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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Pflanzenkrankheitsresistenz, insbesondere Resistenz
gegenüber
pilzlichen Pathogenen. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung
die Verwendung von natürlich
vorkommenden antimikrobiellen Polypeptiden, die aus Insekten isoliert
wurden, die mit Pflanzenpathogenen induziert wurden.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Multizelluläre Organismen
produzieren eine Batterie antimikrobieller Peptide und Proteine,
um sich selbst gegen mikrobiellen Befall oder mikrobielle Schädigung zu
verteidigen. Viele dieser induzierten Peptide und Proteine besitzen
breite antimikrobielle Aktivität
gegen Grampositive und/oder Gram-negative Bakterien (Boman, H. G.
(1995) Annu. Rev. Immunol. 13:61–92). Dieses Abwehrsystem,
bezeichnet als "angeborene
Immunität", kann eine chemische
Barriere darstellen, die Organismen einsetzen, um gefährliche
Mikroben an ihrer Kontaktstelle zu stoppen.
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Die
in Reaktion auf einen mikrobiellen Befall produzierten Peptide und
Proteine neigen dazu, sehr unterschiedlich zu herkömmlichen
Antibiotika zu wirken. Antibiotika wirken so, dass sie ein entscheidendes
Protein in einer eindringenden bzw. einwandernden Mikrobe blockieren.
Die Wirkweise der antimikrobiellen Abwehrproteine variiert. In einigen
Fällen
können
sie Löcher
in den Membranen einer Mikrobe verursachen und die interne Signalisierung
der Mikrobe unterbrechen. In anderen Fällen können sie so wirken, dass die
Immunaktivität
der Wirtszelle erhöht
wird.
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Mehrere
antimikrobielle Peptide sind isoliert worden, und ihre Strukturen
wurden partiell charakterisiert. Die Defensine, ein Typ der antimikrobiellen
Peptide, sind Cystein-reiche Peptide. Defensine sind aus Insekten
und Säugern
isoliert worden. Insekten-Defensine sind 34–43 Aminosäuren lange Peptide mit drei
Disulfidbrücken.
Sie werden durch den Insektenfettkörper produziert (Hoffmann et
al. (1992) Immunol. Today 13:411–15). Es ist gezeigt worden,
dass sie die Permeabilität
der Cytoplasmamembran von Micrococcus luteus stören, was aus der Bildung von
Spannungs-abhängigen
Ionenkanälen
der Cytoplasmamembran resultiert (Cociancich et al. (1993) J. Biol.
Chem. 268:19239–19245).
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Thionine
sind eine weitere Gruppe kleinerer Cystein-reicher antimikrobieller
Peptide. Es wird angenommen, dass Thionine eine Rolle im Schutz
von Pflanzen gegen eine mikrobielle Infektion spielen. Sie werden
im Endosperm von Samen, in Stängeln
bzw. Stämmen,
Wurzeln und in etiolierten oder Pathogenstress unterliegenden Blättern vieler
Pflanzenarten gefunden (Bohlmann et al. (1991) Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 42:227–240). Thionine zeigen Toxizität gegenüber Bakterien,
Pilzen, Hefen und sogar verschiedenen Säugerzelltypen.
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Krankheiten
bei Pflanzen haben viele Ursachen, einschließlich Pilze, Viren, Bakterien
und Nematoden. Phytopathogene Pilze haben signifikante Einbußen im Jahresernteertrag
sowie verheerende Epidemien bewirkt. Zusätzlich haben Ausbrüche von
Pflanzenkrankheiten katastrophale Ernteausfälle bewirkt, die Hungersnöte ausgelöst und große soziale
Veränderungen
verursacht haben.
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Molekulare
Verfahren des Pflanzenschutzes besitzen nicht nur das Potential,
neue Mechanismen für Krankheitsresistenz
zu implementieren, sondern können
auch schneller als traditionelle Züchtungsverfahren implementiert
werden. Demgemäß werden
zum Ergänzen
traditioneller Züchtungsverfahren
molekulare Verfahren benötigt,
um Pflanzen vor Pathogenbefall zu schützen. Der Einfluss der Biotechnologie
auf auf Hyphomyceten beruhende pilzliche Biokontrollmittel ist in
Hegedus et al. (1995) (Biotechnology Advances, Bd. 13, Nr. 3, 1995,
Seiten 455–490)
diskutiert.
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Pflanzenpathogene
Pilze greifen alle der näherungsweise
300.000 Arten von Blütenpflanzen
an, jedoch kann eine einzelne Pflanzenart ein Wirt für lediglich
einige Pilzarten sein, und die meisten Pilze besitzen üblicherweise
ein beschränktes
Wirtsspektrum. Aus diesem Grund bestand die beste allgemeine Strategie zum
Kontrollieren von pilzlichen Pflanzenerkrankungen bis jetzt in der
Verwendung resistenter Kultivare, ausgewählt oder entwickelt von Pflanzenzüchtern.
Unglücklicherweise
besteht selbst bei der Verwendung von resistenten Kultivaren heute
das Potential für
ernste (Nutz-)Pflanzenkrankheitsepidemien, wie durch Ausbrüche von
Victoria-Brandkrankheit bei Hafer und Blattbrand von Mais ("southern corn leaf
blight") bewiesen.
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Demgemäß sind molekulare
Verfahren, die die Resistenzmechanismen von natürlich vorkommenden Insekten-Pflanzenschädlingen
("plant insect pests") nutzen, um die
Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber Mikroben, insbesondere
pathogenen Pilzen, zu verstärken,
wünschenswert.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Zusammensetzungen
und Verfahren zum Erhöhen
der Resistenz gegenüber
Pathogenen werden bereitgestellt. Die Zusammensetzungen umfassen
antipathogene Peptide oder abwehrende Mittel bzw. Agentien, die
in Insekten induziert werden, indem das Insekt mit einem Pathogen
von Interesse in Kontakt gebracht wird. Die Zusammensetzungen umfassen
Polypeptide, die antimikrobielle Eigenschaften, insbesondere fungizide
Eigenschaften, besitzen und die Nukleinsäuremoleküle, die für derartige Polypeptide codieren.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden
Anwendung bei der Beeinflussung von mikrobiellen Pflanzenpathogenen
und bei der Verstärkung
von Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber mikrobiellen Pathogenen.
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Expressionskassetten,
die die Nukleinsäuremoleküle, codierend
für die
abwehrenden Mittel, umfassen, Vektorsequenzen und Wirtszellen für die Expression
der Polypeptide und Antikörper
gegen die Polypeptide werden ebenso bereitgestellt. Die Zusammensetzungen
der Erfindung stellen ferner Pflanzenzellen, Pflanzen und Samen
davon, die mit den Nukleinsäuremolekülen der
Erfindung transformiert sind, bereit. Die transgenen Pflanzen der
vorliegenden Er findung sind mit einer Nukleotidsequenz der Erfindung
transformiert und weisen eine erhöhte antimikrobielle Krankheitsresistenz,
insbesondere Pilzkrankheitsresistenz auf, die den Bedarf an künstlichen
agrikulturellen Chemikalien zum Schützen von Feldfrüchten bzw.
Feldkulturen und zum Erhöhen
des Ernteertrags verringern werden.
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Die
Verfahren der Erfindung involvieren das stabile Transformieren einer
Pflanze mit wenigstens einer Expressionskassette, die wenigstens
eine Nukleotidsequenz der Erfindung, funktionell verknüpft mit
einem Promotor, der zum Steuern der Expression der Nukleotidsequenz
in der Pflanze oder Pflanzenzelle fähig ist, umfasst. Es wird anerkannt,
dass eine Vielfalt von Promotoren in der Erfindung verwendbar sein
wird, deren Wahl teilweise von der gewünschten Gewebelokalisierung
und dem Expressionslevel der offenbarten Nukleotidsequenzen und
entsprechenden Polypeptide abhängen
wird. Es wird anerkannt, dass die Expressionslevel der abwehrenden
Mittel in der Pflanzenzelle kontrolliert bzw. gesteuert werden können, um
eine optimale Krankheitsresistenz zu erzielen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1.
Aminosäuresequenz-Alignment
des Vorläufer-Mag1-Polypeptids
(SEQ ID NO:2) mit der Klasse von Immunproteinen, die als Attacine
bekannt sind. Das Vorläufer-Mag1-Polypeptid besitzt
78% Sequenzähnlichkeit
mit dem Attacin E/F-Vorläufer-Polypeptid
(SEQ ID NO:19, Eingangs-Nr.: P01513). Die restlichen Sequenzen sind:
Attacin A-Vorläufer-Polypeptid
(SEQ ID NO:17, Eingangs-Nr.: P50725), Attacin B-Vorläufer-Polypeptid
(SEQ ID NO:18, Eingangs-Nr.: P01512) und das Attacin-Vorläufer-Polypeptid,
das als Nuecin bekannt ist (SEQ ID NO:20, Eingangs-Nr.: Q26431).
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2.
Aminosäuresequenz-Alignment
des Vorläufer-Mag1-Polypeptids
(SEQ ID NO:2) mit homologen Polypeptidsequenzen der Erfindung, codiert
durch cDNAs, die aus Pathogen-induzierten Manduca sexta-Bibliotheken
isoliert wurden (SEQ ID NOs:4, 6, 8 und 10).
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3.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen
für die
vier Mag1-Polypeptidfragmente nach Lys-C-Verdau (SEQ ID NO:96, 97,
98 und 99).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum
Erhöhen
bzw. Verstärken von
Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber Pflanzenpathogenen, insbesondere
pilzlichen Pathogenen, bereit. Die Zusammensetzungen der Erfindung
umfassen Polypeptide und Peptide, die antimikrobielle Aktivität, insbesondere
fungizide Aktivität,
besitzen. Derartige Peptide oder Polypeptide werden hierin allgemein
als "abwehrende
Mittel" bzw. "Abwehrmittel" bezeichnet. Nukleinsäuremoleküle, die
für derartige
abwehrende Mittel codieren, sowie Pflanzen, die mit den Nukleinsäuremolekülen transformiert
sind, sind ebenso umfasst. Die Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen
und Verfahren zum Induzieren einer Resistenz in einer Pflanze gegenüber Pflanzenschädlingen.
Die abwehrenden Mittel umfassen von Insekten abgeleitete bzw. stammende Nukleotid-
und Polypeptidsequenzen. Demgemäß sind die
Zusammen setzungen und Verfahren auch nützlich beim Schützen von
Pflanzen gegen pilzliche Pathogene, Viren, Nematoden und dergleichen.
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Zusammensetzungen
zum Kontrollieren von pflanzenpathogenen Agentien, insbesondere
pflanzenpathogenen mikrobiellen Agentien, spezieller pflanzenpathogenen
pilzlichen Agentien, werden bereitgestellt. Bereitgestellte spezifische
Zusammensetzungen umfassen von Insekten abgeleitete antimikrobielle
Polypeptide und die Nukleinsäuremoleküle, die
für derartige
Polypeptide codieren. Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und
Samen davon, die mit den Nukleotidsequenzen der Erfindung transformiert
sind, werden bereitgestellt. Zusätzlich
können
die Zusammensetzungen der Erfindung wegen ihrer Krankheitsresistenzaktivitäten in Formulierungen
verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, umfassend Nukleotidsequenzen,
die für
die Aminosäuresequenzen
codieren, die in SEQ ID NO:101 und 103 gezeigt sind. Weiterhin werden
Polypeptide bereitgestellt, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die durch
ein Nukleinsäuremolekül codiert
wird, das hierin beschrieben ist, z. B. jene, die in SEQ ID NO:100
und 102 angegeben sind, und Fragmente und Varianten davon. Verfahren
zur Expression dieser Sequenzen in einer Wirtspflanze, um eine verstärkte Krankheitsresistenz
der Wirtspflanze gegenüber
Pflanzenpathogenen, insbesondere pilzlichen Pflanzenpathogenen,
zu verleihen, werden bereitgestellt. Die Verfahren der Erfindung
involvieren das stabile Transformieren einer Pflanze mit wenigstens
einer Expressionskassette, die wenigstens eine Nukleotidsequenz
der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der
zum Steuern der Expression der Nukleotidsequenz in der Pflanzenzelle
fähig ist,
umfasst. Es wird anerkannt, dass eine Vielfalt von Promotoren in
der Erfindung verwendbar sein wird, wobei deren Wahl teilweise vom
gewünschten
Level und der gewünschten
Gewebelokalisierung der Expression der offenbarten Nukleotidsequenzen
abhängen
wird. Es wird anerkannt, dass die Level und die Gewebelokalisation
der Expression kontrolliert werden können, um die Level der antimikrobiellen
Polypeptide in der Pflanzenzelle zu modulieren, so dass die Pflanzenkrankheitsresistenz
gegenüber
einem bestimmten Pathogen optimiert wird.
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Mit "Pflanzenpathogen" oder "Pflanzenschädling" ist jeder Mikroorganismus
gemeint, der Schaden an einer Pflanze verursachen kann, wie z. B.
durch Hemmung oder Verlangsamung des Wachstums einer Pflanze, durch
Schädigung
der Gewebe einer Pflanze, durch Schwächung des Immunsystems einer
Pflanze oder der Resistenz einer Pflanze gegenüber abiotischen Stressarten
und/oder durch Verursachung des vorzeitigen Todes der Pflanze usw.
Pflanzenpathogene und Pflanzenschädlinge umfassen Mikroben, wie
Pilze, Viren, Bakterien und Nematoden.
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Mit "Krankheitsresistenz" oder "Pathogenresistenz" ist gemeint, dass
die Pflanzen die Krankheitssymptome, die das Ergebnis von Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen
sind, vermeiden. D. h., dass Pathogene daran gehindert werden, Pflanzenkrankheiten
und die damit zusammenhängenden
Krankheitssymptome zu verursachen, oder alternativ, dass die durch
das Pathogen verursachten Krankheitssymptome minimiert oder verringert
werden. Die Verfahren der Erfindung können eingesetzt werden, um
Pflanzen vor Krankheiten zu schützen,
insbesondere vor jenen Krankheiten, die durch pilzliche Pflanzenpathogene
verursacht werden.
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Ein "antimikrobielles
Mittel", ein "pestizides Mittel", ein "abwehrendes Mittel" bzw. "Abwehrmittel" und/oder ein "fungizides Mittel" werden in ähnlicher
Weise wirken, um das eindringende Pathogen zu supprimieren, zu kontrollieren
und/oder abzutöten.
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Ein
abwehrendes Mittel wird abwehrende Aktivität besitzen. Mit "abwehrende Aktivität" ist eine antipathogene,
antimikrobielle oder antifungale Aktivität gemeint.
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Mit "antipathogene Zusammensetzungen" ist gemeint, dass
die Zusammensetzungen der Erfindung Aktivität gegen Pathogene besitzen,
einschließlich
Pilze, Mikroorganismen, Viren und Nematoden, und somit fähig sind,
den eindringenden pathogenen Organismus zu supprimieren, zu kontrollieren
und/oder abzutöten. Eine
antipathogene Zusammensetzung der Erfindung wird die Krankheitssymptome,
die aus der Provokation mit dem mikrobiellen Pathogen resultieren,
um wenigstens etwa 5% bis etwa 50%, wenigstens etwa 10% bis etwa
60%, wenigstens etwa 30% bis etwa 70%, wenigstens etwa 40% bis etwa
80% oder wenigstens etwa 50% bis etwa 90% oder mehr verringern.
Folglich können
die Verfahren der Erfindung eingesetzt werden, um Organismen, insbesondere
Pflanzen, vor einer Erkrankung, insbesondere jenen Erkrankungen,
die durch eindringende Pathogene verursacht werden, zu schützen.
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Assays,
die antipathogene Aktivität
messen, sind gewöhnlicherweise
auf dem Fachgebiet bekannt, wie auch Verfahren zum Quantifizieren
von Krankheitsresistenz in Pflanzen nach Pathogeninfektion. Siehe
z. B.
US-Patent Nr. 5 614 395 .
Derartige Techniken umfassen das Messen des mittleren Läsionsdurchmessers, der
Pathogenbiomasse und des insgesamten prozentualen Anteils zerstörter bzw.
verfaulter Pflanzengewebe über
die Zeit. Z. B. zeigt eine Pflanze, die entweder ein antipathogenes
Polypeptid exprimiert oder auf deren Oberfläche eine antipathogene Zusammensetzung
aufgebracht wurde, eine Abnahme der Gewebenekrose (d. h. Läsionsdurchmesser)
oder eine Abnahme des Pflanzentodes nach Pathogenprovokation, wenn
mit einer Kontrollpflanze, die der antipathogenen Zusammensetzung
nicht ausgesetzt worden war, verglichen wird. Alternativ kann eine
antipathogene Aktivität
durch eine Abnahme der Pathogenbiomasse gemessen werden. Z. B. wird
eine Pflanze, die ein antipathogenes Polypeptid exprimiert oder
die einer antipathogenen Zusammensetzung ausgesetzt wurde, mit einem
Pathogen von Interesse provoziert. Über die Zeit hinweg werden
Gewebeproben aus den Pathogen-inokulierten Geweben entnommen, und
RNA wird extrahiert. Der prozentuale Anteil eines spezifischen Pathogen-RNA-Iranskripts
relativ zum Level eines Pflanzen-spezifischen Transkripts erlaubt
die Bestimmung des Levels der Pathogenbiomasse. Siehe z. B. Thomma
et al. (1998) Plant Biology 95:15107–5111.
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In
vitro-Fungizid-Assays umfassen weiterhin z. B. die Aufgabe von variierenden
Konzentrationen der fungiziden Zusammensetzung auf Papierscheiben
und das Platzieren der Scheiben auf Agar, der eine Suspension des
Pathogens von Interesse enthält.
Nach Inkubation entwickeln sich klare Hemmhöfe ("inhibition zones") um die Scheiben, die eine wirksame
Konzentra tion des fungiziden Polypeptids enthalten (Liu et al. (1994) Plant
Biology 91:1888–1892).
Zusätzliche
Verfahren werden auf dem Fachgebiet verwendet, um die fungiziden Eigenschaften
einer Zusammensetzung in vitro zu messen (Hu et al. (1997) Plant
Mol. Biol. 34:949–959;
Cammue et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228–2233; und Thevissen et al.
(1996) J. Biol. Chem. 271:15018–15025).
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Pathogene
der Erfindung umfassen, ohne Beschränkung darauf, Viren oder Viroide,
Bakterien, Insekten, Nematoden, Pilze und dergleichen. Viren umfassen
jedes beliebige Pflanzenvirus, z. B. Tabak- oder Gurkenmosaikvirus,
Ringfleckenvirus, Nekrosevirus ("necrosis
virus"), Maisverzwergungsmosaikvirus
usw. Spezifische pilzliche und virale Pathogene für die Hauptnutzpflanzen
umfassen: Sojabohnen: Phytophthora megasperma f. sp. glycinea, Macrophomina
phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum,
Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum
var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora
sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum
truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta
sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p. v. glycinea,
Xanthomonas campestris p. v. phaseoli, Microsphaera diffusa, Fusarium
semitectum, Phialophora gregata, Sojabohnenmosaikvirus, Glomerella
glycines, Tabakringfleckenvirus, Tabakstrichelvirus, Phakopsora
pachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum,
Tomatenbronzefleckenvirus, Heterodera glycines, Fusarium solani;
(Öl-)Raps:
Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia
solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium
ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata;
Alfalfa: Clavibacter michiganensis subsp. insidiosum, Pythium ultimum,
Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium
aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum,
Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza
medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris
p. v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium
alfalfae; Weizen: Pseudomonas syringae p. v. atrofaciens, Urocystis
agropyri, Xanthomonas campestris p. v. translucens, Pseudomonas
syringae p. v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum,
Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago
tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum
graminicola, Erysiphe graminis f. sp. tritici, Puccinia graminis
f. sp. tritici, Puccinia recondita f. sp. tritici, Puccinia striiformis,
Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici,
Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoideus, Rhizoctonia
solani, Rhizoctonia ceralis, Gaeumannomyces graminis var. tritici,
Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris
sorokiniana, Gerstengelbverzwergungsvirus, Trespenmosaikvirus, Boden-übertragbares
bzw. bodenbürtiges
Weizenmosaikvirus, Weizenstrichelmosaikvirus, Weizenspindelstrichelvirus, "American Wheat Striate
Virus", Claviceps purpurea,
Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica,
Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomanes, Pythium gramicola, Pythium
aphanidermatum, „High-Plains-Virus”, "European wheat striate
Virus"; Sonnenblume:
Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows,
Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria
zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina,
Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus
stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahlia, Erwinia carotovorum
p. v. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea,
Albugo tragopogonis; Mais: Fusarium moniliforme var. subglutinans,
Erwinia stewartii, Fusarium verticilloides, Fusarium moniliforme,
Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydis (Diplodia
maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola,
Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus
flavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium
carbonum I, II & III
(Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium
pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella
maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia
polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora
oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis,
Curvularia pallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense,
Trichoderma viridae, Maisverzwergungsmosaikvirus A & B, Weizenstrichelmosaikvirus,
Chlorotisches Maisverzwergungsvirus, Claviceps sorghi, Pseudomonas
avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora, Corn stunt
spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora
sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis,
Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheca reiliana, Physopella zeae,
Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium, Chlorotisches
Maisscheckungsvirus, „High-Plains-Virus", Maismosaikvirus, "Maize Rayado Fino
Virus", Maisstrichelvirus, "Maize Stripe Virus", Maisrauverzwergungsvirus;
Sorghum: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella
graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta
sorghina, Pseudomonas syringae p. v. syringae, Xanthomonas campestris
p. v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina
phaseolina, Periconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria
alternata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia
lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans),
Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari,
Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelothea cruenta,
Sporisorium sorghi, Zuckerrohrmosaik(virus) H, Maisverzwergungsmosaikvirus
A & B, Claviceps
sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthora macrospora,
Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora
graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes,
Pythium graminicola; Reis: Magnaporthe grisea, Rhizoctonia solani,
etc.
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Es
ist gezeigt worden, dass die spezifischen abwehrenden Mittel der
Erfindung antipathogene Aktivität gegen
bestimmte Pathogene besitzen. Es wird anerkannt, dass sie Aktivität gegen
andere Pathogene, insbesondere andere pilzliche Pathogene, zeigen
können.
Einige können
sogar antipathogene Aktivität
mit breitem Spektrum aufweisen. Es wird anerkannt, dass, während antifungale
Polypeptide Aktivität
gegen einen bestimmten Schädling
zeigen können,
derartige abwehrende Mittel Aktivität gegenüber zahlreichen pilzlichen
Pathogenen sowie anderen Pflanzenschädlingen aufweisen können. Somit
kann eine Pflanze, die mit einem bestimmten abwehrenden Mittel der
Erfindung transformiert ist, Breitspektrum-Resistenz zeigen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden die abwehrenden Mittel aus der Hämolymphe
von Insektenlarven, induziert durch Injektion eines pflanzenpathogenen
Pilzes, isoliert. Die induzierten antimikrobiellen Peptide können gemäß ihrer
Aminosäuresequenzhomologie
mit bekannten Klassen von Proteinen in wenigstens vier Gruppen eingeordnet
werden. Diese vier Gruppen bestehen aus dem Attacin, dem Lebocin
und Serinprotease-Inhibitor-Klassen von Proteinen und einer Gruppe,
die keine wesentliche Homologie mit bekannten Proteinen zeigt. Die
abwehrenden Mittel verstärken
die Krankheitsresistenz gegen pilzliche Pathogene, Magnathorpa grisea
(M. grisea), Rhizoctonia solani (R. solani) und Fusarium verticilloides
(F. verticilloides).
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenzen
von Agrotis ipsilon (Ipsiloneule). Insbesondere sind Polypeptide,
die gegen Fusarium-Arten
wirksam sind, aus Agrotis ipsilon identifiziert worden. Die Fus6-Nukleotidsequenz
ist in SEQ ID NO:100 und 102 angegeben. Die Aminosäuresequenzen
des Fus6-Polypeptids ist/sind in SEQ ID NO:101 und 103 angegeben.
Die in SEQ ID NO:102 angegebene Nukleotidsequenz codiert für das reife
Fus6-Peptid, dessen Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO:103 angegeben ist.
