DE60225128T2

DE60225128T2 - Antimikrobielle polypeptide und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60225128T2
Application number: DE60225128T
Authority: DE
Inventors: Daniel J. Waukee ALTIER; Rafael Wilmington HERRMANN; Albert L. Newark LU; Billy F. Clive McCUTCHEN; James K. Avondale PRESNAIL; Janine L. Bear WEAVER; James F. Johnston WONG
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2002-04-19
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2022-04-20
Also published as: US7262342B2; US20030028920A1; US20050164940A1; US20050188440A1; WO2002086072A2; DE60225128D1; US7064184B2; ATE386431T1; HUP0500989A2; US6891085B2; WO2002086072A3; WO2002086072A8; US7323623B2; US7202214B2; EP1385370A2; US20050164941A1; EP1385370B1; US20050166287A1; CA2444683A1; US20050166286A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Pflanzenkrankheitsresistenz, insbesondere Resistenz gegenüber pilzlichen Pathogenen. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von natürlich vorkommenden antimikrobiellen Polypeptiden, die aus Insekten isoliert wurden, die mit Pflanzenpathogenen induziert wurden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Multizelluläre Organismen produzieren eine Batterie antimikrobieller Peptide und Proteine, um sich selbst gegen mikrobiellen Befall oder mikrobielle Schädigung zu verteidigen. Viele dieser induzierten Peptide und Proteine besitzen breite antimikrobielle Aktivität gegen Grampositive und/oder Gram-negative Bakterien (Boman, H. G. (1995) Annu. Rev. Immunol. 13:61–92). Dieses Abwehrsystem, bezeichnet als "angeborene Immunität", kann eine chemische Barriere darstellen, die Organismen einsetzen, um gefährliche Mikroben an ihrer Kontaktstelle zu stoppen.
Die in Reaktion auf einen mikrobiellen Befall produzierten Peptide und Proteine neigen dazu, sehr unterschiedlich zu herkömmlichen Antibiotika zu wirken. Antibiotika wirken so, dass sie ein entscheidendes Protein in einer eindringenden bzw. einwandernden Mikrobe blockieren. Die Wirkweise der antimikrobiellen Abwehrproteine variiert. In einigen Fällen können sie Löcher in den Membranen einer Mikrobe verursachen und die interne Signalisierung der Mikrobe unterbrechen. In anderen Fällen können sie so wirken, dass die Immunaktivität der Wirtszelle erhöht wird.
Mehrere antimikrobielle Peptide sind isoliert worden, und ihre Strukturen wurden partiell charakterisiert. Die Defensine, ein Typ der antimikrobiellen Peptide, sind Cystein-reiche Peptide. Defensine sind aus Insekten und Säugern isoliert worden. Insekten-Defensine sind 34–43 Aminosäuren lange Peptide mit drei Disulfidbrücken. Sie werden durch den Insektenfettkörper produziert (Hoffmann et al. (1992) Immunol. Today 13:411–15). Es ist gezeigt worden, dass sie die Permeabilität der Cytoplasmamembran von Micrococcus luteus stören, was aus der Bildung von Spannungs-abhängigen Ionenkanälen der Cytoplasmamembran resultiert (Cociancich et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:19239–19245).
Thionine sind eine weitere Gruppe kleinerer Cystein-reicher antimikrobieller Peptide. Es wird angenommen, dass Thionine eine Rolle im Schutz von Pflanzen gegen eine mikrobielle Infektion spielen. Sie werden im Endosperm von Samen, in Stängeln bzw. Stämmen, Wurzeln und in etiolierten oder Pathogenstress unterliegenden Blättern vieler Pflanzenarten gefunden (Bohlmann et al. (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:227–240). Thionine zeigen Toxizität gegenüber Bakterien, Pilzen, Hefen und sogar verschiedenen Säugerzelltypen.
Krankheiten bei Pflanzen haben viele Ursachen, einschließlich Pilze, Viren, Bakterien und Nematoden. Phytopathogene Pilze haben signifikante Einbußen im Jahresernteertrag sowie verheerende Epidemien bewirkt. Zusätzlich haben Ausbrüche von Pflanzenkrankheiten katastrophale Ernteausfälle bewirkt, die Hungersnöte ausgelöst und große soziale Veränderungen verursacht haben.
Molekulare Verfahren des Pflanzenschutzes besitzen nicht nur das Potential, neue Mechanismen für Krankheitsresistenz zu implementieren, sondern können auch schneller als traditionelle Züchtungsverfahren implementiert werden. Demgemäß werden zum Ergänzen traditioneller Züchtungsverfahren molekulare Verfahren benötigt, um Pflanzen vor Pathogenbefall zu schützen. Der Einfluss der Biotechnologie auf auf Hyphomyceten beruhende pilzliche Biokontrollmittel ist in Hegedus et al. (1995) (Biotechnology Advances, Bd. 13, Nr. 3, 1995, Seiten 455–490) diskutiert.
Pflanzenpathogene Pilze greifen alle der näherungsweise 300.000 Arten von Blütenpflanzen an, jedoch kann eine einzelne Pflanzenart ein Wirt für lediglich einige Pilzarten sein, und die meisten Pilze besitzen üblicherweise ein beschränktes Wirtsspektrum. Aus diesem Grund bestand die beste allgemeine Strategie zum Kontrollieren von pilzlichen Pflanzenerkrankungen bis jetzt in der Verwendung resistenter Kultivare, ausgewählt oder entwickelt von Pflanzenzüchtern. Unglücklicherweise besteht selbst bei der Verwendung von resistenten Kultivaren heute das Potential für ernste (Nutz-)Pflanzenkrankheitsepidemien, wie durch Ausbrüche von Victoria-Brandkrankheit bei Hafer und Blattbrand von Mais ("southern corn leaf blight") bewiesen.
Demgemäß sind molekulare Verfahren, die die Resistenzmechanismen von natürlich vorkommenden Insekten-Pflanzenschädlingen ("plant insect pests") nutzen, um die Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber Mikroben, insbesondere pathogenen Pilzen, zu verstärken, wünschenswert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zusammensetzungen und Verfahren zum Erhöhen der Resistenz gegenüber Pathogenen werden bereitgestellt. Die Zusammensetzungen umfassen antipathogene Peptide oder abwehrende Mittel bzw. Agentien, die in Insekten induziert werden, indem das Insekt mit einem Pathogen von Interesse in Kontakt gebracht wird. Die Zusammensetzungen umfassen Polypeptide, die antimikrobielle Eigenschaften, insbesondere fungizide Eigenschaften, besitzen und die Nukleinsäuremoleküle, die für derartige Polypeptide codieren. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden Anwendung bei der Beeinflussung von mikrobiellen Pflanzenpathogenen und bei der Verstärkung von Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber mikrobiellen Pathogenen.
