Die Reaktion wurde auf 22 ± 3°C abgekühlt und mit Isopropylacetat (96 ml) versetzt, gefolgt von einer Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (5 % G/V, 96 ml). Die organische Phase wurde mit weiterem Kaliumdihydrogenphosphat (5 % G/V, 2 × 96 ml) und dann mit Wasser (96 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde durch Celite filtriert, und der Kuchen wurde mit Isopropylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde zu einem halbfesten Stoff aufkonzentriert und in Isopropylacetat (200 ml) im Rückfluß resuspendiert. Die Aufschlämmung wurde auf 20–25°C über 1 h abgekühlt, auf 0–5°C abgekühlt und für 15 min gereift. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert, mit Isopropylacetat (50 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung als weißen Feststoff (17,4 g) zu ergeben.
LC-MS (System A) R_t 2,27 min,
Massenspektrum m/z 451/453 (MH⁺).
Beschreibung 13: Herstellung von 2-{[(2R)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}-1H-isoindol-1,3(2H)-dion
Eine Mischung aus 2-[(3,4-Dichlorbenzyl)amino]ethanol (400 g) und (S)-2-(Oxiran-2-ylmethyl)-1H-isoindol-1,3(2H)-dion (399,6 g) in Toluol (1150 ml) wurde gerührt und auf 103–107°C unter Stickstoff erwärmt. Nach 22,5 h wurde die Mischung auf <60°C abgekühlt und mit Tetrahydrofuran (2800 ml) versetzt. Triphenylphosphin (548 g) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde gerührt, bis sich der gesamte Feststoff gelöst hatte, und dann auf 5–9°C abgekühlt. Diisopropylazodicarboxylat (412 ml) wurde dann über 70 min hinzugegeben, wobei die Temperatur auf <12°C gehalten wurde. Die Mischung wurde auf 21–55°C erwärmt und für 1,5 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Destillation auf ein Endvolumen von 2800 ml aufkonzentriert. Methanol (2800 ml) wurde hinzugegeben und das Aufkonzentrieren auf ein Volumen von 2800 ml wiederholt. weiteres Methanol (2000 ml) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde auf 55°C erwärmt. Nach 0,75 h wurde die Ausfällung auf 18°C abgekühlt, und dann wurde das Produkt nach einer weiteren Stunde aufgefangen. Das Bett wurde mit Methanol (2 × 1200 ml) gewaschen und dann im Vakuum bei 40°C getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben (526,9 g).
Röntgenbeugung
Die Röntgenbeugungsdaten für (4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat sind in 1 gezeigt. Die nachfolgende Tabelle 1 stellt das Instrument und die verwendeten Parameter dar. Die nachfolgende Tabelle 2 stellt die Peak-Liste dar.
Tabelle 1. Instrument und Instrumentenparameter, die für die Datenaufnahme verwendet wurden
Tabelle 2. Peak-Liste
Tabelle 2. Peak-Liste (Fortsetzung)
Differentialrasterkalorimetrie
Die Stabilität von 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat wurde unter Verwendung der Differentialrasterkalorimetrie gemessen. Tabelle 3 stellt das Instrument und die verwendeten Parameter dar, und die Ergebnisse sind in 2 und 3 gezeigt.
Tabelle 3
Thermogravimetrische Analyse
Die Stabilität von 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzolsulfonatdihydrat wurde unter Verwendung der thermogravimetrischen Analyse gemessen. Tabelle 4 stellt das Instrument und die verwendeten Parameter dar, und die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Tabelle 4

Claims

Verbindung der Formel (I):
worin A^– das Benzolsulfonat-(Besylat)-anion darstellt; R H oder C_1-6-Alkyl darstellt; und n eine Zahl von 0,8 bis 2,2 ist.
Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, worin R H darstellt.
Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder 2, worin n eine Zahl zwischen 1,1 und 2,1 darstellt.
Verbindung der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin n circa 2 ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, die 4-({[({[(2S)-4-(3,4-Dichlorbenzyl)morpholin-2-yl]methyl}amino)carbonyl]amino}methyl)benzamidbenzol-sulfonatdihydrat ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel (IA):
mit einer Quelle für das Besylatanion und einem geeigneten C_1-6-Alkanol und Wasser umfaßt.
Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung als Therapeutikum, insbesondere in der Behandlung von Patienten mit inflammatorischen Zuständen, z.B. Asthma oder Rhinitis.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von inflammatorischen Zuständen, z.B. Asthma oder Rhinitis.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert umfaßt, gegebenenfalls mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Verdünnungsmitteln oder Trägern.
Verbindung der Formel (IIA):
worin A eine Phthalimidogruppe ist.
Verbindung der Formel (IIBR)
worin A eine Phthalimidogruppe ist.
Verbindung der Formel (IIB):
worin A eine Phthalimidogruppe ist.