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Fragmente
und Varianten der offenbarten Nukleotidsequenzen und der dadurch
codierten Polypeptide sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung
umfasst. Mit "Fragment" ist ein Teil der
Nukleotidsequenz oder ein Teil der Aminosäuresequenz gemeint. Fragmente
einer Nukleotidsequenz können
für Polypeptidfragmente codieren,
die die biologische Aktivität
des nativen Proteins beibehalten und folglich antimikrobielle und/oder fungizide
Aktivität
besitzen. Mit "antimikrobielle
Aktivität" oder "fungizide Aktivität" ist die Fähigkeit
zum Supprimieren, Kontrollieren und/oder Abtöten der eindringenden pathogenen
Mikrobe bzw. des eindringenden pathogenen Pilzes gemeint. Eine Zusammensetzung
der Erfindung, die antimikrobielle oder fungizide Aktivität besitzt,
wird die Krankheitssymptome, die aus einer Provokation mit einem
mikrobiellen oder pilzlichen Pathogen resultieren, um wenigstens
etwa 5% bis etwa 50%, wenigstens etwa 10% bis etwa 60%, wenigstens
etwa 30% bis etwa 70%, wenigstens etwa 40% bis etwa 80% oder wenigstens
etwa 50% bis etwa 90% oder mehr verringern. Fragmente einer Nukleotidsequenz,
die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, codieren alternativ
allgemein nicht für
Fragmentproteine, die eine biologische Aktivität beibehalten. Somit können Fragmente einer
Nukleotidsequenz von wenigstens etwa 20 Nukleotiden, etwa 50 Nukleotiden,
etwa 100 Nukleotiden und bis zur Volllängennukleotidsequenz, die für die Proteine
der Erfindung codiert, reichen.
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Alternativ
können
Fragmente einer Nukleotidsequenz der Erfindung für Polypeptidfragmente, die
antigen sind, codieren. Diese sind somit fähig, eine Immunreaktion hervorzurufen.
Ein "antigenes Polypeptid" ist hierin definiert
als ein Polypeptid, das zur Erzeugung eines Anti körpers fähig ist.
Antigene Polypeptidfragmente der offenbarten Aminosäuresequenzen
sind ebenso von der Erfindung umfasst.
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Ein
Nukleotidfragment von SEQ ID NO:100 oder 102, das für einen
biologisch aktiven oder antigenen Teil der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:101 oder 103 codiert, wird für wenigstens 5, 10, 15, 20,
25, 30, 35, 40, 45, 50 oder 55 zusammenhängende Aminosäuren oder
für bis
zur Gesamtzahl der Aminosäuren,
die in SEQ ID NO:101 oder 103 vorhanden sind, codieren.
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Ein
biologisch aktiver oder antigener Teil einer in SEQ ID NO:101 oder
103 angegebenen Polypeptidsequenz kann hergestellt werden durch
Isolieren eines Teils der Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO:100 oder
102 angegeben sind, Exprimieren des codierten Teils des Polypeptids
(z. B. mittels rekombinanter Expression in vitro) und Feststellen
der Aktivität
des codierten Teils des Polypeptids.
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Fragmente
einer Nukleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden verwendbar
sind, codieren alternativ allgemein nicht für Fragmentpolypeptide, die
eine biologische Aktivität
beibehalten. Somit können
Fragmente einer Nukleotidsequenz von wenigstens etwa 25 Nukleotiden,
etwa 30 Nukleotiden, etwa 50 Nukleotiden, etwa 100 Nukleotiden und
bis zur Volllängennukleotidsequenz,
die für
die Polypeptide der Erfindung codiert, reichen.
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Fragmente
der in SEQ ID NO:100 (Fus6) angegebenen Nukleotidsequenz von Nukleotid
1 bis 195 können
von wenigstens 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175,
180, 185, 190 oder 195 zusammenhängende
Nukleotide oder bis zur Gesamtzahl der Nukleotide (358), die in
SEQ ID NO:100 vorhanden sind, die für SEQ ID NO:101 codieren, reichen.
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Die
Erfindung umfasst isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäure- oder
Proteinzusammensetzungen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Nukleinsäuremolekül oder Protein
oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im Wesentlichen frei
von anderem zellulären
Material oder Kulturmedium, wenn mittels rekombinanter Techniken
produziert, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder
anderen Chemikalien, wenn chemisch synthetisiert. Vorzugsweise ist
eine "isolierte" Nukleinsäure frei
von Sequenzen (vorzugsweise Proteincodierenden Sequenzen), die die
Nukleinsäure
natürlicherweise
in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt
bzw. abgeleitet wird, flankieren (d. h., Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert
sind). In verschiedenen Ausführungsformen
kann das isolierte Nukleinsäuremolekül z. B.
weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb,
an Nukleotidsequenzen enthalten, die das Nukleinsäuremolekül in der
genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise
flankieren.
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Ein
Protein, das im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist, umfasst Proteinpräparationen,
die weniger als etwa 30%, 20%, 10%, 5% (bezogen auf das Trockengewicht)
an kontaminierendem Protein aufweisen. Wenn das Protein der Erfindung
oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant produziert wird, stellt
das Kulturmedium vorzugsweise weniger als et wa 30%, 20%, 10% oder
5% (bezogen auf das Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder
Chemikalien, die nicht das Protein von Interesse sind, dar.
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Mit "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche
Sequenzen gemeint. Bei Nukleotidsequenzen umfassen konservative
Varianten jene Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen
Codes für
die Aminosäuresequenz
von einem der Polypeptide der Erfindung codieren. Natürlich vorkommende
allelische Varianten wie diese können
durch Verwendung von gut bekannten Molekularbiologietechniken, wie
z. B. mit Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken,
wie unten dargelegt identifiziert werden. Variante Nukleotidsequenzen
umfassen auch synthetisch abgeleitete Nukleotidsequenzen, wie z.
B. jene, die unter Verwendung von ortsgerichteter bzw. ortsspezifischer
Mutagenese erzeugt werden, die jedoch noch für ein Polypeptid der Erfindung
codieren. Im Allgemeinen werden Varianten einer bestimmten Nukleotidsequenz
der Erfindung wenigstens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der bestimmten Nukleotidsequenz
aufweisen, wie mittels Sequenzalignmentprogrammen, die hierin an
anderer Stelle beschrieben sind, unter Verwendung von Default-Parametern
bzw. Standardeinstellungen bestimmt wird.
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Mit "variantes" Polypeptid ist ein
Polypeptid gemeint, das aus dem nativen Polypeptid durch Deletion (sogenannte
Trunkierung) oder Hinzufügung
bzw. Addition von einer oder mehreren Aminosäuren zum N-terminalen und/oder
C-terminalen Ende des nativen Polypeptids; Deletion oder Hinzufügung von
einer oder mehreren Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen im nativen Polypeptid oder Substitution
von einer oder mehreren Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen im nativen Polypeptid abgeleitet
ist. Variante Polypeptide, die von der vorliegenden Erfindung umfasst
sind, sind biologisch aktiv, d. h., dass sie weiterhin die gewünschte biologische
Aktivität
des nativen Polypeptids besitzen. Sie werden folglich weiterhin
antimikrobielle und/oder fungizide Aktivität besitzen. Derartige Varianten
können
z. B. aus einem genetischen Polymorphismus oder aus Manipulation
durch den Menschen resultieren.
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Biologisch
aktive Varianten eines nativen Polypeptids der Erfindung werden
wenigstens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder
mehr Sequenzidentität
mit der Aminosäuresequenz
für das native
Polypeptid aufweisen, wie mittels Sequenzalignmentprogrammen, die
hierin an anderer Stelle beschrieben sind, unter Verwendung von
Default-Parametern bestimmt. Eine biologisch aktive Variante eines
Polypeptids der Erfindung kann sich von dem Polypeptid durch nur
1–15 Aminosäurereste,
nur 1–10,
wie 6–10,
nur 5, nur 4, 3, 2 oder sogar einen Aminosäurerest(e), unterscheiden.
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Die
biologische Aktivität
der Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann mittels eines beliebigen
Verfahrens, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, festgestellt werden
(siehe z. B.
US-Patent Nr. 5 614
395 ; Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107–15111;
Liu et al. (1994) Plant Biology 91:1888–1892; Hu et al. (1997) Plant
Mol. Biol. 34:949–959;
Cammue et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228–2233; und Thevissen et al.
(1996) J. Biol. Chem. 271:15018–15025).
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Die
Polypeptide der Erfindung können
auf zahlreiche Weisen, einschließlich Aminosäure-Substitutionen,
-Deletionen, -Trunkierungen und -Insertionen, verändert werden.
Verfahren für
derartige Manipulationen sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
Beispielsweise können
Aminosäuresequenzvarianten
der Polypeptide der Erfindung hergestellt werden durch Mutationen
in der DNA. Verfahren für
Mutagenese und Nukleotidsequenzänderungen
sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Kunkel (1985) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82:488–492;
Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367–382;
US-Patent Nr. 4 873 192 ; Walker und
Gaastra, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan
Publishing Company, New York) und die darin zitierten Verweise.
Leitlinien hinsichtlich zweckdienlicher Aminosäure-Substitutionen, die die biologische
Aktivität
des Polypeptids von Interesse nicht beeinträchtigen, können im Modell von Dayhoff
et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed.
Res. Found., Washington, D. C.) gefunden werden. Konservative Substitutionen,
wie der Austausch einer Aminosäure
durch eine andere mit ähnlichen
Eigenschaften, können
bevorzugt sein.
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Somit
umfassen die Gene und Nukleotidsequenzen der Erfindung sowohl natürlich vorkommende
Sequenzen als auch mutante Formen. Gleichermaßen umfassen die Polypeptide
der Erfindung sowohl natürlich vorkommende
Polypeptide als auch Variationen und modifizierte Formen davon.
Derartige Varianten werden die gewünschte antimikrobielle oder
in einigen Fällen
fungizide Aktivität
weiterhin besitzen. Es ist offensichtlich, dass die Mutationen,
die in der DNA, die für
die Variante codiert, durchgeführt
werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster verschieben dürfen, und
sie werden vorzugsweise keine komplementären Regionen, die eine mRNA-Sekundärstruktur
erzeugen könnten,
schaffen. Siehe
EP-Patentanmeldung
Veröffentlichungs-Nr.
75 444 .
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Es
wird erwartet, dass Deletionen, Insertionen und Substitutionen der
Polypeptidsequenzen, die hierin umfasst sind, keine radikalen Änderungen
hinsichtlich der Eigenschaften des Polypeptids erzeugen. Wenn es jedoch
schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder
Insertion vor der Durchführung
vorherzusagen, wird ein Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass
die Wirkung mittels Routine-Screeningassays auf antimikrobielle
und/oder fungizide Aktivität,
wie supra im Verweis angegeben, bewertet wird.
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Variante
Nukleotidsequenzen und Polypeptide umfassen auch Sequenzen und Polypeptide,
die aus einer mutagenen und rekombinogenen Verfahrensweise, wie
DNA-Shuffling, stammen. Mit einer derartigen Verfahrensweise können eine
oder mehrere unterschiedliche codierende Sequenzen in den Nukleinsäuremolekülen, die
in SEQ ID NO:100 oder 102 beschrieben sind, manipuliert werden,
um ein neues Polypeptid, das die gewünschten Eigenschaften besitzt,
zu schaffen. Auf diese Weise werden Bibliotheken von rekombinanten Polynukleotiden
aus einer Population von Polynukleotiden mit verwandter Sequenz,
umfassend Sequenzregionen, die wesentliche Sequenzidentität besitzen
und homolog in vitro oder in vivo rekombiniert werden können, erzeugt.
Unter Verwendung dieser Herangehensweise können z. B. Sequenzmotive, die
für eine
Domäne von
Interesse codieren, zwischen den Nukleinsäuremolekülen der Erfindung und anderen
bekannten antimikrobiellen codierenden Nukleotidsequenzen transportiert
bzw. verschoben werden ("shuffled"), um eine neue Nukleotidsequenz
zu erhalten, die für
ein Polypeptid mit einer verbesserten Eigenschaft von Interesse,
wie gesteigerten antimikrobiellen und/oder fungiziden Eigenschaften
bei geringeren Polypeptidkonzentrationen oder Spezifität für bestimmte
Pflanzenpathogene, zu erhalten. Beispielsweise: Spezifität für ein bestimmtes
pilzliches Pflanzenpathogen, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf,
Pathogene, wie M. grisea und F. verticilloides. Strategien für ein derartiges
DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Stemmer (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747–10751; Stemmer (1994) Nature
370:389–391;
Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436–438; Moore et al. (1997) J.
Mol. Biol. 272:336–347;
Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504–4509; Crameri
et al. (1998) Nature 391:288–291;
und
US-Patente Nm. 5 605 793 und
5 837 458 .
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Die
Nukleotidsequenzen der Erfindung können verwendet werden, um korrespondierende
Sequenzen aus anderen Organismen, insbesondere anderen Insekten,
zu isolieren. Auf diese Weise können
Verfahren, wie PCR, Hybridisierung und dergleichen, verwendet werden,
um derartige Sequenzen auf der Basis ihrer Sequenzhomologie mit
den hierin angegebenen Sequenzen zu identifizieren. Sequenzen, isoliert
auf der Basis ihrer Sequenzidentität mit den Volllängennukleotidsequenzen,
die hierin angegeben sind, oder mit Fragmenten davon, sind von der
vorliegenden Erfindung umfasst. Derartige Sequenzen umfassen Sequenzen,
die Orthologe der offenbarten Sequenzen sind. Mit "Orthologe" sind Gene gemeint,
die von einem gemeinsamen ancestralen Gen bzw. Stammgen abstammen
und die als Ergebnis der Artenbildung in verschiedenen Arten gefunden
werden. Gene, die in verschiedenen Arten gefunden werden, werden
als Orthologe angesehen, wenn ihre Nukleotidsequenzen und/oder ihre
codierten Polypeptidsequenzen eine wesentliche Identität, wie sie
hier an anderer Stelle definiert ist, aufweisen. Funktionen von
Orthologen sind zwischen Arten oft in hohem Maße konserviert. Somit sind
isolierte Sequenzen, die für
ein antimikrobielles Protein codieren und die unter stringenten Bedingungen
mit den hierin offenbarten Nukleotidsequenzen oder mit Fragmenten
davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
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Bei
einer PCR-Herangehensweise können
Oligonukleotid-Primer für
eine Verwendung in PCR-Reaktionen zum Amplifizieren korrespondierender
DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA, extrahiert aus einem
beliebigen Insekt von Interesse, konzipiert bzw. entworfen werden.
Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und zur PCR-Klonierung sind
allgemein im Fachgebiet bekannt und sind offenbart in Sambrook et
al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Siehe auch
Innis et al., Hrsg., (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications (Academic Press, New York); Innis und Gelfand, Hrsg.,
(1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und
Gelfand, Hrsg., (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).
Bekannte Verfahren der PCR umfassen, ohne Beschränkung darauf, Verfah ren unter
Verwendung von gepaarten Primern, geschachtelten bzw. gensteten
Primern, einzelnen spezifischen Primern, degenerierten Primern,
Gen-spezifischen Primern, Vektor-spezifischen Primern, partiell
fehlgepaarten Primern und dergleichen.
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Bei
Hybridisierungstechniken wird eine gesamte oder ein Teil einer bekannte(n)
Nukleotidsequenz als eine Sonde verwendet, die selektiv mit anderen
korrespondierenden Nukleotidsequenzen, die in einer Population von
klonierten genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d. h., genomische oder cDNA-Bibliotheken)
aus einem gewählten
Organismus vorhanden sind, hybridisiert. Die Hybridisierungssonden können genomische
DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Oligonukleotide
sein und können
mit einer detektierbaren Gruppe, wie 32P,
oder einem beliebigen anderen detektierbaren Marker markiert sein.
Somit können
Sonden zur Hybridisierung z. B. durch Markierung von synthetischen
Oligonukleotiden, die auf den Krankheitsresistenzsequenzen der Erfindung
basieren, hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Sonden
für die
Hybridisierung und zur Konstruktion von cDNA- und genomischen Bibliotheken sind
auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
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Beispielsweise
kann eine gesamte Nukleotidsequenz, die hierin offenbart ist, oder
ein oder mehrere Teil(e) davon als eine Sonde verwendet werden,
die dazu fähig
ist, spezifisch mit korrespondierenden Nukleotidsequenzen und Boten-RNAs
zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer
Vielfalt von Bedingungen zu erreichen, umfassen derartige Sonden
Sequenzen, die innerhalb der Nukleotidsequenzen der Erfindung einzigartig
sind, und sind vorzugsweise wenigstens etwa 10 Nukleotide lang und,
am stärksten
bevorzugt, wenigstens etwa 20 Nukleotide lang. Derartige Sonden
können
verwendet werden, um korrespondierende Sequenzen aus einem gewählten Organismus
mittels PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann zum Isolieren zusätzlicher
codierender Sequenzen aus einem gewählten Organismus oder als ein
diagnostischer Assay zum Feststellen des Vorhandenseins von codierenden
Sequenzen in einem Organismus verwendet werden. Hybridisierungstechniken
umfassen Hybridisierungsscreening von ausplattierten DNA-Bibliotheken (entweder
Plaques oder Kolonien; siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Plainview, New York).
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Die
Hybridisierung von derartigen Sequenzen kann unter hochstringenten
Bedingungen durchgeführt werden.
-
Somit
sind isolierte Sequenzen, die für
ein antimikrobielles Polypeptid codieren und die unter hochstringenten
Bedingungen mit einer hierin offenbarten Sequenz oder Fragmenten
davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
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Hierin
umfassen Bedingungen hoher Stringenz eine Hybridisierung in 50%
Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C
und einen Waschschritt in 0,1X SSC bei 60 bis 65°C. Die Dauer der Hybridisierung
beträgt
im Allgemeinen weniger als etwa 24 Stunden, üblicherweise etwa 4 bis etwa
12 Stunden.
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Die
Spezifität
ist typischerweise die Funktion von Waschschritten nach der Hybridisierung,
wobei die Ionenstärke
und die Temperatur der letzten Waschlösung die kritischen Faktoren
sind. Für
DNA-DNA-Hybride kann die Tm aus der Gleichung
von Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267–284: Tm = 81,5°C
+ 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61
(% Form) – 500/L;
wobei M die Molarität
monovalenter Kationen ist; %GC der prozentuale Anteil an Guanosin-
und Cytosin-Nukleotiden in der DNA ist, % Form der prozentuale Anteil an
Formamid in der Hybridisierungslösung
ist und L die Länge
des Hybrids in Basenpaaren ist. Die Tm ist
die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei
der 50% einer komplementären
Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden
Sonde hybridisieren. Die Tm wird für jedes
1% Fehlpaarung um etwa 1°C verringert.
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Eine
ausführliche
Anweisung hinsichtlich der Hybridisierung von Nukleinsäuren ist
zu finden in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology – Hybridization
with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York);
und Ausubel et al., Hrsg., (1995) Current Protocols in Molecular
Biology, Kapitel 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New
York). Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
New York).
-
Die
folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen bzw.
-verwandtschaften zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren oder
Polypeptiden zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentsatz der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".
- (a)
Wie hierin verwendet, ist eine "Referenzsequenz" eine definierte
Sequenz, die als eine Basis für
den Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann eine
Teilmenge oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein;
beispielsweise ein Abschnitt einer Volllängen-cDNA- oder -Gensequenz
oder die vollständige
cDNA- oder Gensequenz.
- (b) Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "Vergleichsfenster" auf einen zusammenhängenden und spezifizierten
Abschnitt einer Polynukleotidsequenz, wobei die Polynukleotidsequenz
im Vergleichsfenster Hinzufügungen
oder Deletionen (d. h. Lücken)
im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Hinzufügungen bzw. Additionen
oder Deletionen umfasst) für
ein optimales Alignment bzw. eine optimale vergleichende Anordnung
der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster
wenigstens 20 zusammenhängende
Nukleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 (Nukleotide)
oder länger
sein. Fachleute auf dem Gebiet verstehen, dass zum Vermeiden einer
hohen Ähnlichkeit
mit einer Referenzsequenz aufgrund des Einschlusses von Lücken in
die Polynukleotidsequenz typischerweise eine "gap penalty" bzw. ein Lückenstrafmaß eingeführt und von der Zahl der Übereinstimmungen
abgezogen wird.
-
Verfahren
des Alignments von Sequenzen für
den Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Somit kann die
Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei beliebigen
Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus bewerkstelligt
werden. Nichteinschränkende
Beispiele für
derartige mathematische Algorithmen sind der Algorithmus von Myers
und Miller (1988) CABIOS 4:11–17;
der lokale Homologie-Algorithmus von Smith et al. (1981) Adv. Appl.
Math. 2:482; der Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und
Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453; das Verfahren der Suche
nach Ähnlichkeit
von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444–2448; der
Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:2264, wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:5873–5877 modifiziert.
-
Computerimplementierungen
dieser mathematischen Algorithmen können für den Vergleich von Sequenzen
zum Bestimmen einer Sequenzidentität eingesetzt werden. Derartige
Implementierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich
von Intelligenetics, Mountain View, Californien); das ALIGN-Programm
(Version 2.0); das ALIGN PLUS-Programm (Version 3.0, Urheberrecht
1997) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics
Software Package, Version 8 (erhältlich
von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
USA). Alignments unter Verwendung dieser Programme können unter
Verwendung der Default-Parameter
durchgeführt werden.
Das CLUSTAL-Programm ist gut beschrieben von Higgins et al. (1988)
Gene 73:237–244
(1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151–153; Corpet et al. (1988)
Nucleic Acids Res. 16:10881–90;
Huang et al. (1992) CABIOS 8:155–65; und Pearson et al. (1994)
Meth. Mol. Biol. 24:307–331.
Die ALIGN- und ALIGN PLUS-Programme basieren auf dem Algorithmus
von Myers und Miller (1988) supra. Eine PAM120-Reste-Gewichtungstabelle
(„PAM120
weight residue table"),
eine "gap length
penalty" von 12
und eine "gap penalty” von 4
können
beim ALIGN-Programm verwendet werden, wenn Aminosäuresequenzen
verglichen werden.
-
Die
BLAST-Programme von Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403,
basieren auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) supra.
Die BLAST-Familie von Programmen, die für Datenbank-gestützte Ähnlichkeitsrecherchen
("database similarity
searches") verwendet
werden kann, umfasst: BLASTN für
Nukleotidsequenzabfragen gegen Nukleotidsequenz-Datenbanken; BLASTP für Peptidsequenzabfragen
gegen eine Peptid-Datenbank; BLASTX für Nukleotidsequenzabfragen
gegen Protein-Datenbanksequenzen; TBLASTN für Proteinsequenzabfragen gegen
Nukleotidsequenz-Datenbanken und TBLASTX für Nukleotidsequenzabfragen
gegen Nukleotid-Datenbanken mit der Translation aller Nukleotidsequenzen
zu Protein. BLAST-Nukleotidrecherchen können mit dem BLASTN-Programm,
score = 100, wordlength = 12, durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen
zu erhalten, die mit einer Nukleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid
der Erfindung, homolog sind. BLAST-Proteinrecherchen können mit
dem BLASTX-Programm, score = 50, wordlength = 3, durchgeführt werden,
um Aminosäu resequenzen
zu erhalten, die zu einem Protein oder Polypeptid der Erfindung
homolog sind. Um lückige
bzw. "gapped" Alignments für Vergleichszwecke
zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden,
wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389, beschrieben.
Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine
iterierte bzw. wiederholte Recherche durchzuführen, die entfernte Beziehungen
zwischen Molekülen
detektiert. Siehe Altschul et al. (1997) supra. Bei Verwendung von
BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST können
die Default-Parameter der jeweiligen Programme (z. B. BLASTN für Nukleotidsequenzen,
BLASTX für
Proteine) verwendet werden. Siehe www.ncbi.hlm.nih.gov. Ein Alignment
kann auch manuell mittels Prüfung
durchgeführt
werden.
-
Sofern
nicht anders angegeben, beziehen sich Sequenzidentitäts-/Ähnlichkeitswerte,
die hierin angegeben werden, auf den Wert, der unter Verwendung
von GAP, Version 10, erhalten wird, wenn die folgenden Parameter
verwendet werden: % Identität
unter Verwendung von "Gap
Weight" von 50 und "Length Weight" von 3; % Ähnlichkeit
unter Verwendung von "Gap
Weight" von 12 und "Length Weight" von 4; oder mit
einem gleichwertigen Programm. Mit "gleichwertiges Programm" ist jedes Sequenzvergleichsprogramm
gemeint, das für
zwei beliebige fragliche Sequenzen ein Alignment mit identischen
Nukleotid- oder Aminosäurerestübereinstimmungen
und einer identischen prozentualen Sequenzidentität bei Vergleich
mit dem korrespondierenden Alignment, das durch das bevorzugte Programm
erzeugt wird, erzeugt.