Expressionskassetten, die die Nukleinsäuremoleküle, codierend für die abwehrenden Mittel, umfassen, Vektorsequenzen und Wirtszellen für die Expression der Polypeptide und Antikörper gegen die Polypeptide werden ebenso bereitgestellt. Die Zusammensetzungen der Erfindung stellen ferner Pflanzenzellen, Pflanzen und Samen davon, die mit den Nukleinsäuremolekülen der Erfindung transformiert sind, bereit. Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Er findung sind mit einer Nukleotidsequenz der Erfindung transformiert und weisen eine erhöhte antimikrobielle Krankheitsresistenz, insbesondere Pilzkrankheitsresistenz auf, die den Bedarf an künstlichen agrikulturellen Chemikalien zum Schützen von Feldfrüchten bzw. Feldkulturen und zum Erhöhen des Ernteertrags verringern werden.
Die Verfahren der Erfindung involvieren das stabile Transformieren einer Pflanze mit wenigstens einer Expressionskassette, die wenigstens eine Nukleotidsequenz der Erfindung, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der zum Steuern der Expression der Nukleotidsequenz in der Pflanze oder Pflanzenzelle fähig ist, umfasst. Es wird anerkannt, dass eine Vielfalt von Promotoren in der Erfindung verwendbar sein wird, deren Wahl teilweise von der gewünschten Gewebelokalisierung und dem Expressionslevel der offenbarten Nukleotidsequenzen und entsprechenden Polypeptide abhängen wird. Es wird anerkannt, dass die Expressionslevel der abwehrenden Mittel in der Pflanzenzelle kontrolliert bzw. gesteuert werden können, um eine optimale Krankheitsresistenz zu erzielen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Aminosäuresequenz-Alignment des Vorläufer-Mag1-Polypeptids (SEQ ID NO:2) mit der Klasse von Immunproteinen, die als Attacine bekannt sind. Das Vorläufer-Mag1-Polypeptid besitzt 78% Sequenzähnlichkeit mit dem Attacin E/F-Vorläufer-Polypeptid (SEQ ID NO:19, Eingangs-Nr.: P01513). Die restlichen Sequenzen sind: Attacin A-Vorläufer-Polypeptid (SEQ ID NO:17, Eingangs-Nr.: P50725), Attacin B-Vorläufer-Polypeptid (SEQ ID NO:18, Eingangs-Nr.: P01512) und das Attacin-Vorläufer-Polypeptid, das als Nuecin bekannt ist (SEQ ID NO:20, Eingangs-Nr.: Q26431).
2. Aminosäuresequenz-Alignment des Vorläufer-Mag1-Polypeptids (SEQ ID NO:2) mit homologen Polypeptidsequenzen der Erfindung, codiert durch cDNAs, die aus Pathogen-induzierten Manduca sexta-Bibliotheken isoliert wurden (SEQ ID NOs:4, 6, 8 und 10).
3. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen für die vier Mag1-Polypeptidfragmente nach Lys-C-Verdau (SEQ ID NO:96, 97, 98 und 99).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Erhöhen bzw. Verstärken von Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber Pflanzenpathogenen, insbesondere pilzlichen Pathogenen, bereit. Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Polypeptide und Peptide, die antimikrobielle Aktivität, insbesondere fungizide Aktivität, besitzen. Derartige Peptide oder Polypeptide werden hierin allgemein als "abwehrende Mittel" bzw. "Abwehrmittel" bezeichnet. Nukleinsäuremoleküle, die für derartige abwehrende Mittel codieren, sowie Pflanzen, die mit den Nukleinsäuremolekülen transformiert sind, sind ebenso umfasst. Die Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zum Induzieren einer Resistenz in einer Pflanze gegenüber Pflanzenschädlingen. Die abwehrenden Mittel umfassen von Insekten abgeleitete bzw. stammende Nukleotid- und Polypeptidsequenzen. Demgemäß sind die Zusammen setzungen und Verfahren auch nützlich beim Schützen von Pflanzen gegen pilzliche Pathogene, Viren, Nematoden und dergleichen.
Zusammensetzungen zum Kontrollieren von pflanzenpathogenen Agentien, insbesondere pflanzenpathogenen mikrobiellen Agentien, spezieller pflanzenpathogenen pilzlichen Agentien, werden bereitgestellt. Bereitgestellte spezifische Zusammensetzungen umfassen von Insekten abgeleitete antimikrobielle Polypeptide und die Nukleinsäuremoleküle, die für derartige Polypeptide codieren. Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Samen davon, die mit den Nukleotidsequenzen der Erfindung transformiert sind, werden bereitgestellt. Zusätzlich können die Zusammensetzungen der Erfindung wegen ihrer Krankheitsresistenzaktivitäten in Formulierungen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, umfassend Nukleotidsequenzen, die für die Aminosäuresequenzen codieren, die in SEQ ID NO:101 und 103 gezeigt sind. Weiterhin werden Polypeptide bereitgestellt, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, das hierin beschrieben ist, z. B. jene, die in SEQ ID NO:100 und 102 angegeben sind, und Fragmente und Varianten davon. Verfahren zur Expression dieser Sequenzen in einer Wirtspflanze, um eine verstärkte Krankheitsresistenz der Wirtspflanze gegenüber Pflanzenpathogenen, insbesondere pilzlichen Pflanzenpathogenen, zu verleihen, werden bereitgestellt. Die Verfahren der Erfindung involvieren das stabile Transformieren einer Pflanze mit wenigstens einer Expressionskassette, die wenigstens eine Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der zum Steuern der Expression der Nukleotidsequenz in der Pflanzenzelle fähig ist, umfasst. Es wird anerkannt, dass eine Vielfalt von Promotoren in der Erfindung verwendbar sein wird, wobei deren Wahl teilweise vom gewünschten Level und der gewünschten Gewebelokalisierung der Expression der offenbarten Nukleotidsequenzen abhängen wird. Es wird anerkannt, dass die Level und die Gewebelokalisation der Expression kontrolliert werden können, um die Level der antimikrobiellen Polypeptide in der Pflanzenzelle zu modulieren, so dass die Pflanzenkrankheitsresistenz gegenüber einem bestimmten Pathogen optimiert wird.
Mit "Pflanzenpathogen" oder "Pflanzenschädling" ist jeder Mikroorganismus gemeint, der Schaden an einer Pflanze verursachen kann, wie z. B. durch Hemmung oder Verlangsamung des Wachstums einer Pflanze, durch Schädigung der Gewebe einer Pflanze, durch Schwächung des Immunsystems einer Pflanze oder der Resistenz einer Pflanze gegenüber abiotischen Stressarten und/oder durch Verursachung des vorzeitigen Todes der Pflanze usw. Pflanzenpathogene und Pflanzenschädlinge umfassen Mikroben, wie Pilze, Viren, Bakterien und Nematoden.
Mit "Krankheitsresistenz" oder "Pathogenresistenz" ist gemeint, dass die Pflanzen die Krankheitssymptome, die das Ergebnis von Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen sind, vermeiden. D. h., dass Pathogene daran gehindert werden, Pflanzenkrankheiten und die damit zusammenhängenden Krankheitssymptome zu verursachen, oder alternativ, dass die durch das Pathogen verursachten Krankheitssymptome minimiert oder verringert werden. Die Verfahren der Erfindung können eingesetzt werden, um Pflanzen vor Krankheiten zu schützen, insbesondere vor jenen Krankheiten, die durch pilzliche Pflanzenpathogene verursacht werden.