-
GAP
verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol.
Biol. 48:443–453,
um das Alignment bzw. die vergleichende Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen
festzustellen, das/die die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert
und die Anzahl an Lücken
minimiert. GAP berücksichtig
alle möglichen Alignments
und Lückenpositionen
und erzeugt das Alignment mit der größten Zahl an übereinstimmenden
Basen und den wenigsten Lücken.
Es ermöglicht
das Vorsehen einer "gap
creation penalty" und
einer "gap extension
penalty" in Einheiten übereinstimmender
Basen. GAP muss für
jede Lücke,
die es einfügt,
einen Gewinn aus der "gap
creation penalty"-Zahl
von Übereinstimmungen
ziehen. Falls eine "gap
extension penalty" größer als
null gewählt
wird, muss GAP zusätzlich
für jede
eingefügte
Lücke einen
Gewinn aus der Länge
der Lücke
mal der "gap extension
penalty" ziehen.
Default- bzw. Standard-"gap
creation penalty"-Werte
und -"gap extension
penalty"-Werte in
Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package für Proteinsequenzen
sind 8 bzw. 2. Für
Nukleotidsequenzen ist die Default-"gap creation penalty" 50, während die Default-"gap extension penalty" 3 ist. Die "gap creation" und "gap extension penalties" können als
eine ganze Zahl, ausgewählt
aus der Gruppe ganzer Zahlen, bestehend aus (dem Bereich) von 0
bis 200, ausgedrückt
werden. Somit können die "gap creation" und "gap extension penalties" 0, 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder
größer sein.
-
GAP
stellt ein Mitglied der Familie bester Alignments dar. Es kann viele
Mitglieder dieser Familie geben, jedoch hat kein Mitglied eine bessere
Qualität.
GAP gibt vier Leistungszahlen für
Alignments an: Qualität ("quality"), Verhältnis ("ratio"), Identität und Ähnlichkeit.
Die Qualität
ist das Maß,
das zum vergleichenden Anordnen der Sequenzen maximiert wird. Das
Verhältnis
ist die Qualität
geteilt durch die Zahl der Basen im kürzeren Abschnitt. Die prozentuale
Identität
ist der Prozentsatz der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Die prozentuale Ähnlichkeit
ist der Prozentsatz der Symbole, die ähnliche sind. Symbole, die
Lücken
gegenüberstehen,
werden ignoriert. Eine Ähnlichkeit
wird gewertet, wenn der Bewertungsmatrixwert bzw. Ähnlichkeitsmatrixwert
bzw. "scoring matrix
value" für ein Paar
von Symbolen größer als
oder gleich 0,50, die Ähnlichkeitsschwelle,
ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package verwendete
Bewertungsmatrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
-
Für Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird ein Vergleich von Nukleotid- oder
Polypeptidsequenzen zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität zu bzw.
mit den hierin offenbarten Nukleotid- oder Polypeptidsequenzen vorzugsweise
unter Verwendung des ClustalW-Programms
(Version 1.7 oder höher)
mit dessen Default-Parametern oder mit einem beliebigen gleichwertigen
Programm durchgeführt.
Mit "gleichwertiges Programm" ist jedes Sequenzvergleichsprogramm
gemeint, das für
zwei beliebige fragliche Sequenzen ein Alignment mit identischen
Nukleotid- oder Aminosäurerestübereinstimmungen
und einer identischen prozentualen Sequenzidentität bei Vergleich
mit dem korrespondierenden Alignment, das durch das bevorzugte Programm
erzeugt wird, erzeugt.
- (c) Wie hierin verwendet,
bezieht sich "Sequenzidentität" oder "Identität" im Kontext von zwei
Nukleinsäure- oder
Polypeptidsequenzen auf die Reste in den zwei Sequenzen, die gleich
sind, wenn hinsichtlich einer maximalen Entsprechung über ein
spezifiziertes Vergleichsfenster vergleichend angeordnet wird. Wenn
ein Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug auf Proteine verwendet
wird, wird anerkannt, dass sich Restpositionen, die nicht identisch
sind, oft durch konservative Aminosäure-Substitutionen unterscheiden,
wobei Aminosäurereste
durch andere Aminosäurereste
mit ähnlichen
chemischen Eigenschaften (z. B. Ladung oder Hydrophobizität) ersetzt
sind und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wenn
sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann
die prozentuale Sequenzidentität
nach oben angepasst werden, um die konservative Natur der Substitution
korrigierend zu berücksichtigen.
Sequenzen, die sich durch derartige konservative Substitutionen
unterscheiden, werden als "Sequenzähnlichkeit" oder "Ähnlichkeit" besitzend bezeichnet. Mittel zur Durchführung dieser
Anpassung sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Typischerweise
umfasst dies die Bewertung einer konservativen Substitution als
eine teilweise statt einer völligen
Fehlpaarung, wodurch die prozentuale Sequenzidentität erhöht wird.
Wenn beispielsweise eine identische Aminosäure eine Bewertung von 1 erhält und eine nicht-konservative
Substitution eine Bewertung von 0 erhält, erhält somit eine konservative
Substitution einen Wert zwischen 0 und 1. Die Bewertung von konservativen
Substitutionen wird berechnet, wie es z. B. im Programm PC/GENE
(Intelligenetics, Mountain View, Californien) implementiert ist.
- (d) Wie hierin verwendet, bedeutet "Prozentsatz der Sequenzidentität" den Wert, der durch
Vergleichen von zwei optimal vergleichend angeordneten Sequenzen über ein
Vergleichsfenster hinweg bestimmt wird, wobei der Anteil der Polynukleotidsequenz
im Vergleichsfenster Hinzufügungen
bzw. Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken), verglichen mit der Referenzsequenz
(die keine Hinzufügungen
oder Deletionen umfasst), für
ein optimales Alignment der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz
bzw. prozentuale Anteil wird berechnet durch Bestimmen der Zahl
von Positionen, an denen die identische Nukleinsäurebase oder der identische
Aminosäurerest
in beiden Sequenzen auftritt, um die Zahl übereinstimmender Positionen
zu erhalten, Teilen der Zahl übereinstimmender
Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Fenster des Vergleichs
und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz der
Sequenzidentität
zu erhalten.
- (e)(i) Der Begriff "wesentliche
Identität" von Polynukleotidsequenzen
bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens
90%, 95% oder mehr Sequenzidentität aufweist, verglichen mit
einer Referenzsequenz unter Verwendung von einem der beschriebenen
Alignmentprogramme und unter Verwendung von Standardparametern.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass diese Werte in zweckdienlicher
Weise angepasst werden können,
um eine entsprechende Identität
von Polypeptiden, die durch zwei Nukleotidsequenzen codiert werden,
zu bestimmen, indem Kodondegeneriertheit, Aminosäureähnlichkeit, Leserasterpositionierung
und dergleichen berücksichtigt
werden. Wesentliche Identität
von Aminsäuresequenzen
für diese
Zwecke bedeutet normalerweise eine Sequenzidentität von wenigstens 90%
oder 95%.
-
Ein
weiteres Anzeichen dafür,
dass Nukleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es,
wenn zwei Moleküle
miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Allgemein
werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische
Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH
sind. Jedoch umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich
von etwa 1°C
bis etwa 20°C,
abhängig
vom gewünschten
Grad der Stringenz, wie hierin an anderer Stelle ausgewiesen. Nukleinsäuren, die
miteinander nicht unter stringenten Bedingungen hybridisieren, sind
noch im Wesentlichen identisch, falls die Polypeptide, für die sie
codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann z. B. auftreten,
wenn eine Kopie einer Nukleinsäure
unter Verwendung der maximalen Kodondegeneriertheit, die vom genetischen
Code zugelassen wird, erzeugt wird. Ein Anzeichen dafür, dass
zwei Nukleinsäuresequenzen
im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn das durch die erste
Nukleinsäure
codierte Polypeptid immunologisch kreuzreagiert mit dem durch die
zweite Nukleinsäure
codierten Polypeptid.
- (e)(ii) Der Begriff "wesentliche Identität" deutet im Kontext
eines Peptids darauf hin, dass ein Peptid eine Sequenz mit wenigstens
90% oder 95% Sequenzidentität
zur Referenzsequenz über
ein spezifiziertes Vergleichsfenster hinweg umfasst. Vorzugsweise
wird ein optimales Alignment unter Verwendung des Homologie-Alignment-Algorithmus
von Needleman und Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443–453, durchgeführt. Ein
Anzeichen dafür,
dass zwei Peptid sequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es,
wenn ein Peptid immunologisch reaktiv ist mit Antikörpern, die
gegen das zweite Peptid erzeugt wurden. Somit ist ein Peptid im
Wesentlichen identisch mit einem zweiten Peptid, wenn sich die zwei
Peptide z. B. nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
Peptide, die "im
Wesentlichen ähnlich" sind, haben Sequenzen,
wie sie oben bezeichnet sind, gemeinsam, abgesehen davon, dass sich
Restpositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäureänderungen
unterscheiden können.
-
Die
Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung können
in einer Wirtszelle, wie Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Insekten-, Säuger- oder
Pflanzenzellen, exprimiert werden. Es wird erwartet, dass Fachleute
auf dem Gebiet über
die zahlreichen Expressionssysteme, die zur Expression einer Nukleinsäure, die
für ein
Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verfügbar sind,
gut unterrichtet sind. Es wird kein Versuch unternommen werden,
die verschiedenen Verfahren, die für die Expression von Polypeptiden
in Prokaryonten oder Eukaryonten bekannt sind, im Detail zu beschreiben.
-
Wie
hierin verwendet, bedeutet "heterolog" in Bezug auf eine
Nukleinsäure
eine Nukleinsäure,
die aus einer fremden Art stammt oder, falls sie aus der gleichen
Art stammt, wesentlich von ihrer nativen Form in Zusammensetzung
und/oder genomischem Locus durch absichtlichen menschlichen Eingriff
modifiziert ist. Ein Promotor, der mit einem heterologen Strukturgen
funktionell verknüpft
ist, ist z. B. aus einer Art, die von der, aus der das Strukturgen
stammte, verschieden ist, oder ein Element oder beide sind wesentlich
von ihrer ursprünglichen
Form modifiziert, falls sie aus der gleichen Art sind. Ein heterologes
Protein kann aus einer fremden Art stammen oder ist, falls es aus
der gleichen Art stammt, wesentlich von seiner ursprünglichen
Form durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert.
-
Mit "Wirtszelle" ist eine Zelle gemeint,
die eine heterologe Nukleinsäuresequenz
der Erfindung umfasst. Wirtszellen können prokaryotische Zellen,
wie E. coli, oder eukaryotische Zellen, wie Hefe-, Insekten-, Amphibien-
oder Säugerzellen,
sein. Vorzugsweise sind Wirtszellen einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanzen-Zellen,
insbesondere Reis- und Maispflanzenzellen.
-
Die
Krankheitsresistenz-verleihenden Sequenzen der Erfindung werden
in Expressionskassetten oder DNA-Konstrukten zur Expression in der
Pflanze von Interesse bereitgestellt. Die Kassette wird 5'- und 3'-Regulatorsequenzen
in funktioneller Verknüpfung
mit einer Nukleotidsequenz der Erfindung umfassen. Mit "in funktioneller
Verknüpfung" ist eine funktionelle
Verknüpfung
zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei
die Promotorsequenz die Transkription der Nukleotidsequenz, die
der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Allgemein
bedeutet funktionell verknüpft,
dass die miteinander verknüpften Nukleinsäuresequenzen
zusammenhängend
und, wo zum Verbinden von zwei Protein-codierenden Regionen nötig, zusammenhängend und
im gleichen Leseraster sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens
ein zusätzliches
Gen, mit dem der Organismus zu cotransformieren ist, enthalten.
-
Alternativ
kann das/die zusätzliche(n)
Gen(e) auf mehreren Expressionskassetten bereitgestellt werden.
-
Eine
derartige Expressionskassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsschnittstellen
zur Insertion der Krankheitsresistenzsequenz, so dass sie unter
der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen steht,
ausgestattet. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene
enthalten.
-
Die
Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung
der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion,
eine Signalpeptidsequenz, eine Krankheitsresistenz-DNA-Sequenz der Erfindung
und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, funktionell
in Pflanzen, umfassen. Die Transkriptionsinitiationsregion, der
Promotor, kann nativ oder analog oder fremd oder heterolog zum Pflanzenwirt
sein. Zusätzlich
kann der Promotor die natürliche
Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass
die Transkriptionsinitiationsregion nicht in der nativen Pflanze
gefunden wird, in die die Transkriptionsinitiationsregion eingeführt wird.
Wie hierin verwendet, umfasst ein chimäres Gen eine codierende Sequenz
in funktioneller Verknüpfung
mit einer Transkriptionsinitiationsregion, die zur codierenden Sequenz heterolog
ist.
-
Während es
bevorzugt sein kann, die Sequenzen unter Verwendung heterologer
Promotoren zu exprimieren, können
die nativen Promotorsequenzen verwendet werden. Derartige Konstrukte
würden
Expressionslevel der/des Krankheitsresistenz-RNA/Proteins in der
Pflanze oder Pflanzenzelle variieren. Somit wird der Phänotyp der
Pflanze oder Pflanzenzelle verändert.
-
Die
Terminationsregion kann bezüglich
der Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der
funktionell verknüpften
DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder sie kann aus einer anderen
Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind aus dem
Ti-Plasmid von A.
tumefaciens erhältlich,
wie die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau
et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot (1991) Cell
64:671–674;
Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant
Cell 2:1261–1272;
Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17:7891–7903;
und Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627–9639.
-
Wenn
es zweckdienlich ist, können
die Nukleotidsequenzen für
eine erhöhte
Expression im transformierten Wirt optimiert werden. D. h., dass
die Nukleotidsequenzen unter Verwendung von Pflanzen-bevorzugten
Kodons für
eine verbesserte Expression in Pflanzen synthetisiert werden können. Auf
dem Fachgebiet sind Verfahren zum Synthetisieren Pflanzen-bevorzugter
Nukleotidsequenzen oder Gene verfügbar. Siehe z. B. die
US-Patente Nrn. 5 380 831 und
5 436 391 und Murray et
al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498.
-
Weitere
Sequenzmodifikationen sind dafür
bekannt, eine Genexpression in einem zellulären Wirt zu verstärken. Diese
umfassen die Elimination von Sequenzen, codierend für störende bzw.
unechte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale,
Transposon-ähnliche
Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen,
die auf die Genexpression schädlichen
Einfluss nehmen können.
Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level angepasst werden, die
für einen
gegebenen zellulären
Wirt durchschnittlich sind, wie sie unter Bezugnahme auf bekannte
Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet werden.
Wenn möglich,
wird die Sequenz so modifiziert, dass vorhergesagte Haarnadel-Sekundärstrukturen
der mRNA vermieden werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
ist es wünschenswert,
das reife Peptid oder die Nukleotidsequenz, die für das reife
Peptid codiert, zu verwenden. Innerhalb der Zelle treten häufig proteolytische
Modifikationen von Aminosäuresequenzen
auf. Das proteolytische Ereignis entfernt Aminosäuren aus dem Vorläuferpeptid,
wodurch ein reifes Peptid erhalten wird. Die proteolytische Prozessierung
kann in hohem Maße
Sequenz-spezifisch sein. Oft sind die Vorläuferpeptide inaktiv, während die
reifen Peptide die gewünschte
Aktivität
besitzen. Somit resultiert die Isolierung eines Peptids auf der
Basis von dessen Aktivität
in der Isolierung des aktiven, reifen Peptids. Die Entdeckung der
Existenz von Vorsequenzen erfolgt, wenn die Nukleotidsequenz, die
für das
reife Peptid codiert, identifiziert wird. Das offene Leseraster,
das für
das reife Peptid codiert, codiert auch für die Vorsequenzen, die durch
die Zelle entfernt wurden. Eine proteolytische Reifung von Aminosäuresequenzen
tritt in mehreren zellulären
Orten auf, einschließlich,
aber ohne Beschränkung
darauf, dem endoplasmatischen Reticulum, dem Cytoplasma, den Mitochondrien,
den Chloroplasten, dem Kern, dem Golgi-Apparat und der extrazellulären Matrix.
Die proteolytische Prozessierung von Peptiden wird diskutiert in
Creighton, T. E. (1993) Proteins: Structures & Molecular Properties. W. H. Freeman & Co., USA, und
Alberts et al., Hrsg. (1994) Molecular Biology of the Cell. Garland
Publishing, Inc., New York. Anstatt darauf zu vertrauen, dass eine
Wirtszelle das Polypeptid der Erfindung in geeigneter Weise prozessiert, kann
es wünschenswert
sein, eine Nukleotidsequenz, die für das reife Peptid codiert,
einzusetzen.
-
Die
Expressionskassetten können
zusätzlich
5'-Leadersequenzen
in dem Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Derartige Leadersequenzen
können
zu einer Verstärkung
der Translation führen.
Translationsleader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen:
Picornavirus-Leader,
z. B. den EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989)
PNAS USA 86:6126–6130);
Potyvirus-Leader, z. B. TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Allison et al. (1986);
MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaikvirus); Virology 154:9–20) und
das humane Immunglobulin-Schwerketten-Bindungsprotein (BiP) (Macejak
et al. (1991) Nature 353:90–94);
nicht-translatierte Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV
RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622–625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie
et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Hrsg. Cech (Liss, New
York), S. 237–256);
und Leader aus dem Chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) (Lommel
et al. (1991) Virology 81:382–385).
Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965–968. Andere
Verfahren, die dafür
bekannt sind, die Translation zu verstärken, können ebenso eingesetzt werden,
z. B. Introns und dergleichen. Signalpeptide können mit den Krankheitsresistenz-Nukleotidsequenzen
der Erfindung fusioniert werden, um den Transport des exprimierten
Gen- Produkts aus
der Zelle zum gewünschten
Wirkort im interzellulären
Raum zu steuern. Beispiele für
Signalpeptide umfassen jene, die nativ verknüpft sind mit dem Gersten-alpha-Amylaseprotein (BAA),
Sporamin, Oryzacystatin-I und jene aus mit der Pathogenese in Pflanzen
zusammenhängenden
Proteinen, z. B. PR-1, PR-2, usw.
-
Bei
der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente
so manipuliert werden, dass die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung
und, sofern zweckdienlich, im richtigen Leseraster bereitgestellt
werden. Dazu können
Adaptoren oder Verknüpfungselemente
bzw. Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden,
oder andere Manipulationen können
einbezogen werden, um für
zweckdienliche Restriktionsschnittstellen, die Entfernung von überflüssiger DNA,
die Entfernung von Restriktionsschnittstellen oder dergleichen zu
sorgen. Zu diesem Zwecke können
in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Anlagerung, Resubstitutionen,
z. B. Transitionen und Transversionen, einbezogen werden.
-
Im
Allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen
zur Selektion von transformierten Zellen umfassen. Selektierbare
Markergene werden zur Selektion von transformierten Zellen oder
Geweben eingesetzt. Markergene umfassen Gene, die für eine Antibiotikaresistenz
codieren, wie jene, die für
Neomycinphosphotransferase II (NEO) und Hygromycinphosphotransferase
(HPT) codieren, sowie Gene, die eine Resistenz gegenüber herbiziden
Verbindungen, wie Glufosinat-Ammonium, Bromoxynil, Imidazolinonen und
2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D) und Sulfonylharnstoffen (SUs) verleihen.
Siehe allgemein Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506–511; Christopherson
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314–6318; Yao et al. (1992) Cell
71:63–72;
Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419–2422; Barkley et al. (1980)
in The Operon, S. 177–220;
Hu et al. (1987) Cell 48:555–566;
Brown et al. (1987) Cell 49:603–612;
Figge et al. (1988) Cell 52:713–722;
Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400–5404; Fuerst
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549–2553; Deuschle et al. (1990)
Science 248:480–483;
Gossen (1993) Dissertation, Universität Heidelberg; Reines et al.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917–1921; Labow et al. (1990)
Mol. Cell. Biol. 10:3343–3356;
Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952–3956; Baim
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072–5076; Wyborski et al. (1991)
Nukleic Acids Res. 19:4647–4653;
Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143–162; Degenkolb
et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591–1595; Kleinschnidt
et al. (1988) Biochemistry 27:1094–1104; Bonin (1993) Dissertation,
Universität
Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547–5551; Oliva
et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913–919; Hlavka
et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Bd. 78 (Springer-Verlag,
Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721–724.
-
Die
obenstehende Liste von selektierbaren Markergenen soll nicht beschränkend sein.
In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges selektierbares
Markergen verwendet werden.
-
Eine
Anzahl von Promotoren kann bei der Ausführung der Erfindung verwendet
werden. Die Promotoren können
auf der Basis des gewünschten
Ergebnisses selektiert werden. D. h., dass die Nukleinsäuren mit konstitutiven,
Gewebe-bevorzugten ("tissue-preferred"), induzierbaren
oder anderen Promotoren für
eine Expression in Pflanzen kombiniert werden können. Derartige konstitutive
Promotoren umfassen z. B. den Kernpromotor aus dem Rsyn7-Promotor
und andere konstitutive Promotoren, die in
WO 99/43838 und im
US-Patent Nr. 6 072 050 offenbart
sind; den Scp1-Promotor (
US-Patent
Nr. 6 072 050 ), Reisactin (McElroy et al. (1990) Plant
Cell 2:163–171);
Ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619–632, und
Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675–689); pEMU
(Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581–588); MAS (Velten et al. (1984)
EMBO J. 3:2723–2730);
den ALS-Promotor (
US-Patent Nr.
5 659 026 ); Mais-h2B (PCT-Anmeldung, Aktenzeichen
WO 99/43797 ) und dergleichen.
Andere konstitutive Promotoren umfassen z. B. die, die offenbart
sind in den
US-Patenten Nrn.
5 608 149 ,
5 608 144 ,
5 604 121 ,
5 569 597 ,
5 466 785 ,
5 399 680 ,
5 268 463 ,
5 608 142 und
6 177 611 .
-
Im
Allgemeinen wird es günstig
sein, das Gen ausgehend von dem induzierbaren Promotor, insbesondere
ausgehend von einem Pathogen-induzierbaren Promotor, zu exprimieren.
Derartige Promotoren umfassen z. B. jene aus mit Pathogenese zusammenhängenden
Proteinen (PR-Proteine),
die nach einer Infektion durch ein Pathogen induziert werden; z.
B. PR-Proteine, SAR-Proteine,
beta-1,3-Glucanase, Chitinase, usw. Siehe z. B. Redolfi et al. (1983)
Neth. J. Plant Pathol. 89:245–254;
Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645–656; und Van Loon (1985) Plant
Mol. Virol. 4:111–116.
Siehe auch
WO 99/43819 .
-
Von
Interesse sind Promotoren, die lokal an oder nahe der Stelle der
Pathogeninfektion exprimiert werden. Siehe z. B. Marineau et al.
(1987) Plant Mol. Biol. 9:335–342;
Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325–331; Somsisch
et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427–2430; Somsisch et al. (1988)
Mol. Gen. Genet. 2:93–98,
und Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972–14977.
Siehe auch Chen et al. (1996) Plant J. 10:955–966; Zhang et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:2507–2511;
Warner et al. (1993) Plant J. 3:191–201; Siebertz et al. (1989)
Plant Cell 1:961–968;
US-Patent Nr. 5 750 386 (Nematoden-induzierbar);
und die darin zitierten Verweise. Von besonderem Interesse ist der
induzierbare Promotor für
das Mais-PRms-Gen, dessen Expression durch das Pathogen Fusarium
moniliforme induziert wird (siehe z. B. Cordero et al. (1992) Physiol.
Mol. Plant Path. 41:189–200).
-
Da
Pathogene durch Wunden oder Insektenschädigung Zugang zu Pflanzen finden,
kann zusätzlich ein
Wund-induzierbarer Promotor in den Konstrukten der Erfindung verwendet
werden. Derartige Wund-induzierbare Promotoren umfassen das Kartoffel-Proteinase-Inhibitor
(pinII)-Gen(Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425–449; Duan
et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494–498), wun1 und wun2,
US-Patent Nr. 5 428 148 ;
win1 und win2 (Standford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200–208); Systemin
(McGurl et al. (1992) Science 225:1570– 1573); WIP1 (Rohmeier et al.
(1993) Plant Mol. Biol. 22:783–792;
Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73–76); das MPI-Gen (Corderok
et al. (1994) Plant J. 6(2):141–150);
und dergleichen.
-
Chemikalien-regulierte
Promotoren können
verwendet werden, um die Expression eines Gens in einer Pflanze
durch die Anwendung bzw. Applikation eines exogenen chemischen Regulators
zu modulieren. In Abhängigkeit
von der Aufgabe kann der Promotor ein Chemikalieninduzierbarer Promotor
sein, wobei die Anwendung der Chemikalie die Genexpression induziert,
oder ein Chemikalien-reprimierbarer Promotor, wobei die Anwendung
der Chemikalie die Genexpression reprimiert. Chemikalien-induzierbare
Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne Beschränkung darauf,
den Mais-In2-2-Promotor, der durch Benzolsulfonamid-Herbizidsafener
aktiviert wird, den Mais-GST-Promotor, der durch hydrophobe elektrophile
Verbindungen, die als Vorauflaufherbizide verwendet werden, aktiviert
wird und den Tabak-PR-1a-Promotor, der durch Salicylsäure aktiviert
wird. Andere Chemikalienregulierte Promotoren von Interesse umfassen
Steroid-reaktive Promotoren (siehe z. B. der Glucocorticoid-induzierbare
Promotor in Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421–10425,
und McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247–257), und Tetracyclin-induzierbare
und Tetracyclin-reprimierbare Promotoren (siehe z. B. Gatz et al.
(1991) Mol. Gen. Genet. 227:229–237,
und die
US-Patente Nrn. 5 814
618 und
5 789 156 ).
-
Gewebe-bevorzugte
Promotoren können
eingesetzt werden, um eine verstärkte
Expression eines antimikrobiellen Polypeptids innerhalb eines bestimmten
Pflanzengewebes zu targetieren. Siehe z. B. Yamamoto et al. (1997)
Plant J. 12(2):255–265;
Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792–803; Hansen
et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337–343; Russell et al. (1997)
Transgenic Res. 6(2):157–168;
Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331–1341; Van
Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525–535; Canevascini et al. (1996)
Plant Physiol. 112(2):513–524;
Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773–778; Lam (1994)
Results Probl. Cell Differ. 20:181–196; Orozco et al. (1993)
Plant Mol Biol. 23(6):1129–1138;
Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586–9590; und
Guevara-Garcia et
al. (1993) Plant J. 4(3):495–505.
Derartige Promotoren können,
sofern nötig,
für eine
schwache Expression modifiziert sein.
-
Das
Verfahren der Transformation/Transfektion ist für die vorliegende Erfindung
nicht kritisch; zahlreiche Verfahren der Transformation oder Transfektion
sind gegenwärtig
verfügbar.
Somit kann jedes Verfahren, das für eine wirksame Transformation/Transfektion
sorgt, eingesetzt werden. Transformationsprotokolle sowie Protokolle
zum Einführen
von Nukleotidsequenzen in Pflanzen können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder
Pflanzenzelle, d. h., Monocotyl oder Dicotyl, die für die Transformation
targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren des Einführens von
Nukleotidsequenzen in Pflanzenzellen und der nachfolgenden Insertion
in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986)
Biotechniques 4:320–334),
Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:5602–5606),
Agrobacterium vermittelte Transformation (Townsend et al.,
US-Patent Nr. 5 563 055 ;
Zhao et al.,
US-Patent Nr. 5
981 840 ), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984)
EMBO J. 3:2717–2722)
und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z. B. Sanford et al.,
US-Patent Nr. 4 945 050 ;
Tomes et al.,
US-Patent Nr. 5
879 918 ; Tomes et al.,
US-Patent
Nr. 5 886 244 ; Bidney et al.,
US-Patent Nr. 5 932 782 ; Tomes et
al. (1995) "Direct
DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant, Cell,
Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und
Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology
6:923–926);
und Lec1-Transformation (
WO
00/28058 ). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Ann. Rev.
Genet. 22:421–477;
Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27–37 (Zwiebel);
Christou et al. (1988) Plant Phsiol. 87:671–674 (Sojabohne); McCabe et
al. (1988) Bio/Technology 6:923–926
(Sojabohne); Finer und McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol.
27P:175–182
(Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319–324 (Sojabohne);
Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736–740 (Reis); Klein et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (Mais); Klein et al.
(1988) Biotechnology 6:559–563
(Mais); Tomes,
US-Patent Nr. 5 240
855 ; Buising et al.,
US-Patent
Nrn. 5 322 783 und
5
324 646 ; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant
Cells via Microprojectile Bombardment" in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:
Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais);
Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology
8:833–839
(Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763–764; Bowen et
al.,
US-Patent Nr. 5 736 369 (Getreide);
Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345–5349 (Liliaceae);
De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,
Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197–209 (Pollen); Kaepller et
al. (1990) Plant Cell Reports 9:415–418, und Kaeppler et al. (1992)
Theor. Appl. Genet. 84:560–566
(Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495–1505 (Elektroporation);
Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250–255, und Christou und Ford
(1995) Annals of Botany 75:407–413
(Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745–750 (Mais über Agrobacterium
tumefaciens).
-
Die
Zellen, die transformiert wurden, können gemäß herkömmlicher Weisen zu Pflanzen
gezogen werden. Siehe z. B. McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports
5:81–84.
Diese Pflanzen können
dann gezüchtet und
entweder mit dem gleichen transformierten Stamm oder unterschiedlichen
Stämmen
bestäubt
werden, und die resultierende Hybride, die eine konstitutive Expression
des gewünschten
phänotypischen
Merkmals aufweist, wird identifiziert. Zwei oder mehr Generationen
können
gezüchtet
werden, um sicherzustellen, dass eine konstitutive Expression des
gewünschten
phänotypischen
Merkmals stabil aufrechterhalten und vererbt wird, und anschließend können Samen
geerntet werden, um sicherzustellen, dass die konstitutive Expression des
gewünschten
phänotypischen
Merkmals erzielt worden ist.
-
Die
vorliegende Erfindung kann für
die Transformation von beliebigen Pflanzenarten, einschließlich, aber
ohne Beschränkung
darauf, einkeimblättrige
und zweikeimblättrige,
ver wendet werden. Beispiele für Pflanzen
von Interesse umfassen, ohne Beschränkung darauf, Reis (Oryza sativa),
Mais (Zea mays), Brassica sp. (z. B. B. napus, B. rapa, B. juncea),
insbesondere jene Brassica-Arten, die als Quellen für Samenöl verwendbar
sind, Alfalfa (Medicago sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum
(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z. B. Perlhirse (Pennisetum
glaucum), Rispenhirse (Panicum miliacaeum), Borstenhirse bzw. Kolbenhirse
(Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)), Sonnenblume
(Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum
aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum
tuberosum), Erdnüsse
(Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum),
Süßkartoffel
(Ipomoea batatus), Cassava bzw. Maniok (Manihot esculenta), Kaffee
(Coffea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus),
Zitruspflanzen bzw. -bäume
(Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis),
Bananen (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guave
(Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea),
Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia
(Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta
vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen
und Koniferen.
-
Gemüse umfassen
Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z. B. Lactuca sativa),
grüne Bohnen (Phaseolus
vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.)
und Angehörige
der Gattung Cucumis, wie Gurke (C. sativus), Cantaloup- (C. cantalupensis)
und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen die Azalee (Rhododendron
spp.), Hydrangea bzw. Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiscus
(Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.),
Osterglocken (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), die Nelke
(Dianthus caryophyllus), Poinsettia bzw. Weihnachtsstern (Euphorbia
pulcherrima) und Chrysantheme. Koniferen, die in der Ausführung der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen z. B. Kiefern,
wie die Weihrauchkiefer (Pinus taeda), karibische Kiefer bzw. "slash eine" (Pinus elliotii), Gelbkiefer
(Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und die Montereykiefer
(Pinus radiata); die Douglasie (Pseudotsuga menziesii); die westamerikanische
Hemlocktanne (Tsuga canadensis); die Sitka-Fichte (Picea glauca);
den (Küsten-)
Mammutbaum (Sequoia sempervirens); echte Tannen, wie die Purpurtanne
bzw. "silver fir" (Abies amabilis)
und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, wie den Riesenlebensbaum
(Thuja plicata), und die Nutka-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis).
Vorzugsweise sind Pflanzen der Erfindung Nutzpflanzen bzw. Feldpflanzen
(z. B. Reis, Mais, Alfalfa bzw. Luzerne, Sonnenblumen, Brassica,
Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak
usw.).
-
Prokaryotische
Zellen können
als Wirte für
die Expression verwendet werden. Prokaryonten werden am häufigsten
durch zahlreiche Stämme
von E. coli wiedergegeben, jedoch können auch andere mikrobielle Stämme verwendet
werden. Gewöhnlicherweise
verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen, die hierin so definiert
sind, dass sie Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls
mit einem Operator, zusammen mit Ribosomenbindungssequenzen umfassen,
umfassen herkömmlicherweise
verwendete Promotoren, wie die beta-Lactamase (Penicillinase) und
Lactose (lac) Promotorsysteme (Chang et al. (1977) Nature 198:1056), das
Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al. (1980) Nukleic Acids
Res. 8:4057) und den lambda-abgeleiteten P L-Promotor und die Ribosomenbindungsstelle
des N-Gens (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128). Der Einschluss
von Selektionsmarkern in DNA-Vektoren, mit denen E. coli transfiziert
wird, ist ebenfalls nützlich.
Beispiele für
derartige Marker umfassen Gene, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin,
Tetracyclin oder Chloramphenicol spezifizieren.
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Der
Vektor wird so gewählt,
dass eine Einführung
in die zweckdienliche Wirtszelle ermöglicht wird. Bakterielle Vektoren
sind typischerweise von Plasmid- oder Phagenursprung. Zweckdienliche
Bakterienzellen werden mit Phagenvektorpartikeln infiziert oder
mit nackter Phagenvektor-DNA transfiziert. Falls ein Plasmidvektor
verwendet wird, werden die Bakterienzellen mit der Plasmidvektor-DNA
transfiziert. Expressionssysteme zum Exprimieren eines Polypeptids
der vorliegenden Erfindung sind verfügbar, wobei Bacillus sp. und Salmonella
verwendet werden (Palva et al. (1983) Gene 22:229–235); Mosbach
et al. (1983) Nature 302:543–545).
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Eine
Vielfalt von eukaryotischen Expressionssystemen, wie Hefe, Insektenzelllinien,
Pflanzen- und Säugerzellen,
sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Wie untenstehend kurz erläutert, kann
ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in diesen eukaryotischen
Systemen exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen werden transformierte/transfizierte
Pflanzenzellen, wie infra diskutiert, als Expressionssysteme zur
Produktion der Polypeptide der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
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Die
Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch mit zahlreichen Expressionsvektoren
zur Verwendung beim Transfizieren von Zellkulturen, die z. B. von
Säugern,
Insekten oder Pflanzen stammen, ligiert werden. Beispielhafte Zellkulturen,
die zur Produktion der Peptide verwendbar sind, sind Säugerzellen. Eine
Anzahl geeigneter Wirtszelllinien, die zum Exprimieren intakter
Proteine befähigt
sind, sind auf dem Fachgebiet entwickelt worden und umfassen die
HEK293-, BHK21- und CHO-Zelllinien. Expressionsvektoren für diese
Zellen können
Expressionskontrollsequenzen, wie ein Replikationsursprung, einen
Promotor (z. B. den CMV-Promotor,
einen HSV tk-Promotor oder einen pgk (Phosphoglyceratkinase)-Promotor),
einen Enhancer (Queen et al. (1986) Immunol. Rev. 89:49) und notwendige
Prozessierungsinformationsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen,
RNA-Spleißstellen,
Polyadenylierungsstellen (z. B. eine Poly A-Additionsstelle vom
Typ SV40 large T Ag), und Transkriptionsterminatorsequenzen umfassen.
Andere Tierzellen, die zur Produktion von Polypeptiden der vorliegenden
Erfindung verwendbar sind, sind z. B. von der American Type Culture
Collection erhältlich.
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Zweckdienliche
Vektoren zum Exprimieren von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung
in Insektenzellen sind üblicherweise
vom SF9-Baculovirus abgeleitet. Geeignete Insektenzelllinien umfassen
Moskitolarven-, Seidenraupen-, Heerwurm-, Motten- und Drosophila- Zelllinien, wie eine
Schneider-Zelllinie (siehe Schneider (1987) J. Embryol. Exp. Morphol.
27:353–365).
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Wie
bei Hefe werden, wenn höhere
Tier- oder Pflanzenwirtszellen eingesetzt werden, Polyadenylierungs-
oder Transkriptionsterminatorsequenzen typischerweise in den Vektor
eingebaut. Ein Beispiel einer Terminatorsequenz ist die Polyadenylierungssequenz
aus dem bovinen Wachstumshormongen. Sequenzen für ein akkurates Spleißen des
Transkripts können
ebenso eingeschlossen werden. Ein Beispiel für eine Spleißsequenz
ist das VP1-Intron aus SV40 (Sprague et al. (1983) J. Virol. 45:773–781). Zusätzlich können Gensequenzen
zum Kontrollieren der Replikation in der Wirtszelle in den Vektor
eingebaut werden, wie z. B. jene, die in Vektoren vom Typ des bovinen
Papillomavirus gefunden werden (Saveria-Campo (1985) DNA Cloning
Bd. II a Practical Approach, D. M. Glover, Hrsg., IRL Press, Arlington,
Virginia, S. 213–238).
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Tierische
und niedere eukaryotische (z. B. Hefe-) Wirtszellen sind kompetent
oder werden durch verschiedene Mittel für eine Transfektion kompetent
gemacht. Es gibt mehrere gut bekannte Verfahren des Einführens von
DNA in Tierzellen. Diese umfassen: Calciumphosphat-Präzipitation,
Fusion der Empfängerzellen mit
Bakterienprotoplasten, die die DNA enthalten, Behandlung der Empfängerzellen
mit Liposomen, die die DNA enthalten, DEAE-Dextrin, Elektroporation,
biolistische Herangehensweisen ("biolistics") und Mikroinjektion
der DNA direkt in die Zellen. Die transfizierten Zellen werden durch
Mittel kultiviert, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (Kuchler
(1997) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden,
Hutchinson und Ross, Inc.).
-
Die
Synthese von heterologen Nukleotidsequenzen in Hefe ist gut bekannt
(Sherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory). Zwei weithin verwendete Hefen zur Produktion von eukaryotischen
Proteinen sind Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Vektoren,
Stämme
und Protokolle zur Expression in Saccharomyces und Pichia pastoris
sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind von kommerziellen Lieferanten
(z. B. Invitrogen) erhältlich.
Geeignete Vektoren besitzen üblicherweise
Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase
oder Alkoholoxidase, und einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen
und dergleichen, wie gewünscht.
-
Ein
Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann, sobald es exprimiert
ist, aus Hefe isoliert werden, indem die Zellen lysiert und Standardproteinisolationstechniken
auf die Lysate angewendet werden. Die Überwachung des Reinigungsvorgangs
kann durch Verwendung von Western-Blot-Techniken, UV-Absorptionsspektren,
Radioimmunassay oder andere Immunassay-Standardtechniken bewerkstelligt
werden.
-
Die
Erfindung betrifft ein allgemeines Verfahren zum Identifizieren
und Herstellen von antimikrobiellen Zusammensetzungen, insbesondere
antifungalen Zusammensetzungen. Die Verfahren umfassen das Injizieren
einer Suspension eines pflanzenpathogenen Pilzes in ein Insekt,
um Insektenpolypeptide, die antimikrobielle Aktivität besitzen,
zu induzieren. Derartige Polypeptide werden aus der Insekten-Hämolymphe
unter Verwendung einer Kombination von hochauflösender Flüssigkeitschromatographie und
Massenspektrophotometrie isoliert.
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Die
allgemeine Strategie zur Entdeckung dieser aus Insekten abgeleiteten
antimikrobiellen Peptide involviert das Provozieren von Insekten
mit einem ausgewählten
Pflanzenpathogen und das Gewinnen von Hämolymphe- und Fettkörperproben
zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion. Z. B. können Hämolymphe- und
Fettkörperproben
in Intervallen von etwa 8 Stunden, 16 Stunden, 24 Stunden oder 48
Stunden gesammelt werden. Es wird anerkannt, dass jedes Verfahren
zur Proteintrennung und -identifikation verwendet werden kann, um
Peptide und die korrespondierenden Nukleinsäuresequenzen zu isolieren.
-
Obgleich
keine Bindung an ein bestimmtes Verfahren besteht, kann eine Identifizierung
von antimikrobiellen Peptiden, die gegen das Zielpathogen aktiv
sind, bewerkstelligt werden, indem eine integrierte Proteom-bezogene,
Genom-bezogene und miniaturisierte Bioassay-Herangehensweise verwendet wird. Diese
Herangehensweise besteht in der Auftrennung von Hämolymphe,
die aus induzierten Insekten isoliert wurde. Ein beliebiges Trennverfahren,
einschließlich
HPLC-Auftrennung, kann verwendet werden. Fraktionen aus der HPLC-unterstützten Auftrennung
können
in 30 Sekundärfraktionen
in einem Mikrotiterplattenformat, d. h., einer 96-Well-Mikrotiterplatte,
aufgetrennt werden. Auf diese Weise gewonnene Fraktionen werden
getrocknet und direkt in einem Pilzwachstums-Assay (FGA) verwendet,
bei dem die getrockneten Fraktionen in 100 μl halbkonzentrierter Kartoffeldextrosebouillon,
enthaltend eine Suspension des pilzlichen Zielpathogens, resuspendiert
werden. Fraktionen, die antimikrobielle Peptide enthalten, werden
in dem FGA durch ihre Fähigkeit, das
Pilzwachstum nach mehreren Stunden, im Allgemeinen 24–48 Stunden,
zu inhibieren, identifiziert. Diese Fraktionen werden einer weiteren
Aufreinigung unterworfen, um einzelne Peptide zu isolieren, und
das spezifische Peptid, das für
die beobachtete Aktivität
verantwortlich ist, wird mittels FGA bestimmt. Dieses Peptid wird
nachfolgend N-terminal sequenziert, und sein Molekulargewicht wird
mittels Massenspektrometrie bestimmt, um Informationen zum Identifizieren
des entsprechenden Gens aus Sequenzdaten, die aus den entsprechenden
Insekten-cDNA-Bibliotheken stammen, bereitzustellen. Die vollständige Aminosäuresequenz des
Peptids wird durch Translation der Nukleinsäuresequenz bestimmt, und das
reife Peptid auf der Basis von sowohl der N-terminalen Sequenz als
auch der Molekulargewichtsinformation identifiziert.
-
Die
abwehrenden Mittel der Erfindung umfassen die reifen aktiven Peptide
sowie nicht-prozessierte oder
Präpro-Formen
der Peptide. Wenn ein reifes Peptid isoliert worden ist, kann die
Präpro-Sequenz
oder Signalsequenz mittels einer Anzahl allgemeiner Molekularbiologietechniken,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erhalten werden.
-
Wie
angegeben, können
die abwehrenden Mittel aus einem beliebigen Insekt von Interesse
isoliert werden. Von besonderem Interesse sind Insekten, die in
rauen Umgebungen leben, und Insekten, die natürliche Pflanzenräuber bzw.
-schädlinge
("plant predators") sind. Obgleich
jedes beliebige Insekt eingesetzt werden kann, kann es günstig sein,
Insektenräuber
einer be stimmten Pflanze von Interesse zu verwenden. Zum Erhalten
abwehrender Mittel zur Verwendung bei Mais können beispielsweise, obgleich
jedes beliebige Insekt verwendet werden kann, Mais-Insektenräuber günstig sein.
-
Obgleich
ein abwehrendes Mittel durch ein beliebiges Pathogen induziert werden
kann, wird vorhergesagt, dass das abwehrende Mittel gegen einen
oder mehrere weitere Pathogene, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf,
beliebige der oben aufgelisteten Pathogene, wirksam sein kann.
-
Die
Polypeptide werden unter Verwendung von in vitro-Assays, wie hierin
an anderer Stelle beschrieben, auf antimikrobielle Aktivität getestet.
Isolierte antimikrobielle Polypeptide werden einer Proteolyse unterworfen,
und die Aminotermini der resultierenden proteolytischen Fragmente
werden sequenziert. Degenerierte Oligonukleotide, die für die aminoterminalen
Sequenz-tags codieren, werden verwendet, um die cDNAs, die für antimikrobielle
Polypeptide codieren, ausgehend von entsprechenden Pathogen-induzierten
Insekten-cDNA-Bibliotheken, zu identifizieren. Die Nukleinsäuremoleküle, die
für die
antimikrobiellen Polypeptide codieren, werden für die Transformation von Pflanzenzellen
verwendet, um Pflanzen mit verstärkter
Krankheitsresistenz zu erzeugen. Zusätzlich können die Zusammensetzungen
der Erfindung verwendet werden, um Formulierungen zu erzeugen, die
Krankheitsresistenzaktivitäten
besitzen.
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Verfahren
zum Verstärken
bzw. Erhöhen
einer Pathogenresistenz in einer Pflanze werden bereitgestellt.
Die Verfahren umfassen das stabile Transformieren einer Pflanze
mit einem DNA-Konstrukt, umfassend eine Nukleotidsequenz für ein abwehrendes
Mittel der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der
die Expression in einer Pflanze steuert. Derartige Verfahren können in
der Agrikultur, insbesondere beim Begrenzen des Einflusses von pilzlichen
Pflanzenpathogenen auf Feld- bzw. Nutzpflanzen, Verwendung finden.
Die antimikrobiellen Nukleotidsequenzen umfassen die Insekten-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung und
funktionelle Varianten und Fragmente davon. Die Wahl des Promotors
wird von der gewünschten
zeitlichen Abstimmung und Lokalisierung der Expression der antimikrobiellen
Nukleotidsequenzen abhängen.
Promotoren der Erfindung umfassen konstitutive, induzierbare und
Gewebe-bevorzugte Promotoren.
-
Wie
oben diskutiert, codieren die Nukleotidsequenzen der Erfindung für Polypeptide
mit antimikrobiellen Eigenschaften, insbesondere fungiziden Eigenschaften.
Folglich können
die Sequenzen der Erfindung eine Resistenz transgener Pflanzen verstärken, indem
zelluläre
Funktionen der Pflanzenpathogene, insbesondere pilzliche Pflanzenpathogene,
gestört
bzw. unterbrochen werden. Es wird jedoch anerkannt, dass die vorliegende
Erfindung nicht von einem bestimmten Abwehrmechanismus abhängig ist.
Vielmehr wirken die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
so, dass eine Resistenz der Pflanze gegenüber Pathogenen verstärkt wird,
unabhängig
davon, wie die Resistenz verstärkt
oder erzielt wird.
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Die
Verfahren der Erfindung können
mit anderen Verfahren, die auf dem Fachgebiet zum Verstärken der
Krankheitsresistenz in Pflanzen verfügbar sind, verwendet werden.
Gleicherma ßen
können
die hierin beschriebenen antimikrobiellen Zusammensetzungen alleine
oder in Kombination mit anderen Nukleotidsequenzen, Polypeptiden
oder Mitteln zum Schützen
von Pflanzen gegen Pflanzenkrankheiten und Pathogene verwendet werden.
Obgleich eine Beliebige aus einer Vielfalt von zweiten Nukleotidsequenzen
eingesetzt werden kann, umfassen spezifische Ausführungsformen
der Erfindung jene zweiten Nukleotidsequenzen, die, wenn sie in
einer Pflanze exprimiert werden, die Erhöhung der Resistenz einer Pflanze
gegenüber
Pathogenen unterstützen.
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Proteine,
Peptide und Lysozyme, die natürlicherweise
in Insekten (Jaynes et al. (1987) Bioassays 6:263–270), Plants
(Broekaert et al. (1997) Critical Reviews in Plant Sciences 16:297–323), Tieren
(Vunnam et al. (1997) J. Peptide Res. 49:59–66) und Menschen (Mitra und
Zang (1994) Plant Physiol. 106:977–981; Nakajima et al. (1997)
Plant Cell Reports 16:674–679)
vorkommen, sind ebenso eine potentielle Quelle für Pflanzenkrankheitsresistenz
(Ko, K. (2000) http://www.scisoc.org/feature/BioTechnology/antimicrobial.html).