Ein "antimikrobielles Mittel", ein "pestizides Mittel", ein "abwehrendes Mittel" bzw. "Abwehrmittel" und/oder ein "fungizides Mittel" werden in ähnlicher Weise wirken, um das eindringende Pathogen zu supprimieren, zu kontrollieren und/oder abzutöten.
Ein abwehrendes Mittel wird abwehrende Aktivität besitzen. Mit "abwehrende Aktivität" ist eine antipathogene, antimikrobielle oder antifungale Aktivität gemeint.
Mit "antipathogene Zusammensetzungen" ist gemeint, dass die Zusammensetzungen der Erfindung Aktivität gegen Pathogene besitzen, einschließlich Pilze, Mikroorganismen, Viren und Nematoden, und somit fähig sind, den eindringenden pathogenen Organismus zu supprimieren, zu kontrollieren und/oder abzutöten. Eine antipathogene Zusammensetzung der Erfindung wird die Krankheitssymptome, die aus der Provokation mit dem mikrobiellen Pathogen resultieren, um wenigstens etwa 5% bis etwa 50%, wenigstens etwa 10% bis etwa 60%, wenigstens etwa 30% bis etwa 70%, wenigstens etwa 40% bis etwa 80% oder wenigstens etwa 50% bis etwa 90% oder mehr verringern. Folglich können die Verfahren der Erfindung eingesetzt werden, um Organismen, insbesondere Pflanzen, vor einer Erkrankung, insbesondere jenen Erkrankungen, die durch eindringende Pathogene verursacht werden, zu schützen.
Assays, die antipathogene Aktivität messen, sind gewöhnlicherweise auf dem Fachgebiet bekannt, wie auch Verfahren zum Quantifizieren von Krankheitsresistenz in Pflanzen nach Pathogeninfektion. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5 614 395 . Derartige Techniken umfassen das Messen des mittleren Läsionsdurchmessers, der Pathogenbiomasse und des insgesamten prozentualen Anteils zerstörter bzw. verfaulter Pflanzengewebe über die Zeit. Z. B. zeigt eine Pflanze, die entweder ein antipathogenes Polypeptid exprimiert oder auf deren Oberfläche eine antipathogene Zusammensetzung aufgebracht wurde, eine Abnahme der Gewebenekrose (d. h. Läsionsdurchmesser) oder eine Abnahme des Pflanzentodes nach Pathogenprovokation, wenn mit einer Kontrollpflanze, die der antipathogenen Zusammensetzung nicht ausgesetzt worden war, verglichen wird. Alternativ kann eine antipathogene Aktivität durch eine Abnahme der Pathogenbiomasse gemessen werden. Z. B. wird eine Pflanze, die ein antipathogenes Polypeptid exprimiert oder die einer antipathogenen Zusammensetzung ausgesetzt wurde, mit einem Pathogen von Interesse provoziert. Über die Zeit hinweg werden Gewebeproben aus den Pathogen-inokulierten Geweben entnommen, und RNA wird extrahiert. Der prozentuale Anteil eines spezifischen Pathogen-RNA-Iranskripts relativ zum Level eines Pflanzen-spezifischen Transkripts erlaubt die Bestimmung des Levels der Pathogenbiomasse. Siehe z. B. Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107–5111.
In vitro-Fungizid-Assays umfassen weiterhin z. B. die Aufgabe von variierenden Konzentrationen der fungiziden Zusammensetzung auf Papierscheiben und das Platzieren der Scheiben auf Agar, der eine Suspension des Pathogens von Interesse enthält. Nach Inkubation entwickeln sich klare Hemmhöfe ("inhibition zones") um die Scheiben, die eine wirksame Konzentra tion des fungiziden Polypeptids enthalten (Liu et al. (1994) Plant Biology 91:1888–1892). Zusätzliche Verfahren werden auf dem Fachgebiet verwendet, um die fungiziden Eigenschaften einer Zusammensetzung in vitro zu messen (Hu et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:949–959; Cammue et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228–2233; und Thevissen et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:15018–15025).
Pathogene der Erfindung umfassen, ohne Beschränkung darauf, Viren oder Viroide, Bakterien, Insekten, Nematoden, Pilze und dergleichen. Viren umfassen jedes beliebige Pflanzenvirus, z. B. Tabak- oder Gurkenmosaikvirus, Ringfleckenvirus, Nekrosevirus ("necrosis virus"), Maisverzwergungsmosaikvirus usw. Spezifische pilzliche und virale Pathogene für die Hauptnutzpflanzen umfassen: Sojabohnen: Phytophthora megasperma f. sp. glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p. v. glycinea, Xanthomonas campestris p. v. phaseoli, Microsphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, Sojabohnenmosaikvirus, Glomerella glycines, Tabakringfleckenvirus, Tabakstrichelvirus, Phakopsora pachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomatenbronzefleckenvirus, Heterodera glycines, Fusarium solani; (Öl-)Raps: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata; Alfalfa: Clavibacter michiganensis subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p. v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae; Weizen: Pseudomonas syringae p. v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p. v. translucens, Pseudomonas syringae p. v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f. sp. tritici, Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia recondita f. sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoideus, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia ceralis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Gerstengelbverzwergungsvirus, Trespenmosaikvirus, Boden-übertragbares bzw. bodenbürtiges Weizenmosaikvirus, Weizenstrichelmosaikvirus, Weizenspindelstrichelvirus, "American Wheat Striate Virus", Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomanes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, „High-Plains-Virus”, "European wheat striate Virus"; Sonnenblume: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahlia, Erwinia carotovorum p. v. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis; Mais: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium verticilloides, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydis (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viridae, Maisverzwergungsmosaikvirus A & B, Weizenstrichelmosaikvirus, Chlorotisches Maisverzwergungsvirus, Claviceps sorghi, Pseudomonas avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora, Corn stunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium, Chlorotisches Maisscheckungsvirus, „High-Plains-Virus", Maismosaikvirus, "Maize Rayado Fino Virus", Maisstrichelvirus, "Maize Stripe Virus", Maisrauverzwergungsvirus; Sorghum: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p. v. syringae, Xanthomonas campestris p. v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Periconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelothea cruenta, Sporisorium sorghi, Zuckerrohrmosaik(virus) H, Maisverzwergungsmosaikvirus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola; Reis: Magnaporthe grisea, Rhizoctonia solani, etc.