Beispiele für
derartige Pflanzenresistenz-verleihende Sequenzen umfassen jene,
die für
das rhoGTPase-aktivierende Protein (rhoGAP) der Sonnenblume, Lipoxygenase
(LOX), Alkohol-Dehydrogenase (ADH) und das Sclerotinia-induzierbare
Protein-1 (SCIP-1) codieren. Diese Nukleotidsequenzen verstärken eine
Pflanzenkrankheitsresistenz durch die Modulation der Entwicklung,
von Entwicklungswegen und des Pflanzenpathogen-Abwehrsystems. Andere
Pflanzenabwehrproteine umfassen jene, die in
WO 99/43823 und
WO 99/43821 beschrieben sind. Es
wird anerkannt, dass derartige zweite Nukleotidsequenzen in Abhängigkeit
vom gewünschten
Ergebnis entweder in Sinn- bzw. Sense- oder in Gegensinn- bzw. Antisense-Orientierung
verwendet werden können.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung können
die Polypeptide der Erfindung mit einem annehmbaren bzw. verträglichen
Träger
zu (einer) antimikrobiellen Zusammensetzung(en) formuliert werden,
die z. B. eine Suspension, eine Lösung, eine Emulsion, ein Stäubepulver,
ein dispergierbares Granulat, ein benetzbares Pulver und ein emulgierbares
Konzentrat, ein Aerosol, ein imprägniertes Granulat, ein Adjuvans
bzw. Hilfsstoff oder eine Beschichtungs-taugliche Paste ("coatable Paste") ist bzw. sind,
und auch in Einkapselungen, z. B. (mit) polymeren Substanzen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfassen die abwehrenden Mittel isolierte Polypeptide der Erfindung.
Die abwehrenden Mittel der Erfindung finden Verwendung beim Dekontaminieren
von Pflanzenpathogenen während
der Bearbeitung von Getreide bzw. Körnern für die Tier- oder Humanernährung ("animal or human food
consumption"), während der
Bearbeitung von Futterstoffen und während der Bearbeitung von Pflanzenmaterial
für die
Silage. In dieser Ausführungsform
werden die abwehrenden Mittel der Erfindung an Getreide bzw. Körnern, Pflanzenmaterial
für die
Silage oder einer kontaminierten Nahrungs(mittel)kultur oder während einer
zweckdienlichen Stufe der Bearbeitungsverfahrensweise in Mengen
präsentiert,
die hinsichtlich einer antimikrobiellen Aktivität wirksam sind. Die Zusammensetzungen
können
auf die Umgebung eines Pflanzenpathogens angewendet werden, beispielsweise
durch Sprühen,
zer stäuben,
(Auf-)Stäuben,
Streuen ("scattering"), Benetzen bzw.
Beschichten oder Übergießen, Einarbeiten
in oder auf den Boden, Einarbeiten in Wasser zur Bewässerung,
durch Samenbehandlung oder durch Stäuben zu der Zeit, zu der das
Pflanzenpathogen aufzutreten begonnen hat oder vor dem Auftreten
von Schädlingen
als eine Schutzmaßnahme.
Es wird anerkannt, dass beliebige Mittel zum Inkontaktbringen der
abwehrenden Polypeptidmittel ("defensive
agent polypeptides")
mit dem Pflanzenpathogen in der Ausführung der Erfindung verwendet
werden können.
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Verfahren
zum Kontrollieren von Pflanzenpathogenen, die das Anwenden einer
dekontaminierenden Menge eines Polypeptids oder einer Zusammensetzung
der Erfindung auf die Umgebung des Pflanzenpathogens umfassen, werden
bereitgestellt. Die Polypeptide der Erfindung können mit einem annehmbaren
Träger zu
(einer) Zusammensetzung(en) formuliert werden, die z. B. eine Suspension,
eine Lösung,
eine Emulsion, ein Stäubepulver,
ein dispergierbares Granulat, ein benetzbares Pulver, ein emulgierbares
Konzentrat, ein Aerosol, ein imprägniertes Granulat, ein Adjuvans
bzw. Hilfsstoff, eine Beschichtungs-taugliche Paste ("coatable Paste") und auch Einkapselungen,
z. B. (in) polymeren Substanzen, ist bzw. sind.
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Solche
obenstehend offenbarten Zusammensetzungen können erhalten werden durch
die Zugabe eines oberflächenaktiven
Mittels, eines inerten Trägers,
eines Konservierungsmittels, eines Feuchthaltemittels, eines Fressstimulans,
eines Lockstoffs, eines Einkapselungsmittels, eines Bindemittels,
eines Emulgators, eines Farbstoffs, eines UV-Schutzmittels, eines
Puffers, eines Fließ(hilfs)mittels
oder von Düngern,
Mikromerstoffspendern oder anderen Zubereitungen, die das Pflanzenwachstum
beeinflussen. Eine oder mehrere Agrochemikalien, einschließlich, aber
ohne Beschränkung
darauf, Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakteriozide, Nematozide,
Molluscizide, Acarazide, Pflanzenwachstumsregulatoren, Erntehilfsmittel
und Dünger,
können mit
Trägern,
oberflächenaktiven
Mitteln oder Adjuvantien bzw. Hilfsstoffen, die herkömmlicherweise
auf dem Fachgebiet der Formulierung eingesetzt werden, oder anderen
Komponenten zum Erleichtern der Handhabung des Produkts und der
Anwendung bzw. Aufbringung für
bestimmte Zielmycotoxine kombiniert werden. Geeignete Träger und
Adjuvantien bzw. Hilfsstoffe können
fest oder flüssig
sein und entsprechen den Substanzen, die gewöhnlicherweise in der Formulierungstechnologie
eingesetzt werden, z. B. natürliche
oder regenerierte mineralische Substanzen, Lösungsmittel, Dispergiermittel,
Benetzungsmittel, klebrigmachende Mittel, Bindemittel oder Dünger. Die
aktiven Ingredientien der vorliegenden Erfindung werden normalerweise
in der Form von Zusammensetzungen angewendet und können auf
die zu behandelnde Anbaufläche
oder Pflanze gleichzeitig mit oder in Folge mit anderen Verbindungen
angewendet werden. In einigen Ausführungsformen sind Verfahren
der Anwendung eines aktiven Ingrediens der vorliegenden Erfindung
oder einer agrochemischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
(die wenigstens eines der Proteine der vorliegenden Erfindung enthält) Anwendung
auf das Blattwerk, Überziehen
bzw. Beschichten von Samen und Anwendung auf den Boden.
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Geeignete
oberflächenaktive
Mittel umfassen, ohne Beschränkung
darauf, anionische Verbindungen, wie ein Carboxylat z. B. eines
Metalls; ein Carboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N-Acylsarcosinat;
Mono- oder Diester von Phosphorsäure
mit Fettalkoholethoxylaten oder Salze von derartigen Estern; Fettalkoholsulfate,
wie Natriumdodecylsulfat, Natriumoctadecylsulfat oder Natriumcetylsulfat;
ethoxylierte Fettalkoholsulfate; ethoxylierte Alkylphenolsulfate;
Ligninsulfonate; Petroleumsulfonate; Alkylarylsulfonate, wie Alkylbenzolsulfonate
oder Niederalkylnaphthalinsulfonate, z. B. Butyl-Naphthalinsulfonat;
Salze von sulfonierten Naphthalin-Formaldehyd-Kondensaten; Salze
von sulfonierten Phenol-Formaldehyd-Kondensaten; komplexere Sulfonate,
wie die Amidsulfonate, z. B. das sulfonierte Kondensationsprodukt
von Ölsäure und
N-Methyltaurin; oder die Dialkylsulfosuccinate, z. B. das Natriumsulfonat
oder Dioctylsuccinat. Nicht-ionische Mittel umfassen Kondensationsprodukte
von Fettsäureestern,
Fettalkoholen, Fettsäureamiden
oder Fettsäure-Alkyl-
oder -Alkenyl-substituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fettsäureester
von mehrwertigen Alkoholethern, z. B. Sorbitanfettsäureester,
Kondensationsprodukte von derartigen Estern mit Ethylenoxid, z.
B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester,
Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, acetylenische
Glykole, wie 2,4,7,9-Tetraethyl-5-decin-4,7-diol
oder ethoxylierte acetylenische Glykole. Beispiele für ein kationisches
oberflächenaktives
Mittel umfassen z. B. ein aliphatisches Mono-, Di- oder Polyamin,
wie ein Acetat, Naphthenat oder Oleat; oder ein Sauerstoff-enthalendes
Amin, wie ein Aminoxid von Polyoxyethylenalkylamin; ein Amid-verknüpftes Amin,
hergestellt durch die Kondensation einer Carbonsäure mit einem Di- oder Polyamin;
oder ein quaternäres
Ammoniumsalz.
-
Beispiele
für inerte
Materialien umfassen, ohne Beschränkung darauf, anorganische
Mineralien, wie Kaolin, Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate,
oder botanische Materialien, wie Kork, gepulverte Maiskolben, Erdnussschalen,
Maisspelzen und Walnussschalen.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form
für eine
direkte Anwendung oder als ein Konzentrat für eine primäre Zusammensetzung, die eine
Verdünnung
mit einer geeigneten Menge an Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel
vor der Anwendung erfordert, sein. Die dekontaminierende Konzentration
wird in Abhängigkeit
von der Natur der speziellen Formulierung variieren, insbesondere
davon, ob sie als ein Konzentrat oder direkt zu verwenden ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
die Zusammensetzungen sowie die Polypeptide der vorliegenden Erfindung
vor der Formulierung behandelt werden, um die Aktivität zu verlängern, wenn
sie auf die Umgebung eines Pflanzenpathogens angewendet werden,
solange die Vorbehandlung nicht nachteilig für die Aktivität ist. Eine
derartige Behandlung kann durch chemische und/oder physikalische
Mittel erfolgen, solange die Behandlung die Eigenschaften der Zusammensetzung(en)
nicht nachteilig beeinflusst. Beispiele für chemische Reagenzien umfassen,
ohne Beschränkung
darauf, Halogenierungsmittel; Aldehyde, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd;
antiinfektiöse
Substanzen, wie Zephiranchlorid; Alkohole, wie Isopropanol und Ethanol; und
histologische Fixierungsmittel, wie Bouins Fixierungsmittel und
Hellys Fixierungsmittel (siehe z. B. Humason (1967) Animal Tissue
Techniques (W. H. Freeman und Co.)).
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung eine
Mikrobe, die die Nukleotidsequenz eines abwehrenden Mittels stabil
integriert hat. Die resultierenden Mikroben können bearbeitet und als ein
mikrobielles Spray verwendet werden. Für diesen Zweck kam ein beliebiger
geeigneter Mikroorganismus verwendet werden. Siehe z. B. Gaertner
et al. (1993) in Advanced Engineered Pesticides, Kim (Hrsg.). In
einer Ausführungsform
werden die Nukleotidsequenzen der Erfindung in Mikroorganismen eingeführt, die
sich auf Pflanzen vermehren (Epiphyten), um die abwehrenden Mittel
an potentielle Ziel(nutz)pflanzen abzugeben. Die Epiphyten können z.
B. Gram-positive oder Gram-negative Bakterien sein. Es wird ferner
anerkannt, dass ganze, d. h. nicht-lysierte, Zellen des transformierten
Mikroorganismus mit Reagenzien behandelt werden können, die
die Aktivität
des Polypeptids, das in dem Mikroorganismus produziert wurde, verlängern, wenn
der Mikroorganismus auf die Umgebung einer Zielpflanze angewendet
wird. Eine Sekretionssignalsequenz kann in Kombination mit dem Gen
von Interesse verwendet werden, so dass das resultierende Enzym
für die
Präsentation
an die Zielpflanze aus dem Mikroorganismus sekretiert wird.
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Auf
diese Weise kann ein Gen, das für
ein abwehrendes Mittel der Erfindung codiert, über einen geeigneten Vektor
in einen mikrobiellen Wirt eingeführt werden, und der transformierte
Wirt wird auf die Umgebung, Pflanzen oder Tiere angewendet. Mikroorganismenwirte,
die dafür
bekannt sind, die "Phytosphäre" (Phylloplane, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder
Rhizoplane) von einer oder mehreren (Ertrags-)Kulturen bzw. Nutzpflanzen
von Interesse zu besetzen, können
für die
Transformation ausgewählt
werden. Diese Mikroorganismen werden so gewählt, dass sie fähig sind,
mit den Wildtyp-Mikroorganismen in der speziellen Umgebung erfolgreich
zu konkurrieren, um für
eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens, das das detoxifizierende
Polypeptid exprimiert, und für
einen verbesserten Schutz der Enzyme der Erfindung vor Umwelt-bedingtem
bzw. Umgebungs-bedingtem Abbau und Umwelt-bedingter bzw. Umgebungs-bedingter
Inaktivierung zu sorgen.
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Derartige
Mikroorganismen umfassen Bakterien, Algen und Pilze. Von besonderem
Interesse sind Mikroorganismen, wie Bakterien, z. B. Pseudomonas,
Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium,
Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus,
Arthrobacter, Azotobacter Leuconostoc und Alcaligenes; Pilze, insbesondere
Hefe, z. B. Saccharomyces, Pichia, Cryptococcus, Kluyveromyces,
Sporobolomyces, Rhodotorula, Aureobasidium und Gliocladium. Von
besonderem Interesse sind solche Bakterienarten der Phytosphäre, wie
Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens,
Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides,
Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus,
Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandii; und Hefearten der Phytosphäre, wie
Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus
albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis,
S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae
und Aureobasidium pullulans.
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Beispielhafte
Prokaryonten, sowohl Gram-negativ als auch -positiv, umfassen Enterobacteriacae,
wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus; Bacillaceae;
Rhizobiaceae, wie Rhizobium; Spirillaceae, wie Photobacterium, Zymomonas,
Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae;
Pseudomonadaceae, wie Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae;
und Nitrobacteracea. Unter den Eukaryonten sind Pilze, wie Phycomyceten
und Ascomyceten, die Hefen, wie Saccharomyces und Schizosaccharomyces
umfassen; und Basidiomycetes-Hefe, wie Rhodotorula, Aureobasidium,
Sporobolomyces, und dergleichen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung können
die abwehrenden Mittel der Erfindung als pharmazeutische Verbindung
für die
Behandlung von pilzlichen und mikrobiellen Pathogenen bei Menschen
und anderen Tieren verwendet werden. Krankheiten und Störungen,
die durch pilzliche und mikrobielle Pathogene verursacht werden,
umfassen, ohne Beschränkung
darauf, Pilz-bedingte Meningoencephalitis, oberflächliche
Pilzinfektionen, Tinea bzw. Trichophytie ("ringworm"), Fußpilz, Histoplasmose, Candidose,
Soor, Coccidioidom, Lungeninfektion mit Cryptococcus, Trichosporonose,
Piedra, Tinea nigra, Pilzkeratitis, Onychomykose, Tinea capitis,
Chromomykose, Aspergillose, endobronchiale Lungenaspergillose, Mukormykose,
Chromoblastomykose, Dermatophytose, Tinea, Fusariose, Pityriasis,
Myzetom, Pseudallescheriasis und Sporotrichose.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung können als pharmazeutische Verbindungen
verwendet werden, um eine Behandlung für Krankheiten und Störungen bereitzustellen,
die mit den folgenden pilzlichen Pathogenen, jedoch ohne Beschränkung darauf,
zusammenhängen:
Histoplasma capsulatum, Candida spp. (C. albicans, C. tropicalis,
C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata/Torulopsis glabrata,
C. krusei, C. lusitaniae), Aspergillus fumigatus, A. flavus, A.
niger, Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Cunninghamella spp., Apophysomyces
spp., Saksenaee spp., Mucor spp. und Absidia spp. Die Wirksamkeit
der Zusammensetzungen der Erfindung als antifungale bzw. antimykotische
Behandlungen kann durch antifungale Assays, die einem Fachmann auf
dem Gebiet bekannt sind, bestimmt werden.
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Die
abwehrenden Mittel können
Patienten durch zahlreiche Mittel verabreicht werden. Eine systemische
Verabreichung kann auch über
transmucosale oder transdermale Mittel erfolgen. Für eine transmucosale oder
transdermale Verabreichung werden Durchdringungsmittel ("penetrants"), die für die zu
durchdringende Barriere zweckdienlich sind, in der Formulierung
verwendet. Derartige Durchdringungsmittel sind auf dem Fachgebiet
allgemein bekannt und umfassen z. B. für die transmucosale Verabreichung
Detergentien, Gallensalze und Derivate der Fusidinsäure. Eine
transmucosale Verabreichung kann durch Verwendung von Nasensprays
oder Suppositorien bewerkstelligt werden. Für eine transdermale Verabreichung
werden die aktiven Verbindungen in Salben, Unguenta, Gelen oder
Cremes formuliert, wie es auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Die Verbindungen können
auch in der Form von Suppositorien (z. B. mit herkömmlichen
Suppositoriengrundlagen, wie Kakaobutter und andere Glyceride) oder
Retentionsklistieren für
die rektale Abgabe zubereitet werden.
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In
einer Ausführungsform
werden die aktiven Verbindungen mit Trägern zubereitet, die die Verbindung vor
einer raschen Elimination aus dem Körper schützen werden, z. B. eine Formulierung
zur kontrollierten Freisetzung, einschließlich Implantate und mikroverkapselte
Abgabesysteme.
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Biologisch
abbaubare, biokompatible Polymere, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride,
Polyglykolsäure,
Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure, können verwendet werden. Verfahren
zur Herstellung derartiger Formulierungen werden für Fachleute
auf dem Gebiet offensichtlich sein. Die Materialien können ebenso
im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc., erhalten
werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposome, die auf infizierte
Zellen targetiert bzw. gerichtet sind, und zwar mit monoklonalen
Antikörpern
gegen virale Antigene) können
ebenso als pharmazeutisch verträgliche
Träger
verwendet werden. Diese können
gemäß Verfahren,
die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden,
z. B. wie im
US-Patent Nr. 4
522 811 beschrieben.
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Für eine einfache
Verabreichung und die Gleichförmigkeit
der Dosierung ist es insbesondere vorteilhaft, orale oder parenterale
Zusammensetzungen in Einheitsdosierungsform („dosis unit form") zu formulieren. Eine
Einheitsdosierungsform, wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch
diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für das zu
behandelnde Subjekt geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorherbestimmte
Menge der aktiven Verbindung enthält, die so berechnet ist, dass
die gewünschte
therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen
Träger
erzielt wird. In Abhängigkeit
vom Typ und der Schwere der Krankheit sind etwa 1 μg/kg bis
etwa 15 mg/kg (z. B. 0,1 bis 20 mg/kg) an Antikörper eine Anfangskandidatendosierung
("initial candidate
dosage") für die Verabreichung
an den Patienten, z. B. durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen
oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische Tagesdosierung
kann von etwa 1 μg/kg
bis etwa 100 mg/kg oder mehr reichen, und zwar in Abhängigkeit
von den o. g. Faktoren. Für
wiederholte Verabreichungen über
mehrere Tage oder länger
wird die Behandlung in Abhängigkeit
vom Zustand fortgesetzt, bis eine gewünschte Suppression von Krankheitssymptomen
auftritt. Jedoch können
andere Dosierungsregime nützlich
sein. Der Fortschritt dieser Therapie wird mittels herkömmlicher Techniken
und Assays leicht überwacht.
Ein beispielhaftes Dosierungsregime ist in
WO 94/04188 offenbart. Die Beschreibung
für die
Einheitsdosierungsformen der Erfindung wird diktiert und ist direkt
abhängig
von den einzigartigen Merkmalen der aktiven Verbindung und der zu
erzielenden speziellen therapeutischen Wirkung und den Beschränkungen,
die dem Fachgebiet des Einarbeitens bzw. Compoundierens einer derartigen
aktiven Verbindung für
die Behandlung von Individuen inhärent sind.
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"Behandlung" ist hierin definiert
als die Anwendung oder Verabreichung eines therapeutischen Mittels auf
einen/an einem Patienten oder als Anwendung oder Verabreichung eines
therapeutischen Mittels auf/an isoliertes Gewebe oder eine Zelllinie
aus einem Patienten, der/das/die eine Krankheit, ein Krankheitssymptom oder
eine Prädisposition
für eine
Krankheit aufweist, und zwar mit dem Zweck, die Krankheit, die Krankheitssymptome
oder die Prädisposition
für eine
Krankheit zu kurieren, zu heilen, zu lindem, zu erleichtern, zu ändern, ihr/ihn
abzuhelfen, sie zu verbessern, sie zu bessern oder zu beeinflussen.
Ein "therapeutisches
Mittel" umfasst,
ohne Beschränkung
darauf, kleine Moleküle,
Peptide, Antikörper,
Ribozyme und Antisense- bzw. Gegensinn-Oligonukleotide.
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Die
abwehrenden Mittel der Erfindung können für jede Anwendung, einschließlich dem
Beschichten von Oberflächen
zum Targetieren von Mikroben, verwendet werden. Auf diese Weise
umfassen Zielmikroben Humanpathogene oder Mikroorganismen. Oberflächen, die
mit den abwehrenden Mitteln der Erfindung beschichtet werden könnten, umfassen
Teppiche und sterile medizinische Einrichtungen. Polymer-gebundene Polypeptide
der Erfindung können
zum Beschichten von Oberflächen
verwendet werden. Verfahren zum Einarbeiten von Zusammensetzungen
mit antimikrobiellen Eigenschaften in Polymere sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Sehe
US-Patent Nr. 5 847 047 .
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Ein
isoliertes Polypeptid der Erfindung kann als Immunogen verwendet
werden, um Antikörper
zu erzeugen, die abwehrende Mittel binden, und zwar unter Verwendung
von Standardtechniken für
die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern. Als
Immunogene können
die Volllängen-Abwehrmittel
verwendet werden oder, alternativ von der Erfindung bereitgestellt,
antigene Peptidfragmente der abwehrenden Mittel. Das antigene Peptid
eines abwehrenden Mittels umfasst wenigstens 8, vorzugsweise 10,
15, 20 oder 30 Aminosäurereste
der in SEQ ID NO:101 gezeigten Aminosäuresequenz und umfasst ein
Epitop eines abwehrenden Mittels, so dass ein gegen das Peptid erzeugter
Antikörper
einen spezifischen Immunkomplex mit den antimikrobiellen Polypeptiden
bildet. Bevorzugte Epitope, die vom antigenen Peptid umfasst sind,
sind Regionen von abwehrenden Mitteln, die auf der Oberfläche des
Proteins lokalisiert sind, z. B. hydrophile Regionen.
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Demgemäß betrifft
ein weiterer Aspekt der Erfindung polyklonale und monoklonale Antikörper, gerichtet
gegen ein abwehrendes Mittel, die ein abwehrendes Mittel binden.
Polyklonale Abwehrmittel-ähnliche
Antikörper
können
hergestellt werden, indem ein geeignetes Subjekt (z. B. ein Kaninchen,
eine Ziege, eine Maus oder ein anderer Säuger) mit einem Abwehrmittelähnlichen
Immunogen immunisiert wird. Der Abwehrmittel-Antikörpertiter
im immunisierten Subjekt kann über
die Zeit hinweg mittels Standardtechniken, wie z. B. mit einem Enzymgekoppelten
Immunassay (ELISA) unter Verwendung immobilisierter antimikrobieller
Polypeptide, überwacht
werden. Zu einer geeigneten Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn
die Anti-Abwehrmittel-Antikörpertiter
am höchsten
sind, können
Antikörper-produzierende
Zellen aus dem Subjekt erhalten und verwendet werden, um monoklonale
Antikörper
mittels Standardtech niken herzustellen, z. B. der ursprünglich von Kahler
und Milstein (1975), Nature 256:495–497, beschriebenen Hybridomtechnik,
der Technik mit einem humanen B-Zellhybridom (Kozbor et al. (1983)
Immunol. Today 4:72), der EBV-Hybridomtechnik (Cole et al. (1985)
in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Hrsg. Reisfeld und
Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), S. 77–96) oder Triomtechniken. Die
Technologie zum Herstellen von Hybridomen ist gut bekannt (siehe allgemein
Coligan et al., Hrsg. (1994) Current Protocols in Immunology (John
Wiley & Sons,
Inc., New York, NY); Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Kenneth
(1980) in Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses
(Plenum Publishing Corp., NY; und Lerner (1981) Yale J. Biol. Med.,
54:387–402).
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Alternativ
zum Herstellen von Hybridomen, die monoklonale Antikörper sekretieren,
kann ein monoklonaler Anti-Abwehrmittel-ähnlicher Antikörper identifiziert
und isoliert werden, indem eine rekombinante kombinatorische Immunglobulin-Bibliothek
(z. B. eine Antikörper-Phagen-Displaybibliothek)
mit einem abwehrenden Mittel bzw. Abwehrmittel durchmustert wird,
um dadurch Immunglobulin-Bibliotheksmitglieder zu isolieren, die
das abwehrende Mittel binden. Kits zum erzeugen und Durchmustern
von Phagen-Displaybibliotheken sind im Handel erhältlich (z.
B. das Recombinant Phage Antibody System von Pharmacia, Katalog
Nr. 27-9400-01; und
das SurfZAP
TM Phage Display Kit von Stratagene,
Katalog Nr. 240612). Zusätzlich
können
Beispiele für Verfahren
und Reagenzien, die zur Verwendung beim Erzeugen und Durchmustern
einer Antikörper-Displaybibliothek
besonders hilfreich sind, z. B. im
US-Patent
Nr. 5 223 409 , den PCT-Veröffentlichungen mit den Nrn.
WO 92/18619 ,
WO 91/17271 ,
WO 92/20791 ,
WO 92/15679 ,
93/01288 ,
WO 92/01047 ,
92/09690 und
90/02809 ; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology
9:1370–1372;
Hay et al. (1992) Hum. Antibad. Hybridomas 3:81–85; Huse et al. (1989) Science
246:1275–1281;
Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725–734, gefunden werden. Die
Antikörper
können
verwendet werden, um Homologe der abwehrenden Mittel der Erfindung
zu identifizieren.
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Die
folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Erläuterung und nicht zum Zwecke
der Einschränkung
bereitgestellt.
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EXPERIMENTELLES
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Beispiel 1. Bioassay auf fungizide Aktivität von Polypeptiden
aus der Hämolymphe
von Manduca sexta
-
Nach
Auftrennung mittels Flüssigkeitschromatographie
(LC) wurden die verschiedenen Fraktionen, enthaltend Pathogen-induzierte
Polypeptide aus M. sexta, auf fungizide Aktivität gegen die Pflanzenpathogene M.
grisea, R. solani und F. verticilloides getestet. Die LC-Fraktionen wurden
zunächst
in 96-Well-Mikrotiterplatten lyophilisiert. Eine Suspension von
100 μl M.
grisea (oder einem anderen genannten Pathogen) wurde in der Standardkonzentration
für den
Pilzwachstums-Assay bzw. fungalen Wachstums-Assay (2500 Sporen/ml) zu
den Polypeptid-haltigen Mikrotiterplatten-Wells gegeben, und die
Platten wurden mit Borden® SealwrapTM verschlossen.
Die Platten wurden dann für
24 Stunden bei 28°C
in eine Dunkelkammer gegeben.
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Das
Hyphenwachstum wurde unter Verwendung eines Präpariermikroskops überwacht.
Die in den Wells, bei denen ein Hyphenwachstum fehlte oder die im
Vergleich zu Kontrollwells reduziertes Hypenwachstum zeigten, enthaltenen
Polypeptide wurden als fungizide Aktivität besitzend angesehen. Das
Hyphenwachstum wurde 48 Stunden nach der Inokulation für eine abschließende Bestimmung
der fungiziden Aktivität
erneut bewertet.
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Beispiel 2. Induktion einer antimikrobiellen
Reaktion in Manduca sexta
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M.
sexta-Larven im fünften
Larvenstadium wurden intersegmental 20 μl einer hochkonzentrierten Suspension
von M. grisea-Hyphen und -Sporen, die zuvor von einer Agarplattenkolonie
abgeschabt wurden, injiziert. Die Larven wurden dann auf frisches
Futter gesetzt und sich erholen gelassen. Nach 24, 48 und 72 Stunden
wurde Hämolymphe
aus den Larven gewonnen, indem ein Bauchfuß unter Verwendung einer feinen
chirurgischen Schere über
einem Blatt ParafilmTM abgetrennt wurde.
Auf diese Weise kann näherungsweise
1 ml/Insekt gesammelt werden. Die Hämolymphe wurde in einen 50
ml-Konuskolben überführt und
auf Eis gestellt, während
die verbleibenden Larven bearbeitet wurden. Sobald alle Larven bearbeitet
worden waren, wurde Phenylthioharnstoff ("phenyl thiolurea") zu einer Endkonzentration von 20 mM
zugegeben. Aprotinin wurde ebenfalls zu der Probe gegeben (Endkonzentration
20 μg/ml).
Die Proben wurden für
5 Minuten zentrifugiert (3000 UpM), um die Zellen zu pelletieren.
Der verbleibende Überstand
(Hämolymphe)
wurde einer Festphasenextraktion unter Verwendung von Festphasenextraktionssäulen vom
Typ Supelco Discovery® DSC-18 unterworfen. Die
Säulen
werden unter Verwendung von 100% Methanol vorkonditioniert, unter
Verwendung von 100% Lösungsmittel
A (5% Acetonitril, 0,1% TFA; 1 Säulenvolumen) äquilibriert,
bevor die Probe aufgebracht wird. Nachdem die Hämolymphe (der Überstand)
durchgefiltert bzw. durchgedrungen ist, wird die Säule mit Lösungsmittel
A gewaschen, bevor mit einem Säulenvolumen
von 60% Lösungsmittel
B/40% Lösungsmittel
A (Lösungsmittel
B: 95% Acetonitril, 0,1% TFA) eluiert wird. Der gesammelte Eluent
wird bei –80°C gefroren
und bis zur Trockne lyophilisiert. Hämolympheproben werden dann
in einem kleinen Volumen Wasser (üblicherweise 200–500 μl) resuspendiert,
und ein BCA-Assay wird durchgeführt,
um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Nach der Stufe der Festphasenextraktion
werden die Hämolympheproben
mittels HPLC fraktioniert und mittels Bioassay getestet.
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Die
Induktion von M. sexta mit B. bassiana und R. solani wurde in gleicher
Weise durchgeführt.
Mit R. solani induzierte M. sexta-cDNA-Bibliotheken wurden gemäß Standardprotokollen
konstruiert. Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus den Fettkörpern von
Pathogeninduzierter M. sexta isoliert. Die mRNAs wurden unter Verwendung
eines mRNA-Reinigungskits
(BRL) gemäß den Anweisungen
des Herstellers isoliert. Die cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung
des ZAP-cDNA-Synthese-Kits und des pBluescript-Phagemids (Stratagene)
konstruiert.
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Beispiel 3. HPLC-Fraktionierung von Polypeptiden
aus Hämolymphe
von Manduca sexta, induziert mit Magnaportha grisea
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Hämolymphe
aus mit M. grisea induzierten M. sexta-Larven (siehe Beispiel 2)
wurde an einer HPLC vom Typ HP-1100 fraktioniert, wobei eine Säule vom
Typ Vydack C4 (4,6–250
mm) verwendet wurde (3). Ein Gradientensystem wurde
zum Eluieren von gebundenen Proteinen verwendet. Die Gradientenbedingungen
sind unten angegeben. Fraktionen wurden in Intervallen von einer
Minute in einer 96-Well-Mikrotiterplatte gesammelt und auf fungizide
Aktivität
gegen M. grisea (siehe Beispiel 1) getestet.
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Diesem
Protokoll wurde auch zur Fraktionierung von Polypeptiden aus Hämolymphe
von M. sexta, induziert mit B. bassiana und R. solani, gefolgt.
Der Bioassay auf fungizide Aktivität (Beispiel 1) wurde auch unter Verwendung
der Pflanzenpathogene R. solani und F. verticilloides durchgeführt. Gradientenbedingungen: Lösungsmittel
Lösungsmittel
A: | 5%
Acetonitril, 0,1% TFA |
Lösungsmittel
B: | 95%
Acetonitril, 0,1% TFA |
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Flussrate
-
-
Gradient
-
-
Beispiel 4. Kapillar- bzw. Microbore-Reinigung
des fungiziden Polypeptids Mag1
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Nach
Fraktionierung mittels HPLC wurden jene Fraktionen aus Beispiel
3, die fungizide Aktivität
besaßen
(Fraktionen von 47–52
min) weiter aufgetrennt mittels Microbore-LC (Michrome Bioresources),
wobei eine Säule
vom Typ Vydack C4 (1–150
mm) verwendet wurde. Die Gradientenbedingungen sind unten angegeben. Der
Säuleneluent
wurde derart gesammelt, dass die Peaks mit dem höchsten Polypeptidgehalt am
besten getrennt wurden (
4). Die eluierten
Polypeptide wurden auf fungizide Aktivität gegen M. grisea getestet
(siehe Beispiel 1). Die Polypeptidfraktion, die die größte fungizide
Aktivität
enthielt, ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Gradientenbedingungen: Lösungsmittel
Lösungsmittel
A: | 5%
Acetonitril, 0,1% TFA |
Lösungsmittel
B: | 95%
Acetonitril, 0,1% TFA |
-
Flussrate
-
-
Gradient
-
- 5–65%
Lösungsmittel
B über
70 Minuten
-
Die
Polypeptidfraktion, die die größte fungizide
Aktivität
enthielt (in
4 mit einem Pfeil gekennzeichnet),
wurde unter Verwendung von Microbore-LC (Michrome Bioresources) an
einer Säule
vom Typ Vydack C18 (1–150
mm) weiter aufgetrennt (
5). Die Gradientenbedingungen
folgen. Wiederum wurden die Polypeptid-haltigen Fraktionen auf fungizide
Aktivität
gegen M. grisea getestet (siehe Beispiel 1). (Das resultierende
gereinigte Polypeptid wurde mit Mag1 bezeichnet). Gradientenbedingungen: Lösungsmittel
Lösungsmittel
A: | 5%
Acetonitril, 0,1% HFBA |
Lösungsmittel
B: | 95%
Acetonitril, 0,1% HFBA |
-
Flussrate
-
-
Gradient
-
- 5–65%
Lösungsmittel
B über
70 Minuten
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Diesem
Protokoll wurde auch für
die Microbore-Reinigung von fungiziden Peptiden, identifiziert in
Hämolymphe
von M. sexta, die mit B. bassiana und R. solani induziert wurde,
gefolgt. Der Bioassay auf fungizide Aktivität (Beispiel 1) wurde auch unter
Verwendung der Pflanzenpathogene R. solani und F. verticilloides durchgeführt.
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Beispiel 5. Bestimmung des Molekulargewichts
von Mag1
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Das
Molekulargewicht des isolierten Mag1-Polypeptids von Beispiel 4
wurde unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrophotometrie
(LC-MS) bestimmt. Die Molekülmasse
von Mag1 wurde unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie
an einer Micromass-Plattform, LCZ-Massenspektrometer (Micromass,
Manchester, UK), bestimmt. Eine Microbore-LC (Michrom Bioresources,
Auburn, CA) lieferte das Protein und mobile Phase (Acetonitril/Wasser),
wobei eine Umkehrphasensäule
verwendet wurde. Spektren wurden im positiv-Ionen-Modus erhalten,
wobei eine Kapillarenspannung von 3,5 kV, eine Konusspannung von
45 V und eine Quellentemperatur von 90°C verwendet wurden. Die Spektren
wurden über einen
Bereich von 600–3000
bei einer Rate von 3,5 s/Scan abgetastet. Die Molekülmassen
wurden unter Verwendung des Algorithmus für maximale Entropiedekonvolution
(MaxEnt) zum Transformieren des m/z-Bereichs 600–3000 unter Erhalt eines Spektrums
mit echter Massenskala bestimmt. Die Massenkalibration wurde unter
Verwendung von Pferdeherzmyoglobin durchgeführt.
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Ein ähnliches
Protokoll wurde für
die anderen Polypeptide der Erfindung durchgeführt.
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Beispiel 6. Lys-C-Endoproteinaseverdau
von Mag1
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Lyophilisierte
Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) in Sequenzierungsqualität wurde
in 50 μl redestilliertem
Wasser rekonstituiert, was in einer Pufferkonzentration von 50 mM
Tricin, pH 8,0, 10 mM EDTA und 0,5 mg/ml Raffinose resultierte.
Das Mag1-Polypeptid aus Beispiel 4 wurde im Verdaupuffer (25 mM Tris-HCl,
pH 8,5, 1 nM EDTA) zu einem Verhältnis
von 1:50 Lys-C zu Mag1-Polypeptid, bezogen auf das Gewicht, gelöst. Die
Reaktion wurde bei 37°C
für 20
Stunden fortschreiten gelassen. Das verdaute Polypeptid wurde unter Verwendung
einer C4-Säule
an einer Microbore-HPLC mit einem Gradienten von 5–65% Acetonitril
in 0,1% TFA über
70 Minuten bei einer Flussrate von 50 μl/min fraktioniert (6). Vier isolierte Fragmente wurden gesammelt
und zur N-terminalen Sequenzanalyse eingereicht.
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Ein ähnliches
Protokoll wurde für
den Verdau der anderen fungiziden Polypeptide der Erfindung befolgt.
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Beispiel 7. N-terminale Aminosäuresequenz-Bestimmung
von Mag1-Polypeptidfragmenten
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Die
N-Termini der isolierten Mag1-Fragmente aus Beispiel 6 wurden an
einem Proteinsequenziergerät vom
Typ ABI Procise® 494
sequenziert, das aus einer chemischen Arbeitsstation ("chemistry workstation"), einen PTH-Analysesystem,
einer Computersteuerung und einer automatisierten Sequenzbezeichnungs-
bzw. Sequenzaufruf-Software ("automated
sequence calling software")
bestand. Um das System zu betreiben und die Sequenzen zu bestimmen,
wurden Standardprotokolle verwendet (siehe 7).
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Die
N-terminalen Aminosäuresequenzen
von isolierten Fragmenten der anderen Polypeptide der Erfindung
wurden auf ähnliche
Weise bestimmt.
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Die
N-terminale Peptidsequenz ist beim Bestimmen der exakten oder genauen
Prozessierungsstelle für
die Umwandlung des Propeptids in die reife und aktive Form des Proteins
(in diesem Beispiel Mag1) kritisch. Dies ist für sekretorische Proteine besonders
wichtig.
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Die
C-terminale Peptidsequenz wurde sowohl aus dem mittels LC-MS des
aktiven Proteins erzeugten bzw. dargestellten Molekulargewichts
als auch des vorhergesagten Molekulargewichts des gleichen codierten Polypeptids
auf der Basis der identifizierten cDNA-Sequenz (in Beispiel 8) abgeleitet.
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Durch
Kenntnis der genauen Termin des reifen Proteins kann man DNA-Moleküle entwerfen
und konstruieren, die für
das gesamte aktive reife Protein für die Expression in Pflanzen
codieren. Wenn nötig,
können zusätzliche
Pflanzen-spezifische Kontrollelemente und Targetierungssequenzen
maßgeschneidert
und in das Gendesign eingebaut werden, um die Expression des reifen
Polypeptids in Pflanzen zu verstärken
und zu targetieren.
-
Um
die ursprüngliche
Spezifität
und Funktionalität
des z. B. Mag1-Proteins, die in der Pflanze bewahrt wird, sicherzustellen,
ist die Expression der aktiven reifen Form des Proteins in der Pflanze
essentiell.
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Beispiel 8. Isolation des cDNA-Klons,
der für
Mag1 codiert
-
Vor
der Bearbeitung wurden Fettkörper
direkt (unter Einbringung) in flüssigen
Stickstoff gesammelt. Gesamt-RNA aus Fettkörpern von provozierter Manduca
sexta wurde präpariert,
indem das Gewebe mit einem Mörser
und einem Pistill in flüssigem
Stickstoff pulverisiert und die Zellen in Gegenwart von TRIzol (Life
Technologies) gemäß dem Protokoll
des Herstellers lysiert wurden. PolyA(+)-RNA wurde mittels Oligo(dT)-Cellulose
aus Gesamt-RNA affinitätsgereinigt,
wobei das mRNA-Reinigungs-Kit (Amersham Pharmacia Biotech) unter
Befolgung des Protokolls des Herstellers bei der Vorbereitung auf
die cDNA-Bibliothekskonstruktion verwendet wurde. Die Erststrang-cDNA-Synthese
unter Verwendung von Superscript II (Life Technologies) und die
nachfolgende Zweitstrangsynthese, die Linkeraddition und die gerichtete
Klonierung in Restriktionsschnittstellen von pBlueScript SK+ (Stratagene)
wurden gemäß den Instruktionen,
die mit dem Stratagene-cDNA-Kit (Stratagene) geliefert wurden, durchgeführt. Die
cDNA wurde unter Verwendung einer cDNA-Säule (Life Technologies) unmittelbar
vor der Ligation in den Vektor gereinigt.
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Die
Sequenzierung der cDNA-Bibliotheksklone wurde unter Verwendung des
Kits mit der Bezeichnung "ABI
PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready kit" mit Polymerase vom
Typ FS AmpliTaq DNA (Perkin Elmer) durchgeführt, und es erfolgte eine Analyse
an einem automatischen DNA-Sequenziergerät vom Typ ABI Modell 373. Die
Mag1-Gensequenz wurde identifiziert, indem etwa 2000 Klone der cDNA-Bibliothek, hergestellt
aus mRNA, die aus den Fettkörpern
von provozierter M. sexta stammte, sequenziert wurden. Aminosäuresequenzen,
abgeleitet aus den Aminotermini des vollständigen Peptids oder der proteolytischen
Spaltprodukte, wurden zum Vergleich mit der entsprechenden cDNA-Klon-Sequenzbibliothek,
translatiert in die sechs möglichen
Raster, verwendet. Sequenzen, die eine 100%ige Identität zu den
N-terminalen Aminosäuresequenzen
enthielten, wurden vollständig
translatiert, und ihr vorhergesagtes MG wurde mit dem MG des gereinigten
Mag1-Proteins verglichen. Sequenzen mit vergleichbaren MGs wurden
als wahrscheinlich für Mag1
codierend identifiziert.
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Beispiel 9. Isolierung des cDNA-Klons,
der für
ein Polypeptid von Interesse codiert
-
Die
N-terminalen Aminosäuresequenz-tags
eines Polypeptids von Interesse werden verwendet, um cDNA-Klone
zu identifizieren, die für
das Polypeptid codieren. Degenerierte Oligonukleotide, die für die Aminosäuresequenz-tags
des Polypeptids codieren, werden als Sonden zum Detektieren von
cDNAs, die für
das Polypeptid codieren, in einer Pathogen-induzierten M. sexta-cDNA-Bibliothek
verwendet (siehe Beispiel 2). Auf diese Weise wird eine Volllängen-cDNA, die für das Polypeptid
von Interesse codiert, isoliert und sequenziert. Eine vollständige Sequenzierung
des identifizierten cDNA-Klons wird durchgeführt, um zu bestätigen, dass
er für
das gereinigte Polypeptid codiert. Die Bestätigung wird dadurch erhalten,
dass das vorhergesagte Molekulargewicht des cDNA-codierten Polypeptids
das gleiche ist, wie das Molekulargewicht, das durch LC-MS generiert
wurde.
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Beispiel 10. Konstruktion eines rekombinanten
Baculovirus, der fungizide Polypeptide exprimiert
-
Die
Nukleotidsequenzen, die für
die Polypeptide der Erfindung codieren, können in das Baculovirus-Genom
selbst eingeführt
werden. Zu diesem Zweck können
die Nukleotidsequenzen unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors,
des IE1-Promotors oder eines beliebigen anderen der Baculovirus-Promotoren
gestellt werden. Die cDNA wird anschließend zusammen mit zweckdienlichen
Leadersequenzen in einen Baculovirus-Transfervektor inseriert, wobei
Standardtechniken der molekularen Klonierung verwendet werden. Nach
Transformation von E. coli DH5α werden
isolierte Kolonien ausgewählt,
und Plasmid-DNA wird präpariert und
mittels Restriktionsenzymanalyse analysiert. Kolonien, die das geeignete
Fragment enthalten, werden isoliert, propagiert, und Plasmid-DNA
wird für
die Cotransfektion präpariert.
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Beispiel 11. Expression von fungiziden
Polypeptiden in Insektenzellen
-
Die
Polypeptide der Erfindung können
in Insektenzellen exprimiert werden. Zu diesem Zweck werden die
Spodoptera frugiperda-Zellen (Sf-9 oder Sf-21) in ExCell® 401-Medium
(JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder einem ähnlichen Medium, supplementiert
mit 3,0% fötalem
Rinderserum, propagiert. Lipofectin® (50 μl bei 0,1
mg/ml, Gibco/BRL) wird zu einem 50 μl-Aliquot des Transfervektors,
enthaltend die antimikrobiellen Nukleotidsequenzen (500 ng) und
linearisiertes Polyhedrin-negatives AcNPV (2,5 μg, Baculogold®-Virus-DNA, Pharmigen-San Diego, CA), gegeben.
Sf-9-Zellen (näherungsweise
50%ige Monoschicht) werden mit der Virus-DNA/Transfervektor-Lösung cotransfiziert.
Die überstehende
Flüssigkeit
aus dem Cotransfektionsexperiment wird 5 Tage nach der Transfektion
gesammelt, und rekombinante Viren werden unter Einsatz von Standardprotokollen
zur Plaque-Reinigung isoliert, wobei nur Polyhedrin-positive Plaques
ausgewählt
werden (O'Reilly
et al. (1992), Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual,
W. H. Freeman und Company, New York). Sf-9-Zellen in 35 mm Petrischalen
(50%ige Monoschicht) werden mit 100 μl einer seriellen Verdünnung der
Virussuspension inokuliert, und die überstehenden Flüssigkeiten
werden 5 Tage nach der Infektion gesammelt. Um größere Mengen
des Virus für
eine Charakterisierung herzustellen, werden diese überstehenden
Flüssigkeiten
verwendet, um größere Gewebekulturen
für eine
Propagierung von rekombinanten Viren in großem Maßstab zu inokulieren. Die Expression
des codierten fungiziden Polypeptids durch das rekombinante Baculovirus
kann unter Verwendung eines Bioassays (wie in Beispiel 4 beschrieben)
von LC-MS oder von Antikörpern
bestätigt
werden.
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Beispiel 12. Expression von fungiziden
Peptiden in Pichia
-
Die
Nukleotidsequenzen, die für
die Polypeptide der Erfindung codieren, können in Pichia unter der Kontrolle
eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors exprimiert und
so targetiert werden, dass sie intrazelluär bleiben oder in das Medium
sekretiert werden. Die Nukleotidsequenzen werden in einem Pichia-Expressionsvektor
unter Verwendung von molekularen Standardtechniken kloniert. Die
Transformation von Pichia-Stämmen
(z. B. X-33, GS115, SMD1168, KM71 etc. – Invitrogen, Carlsbad, CA)
involviert die Linearisierung des Konstrukts und die Einführung der
DNA in Transformations-kompetente Pichia-Zellen durch chemische
Mittel oder durch Elektroporation gemäß Standardprotokollen. Transformanten
werden entweder anhand ihrer Resistenz gegenüber Zeocin oder Blasticidin
oder anhand ihrer Fähigkeit,
auf Histidin-defizientem Medium zu wachsen, identifiziert. Expressionstests
in kleinem Maßstab
werden an ausgewählten
Transformanten durchgeführt,
um für
eine weitere Maßstabsvergrößerung solche
zu identifizieren, die die Polypeptide der Erfindung hoch exprimieren.
Bei einem induzierbaren System, z. B. wenn das Peptid unter der
Kontrolle des AOX1-Promotors steht, werden Transformanten in einem
Medium bzw. Medien mit Glycerin als Kohlenstoffquelle gezüchtet und
durch Wachstum in einem Medium bzw. Medien, enthaltend Methanol
anstelle von Glycerin, induziert. Eine kontinuierliche Induktion über einen
Zeitraum von 24–120
Stunden wird durch Zugabe von Methanol (0,5% Endkonzentration) alle
24 h erreicht. Die funktionelle Expression des Polypeptids wird
mittels LC-MS-Analyse/Reinigung und Bioassay bestätigt.