Es ist gezeigt worden, dass die spezifischen abwehrenden Mittel der Erfindung antipathogene Aktivität gegen bestimmte Pathogene besitzen. Es wird anerkannt, dass sie Aktivität gegen andere Pathogene, insbesondere andere pilzliche Pathogene, zeigen können. Einige können sogar antipathogene Aktivität mit breitem Spektrum aufweisen. Es wird anerkannt, dass, während antifungale Polypeptide Aktivität gegen einen bestimmten Schädling zeigen können, derartige abwehrende Mittel Aktivität gegenüber zahlreichen pilzlichen Pathogenen sowie anderen Pflanzenschädlingen aufweisen können. Somit kann eine Pflanze, die mit einem bestimmten abwehrenden Mittel der Erfindung transformiert ist, Breitspektrum-Resistenz zeigen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die abwehrenden Mittel aus der Hämolymphe von Insektenlarven, induziert durch Injektion eines pflanzenpathogenen Pilzes, isoliert. Die induzierten antimikrobiellen Peptide können gemäß ihrer Aminosäuresequenzhomologie mit bekannten Klassen von Proteinen in wenigstens vier Gruppen eingeordnet werden. Diese vier Gruppen bestehen aus dem Attacin, dem Lebocin und Serinprotease-Inhibitor-Klassen von Proteinen und einer Gruppe, die keine wesentliche Homologie mit bekannten Proteinen zeigt. Die abwehrenden Mittel verstärken die Krankheitsresistenz gegen pilzliche Pathogene, Magnathorpa grisea (M. grisea), Rhizoctonia solani (R. solani) und Fusarium verticilloides (F. verticilloides).
Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Agrotis ipsilon (Ipsiloneule). Insbesondere sind Polypeptide, die gegen Fusarium-Arten wirksam sind, aus Agrotis ipsilon identifiziert worden. Die Fus6-Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO:100 und 102 angegeben. Die Aminosäuresequenzen des Fus6-Polypeptids ist/sind in SEQ ID NO:101 und 103 angegeben. Die in SEQ ID NO:102 angegebene Nukleotidsequenz codiert für das reife Fus6-Peptid, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:103 angegeben ist.
Fragmente und Varianten der offenbarten Nukleotidsequenzen und der dadurch codierten Polypeptide sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Mit "Fragment" ist ein Teil der Nukleotidsequenz oder ein Teil der Aminosäuresequenz gemeint. Fragmente einer Nukleotidsequenz können für Polypeptidfragmente codieren, die die biologische Aktivität des nativen Proteins beibehalten und folglich antimikrobielle und/oder fungizide Aktivität besitzen. Mit "antimikrobielle Aktivität" oder "fungizide Aktivität" ist die Fähigkeit zum Supprimieren, Kontrollieren und/oder Abtöten der eindringenden pathogenen Mikrobe bzw. des eindringenden pathogenen Pilzes gemeint. Eine Zusammensetzung der Erfindung, die antimikrobielle oder fungizide Aktivität besitzt, wird die Krankheitssymptome, die aus einer Provokation mit einem mikrobiellen oder pilzlichen Pathogen resultieren, um wenigstens etwa 5% bis etwa 50%, wenigstens etwa 10% bis etwa 60%, wenigstens etwa 30% bis etwa 70%, wenigstens etwa 40% bis etwa 80% oder wenigstens etwa 50% bis etwa 90% oder mehr verringern. Fragmente einer Nukleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, codieren alternativ allgemein nicht für Fragmentproteine, die eine biologische Aktivität beibehalten. Somit können Fragmente einer Nukleotidsequenz von wenigstens etwa 20 Nukleotiden, etwa 50 Nukleotiden, etwa 100 Nukleotiden und bis zur Volllängennukleotidsequenz, die für die Proteine der Erfindung codiert, reichen.
Alternativ können Fragmente einer Nukleotidsequenz der Erfindung für Polypeptidfragmente, die antigen sind, codieren. Diese sind somit fähig, eine Immunreaktion hervorzurufen. Ein "antigenes Polypeptid" ist hierin definiert als ein Polypeptid, das zur Erzeugung eines Anti körpers fähig ist. Antigene Polypeptidfragmente der offenbarten Aminosäuresequenzen sind ebenso von der Erfindung umfasst.
Ein Nukleotidfragment von SEQ ID NO:100 oder 102, das für einen biologisch aktiven oder antigenen Teil der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:101 oder 103 codiert, wird für wenigstens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder 55 zusammenhängende Aminosäuren oder für bis zur Gesamtzahl der Aminosäuren, die in SEQ ID NO:101 oder 103 vorhanden sind, codieren.
Ein biologisch aktiver oder antigener Teil einer in SEQ ID NO:101 oder 103 angegebenen Polypeptidsequenz kann hergestellt werden durch Isolieren eines Teils der Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO:100 oder 102 angegeben sind, Exprimieren des codierten Teils des Polypeptids (z. B. mittels rekombinanter Expression in vitro) und Feststellen der Aktivität des codierten Teils des Polypeptids.
Fragmente einer Nukleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, codieren alternativ allgemein nicht für Fragmentpolypeptide, die eine biologische Aktivität beibehalten. Somit können Fragmente einer Nukleotidsequenz von wenigstens etwa 25 Nukleotiden, etwa 30 Nukleotiden, etwa 50 Nukleotiden, etwa 100 Nukleotiden und bis zur Volllängennukleotidsequenz, die für die Polypeptide der Erfindung codiert, reichen.
Fragmente der in SEQ ID NO:100 (Fus6) angegebenen Nukleotidsequenz von Nukleotid 1 bis 195 können von wenigstens 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 180, 185, 190 oder 195 zusammenhängende Nukleotide oder bis zur Gesamtzahl der Nukleotide (358), die in SEQ ID NO:100 vorhanden sind, die für SEQ ID NO:101 codieren, reichen.
Die Erfindung umfasst isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäure- oder Proteinzusammensetzungen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Nukleinsäuremolekül oder Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium, wenn mittels rekombinanter Techniken produziert, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn chemisch synthetisiert. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen (vorzugsweise Proteincodierenden Sequenzen), die die Nukleinsäure natürlicherweise in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt bzw. abgeleitet wird, flankieren (d. h., Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind). In verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte Nukleinsäuremolekül z. B. weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb, an Nukleotidsequenzen enthalten, die das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren.
Ein Protein, das im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist, umfasst Proteinpräparationen, die weniger als etwa 30%, 20%, 10%, 5% (bezogen auf das Trockengewicht) an kontaminierendem Protein aufweisen. Wenn das Protein der Erfindung oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant produziert wird, stellt das Kulturmedium vorzugsweise weniger als et wa 30%, 20%, 10% oder 5% (bezogen auf das Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder Chemikalien, die nicht das Protein von Interesse sind, dar.
Mit "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche Sequenzen gemeint. Bei Nukleotidsequenzen umfassen konservative Varianten jene Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für die Aminosäuresequenz von einem der Polypeptide der Erfindung codieren. Natürlich vorkommende allelische Varianten wie diese können durch Verwendung von gut bekannten Molekularbiologietechniken, wie z. B. mit Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, wie unten dargelegt identifiziert werden. Variante Nukleotidsequenzen umfassen auch synthetisch abgeleitete Nukleotidsequenzen, wie z. B. jene, die unter Verwendung von ortsgerichteter bzw. ortsspezifischer Mutagenese erzeugt werden, die jedoch noch für ein Polypeptid der Erfindung codieren. Im Allgemeinen werden Varianten einer bestimmten Nukleotidsequenz der Erfindung wenigstens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der bestimmten Nukleotidsequenz aufweisen, wie mittels Sequenzalignmentprogrammen, die hierin an anderer Stelle beschrieben sind, unter Verwendung von Default-Parametern bzw. Standardeinstellungen bestimmt wird.