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Beispiel 13. Expression von fungiziden
Polypeptiden in Bakterien
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Die
Nukleotidsequenzen, die für
die Polypeptide der Erfindung codieren, können in Bakterien exprimiert
und die Peptide für
intrazelluläre
oder extrazelluläre
Expression targetiert werden. Die cDNAs können in einen geeigneten bakteriellen
Expressionsvektor (z. B. pET-Vektoren (Novagen, Madison, WI)) kloniert
werden, und zwar unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren
Promotors, wobei Standardtechniken der molekularen Klonierung verwendet
werden. Das Plasmid, das das Gen von Interesse enthält, wird
in Transformations-kompetente Bakterienzellen unter Verwendung von
Standardprotokollen für
die Transformation mit Chemikalien oder Elektroporation eingeführt, und
die Transformanten werden unter Verwendung einer Antibiotikaresistenz
ausgewählt.
Zusätzlich
zu traditionellen E. coli-Stämmen,
die herkömmlicherweise
für die
Transformation verwendet werden, können mutante Stämme, wie
OrigamiTM (Novagen), die eine Disulfid-Brückenbindung
ermöglichen,
verwendet werden, insbesondere um bei Cystein-reichen Peptiden funktionelle
Peptide zu exprimieren. Induzierbare Systeme, wie E. coli-Stämme, die
das T7-RNA-Polymerasegen (Lambda-DE3-Lysogen) tragen, können verwendet
werden, wobei die Expression des Gens von Interesse unter einem
T7-Promotor durch Zugabe von IPTG für variable Zeitspannen induziert
wird. Die Expression und die Aktivität der Polypeptide werden mittels
LC-MS und Bioassays bestätigt.
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Beispiel 14. Transformation von embryogenem
Reiskallus durch Bombardierung und Regeneration von transgenen Pflanzen
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Embryogene
Calluskulturen, die aus dem Scutellum bzw. Schildchen von keimenden
Samen stammen, dienen als Ausgangsmaterial bzw. Quelle für Transformationsexperimente.
Dieses Material wird erzeugt, indem sterile Reissamen auf einem
Callus-Initiationsmedium (MS-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch,
1,0 mg/l 2,4-D und 10 μM
AgNO3) im Dunklen bei 27–28°C keimen gelassen werden. Embryogener
Callus, der aus dem Scutellum der Embryonen proliferiert, wird dann
auf CM-Medium (N6-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 1 mg/l
2,4-D, Chu et al., 1985, Sci. Sinica 18:659–668) transferiert. Calluskulturen
werden auf CM mittels routinemäßiger Subkultur
in zweiwöchigen
Intervallen aufrechterhalten und innerhalb von 10 Wochen nach der
Initiaition zur Transformation verwendet.
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Callus
wird für
die Transformation vorbereitet, indem im Zentrum eines Kreises aus
Papier vom Typ Whatman #541, der auf CM-Medium aufgegeben ist, 0,5–1,0 mm
große
Stücke,
die etwa 1 mm beabstandet in einer kreisförmigen Fläche von etwa 4 cm Durchmesser
angeordnet werden, subkultiviert werden. Die Platten mit Callus
werden für
3–5 Tage
im Dunklen bei 27–28°C inkubiert.
Vor der Bombardierung werden die Filter mit dem Callus auf CM, supplementiert
mit 0,25 M Mannit und 0,25 M Sorbit, transferiert, und zwar für 3 Stunden
im Dunk len. Die Petrischalendeckel werden dann für 20–45 Minuten in einer Sterilbank
("sterile hood") halb offen gelassen,
um Feuchtigkeit auf den Platten verschwinden zu lassen.
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Zirkuläre Plasmid-DNA
von zwei unterschiedlichen Plasmiden, wobei eines den selektierbaren
Marker für
die Reistransformation enthält
und eines das Nukleotid der Erfindung enthält, wird auf der Oberfläche von Goldpartikeln
co-präzipitiert.
Um dies zu bewerkstelligen, wird eine Gesamtmenge von 10 μg DNA bei
einem 2:1-Verhältnis
von Merkmals-DNA:DNA für
einen selektierbaren Marker zu einem 50 μl-Aliquot von Goldpartikeln,
resuspendiert zu einer Konzentration von 60 mg/ml, gegeben. Calciumchlorid
(50 μl einer
2,5 M-Lösung) und
Spermidin (20 μl
einer 0,1 M Lösung)
werden anschließend
zu der Gold-DNA-Suspension gegeben, wobei das Röhrchen für 3 Minuten einer Vortexbehandlung
unterzogen wird. Die Goldpartikel werden für 1 s in einer Kleinzentrifuge
("microfuge") zentrifugiert,
und der Überstand
wird entfernt. Die Goldpartikel werden anschließend zweimal mit 1 ml absolutem
Ethanol gewaschen und anschließend
in 50 μl
absolutem Ethanol resuspendiert und für 1 s (Ultra-)Schall-behandelt((Ultra-)Schallbad),
um die Goldpartikel zu dispergieren. Die Goldsuspension wird für 5 Minuten
bei –70°C inkubiert
und (Ultra-)Schall-behandelt((Ultra-)Schallbad), sofern nötig, um
die Partikel zu dispergieren. Sechs Mikroliter der DNA-beschichteten
Goldpartikel werden anschließend auf
Mylar-Makrocarrier-Scheiben geladen, und das Ethanol wird verdampfen
gelassen.
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Am
Ende des Trocknungszeitraums wird eine Petrischale, die das Gewebe
enthält,
in die Kammer des Geräts
mit der Bezeichnung PDS-1000/He gestellt. Die Luft in der Kammer
wird anschließend
bis zu einem Vakuum von 28–29
Zoll Hg evakuiert. Der Makrocarrier wird mit einer Heliumschockwelle
beschleunigt, wobei eine Berstmembran verwendet wird, die birst,
wenn der He-Druck im Schockrohr 1080–1100 psi erreicht. Das Gewebe
wird näherungsweise
8 cm vom Stoppschirm beabstandet angeordnet, und der Callus wird
zweimal bombardiert. Fünf
bis sieben Platten Gewebe werden auf diese Weise mit den DNA-beschichteten
Goldpartikeln bombardiert. Nach der Bombardierung wird der Callus
auf CM-Medium ohne zusätzliches
Sorbit oder Mannit transferiert.
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Innerhalb
von 3–5
Tagen nach der Bombardierung wird das Callusgewebe auf SM-Medium (CM-medium,
enthaltend 50 mg/l Hygromycin), transferiert. Um dies zu bewerkstelligen,
wird Callusgewebe von Platten in sterile 50 ml-Konusröhrchen transferiert
und abgewogen. Geschmolzener Deckagar mit 40°C wird zugegeben, wobei 2,5
ml Deckagar/100 mg Callus verwendet werden. Callusklumpen werden
durch wiederholtes Aufziehen bzw. Dispensieren durch eine 10 ml-Pipette
zu Fragmenten von weniger als 2 mm Durchmesser gebrochen. Aliquote
von 3 ml der Callussuspension werden auf frischem SM-Medium ausplattiert,
und die Platten werden im Dunklen für 4 Wochen bei 27–28°C inkubiert.
Nach 4 Wochen werden transgene Callusereignisse identifiziert, auf
frische SM-Platten transferiert und für weitere 2 Wochen im Dunklen
bei 27–28°C kultiviert
bzw. gezüchtet.
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Wachsender
Callus wird für
2 Wochen im Dunklen bei 25°C
auf RM1-Medium (MS-Salze,
Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 2% Saccharose, 3% Sorbit, 0,4%
Gelrite + 50 ppm hyg B) transferiert. Nach 2 Wochen wird der Callus
auf RM2-Medium (MS-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 3% Saccharose,
0,4% Gelrite + 50 ppm hyg B) transferiert und unter kaltweißes Licht
(~40 μEm–2s–1)
mit einer 12-stündigen
Photoperiode bei 25°C
und 30–40%
Luftfeuchte gegeben. Nach 2–4
Wochen im Licht beginnt sich der Callus zu organisieren und bildet
Schösslinge.
Die Schösslinge
werden aus dem umgebenden Callus/Medium entfernt und vorsichtig auf
RM3-Medium (1/2 × MS-Salze,
Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 1% Saccharose + 50 ppm Hygromycin B)
in Phytatrays (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) überführt, und
die Inkubation wird unter den gleichen Bedingungen, wie sie in der
vorigen Stufe beschrieben sind, fortgesetzt.
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Die
Pflanzen werden von RM3 auf 4''-Töpfe, enthaltend
Metro-Mix 350, nach 2–3
Wochen transferiert, wenn ein hinreichendes Wurzel- und Schösslingswachstum
aufgetreten ist. Die Pflanzen werden unter einem Licht/Dunkelheit-Zyklus
von 12 Stunden/12 Stunden gezogen, wobei ein Tag/Nacht-Temperaturregime
von ~30/18°C
verwendet wird.
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Beispiel 15. Transformation von Mais mittels
Partikelbombardierung und Regeneration von transgenen Pflanzen.
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Unreife
Maisembryonen aus Gewächshaus-Spenderpflanzen
werden mit einem Plasmid bombardiert, das eine Nukleotidsequenz
der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Ubiquitinpromotor
und das selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene
70:25–37),
das Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos verleiht, enthält. Alternativ
wird das selektierbare Markergen auf einem separaten Plasmid bereitgestellt.
Die Transformation wird wie folgt durchgeführt. Die Rezepte für Medien
folgen unten.
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Präparation von Zielgewebe
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Die
Lieschblätter
der Kolben werden entfernt, und die Kolben werden in 30%iger Clorox-Bleiche
plus 0,5% Mikro-Detergens für
20 Minuten oberflächensterilisiert
und zweimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die unreifen Embryonen
werden exzidiert und mit den Embryoachsenseiten nach unten (Scutellum-
bzw. Schildchenseiten nach oben) zu 25 Embryonen pro Platte für 4 Stunden
auf 560Y-Medium aufgegeben und anschließend innerhalb der 2,5 cm-Zielzone
zur Vorbereitung der Bombardierung angeordnet.
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Präparation von DNA
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Ein
Plasmidvektor, der die Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller
Verknüpfung
mit einem Ubiquitin-Promotor umfasst, wird hergestellt. Diese Plasmid-DNA
plus Plasmid-DNA, die einen selektierbaren PAT-Marker enthält, wird
auf Wolframpellets von 1,1 μm
(mittlerer Durchmesser) präzipitiert,
wobei eine CaCl2-Präzipitationsverfahrensweise
wie folgt verwendet wird:
100 μl vorbereitete Wolfram-Partikel
in Wasser
10 μl
(1 μg) DNA
in Tris-EDTA-Puffer (1 μg
Gesamt-DNA)
100 μl
2,5 M CaCl2
10 μl 0,1 M Spermidin
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Jedes
Reagens wird sequenziell zu der Wolframpartikelsuspension gegeben,
während
diese auf einem Vortexgerät
für mehrere
Röhrchen
("multitube vortexer") gehalten wird.
Das endgültige
Gemisch wird kurz (Ultra-)Schall-behandelt und unter konstanter
Vortexbehandlung für
10 Minuten inkubieren gelassen. Nach der Präzipitationszeitdauer werden
die Röhrchen
kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit
wird entfernt, es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden
zentrifugiert. Wiederum wird die Flüssigkeit entfernt, und 105 μl 100% Ethanol
werden zu den endgültigen
Wolframpartikelpellets gegeben. Für die Partikelkanonenbombardierung
werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz (Ultra-)Schall-behandelt, und
10 μl werden
auf das Zentrum von jedem Makrocarrier aufgetüpfelt und vor der Bombardierung
etwa 2 Minuten trocknen gelassen.
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Partikelkanonenbehandlung
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Die
Probenplatten werden auf dem Level #4 in der Partikelkanone #HE34-1
oder #HE34-2 bombardiert.
Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss bei 650 psi mit einer
Gesamtzahl von 10 Aliquoten, die aus jedem Röhrchen präparierter Partikel/DNA entnommen
wurden.
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Anschließende Behandlung
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Nach
der Bombardierung werden die Embryonen für 2 Tage auf 560Y-Medium gehalten,
anschließend auf
560R-Selektionsmedium, das 3 mg/Liter Bialaphos enthält, transferiert
und alle 2 Wochen subkultiviert. Nach näherungsweise 10 Wochen der
Selektion werden Selektionsresistente Callusklone auf 288J-Medium transferiert,
um die Regeneration von Pflanzen zu initiieren. Nach der Reifung
von somatischen Embryonen (2–4
Wochen) werden gut entwickelte somatische Embryonen auf Medium zur
Keimung transferiert und in den beleuchteten Kulturraum verbracht.
Näherungsweise
7–10 Tage
später
werden sich entwickelnde Pflänzchen für 7–10 Tage
auf Hormon-freies 272V-Medium in Röhrchen transferiert, bis Pflänzchen gut
etabliert sind. Die Pflanzen werden anschließend auf Einsätze in Multitopfpaletten
(entsprechend einem 2,5''-Topf), die Topferde enthalten,
transferiert und für
1 Woche in einer Wachstumskammer gezogen. Anschließend werden
sie für
weitere 1–2
Wochen im Gewächshaus
gezogen, anschließend
auf Töpfe
vom Typ "Classic
600" (1,6 Gallonen) transferiert
und bis zur Reife gezogen. Die Pflanzen werden überwacht und bewertet hinsichtlich
der Expression der Nukleotidsequenz, die für das fungizide Polypeptid
der Erfindung codiert, oder hinsichtlich des Vorhandenseins des
fungiziden Polypeptids mittels immunologischer Verfahren oder hinsichtlich
fungizider Aktivität
mittels Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie hierin
supra beschrieben.
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Bombardierung und Kulturmedien
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Das
Bombardierungsmedium (560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA
C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitamingemisch (1000X, SIGMA-1511), 0,5
mg/l Thiamin-HCl, 120,0 g/l Saccharose, 1,0 mg/l 2,4-D und 2,88
g/l L-Prolin (nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH mit D-I H2O auf das Volumen aufgefüllt); 2,0 g/l Gelrite (zugegeben
nach Auffüllen
auf das Volumen mit D-I H2O) und 8,5 mg/l
Silbernitrat (zugegeben nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf
Raumtemperatur). Das Selektionsmedium (560R) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze
(SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitamingemisch (1000X, SIGMA-1511),
0,5 mg/l Thiamin-HCl, 30,0 g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D (nach
Einstellung auf pH 5,8 mit KOH mit D-I H2O
auf das Volumen aufgefüllt);
3,0 g/l Gelrite (nach Auffüllen
des Volumens mit D-I H2O zugegeben) und
0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisieren
des Mediums und Abkühlen
auf Raumtemperatur zugegeben).
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Das
Pflanzenregenerationsmedium (288J) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO
11117-074), 5,0
ml/l MS-Vitamine-Stammlösung
(0,100 g Nicotinsäure,
0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin,
mit hochfiltriertem ("polished") D-I H2O
auf das Volumen aufgefüllt)
(Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l Myoinosit,
0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (nach
Einstellung auf pH 5,6 mit hochfiltriertem D-I H2O
auf das Volumen aufgefüllt);
3,0 g/l Gelrite (nach Auffüllen
des Volumens mit D-I H2O zugegeben) und
1,0 mg/l Indolessigsäure
und 3,0 mg/l Bialaphos (zugegeben nach Sterilisieren des Mediums
und Abkühlen
auf 60°C).
Das Hormon-freie Medium (272 V) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO
11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamine-Stammlösung (1,00 g/l Nicotinsäure, 0,02
g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, mit
hochfiltriertem ("polished") D-I H2O
auf das Volumen aufgefüllt),
0,1 g/l Myoinosit und 40,0 g/l Saccharose (nach Einstellung auf
pH 5,6 mit hochfiltriertem D-I H2O auf das
Volumen aufgefüllt)
und 6 g/l Bacto-Agar (zugegeben nach Auffüllen des Volumens mit hochfiltriertem D-I
H2O), sterilisiert und abgekühlt auf
50°C.
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Beispiel 16. Agrobacterium-vermittelte
Transformation von Mais und Regeneration von transgenen Pflanzen
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Für eine Agrobacterium-vermittelte
Transformation von Mais mit einer Pflanzen-optimierten Nukleotidsequenz
der Erfindung wird vorzugsweise das Verfahren von Zhao eingesetzt
(
US-Patent Nr. 5 981 840 und PCT-Patentveröffentlichung
WO98/32326 ). Kurz gesagt,
werden unreife Embryonen aus Mais isoliert, und die Embryonen werden
mit einer Suspension von Agrobacterium in Kontakt gebracht, wobei
die Bakterien dazu fähig
sind, die Pflanzenoptimierte Nukleotidsequenz der Erfindung auf
bzw. in wenigstens eine Zelle von wenigstens einem der unreifen
Embryonen zu transferieren (Stufe 1: die Infektionsstufe). In dieser
Stufe werden die unreifen Embryonen vorzugsweise in eine Agrobacterium-Suspension
eingetaucht, um die Inokulation zu initiieren. Die Embryonen werden
für eine
gewisse Zeit mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Stufe 2: die Co-Kultivierungsstufe).
Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen nach der Infektionsstufe
auf festem Medium kultiviert. Nach dieser Co-Kultivierungszeitdauer wird eine optionale "Ruhe"-Stufe in Erwägung gezogen. In
dieser Ruhestufe werden die Embryonen in Gegenwart von wenigstens
einem Antibiotikum, das dafür
bekannt ist, das Wachstum von Agrobacterium zu inhibieren, ohne
Zugabe eines Selektionsmittels für
Pflanzentransformanten inkubiert (Stufe 3: Ruhestufe). Die unreifen
Embryonen werden vorzugsweise auf festem Medium mit Antibiotikum,
jedoch ohne ein Selektionsmittel, kultiviert für die Elimination von Agrobacterium
und für eine
Ruhephase für
die infizierten Zellen. Anschließend werden inokulierte Embryonen
auf einem Medium, das ein Selektionsmittel enthält, kultiviert, und wachsender,
transformierter Callus wird gewonnen (Stufe 4: die Selektionsstufe).
Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen auf einem festen Medium
mit einem Selektionsmittel kultiviert, was im selektiven Wachstum
von transformierten Zellen resultiert. Der Callus wird anschließend zu
Pflanzen regeneriert (Stufe 5: die Regenerationsstufe), und vorzugsweise
werden Calli, die auf Selektivmedium gewachsen sind, auf festem
Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
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Beispiel 17. Transformation von Sojabohnenembryonen
und Regeneration von transgenen Pflanzen
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Sojabohnenembryonen
werden mit einem Plasmid, das eine Nukleotidsequenz der Erfindung
in funktioneller Verknüpfung
mit einem Ubiquitin-Promotor enthält, wie folgt bombardiert.
Um somatische Embryonen zu induzieren, werden Keimblätter in
einer Länge
von 3–5
mm aus oberflächensterilisierten
unreifen Samen des Sojabohnenkultivars A2872 dissektiert und unter
Licht oder im Dunklen bei 26°C
auf einem geeigneten Agarmedium für sechs bis zehn Wochen kultiviert.
Somatische Embryonen, die sekundäre
Embryonen produzieren, werden anschließend exzidiert und in ein geeignetes
Flüssigmedium
gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster von somatischen
Embryonen, die sich als Embryonen der frühen, globulären Stufe vermehrten, wurden
die Suspensionen aufrechterhalten, wie nachstehend beschrieben.
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Embryogene
Sojabohnen-Suspensionskulturen können
in 35 ml Flüssigmedium
auf einem Rotations- bzw. Orbitalschüttler, 150 UpM, bei 26°C mit Fluoreszenzlampen
mit einem Tag/Nacht-Zeitplan von 16:8 Stunden aufrechterhalten werden.
Die Kulturen werden alle 2 Wochen subkultiviert, indem näherungsweise
35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium
inokuliert werden.
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Embryogene
Sojabohnenkulturen können
anschließend
mittels des Verfahrens der Partikelkanonenbombardierung (Klein et
al. (1987) Nature (London) 327:70–73,
US-Patent Nr. 4 945 050 ) transformiert
werden. Für
diese Transformationen kann ein Gerät mit der Bezeichnung Du Pont
Biolistic PDS 1000/HE (Helium-Nachrüstung) verwendet werden.
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Ein
selektierbares Markergen, das verwendet werden kann, um die Sojabohnentransformation
zu erleichtern, ist ein Transgen, bestehend aus dem 35S-Promotor
aus dem Blumenkohlmosaikvirus (Odell et al. (1985) Nature 313:810–812), dem
Hygromycin-Phosphotransferasegen aus dem Plasmid pJR225 (aus E.
coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179–188) und der 3'-Region des Nopalinsynthasegens aus der
T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Die Expressionskassette,
die die Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit
dem Ubiquitin-Promotor umfasst, kann als ein Restriktionsfragment
isoliert werden. Dieses Fragment kann anschließend in eine singuläre Restriktionsschnittstelle
des Vektors, der das Markergen trägt, inseriert werden.
-
Zu
50 μl einer
60 mg/ml-Suspension von 1 μm-Goldpartikeln
werden gegeben (in dieser Reihenfolge): 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl2 (2,5 M). Die Partikelpräparation wird anschließend für drei Minuten
geschüttelt,
in einer Kleinzentrifuge für
10 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die
DNA-beschichteten Partikel werden anschließend einmal in 400 μl 70% Ethanol
gewaschen und in 40 μl
wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension
kann dreimal für
jeweils eine Sekunde (Ultra-)Schall-behandelt werden. Fünf Mikroliter
der DNA-beschichteten Goldpartikel werden anschließend auf
jede Makrocarrierscheibe geladen.
-
Näherungsweise
300–400
mg einer 2 Wochen alten Suspensionskultur werden in eine leere Petrischale
mit den Abmessungen 60 × 15
mm gegeben, und die restliche Flüssigkeit
wird mit einer Pipette vom Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment
werden normalerweise näherungsweise
5–10 Platten
Gewebe bombardiert. Der Membranberstdruck wird auf 1100 psi eingestellt,
und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28 Zoll Quecksilber(säule) evakuiert.
Das Gewebe wird näherungsweise
3,5 Zoll vom Rückhalteschirm
entfernt angeordnet und dreimal bombardiert. Nach der Bombardierung
kann das Gewebe hälftig
aufgeteilt und in Flüssigkeit
zurückgegeben
und wie oben beschrieben kultiviert werden.
-
Fünf bis sieben
Tage nach der Bombardierung kann das Flüssigmedium durch frisches Medium
ersetzt werden und elf bis zwölf
Tage nach der Bombardierung durch frisches Medium, das 50 mg/ml
Hygromycin enthält.
Dieses Selektivmedium kann wöchentlich
aufgefrischt werden. Sieben bis acht Wochen nach der Bombardierung
kann grünes,
transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus nicht-transformierten
nekrotischen embryogenen Clustern hervorwächst. Isoliertes grünes Gewebe
wird entfernt und in einzelne Kolben inokuliert, um neue, klonal
propagierte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen.
Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis
behandelt werden. Diese Suspensionen können anschließend subkultiviert
und als Cluster unreifer Embryonen aufrechterhalten oder zu ganzen
Pflanzen regeneriert werden, und zwar durch Reifung und Keimung
von einzelnen somatischen Embryonen.
-
Beispiel 18. Transformation von Sonnenblumen-Meristemgewebe
und Regeneration von transgenen Pflanzen
-
Sonnenblumen-Meristemgewebe
werden mit einer Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz der
Erfindung in funktioneller Verknüpfung
mit einem Ubiquitin-Promotor enthält, wie folgt transformiert
(siehe auch Europäisches
Patent Nr.
EP 0 486233 und
Malone-Schoneberg
et al. (1994) Plant Science 103:199–207). Reife Sonnenblumensamen
(Helianthus annuus L.) werden unter Verwendung einer Dreschvorrichtung
für einzelne
Weizenähren
entspelzt. Die Samen werden für
30 Minuten in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung mit Zugabe von 2 Tropfen
Tween 20 pro 50 ml der Lösung
oberflächensterilisiert.
Die Samen werden zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült.
-
Explantate
mit bzw. nach Spaltung der Embryonalachse werden mittels einer Modifikation
von Verfahrensweisen, die von Schrammeijer et al. (Schrammeijer
et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:55–60) beschrieben wurden, präpariert.
Nach der Oberflächensterilisationsverfahrensweise
werden die Samen in destilliertem Wasser für 60 Minuten imbibieren gelassen.