Mit "variantes" Polypeptid ist ein Polypeptid gemeint, das aus dem nativen Polypeptid durch Deletion (sogenannte Trunkierung) oder Hinzufügung bzw. Addition von einer oder mehreren Aminosäuren zum N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Polypeptids; Deletion oder Hinzufügung von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Polypeptid oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Polypeptid abgeleitet ist. Variante Polypeptide, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, sind biologisch aktiv, d. h., dass sie weiterhin die gewünschte biologische Aktivität des nativen Polypeptids besitzen. Sie werden folglich weiterhin antimikrobielle und/oder fungizide Aktivität besitzen. Derartige Varianten können z. B. aus einem genetischen Polymorphismus oder aus Manipulation durch den Menschen resultieren.
Biologisch aktive Varianten eines nativen Polypeptids der Erfindung werden wenigstens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz für das native Polypeptid aufweisen, wie mittels Sequenzalignmentprogrammen, die hierin an anderer Stelle beschrieben sind, unter Verwendung von Default-Parametern bestimmt. Eine biologisch aktive Variante eines Polypeptids der Erfindung kann sich von dem Polypeptid durch nur 1–15 Aminosäurereste, nur 1–10, wie 6–10, nur 5, nur 4, 3, 2 oder sogar einen Aminosäurerest(e), unterscheiden.
Die biologische Aktivität der Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann mittels eines beliebigen Verfahrens, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, festgestellt werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5 614 395 ; Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107–15111; Liu et al. (1994) Plant Biology 91:1888–1892; Hu et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:949–959; Cammue et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228–2233; und Thevissen et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:15018–15025).
Die Polypeptide der Erfindung können auf zahlreiche Weisen, einschließlich Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen, -Trunkierungen und -Insertionen, verändert werden. Verfahren für derartige Manipulationen sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Beispielsweise können Aminosäuresequenzvarianten der Polypeptide der Erfindung hergestellt werden durch Mutationen in der DNA. Verfahren für Mutagenese und Nukleotidsequenzänderungen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488–492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367–382; US-Patent Nr. 4 873 192 ; Walker und Gaastra, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) und die darin zitierten Verweise. Leitlinien hinsichtlich zweckdienlicher Aminosäure-Substitutionen, die die biologische Aktivität des Polypeptids von Interesse nicht beeinträchtigen, können im Modell von Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.) gefunden werden. Konservative Substitutionen, wie der Austausch einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, können bevorzugt sein.
Somit umfassen die Gene und Nukleotidsequenzen der Erfindung sowohl natürlich vorkommende Sequenzen als auch mutante Formen. Gleichermaßen umfassen die Polypeptide der Erfindung sowohl natürlich vorkommende Polypeptide als auch Variationen und modifizierte Formen davon. Derartige Varianten werden die gewünschte antimikrobielle oder in einigen Fällen fungizide Aktivität weiterhin besitzen. Es ist offensichtlich, dass die Mutationen, die in der DNA, die für die Variante codiert, durchgeführt werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster verschieben dürfen, und sie werden vorzugsweise keine komplementären Regionen, die eine mRNA-Sekundärstruktur erzeugen könnten, schaffen. Siehe EP-Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 75 444 .
Es wird erwartet, dass Deletionen, Insertionen und Substitutionen der Polypeptidsequenzen, die hierin umfasst sind, keine radikalen Änderungen hinsichtlich der Eigenschaften des Polypeptids erzeugen. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor der Durchführung vorherzusagen, wird ein Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass die Wirkung mittels Routine-Screeningassays auf antimikrobielle und/oder fungizide Aktivität, wie supra im Verweis angegeben, bewertet wird.
Variante Nukleotidsequenzen und Polypeptide umfassen auch Sequenzen und Polypeptide, die aus einer mutagenen und rekombinogenen Verfahrensweise, wie DNA-Shuffling, stammen. Mit einer derartigen Verfahrensweise können eine oder mehrere unterschiedliche codierende Sequenzen in den Nukleinsäuremolekülen, die in SEQ ID NO:100 oder 102 beschrieben sind, manipuliert werden, um ein neues Polypeptid, das die gewünschten Eigenschaften besitzt, zu schaffen. Auf diese Weise werden Bibliotheken von rekombinanten Polynukleotiden aus einer Population von Polynukleotiden mit verwandter Sequenz, umfassend Sequenzregionen, die wesentliche Sequenzidentität besitzen und homolog in vitro oder in vivo rekombiniert werden können, erzeugt. Unter Verwendung dieser Herangehensweise können z. B. Sequenzmotive, die für eine Domäne von Interesse codieren, zwischen den Nukleinsäuremolekülen der Erfindung und anderen bekannten antimikrobiellen codierenden Nukleotidsequenzen transportiert bzw. verschoben werden ("shuffled"), um eine neue Nukleotidsequenz zu erhalten, die für ein Polypeptid mit einer verbesserten Eigenschaft von Interesse, wie gesteigerten antimikrobiellen und/oder fungiziden Eigenschaften bei geringeren Polypeptidkonzentrationen oder Spezifität für bestimmte Pflanzenpathogene, zu erhalten. Beispielsweise: Spezifität für ein bestimmtes pilzliches Pflanzenpathogen, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, Pathogene, wie M. grisea und F. verticilloides. Strategien für ein derartiges DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747–10751; Stemmer (1994) Nature 370:389–391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436–438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336–347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504–4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288–291; und US-Patente Nm. 5 605 793 und 5 837 458 .
Die Nukleotidsequenzen der Erfindung können verwendet werden, um korrespondierende Sequenzen aus anderen Organismen, insbesondere anderen Insekten, zu isolieren. Auf diese Weise können Verfahren, wie PCR, Hybridisierung und dergleichen, verwendet werden, um derartige Sequenzen auf der Basis ihrer Sequenzhomologie mit den hierin angegebenen Sequenzen zu identifizieren. Sequenzen, isoliert auf der Basis ihrer Sequenzidentität mit den Volllängennukleotidsequenzen, die hierin angegeben sind, oder mit Fragmenten davon, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Derartige Sequenzen umfassen Sequenzen, die Orthologe der offenbarten Sequenzen sind. Mit "Orthologe" sind Gene gemeint, die von einem gemeinsamen ancestralen Gen bzw. Stammgen abstammen und die als Ergebnis der Artenbildung in verschiedenen Arten gefunden werden. Gene, die in verschiedenen Arten gefunden werden, werden als Orthologe angesehen, wenn ihre Nukleotidsequenzen und/oder ihre codierten Polypeptidsequenzen eine wesentliche Identität, wie sie hier an anderer Stelle definiert ist, aufweisen. Funktionen von Orthologen sind zwischen Arten oft in hohem Maße konserviert. Somit sind isolierte Sequenzen, die für ein antimikrobielles Protein codieren und die unter stringenten Bedingungen mit den hierin offenbarten Nukleotidsequenzen oder mit Fragmenten davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Bei einer PCR-Herangehensweise können Oligonukleotid-Primer für eine Verwendung in PCR-Reaktionen zum Amplifizieren korrespondierender DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA, extrahiert aus einem beliebigen Insekt von Interesse, konzipiert bzw. entworfen werden. Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und zur PCR-Klonierung sind allgemein im Fachgebiet bekannt und sind offenbart in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Siehe auch Innis et al., Hrsg., (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis und Gelfand, Hrsg., (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und Gelfand, Hrsg., (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Bekannte Verfahren der PCR umfassen, ohne Beschränkung darauf, Verfah ren unter Verwendung von gepaarten Primern, geschachtelten bzw. gensteten Primern, einzelnen spezifischen Primern, degenerierten Primern, Gen-spezifischen Primern, Vektor-spezifischen Primern, partiell fehlgepaarten Primern und dergleichen.
Bei Hybridisierungstechniken wird eine gesamte oder ein Teil einer bekannte(n) Nukleotidsequenz als eine Sonde verwendet, die selektiv mit anderen korrespondierenden Nukleotidsequenzen, die in einer Population von klonierten genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d. h., genomische oder cDNA-Bibliotheken) aus einem gewählten Organismus vorhanden sind, hybridisiert. Die Hybridisierungssonden können genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Oligonukleotide sein und können mit einer detektierbaren Gruppe, wie ³²P, oder einem beliebigen anderen detektierbaren Marker markiert sein. Somit können Sonden zur Hybridisierung z. B. durch Markierung von synthetischen Oligonukleotiden, die auf den Krankheitsresistenzsequenzen der Erfindung basieren, hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Sonden für die Hybridisierung und zur Konstruktion von cDNA- und genomischen Bibliotheken sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Beispielsweise kann eine gesamte Nukleotidsequenz, die hierin offenbart ist, oder ein oder mehrere Teil(e) davon als eine Sonde verwendet werden, die dazu fähig ist, spezifisch mit korrespondierenden Nukleotidsequenzen und Boten-RNAs zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielfalt von Bedingungen zu erreichen, umfassen derartige Sonden Sequenzen, die innerhalb der Nukleotidsequenzen der Erfindung einzigartig sind, und sind vorzugsweise wenigstens etwa 10 Nukleotide lang und, am stärksten bevorzugt, wenigstens etwa 20 Nukleotide lang. Derartige Sonden können verwendet werden, um korrespondierende Sequenzen aus einem gewählten Organismus mittels PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann zum Isolieren zusätzlicher codierender Sequenzen aus einem gewählten Organismus oder als ein diagnostischer Assay zum Feststellen des Vorhandenseins von codierenden Sequenzen in einem Organismus verwendet werden. Hybridisierungstechniken umfassen Hybridisierungsscreening von ausplattierten DNA-Bibliotheken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Die Hybridisierung von derartigen Sequenzen kann unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden.
Somit sind isolierte Sequenzen, die für ein antimikrobielles Polypeptid codieren und die unter hochstringenten Bedingungen mit einer hierin offenbarten Sequenz oder Fragmenten davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Hierin umfassen Bedingungen hoher Stringenz eine Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,1X SSC bei 60 bis 65°C. Die Dauer der Hybridisierung beträgt im Allgemeinen weniger als etwa 24 Stunden, üblicherweise etwa 4 bis etwa 12 Stunden.
Die Spezifität ist typischerweise die Funktion von Waschschritten nach der Hybridisierung, wobei die Ionenstärke und die Temperatur der letzten Waschlösung die kritischen Faktoren sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267–284: T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% Form) – 500/L; wobei M die Molarität monovalenter Kationen ist; %GC der prozentuale Anteil an Guanosin- und Cytosin-Nukleotiden in der DNA ist, % Form der prozentuale Anteil an Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden Sonde hybridisieren. Die T_m wird für jedes 1% Fehlpaarung um etwa 1°C verringert.
Eine ausführliche Anweisung hinsichtlich der Hybridisierung von Nukleinsäuren ist zu finden in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York); und Ausubel et al., Hrsg., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen bzw. -verwandtschaften zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptiden zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentsatz der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".

(a) Wie hierin verwendet, ist eine "Referenzsequenz" eine definierte Sequenz, die als eine Basis für den Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein; beispielsweise ein Abschnitt einer Volllängen-cDNA- oder -Gensequenz oder die vollständige cDNA- oder Gensequenz.
(b) Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "Vergleichsfenster" auf einen zusammenhängenden und spezifizierten Abschnitt einer Polynukleotidsequenz, wobei die Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Hinzufügungen oder Deletionen (d. h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Hinzufügungen bzw. Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Alignment bzw. eine optimale vergleichende Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 zusammenhängende Nukleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 (Nukleotide) oder länger sein. Fachleute auf dem Gebiet verstehen, dass zum Vermeiden einer hohen Ähnlichkeit mit einer Referenzsequenz aufgrund des Einschlusses von Lücken in die Polynukleotidsequenz typischerweise eine "gap penalty" bzw. ein Lückenstrafmaß eingeführt und von der Zahl der Übereinstimmungen abgezogen wird.

Verfahren des Alignments von Sequenzen für den Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Somit kann die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei beliebigen Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus bewerkstelligt werden. Nichteinschränkende Beispiele für derartige mathematische Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4:11–17; der lokale Homologie-Algorithmus von Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; der Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453; das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444–2448; der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873–5877 modifiziert.
Computerimplementierungen dieser mathematischen Algorithmen können für den Vergleich von Sequenzen zum Bestimmen einer Sequenzidentität eingesetzt werden. Derartige Implementierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich von Intelligenetics, Mountain View, Californien); das ALIGN-Programm (Version 2.0); das ALIGN PLUS-Programm (Version 3.0, Urheberrecht 1997) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Alignments unter Verwendung dieser Programme können unter Verwendung der Default-Parameter durchgeführt werden. Das CLUSTAL-Programm ist gut beschrieben von Higgins et al. (1988) Gene 73:237–244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151–153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881–90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155–65; und Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307–331. Die ALIGN- und ALIGN PLUS-Programme basieren auf dem Algorithmus von Myers und Miller (1988) supra. Eine PAM120-Reste-Gewichtungstabelle („PAM120 weight residue table"), eine "gap length penalty" von 12 und eine "gap penalty” von 4 können beim ALIGN-Programm verwendet werden, wenn Aminosäuresequenzen verglichen werden.
Die BLAST-Programme von Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403, basieren auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) supra. Die BLAST-Familie von Programmen, die für Datenbank-gestützte Ähnlichkeitsrecherchen ("database similarity searches") verwendet werden kann, umfasst: BLASTN für Nukleotidsequenzabfragen gegen Nukleotidsequenz-Datenbanken; BLASTP für Peptidsequenzabfragen gegen eine Peptid-Datenbank; BLASTX für Nukleotidsequenzabfragen gegen Protein-Datenbanksequenzen; TBLASTN für Proteinsequenzabfragen gegen Nukleotidsequenz-Datenbanken und TBLASTX für Nukleotidsequenzabfragen gegen Nukleotid-Datenbanken mit der Translation aller Nukleotidsequenzen zu Protein. BLAST-Nukleotidrecherchen können mit dem BLASTN-Programm, score = 100, wordlength = 12, durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die mit einer Nukleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid der Erfindung, homolog sind. BLAST-Proteinrecherchen können mit dem BLASTX-Programm, score = 50, wordlength = 3, durchgeführt werden, um Aminosäu resequenzen zu erhalten, die zu einem Protein oder Polypeptid der Erfindung homolog sind. Um lückige bzw. "gapped" Alignments für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389, beschrieben. Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine iterierte bzw. wiederholte Recherche durchzuführen, die entfernte Beziehungen zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul et al. (1997) supra. Bei Verwendung von BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST können die Default-Parameter der jeweiligen Programme (z. B. BLASTN für Nukleotidsequenzen, BLASTX für Proteine) verwendet werden. Siehe www.ncbi.hlm.nih.gov. Ein Alignment kann auch manuell mittels Prüfung durchgeführt werden.
Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich Sequenzidentitäts-/Ähnlichkeitswerte, die hierin angegeben werden, auf den Wert, der unter Verwendung von GAP, Version 10, erhalten wird, wenn die folgenden Parameter verwendet werden: % Identität unter Verwendung von "Gap Weight" von 50 und "Length Weight" von 3; % Ähnlichkeit unter Verwendung von "Gap Weight" von 12 und "Length Weight" von 4; oder mit einem gleichwertigen Programm. Mit "gleichwertiges Programm" ist jedes Sequenzvergleichsprogramm gemeint, das für zwei beliebige fragliche Sequenzen ein Alignment mit identischen Nukleotid- oder Aminosäurerestübereinstimmungen und einer identischen prozentualen Sequenzidentität bei Vergleich mit dem korrespondierenden Alignment, das durch das bevorzugte Programm erzeugt wird, erzeugt.
GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453, um das Alignment bzw. die vergleichende Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen festzustellen, das/die die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. GAP berücksichtig alle möglichen Alignments und Lückenpositionen und erzeugt das Alignment mit der größten Zahl an übereinstimmenden Basen und den wenigsten Lücken. Es ermöglicht das Vorsehen einer "gap creation penalty" und einer "gap extension penalty" in Einheiten übereinstimmender Basen. GAP muss für jede Lücke, die es einfügt, einen Gewinn aus der "gap creation penalty"-Zahl von Übereinstimmungen ziehen. Falls eine "gap extension penalty" größer als null gewählt wird, muss GAP zusätzlich für jede eingefügte Lücke einen Gewinn aus der Länge der Lücke mal der "gap extension penalty" ziehen. Default- bzw. Standard-"gap creation penalty"-Werte und -"gap extension penalty"-Werte in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package für Proteinsequenzen sind 8 bzw. 2. Für Nukleotidsequenzen ist die Default-"gap creation penalty" 50, während die Default-"gap extension penalty" 3 ist. Die "gap creation" und "gap extension penalties" können als eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe ganzer Zahlen, bestehend aus (dem Bereich) von 0 bis 200, ausgedrückt werden. Somit können die "gap creation" und "gap extension penalties" 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder größer sein.
GAP stellt ein Mitglied der Familie bester Alignments dar. Es kann viele Mitglieder dieser Familie geben, jedoch hat kein Mitglied eine bessere Qualität. GAP gibt vier Leistungszahlen für Alignments an: Qualität ("quality"), Verhältnis ("ratio"), Identität und Ähnlichkeit. Die Qualität ist das Maß, das zum vergleichenden Anordnen der Sequenzen maximiert wird. Das Verhältnis ist die Qualität geteilt durch die Zahl der Basen im kürzeren Abschnitt. Die prozentuale Identität ist der Prozentsatz der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Die prozentuale Ähnlichkeit ist der Prozentsatz der Symbole, die ähnliche sind. Symbole, die Lücken gegenüberstehen, werden ignoriert. Eine Ähnlichkeit wird gewertet, wenn der Bewertungsmatrixwert bzw. Ähnlichkeitsmatrixwert bzw. "scoring matrix value" für ein Paar von Symbolen größer als oder gleich 0,50, die Ähnlichkeitsschwelle, ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package verwendete Bewertungsmatrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
Für Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Vergleich von Nukleotid- oder Polypeptidsequenzen zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität zu bzw. mit den hierin offenbarten Nukleotid- oder Polypeptidsequenzen vorzugsweise unter Verwendung des ClustalW-Programms (Version 1.7 oder höher) mit dessen Default-Parametern oder mit einem beliebigen gleichwertigen Programm durchgeführt. Mit "gleichwertiges Programm" ist jedes Sequenzvergleichsprogramm gemeint, das für zwei beliebige fragliche Sequenzen ein Alignment mit identischen Nukleotid- oder Aminosäurerestübereinstimmungen und einer identischen prozentualen Sequenzidentität bei Vergleich mit dem korrespondierenden Alignment, das durch das bevorzugte Programm erzeugt wird, erzeugt.

(c) Wie hierin verwendet, bezieht sich "Sequenzidentität" oder "Identität" im Kontext von zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen auf die Reste in den zwei Sequenzen, die gleich sind, wenn hinsichtlich einer maximalen Entsprechung über ein spezifiziertes Vergleichsfenster vergleichend angeordnet wird. Wenn ein Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug auf Proteine verwendet wird, wird anerkannt, dass sich Restpositionen, die nicht identisch sind, oft durch konservative Aminosäure-Substitutionen unterscheiden, wobei Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Ladung oder Hydrophobizität) ersetzt sind und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wenn sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepasst werden, um die konservative Natur der Substitution korrigierend zu berücksichtigen. Sequenzen, die sich durch derartige konservative Substitutionen unterscheiden, werden als "Sequenzähnlichkeit" oder "Ähnlichkeit" besitzend bezeichnet. Mittel zur Durchführung dieser Anpassung sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Typischerweise umfasst dies die Bewertung einer konservativen Substitution als eine teilweise statt einer völligen Fehlpaarung, wodurch die prozentuale Sequenzidentität erhöht wird. Wenn beispielsweise eine identische Aminosäure eine Bewertung von 1 erhält und eine nicht-konservative Substitution eine Bewertung von 0 erhält, erhält somit eine konservative Substitution einen Wert zwischen 0 und 1. Die Bewertung von konservativen Substitutionen wird berechnet, wie es z. B. im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Californien) implementiert ist.
(d) Wie hierin verwendet, bedeutet "Prozentsatz der Sequenzidentität" den Wert, der durch Vergleichen von zwei optimal vergleichend angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster hinweg bestimmt wird, wobei der Anteil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Hinzufügungen bzw. Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken), verglichen mit der Referenzsequenz (die keine Hinzufügungen oder Deletionen umfasst), für ein optimales Alignment der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz bzw. prozentuale Anteil wird berechnet durch Bestimmen der Zahl von Positionen, an denen die identische Nukleinsäurebase oder der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, um die Zahl übereinstimmender Positionen zu erhalten, Teilen der Zahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Fenster des Vergleichs und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu erhalten.