Die Keimblätter
von jedem Samen werden anschließend
abgebrochen, wobei ein sauberer Bruch an der Ebene der Embryonalachse
erzeugt wird. Nach Exzision der Wurzelspitze werden die Explantate
in Längsrichtung
zwischen den Primordialblättern
zweigeteilt. Die zwei Hälften
werden mit der Schnittfläche
nach oben auf GBA-Medium platziert, das aus Mineralelementen nach
Murashige und Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant., 15:473–497), Shepard-Vitaminzusätzen (Shepard
(1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops
(University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota)), 40 mg/l Adeninsulfat,
30 g/l Saccharose, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin
(BAP), 0,25 mg/l Indol-3-essigsäure
(IAA), 0,1 mg/l Gibberellinsäure
(GA3), pH 5,6, und 8 g/l Phytagar besteht.
-
Vor
der Agrobacterium-Behandlung werden die Explantate einer Mikroprojektil-Bombardierung unterworfen
(Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301–313). Für diese Behandlung werden dreißig bis
vierzig Explantate in einem Kreis im Zentrum einer Platte mit den
Abmessungen 60 × 20
mm angeordnet. Näherungsweise
4,7 mg 1,8 mm-Wolfram-Mikroprojektile werden in 25 ml sterilem TE-Puffer
(10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, und Aliquote
von 1,5 ml werden je Bombardierung verwendet. Jede Platte wird zweimal
durch einen 150 mm Nytex-Schirm, der 2 cm oberhalb der Proben in
einem Partikelbeschleunigungsgerät vom
Typ PDS 1000® angeordnet
ist, bombardiert.
-
Der
entschärfte
Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 wird in allen Transformationsexperimenten
verwendet. Ein binärer
Plasmidvektor, umfassend die Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz
der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit dem Ubiquitin-Promotor
enthält,
wird über
Gefrieren/Tauen in den Agrobacterium-Stamm EHA105 eingeführt, wie
von Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet., 163:181–187, beschrieben.
Dieses Plasmid umfasst ferner ein selektierbares Kanamycin-Markergen
(d. h. nptII). Bakterien für Pflanzentransformationsexperimente
werden über
Nacht (28°C
und 100 UpM kontinuierliches Schütteln
bzw. kontinuierliche Bewegungen) in YEP-Flüssigmedium (10 g/l Hefeextrakt,
10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0) mit den für die Aufrechterhaltung
des Bakterienstammes und des binären
Plasmids erforderlichen Antibiotika gezüchtet. Die Suspension wird
verwendet, wenn sie eine OD600 von etwa
0,4 bis 0,8 erreicht. Die Agrobacterium-Zellen werden pelletiert
und zu einer End-OD600 von 0,5 in einem Inokulationsmedium,
bestehend aus 12,5 mM MES, pH 5,7, 1 g/l NH4Cl
und 0,3 g/l MgSO4, resuspendiert.
-
Frisch
bombardierte Explantate werden in eine Agrobacterium-Suspension
gegeben, damit gemischt und für
30 Minuten ungestört
gelassen. Die Explantate werden anschließend auf GBA-Medium transferiert
und mit der Schnittfläche
nach unten bei 26°C
und 18-Stunden-Tagen co-kultiviert. Nach dreitägiger Co-Kultivierung werden
die Explantate auf 374B (GBA-Medium ohne Wachstumsregulatoren und
mit einer verringerten Saccharosekonzentration von 1%), supplementiert
mit 250 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Kanamycinsulfat, transferiert.
Die Explantate werden für
zwei bis fünf
Wochen auf Selektion(smedium) kultiviert und anschließend auf
frisches 374B-Medium ohne Kanamycin für ein bis zwei Wochen der fortgesetzten
Entwicklung transferiert. Explantate mit sich differenzierenden,
Antibiotika-resistenten Wachstumsbereichen, die keine Schösslinge,
die für
eine Exzision geeignet sind, produziert haben, werden für eine zweite
3-tätige
Phytohormonbehandlung auf GBA-Medium, das 250 mg/l Cefotaxim enthält, transferiert.
Blattproben aus grünen,
Kanamycin-resistenten Schösslingen
werden auf das Vorhandensein von NPTII mittels ELISA und auf das
Vorhandensein von Transgenexpression mittels Testen auf die Expression
der Nukleotidsequenz, die für
das fungizide Polypeptid der Erfindung codiert, die Gegenwart des
fungiziden Polypeptids mittels immunologischer Verfahren oder auf
fungizide Aktivität
mittels Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie supra hierin
beschrieben, getestet.
-
NPTII-positive
Schösslinge
werden auf in vitro gezüchtete
Sonnenblumensämlings-Wurzelstöcke der Pioneer®-Hybride
6440 gepfropft. Oberflächensterilisierte
Samen werden in 48-0-Medium (halbkonzentrierte Salze nach Murashige
und Skoog, 0,5% Saccharose, 0,3% Gelrite, pH 5,6) gekeimt und unter
den für
die Explantatkultur beschriebenen Bedingungen gezogen bzw. wachsen
gelassen. Der obere Teil des Sämlings
wird entfernt, ein vertikaler Einschnitt von 1 cm wird im Hypokotyl
erstellt, und der transformierte Schössling wird in den Schnitt
eingeführt.
Der gesamte Bereich wird mit Parafilm umwickelt, um den Schössling zu
sichern. Gepfropfte Pflanzen können
nach einwöchiger
in vitro-Kultur auf Erde transferiert werden. Transplantate in Erde werden
unter Bedingungen hoher Feuchte aufrechterhalten, gefolgt von einer
langsamen Eingewöhnung
in die Gewächshausumgebung.
Transformierte Sektoren von T0-Pflanzen (Elterngeneration),
die im Gewächshaus reifen,
werden mittels NPTII-ELISA und/oder mittels der Analyse der fungiziden
Aktivität
von Blattextrakten identifiziert, während transgene Samen, die
von NPTII-positiven T0-Pflanzen geerntet
werden, mittels der Analyse der fungiziden Aktivität von kleinen
Anteilen der Keimblätter
von trockenen Samen identifiziert werden.
-
Ein
alternatives Sonnenblumen-Transformationsprotokoll ermöglicht die
Gewinnung von transgener Nachkommenschaft ohne die Verwendung eines
chemischen Selektionsdrucks. Dieses Verfahren wird allgemein in
Fällen
verwendet, in denen Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung
funktionell mit konstitutiven oder induzierbaren Promotoren verknüpft sind.
Samen werden entspelzt und für
20 Minuten in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung mit Zugabe von zwei bis
drei Tropfen Tween 20 pro 100 ml Lösung oberflächensterilisiert, anschließend dreimal
mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Sterilisierte Samen werden
im Dunklen bei 26°C
für 20
Stunden auf mit Wasser befeuchtetem Filterpapier imbibieren gelassen.
Die Keimblätter
und der Wurzelansatz ("root
radical") werden
entfernt, und die Meristemexplantate werden für 24 Stunden unter Dunkelheit
auf 374E (GBA-Medium, bestehend aus MS-Salzen, Shepard-Vitaminen, 40 mg/l
Adeninsulfat, 3% Saccharose, 0,5 mg/16-BAP, 0,25 mg/l IAA, 0,1 mg/l
GA und 0,8% Phytagar mit pH 5,6) kultiviert. Die Primärblätter werden
entfernt, um das Apikalmeristem freizulegen, etwa 40 Explantate
werden mit dem Apikalkegel nach oben in einem 2 cm-Kreis im Zentrum
von 374M (GBA-Medium mit 1,2% Phytagar) angeordnet und anschließend auf
dem Medium für
24 Stunden im Dunklen kultiviert.
-
Näherungsweise
18,8 mg 1,8 μm
Wolframpartikel werden in 150 μl
absolutem Ethanol resuspendiert. Nach (Ultra-)Schallbehandlung werden
8 μl davon
auf das Zentrum der Oberfläche
des Makrocarriers aufgetropft. Jede Platte wird zweimal mit 650
psi-Berstscheiben in dem ersten Einschub bzw. Fach ("shelf") bei 26 mm Hg-Heliumkanonenvakuum
bombardiert.
-
Das
Plasmid von Interesse wird in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm
EHA105 über
Gefrieren/Tauen, wie zuvor beschrieben, eingeführt. Das Pellet von über Nacht
gezüchteten
Bakterien, bei 28°C
in YEP-Flüssigmedium
(10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0)
in Gegenwart von 50 μg/l Kanamycin,
wird einem Inokulationsmedium (12,5 mM 2-mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, MES,
1 g/l NH4Cl und 0,3 g/l MgSO4 mit
pH 5,7) bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 4,0 bei OD600 resuspendiert. Partikelbombardierte Explantate
werden auf GBA-Medium (374E) transferiert, und ein Tröpfchen Bakteriensuspension
wird direkt auf die Spitze des Meristems gegeben. Die Explantate
werden auf dem Medium für 4
Tage co-kultiviert, wonach die Explantate auf 374C-Medium (GBA mit
1% Saccharose und ohne BAP, IAA, GA3 und supplementiert mit 250 μg/ml Cefotaxim)
transferiert werden. Die Pflänzchen
werden auf dem Medium für
etwa zwei Wochen unter den Inkubationsbedingungen eines 16-Stunden-Tages
und von 26°C
kultiviert.
-
Explantate
(etwa 2 cm lang) aus der zweiwöchigen
Kultur in 374C-Medium werden hinsichtlich der Expression der Nukleotidsequenz
der Erfindung oder des Vorhandenseins des codierten Polypeptids
der Erfindung mittels immunologischer Verfahren oder fungizider
Aktivität
oder dergleichen durchmustert. Nachdem positive Explantate identifiziert
sind, werden jene Schösslinge,
die keine fungizide Aktivität
aufweisen, verworfen, und jedes positive Explantat wird in nodale
Explantate unterteilt. Ein nodales Explantat enthält wenigstens
ein potentielles Nodium. Die nodalen Abschnitte werden für drei bis
vier Tage auf GBA-Medium kultiviert, um die Bildung von Nebenknospen
aus jedem Nodium zu fördern.
Anschließend
werden sie auf 374C-Medium transferiert und für weitere vier Wochen entwickeln
gelassen. Sich entwickelnde Knospen werden abgetrennt und für weitere
vier Wochen auf 374C-Medium kultiviert. Vereinigte Blattproben von
jedem neu gewonnenen Schössling
werden wiederum mittels des geeigneten Protein-Aktivitätsassays
durchmustert. Zu diesem Zeitpunkt werden sich die positiven Schösslinge,
die aus einem einzelnen Nodium gewonnen wurden, im Allgemeinen in
dem transgenen Sektor, der im Ausgangsassay vor der nodalen Kultur
detektiert wurde, angereichert haben.
-
Gewonnene
Schösslinge,
die hinsichtlich eines fungiziden Polypeptids der Erfindung positiv
sind, werden auf in vitro gezüchtete
Sonnenblumensämlings-Wurzelstöcke der
Pioneer-Hybride
6440 gepfropft. Die Wurzelstöcke
werden auf die folgende Weise präpariert.
Samen werden entspelzt und für
20 Minuten in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung mit Zugabe von zwei bis
drei Tropfen Tween 20 pro 100 ml Lösung oberflächensterilisiert, und sie werden
dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen
werden für
drei Tage auf dem Wasser-befeuchteten Filter keimen gelassen, anschließend werden
sie in 48-Medium (halbkonzentrierte MS-Salze, 0,5% Saccharose, 0,3%
Gelrite, pH 5,0) transferiert und für drei Tage bei 26°C im Dunklen gezogen,
anschließend
unter Kulturbedingungen eines 16-Stunden-Tages inkubiert. Der obere
Teil eines ausgewählten
Sämlings
wird entfernt, ein vertikaler Einschnitt wird in jedem Hypokotyl
erstellt, und ein transformierter Schössling wird in einen V-förmigen Schnitt
("V-cut") eingeführt. Der
Schnittbereich wird mit Parafilm umwickelt. Nach einwöchiger Kultur
auf dem Medium werden die gepfropften Pflanzen auf Erde transferiert.
In den ersten zwei Wochen werden sie unter Bedingungen hoher Feuchte
gehalten, um sie an eine Gewächshausumgebung
zu gewöhnen.
-
Beispiel 19. Herstellung von Antikörpern
-
Es
wurden Standardverfahren für
die Produktion von Antikörpern
verwendet, wie z. B. jene, die in Harlow und Lane (1988) Antibodies:
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory), beschrieben sind. Spezifisch wurden Antikörper für Polypeptide
der Erfindung produziert, indem weiblichen Kaninchen (New Zealand
white) (Bethyl Laboratory, Montgomery, Tex.) sechsmal 100 Mikrogramm
denaturiertes, gereinigtes Polypeptid injiziert wurden.
-
Den
Tieren wurde in Intervallen von zwei Wochen Blut abgenommen. Die
Antikörper
wurden mittels Affinitätschromatographie
mit Affigel 15 (BioRad) immobilisiertem Antigen gereinigt, wie von
Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring
Harbor, NY, beschrieben. Die Affinitätssäule wurde mit gereinigtem Polypeptid
im Wesentlichen so hergestellt, wie es von BioRad RTM empfohlen
wird. Die Immundetektion von Antigenen auf PVDF-Blots wurde nach
dem Protokoll von Meyer et al. (1988) J. Cell. Biol. 107:163 durchgeführt, wobei
der ECL-Kit von Amersham (Arlington Heights, Ill.) verwendet wurde.
-
Beispiel 20. Konstruktion eines Fus1-Transformationsvektors
-
Eine
synthetische Version des Fus1-Gens, die dem reifen Fus1-Peptid entspricht,
wurde mit einer Kodonpräferenz,
die für
Manduca sexta repräsentativ
ist, konstruiert (SEQ ID NO:120 und SEQ ID NO:122). Die für Fus1 gewählte Kodonpräferenz wurde
der Kazusa-Kodon-Gebrauchsdatenbank
(zugänglich
unter www.Kazusa.or.jp/codon/) entnommen. Die BAA-Signalsequenz wurde
zu Fus1 hinzugefügt,
um den Export aus der Zelle heraus und in den interzellulären Raum
zu erleichtern (Rahmatullah RJ et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12(1):119–121). Die
BAA-Fus1-Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO:121 und SEQ ID NO:123 angegeben. Um Fus1 in Geweben,
die gegenüber
F. verticilloides anfällig
sind, zu exprimieren, wurden starke konstitutive Promotoren gewählt. BAA-Fus1
(SEQ ID NO:120) wurde anschließend
in die entsprechenden Stellen von Vektoren subkloniert, enthaltend
entweder das Mais-Ubiquitin-Promotor:ubi-Intron
oder das Mais-h2B-Promotor:ubi-Intron (
US-Patent Nr. 6 177 611 ). BAA- Fus1 wurde hinter
den angegebenen Promotor mit einer 3'-Sequenz, die dem pinII-Terminator entspricht,
gestellt. Diese Kassette wird von nicht-kompatiblen Restriktionsenzymschnittstellen
flankiert, die dazu konzipiert sind, die Kassette gerichtet in ein
binäres
Plasmid zu klonieren, das die selektierbare Markergenkassette 35S-PAT-35S
enthält.
Die Restriktionsenzymschnittstellen wurden zum Subklonieren der
Kassette Promotor/Intron:BAA-Fus1:pinII ter in ein binäres Plasmid
für die Transformation
von Mais bzw. Getreide verwendet.
-
Beispiel 21. Konstruktion von Fus2-Transformationsvektoren
-
Eine
synthetische Version von Fus2 in funktioneller Verknüpfung mit
einem modifizierten Signalpeptid von Gersten-alpha-Amylase (BAA)
wurde mit einer Kodonpräferenz,
die für
Streptomyces coelicolor repräsentativ
ist, konstruiert (SEQ ID NO:124 und SEQ ID NO:126). Der S. coelicolor-Kodongebrauch
wurde wegen seiner insgesamten Ähnlichkeit
zu dem Kodon gebraucht, der bei Pflanzen beobachtet wird, gewählt. Die
für Fus2 gewählte Kodonpräferenz wurde
der Kazusa-Kodongebrauchsdatenbank (zugänglich unter www.Kazusa.or.jp/codon/)
entnommen. Siehe auch die Tabellen 1 und 2. Die BAA-Signalsequenz
wurde zu Fus2 hinzugefügt,
um den Export von Fus2 aus der Zelle heraus und in den interzellulären Raum
zu erleichtern. Es wurden Modifikationen am 3'-Ende des Signalpeptids durchgeführt, um
eine korrekte Signalpeptidabspaltung, wie durch das SIGNALP-Programm
(Version 1.1) (Center for Biological Sequence Analyses, Technische
Universität
von Dänemark)
zu erhalten. Die BAA-Fus2-Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO:125 und SEQ ID NO:127 angegeben. Das synthetische
Gen wurde unter Verwendung einer Reihe von überlappenden komplementären Oligonukleotiden
konstruiert, die aneinander angelagert wurden, mit dem Klenow(-Fragment)
zum Reparieren der Lücken
behandelt und mittels PCR amplifiziert wurden, wobei Primer, die
dem 5'- und dem
3'-Ende des synthetischen
Gens entsprachen, verwendet wurden. In die PCR-Primer wurden Restriktionsenzymschnittstellen
eingebaut, um die Genklonierung zu erleichtern. Das PCR-Produkt
wurde in pCR2.1 (Invitrogen) TOPO kloniert, und seine Sequenz wurde
verifiziert. Ein Restriktionsenzymfragment, das BAA-Fus2 enthielt,
wurde anschließend
in die entsprechenden Schnittstellen von Vektoren, enthaltend entweder
das Mais-Ubiquitin-Promotor:ubi-Intron oder das Mais-h2B-Promotor:ubi-Intron,
subkloniert. Die Vektoren enthielten eine 3'-Sequenz, die dem pinII-Terminator entsprach.
Das BAA-Fus2-Fragment wurde zwischen den angegebenen Promotor und
den pinII-Terminator kloniert. Um Fus2 in gegenüber F. verticilloides anfälligen Geweben
zu exprimieren, wurden starke konstitutive Promotoren gewählt. Die
Kassette Promotor/Intron:BAA-Fus2:pinII ter wird von nicht-kompatiblen
Restriktionsenzymschnittstellen flankiert, die dazu konzipiert sind,
die Kassette gerichtet in ein binäres Plasmid, das einen selektierbaren
Marker enthält,
zu klonieren. Die Restriktionsenzymschnittstellen wurden zum Subklonieren
der Kassette Promotor/Intron:BAA-Fus2:pinII ter in ein binäres Plasmid
für die Transformation
von Mais bzw. Getreide verwendet.
Tabelle
1. Streptomyces coelicolor A3(2) [gbbct]: 6257 CDSs(2043281 Kodons) |
Felder:
[Triplet] [Frequenz: pro Tausend] ([Anzahl]) |
UUU | 0,4 | (863) | UCU | 0,6 | (1266) | UAU | 1,0 | (1962) | UGU | 0,7 | (1448) |
UUC | 26,0 | (53065) | UCC | 20,2 | (41262) | UAC | 19,5 | (39789) | UGC | 7,0 | (14341) |
UUA | 0,1 | (128) | UCA | 1,0 | (2137) | UAA | 0,1 | (290) | UGA | 2,4 | (4878) |
UUG | 2,4 | (4935) | UCG | 13,8 | (28229) | UAG | 0,5 | (1089) | UGG | 15,1 | (30770) |
|
CUU | 1,5 | (3129) | CCU | 1,5 | (2995) | CAU | 1,6 | (3366) | CGU | 5,5 | (11183) |
CUC | 36,6 | (74736) | CCC | 25,4 | (51951) | CAC | 21,5 | (44018) | CGC | 39,1 | (79956) |
CUA | 0,3 | (657) | CCA | 1,3 | (2633) | CAA | 1,3 | (2593) | CGA | 2,5 | (5124) |
CUG | 61,3 | (125241) | CCG | 33,6 | (68652) | CAG | 25,1 | (51248) | CGG | 32,0 | (65332) |
|
AUU | 0,6 | (1228) | ACU | 1,1 | (2347) | AAU | 0,7 | (1436) | AGU | 1,5 | (3030) |
AUC | 27,6 | (56340) | ACC | 39,6 | (80826) | AAC | 16,2 | (33191) | AGC | 12,3 | (25187) |
AUA | 0,7 | (1367) | ACA | 1,6 | (3194) | AAA | 1,0 | (2041) | AGA | 0,8 | (1574) |
AUG | 15,8 | (32271) | ACG | 18,9 | (38697) | AAG | 19,7 | (40293) | AGG | 3,7 | (7488) |
|
GUU | 1,4 | (2905) | GCU | 2,9 | (5908) | GAU | 2,9 | (6024) | GGU | 9,3 | (18920) |
GUC | 47,2 | (96460) | GCC | 78,6 | (160548) | GAC | 58,0 | (118595) | GGC | 61,4 | (125467) |
GUA | 2,7 | (5416) | GCA | 5,3 | (10890) | GAA | 8,5 | (17445) | GGA | 7,1 | (14608) |
GUG | 35,3 | (72144) | GCG | 49,8 | (101831) | GAG | 48,5 | (99056) | GGG | 18,2 | (37288) |
- Codierendes GC 72,38%, GC an 1. Position
72,74%, GC an 2. Position 51,39%, GC an 3. Position 93,00%
Tabelle
2. Streptomyces coelicolor [gbbct]: 2110 CDSs (646333 Kodons) |
Felder:
[Triplet] [Frequenz: pro Tausend] ([Anzahl]) |
UUU | 0,5 | (329) | UCU | 0,8 | (496) | UAU | 1,0 | (676) | UGU | 0,8 | (517) |
UUC | 25,7 | (16596) | UCC | 20,1 | (12971) | UAC | 19,4 | (12521) | UGC | 7,3 | (4734) |
UUA | 0,1 | (49) | UCA | 1,2 | (797) | UAA | 0,2 | (105) | UGA | 2,6 | (1650) |
UUG | 2,6 | (1696) | UCG | 13,5 | (8729) | UAG | 0,5 | (355) | UGG | 15,2 | (9813) |
|
CUU | 1,9 | (1228) | CCU | 1,8 | (1178) | CAU | 1,9 | (1251) | CGU | 5,6 | (3602) |
CUC | 36,2 | (23411) | CCC | 25,4 | (16419) | CAC | 22,6 | (14594) | CGC | 39,2 | (25310) |
CUA | 0,5 | (304) | CCA | 1,6 | (1018) | CAA | 1,7 | (1076) | CGA | 2,9 | (1885) |
CUG | 59,3 | (38346) | CCG | 32,7 | (21145) | CAG | 25,8 | (16671) | CGG | 31,5 | (20333) |
|
AUU | 0,8 | (497) | ACU | 1,4 | (925) | AAU | 0,8 | (515) | AGU | 1,6 | (1023) |
AUC | 27,8 | (17997) | ACC | 39,9 | (25804) | AAC | 16,2 | (10447) | AGC | 12,7 | (8194) |
AUA | 0,7 | (444) | ACA | 1,9 | (1245) | AAA | 1,3 | (829) | AGA | 0,8 | (537) |
AUG | 16,1 | (10392) | ACG | 19,1 | (12377) | AAG | 19,8 | (12795) | AGG | 3,8 | (2441) |
|
GUU | 1,7 | (1086) | GCU | 3,8 | (2429) | GAU | 3,5 | (2251) | GGU | 9,1 | (5867) |
GUC | 46,3 | (29904) | GCC | 77,5 | (50098) | GAC | 58,2 | (37624) | GGC | 58,8 | (38034) |
GUA | 2,7 | (1767) | GCA | 6,7 | (4302) | GAA | 9,6 | (6215) | GGA | 7,3 | (4689) |
GUG | 33,9 | (21929) | GCG | 48,6 | (31399) | GAG | 47,9 | (30970) | GGG | 17,8 | (11502) |
- Codierendes GC 71,94%, GC an 1. Position
72,38%, GC an 2. Position 51,28%, GC an 3. Position 92,14%
-
Alle
Druckschriften und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt
werden, geben den Kenntnisstand von Fachleuten auf dem Gebiet, das
diese Erfindung betrifft, an.
-
Obgleich
die vorstehende Erfindung auf dem Wege von Erläuterung und Beispielen zu Zwecken
der Klarheit des Verständnisses
in einigem Detail beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein,
dass gewisse Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angehängten Ansprüche durchgeführt werden können. SEQUENZPROTOKOLL