(e)(i) Der Begriff "wesentliche Identität" von Polynukleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität aufweist, verglichen mit einer Referenzsequenz unter Verwendung von einem der beschriebenen Alignmentprogramme und unter Verwendung von Standardparametern. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass diese Werte in zweckdienlicher Weise angepasst werden können, um eine entsprechende Identität von Polypeptiden, die durch zwei Nukleotidsequenzen codiert werden, zu bestimmen, indem Kodondegeneriertheit, Aminosäureähnlichkeit, Leserasterpositionierung und dergleichen berücksichtigt werden. Wesentliche Identität von Aminsäuresequenzen für diese Zwecke bedeutet normalerweise eine Sequenzidentität von wenigstens 90% oder 95%.

Ein weiteres Anzeichen dafür, dass Nukleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn zwei Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Allgemein werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH sind. Jedoch umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich von etwa 1°C bis etwa 20°C, abhängig vom gewünschten Grad der Stringenz, wie hierin an anderer Stelle ausgewiesen. Nukleinsäuren, die miteinander nicht unter stringenten Bedingungen hybridisieren, sind noch im Wesentlichen identisch, falls die Polypeptide, für die sie codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann z. B. auftreten, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Kodondegeneriertheit, die vom genetischen Code zugelassen wird, erzeugt wird. Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn das durch die erste Nukleinsäure codierte Polypeptid immunologisch kreuzreagiert mit dem durch die zweite Nukleinsäure codierten Polypeptid.

(e)(ii) Der Begriff "wesentliche Identität" deutet im Kontext eines Peptids darauf hin, dass ein Peptid eine Sequenz mit wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität zur Referenzsequenz über ein spezifiziertes Vergleichsfenster hinweg umfasst. Vorzugsweise wird ein optimales Alignment unter Verwendung des Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443–453, durchgeführt. Ein Anzeichen dafür, dass zwei Peptid sequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn ein Peptid immunologisch reaktiv ist mit Antikörpern, die gegen das zweite Peptid erzeugt wurden. Somit ist ein Peptid im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Peptid, wenn sich die zwei Peptide z. B. nur durch eine konservative Substitution unterscheiden. Peptide, die "im Wesentlichen ähnlich" sind, haben Sequenzen, wie sie oben bezeichnet sind, gemeinsam, abgesehen davon, dass sich Restpositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäureänderungen unterscheiden können.

Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können in einer Wirtszelle, wie Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Insekten-, Säuger- oder Pflanzenzellen, exprimiert werden. Es wird erwartet, dass Fachleute auf dem Gebiet über die zahlreichen Expressionssysteme, die zur Expression einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verfügbar sind, gut unterrichtet sind. Es wird kein Versuch unternommen werden, die verschiedenen Verfahren, die für die Expression von Polypeptiden in Prokaryonten oder Eukaryonten bekannt sind, im Detail zu beschreiben.
Wie hierin verwendet, bedeutet "heterolog" in Bezug auf eine Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die aus einer fremden Art stammt oder, falls sie aus der gleichen Art stammt, wesentlich von ihrer nativen Form in Zusammensetzung und/oder genomischem Locus durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert ist. Ein Promotor, der mit einem heterologen Strukturgen funktionell verknüpft ist, ist z. B. aus einer Art, die von der, aus der das Strukturgen stammte, verschieden ist, oder ein Element oder beide sind wesentlich von ihrer ursprünglichen Form modifiziert, falls sie aus der gleichen Art sind. Ein heterologes Protein kann aus einer fremden Art stammen oder ist, falls es aus der gleichen Art stammt, wesentlich von seiner ursprünglichen Form durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert.
Mit "Wirtszelle" ist eine Zelle gemeint, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz der Erfindung umfasst. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, wie E. coli, oder eukaryotische Zellen, wie Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen, sein. Vorzugsweise sind Wirtszellen einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanzen-Zellen, insbesondere Reis- und Maispflanzenzellen.
Die Krankheitsresistenz-verleihenden Sequenzen der Erfindung werden in Expressionskassetten oder DNA-Konstrukten zur Expression in der Pflanze von Interesse bereitgestellt. Die Kassette wird 5'- und 3'-Regulatorsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleotidsequenz der Erfindung umfassen. Mit "in funktioneller Verknüpfung" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz die Transkription der Nukleotidsequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Allgemein bedeutet funktionell verknüpft, dass die miteinander verknüpften Nukleinsäuresequenzen zusammenhängend und, wo zum Verbinden von zwei Protein-codierenden Regionen nötig, zusammenhängend und im gleichen Leseraster sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches Gen, mit dem der Organismus zu cotransformieren ist, enthalten.
Alternativ kann das/die zusätzliche(n) Gen(e) auf mehreren Expressionskassetten bereitgestellt werden.
Eine derartige Expressionskassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsschnittstellen zur Insertion der Krankheitsresistenzsequenz, so dass sie unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen steht, ausgestattet. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten.
Die Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, eine Signalpeptidsequenz, eine Krankheitsresistenz-DNA-Sequenz der Erfindung und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, funktionell in Pflanzen, umfassen. Die Transkriptionsinitiationsregion, der Promotor, kann nativ oder analog oder fremd oder heterolog zum Pflanzenwirt sein. Zusätzlich kann der Promotor die natürliche Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die Transkriptionsinitiationsregion nicht in der nativen Pflanze gefunden wird, in die die Transkriptionsinitiationsregion eingeführt wird. Wie hierin verwendet, umfasst ein chimäres Gen eine codierende Sequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer Transkriptionsinitiationsregion, die zur codierenden Sequenz heterolog ist.
Während es bevorzugt sein kann, die Sequenzen unter Verwendung heterologer Promotoren zu exprimieren, können die nativen Promotorsequenzen verwendet werden. Derartige Konstrukte würden Expressionslevel der/des Krankheitsresistenz-RNA/Proteins in der Pflanze oder Pflanzenzelle variieren. Somit wird der Phänotyp der Pflanze oder Pflanzenzelle verändert.
Die Terminationsregion kann bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der funktionell verknüpften DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder sie kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot (1991) Cell 64:671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891–7903; und Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627–9639.
Wenn es zweckdienlich ist, können die Nukleotidsequenzen für eine erhöhte Expression im transformierten Wirt optimiert werden. D. h., dass die Nukleotidsequenzen unter Verwendung von Pflanzen-bevorzugten Kodons für eine verbesserte Expression in Pflanzen synthetisiert werden können. Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zum Synthetisieren Pflanzen-bevorzugter Nukleotidsequenzen oder Gene verfügbar. Siehe z. B. die US-Patente Nrn. 5 380 831 und 5 436 391 und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498.
Weitere Sequenzmodifikationen sind dafür bekannt, eine Genexpression in einem zellulären Wirt zu verstärken. Diese umfassen die Elimination von Sequenzen, codierend für störende bzw. unechte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-ähnliche Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen, die auf die Genexpression schädlichen Einfluss nehmen können. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level angepasst werden, die für einen gegebenen zellulären Wirt durchschnittlich sind, wie sie unter Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet werden. Wenn möglich, wird die Sequenz so modifiziert, dass vorhergesagte Haarnadel-Sekundärstrukturen der mRNA vermieden werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist es wünschenswert, das reife Peptid oder die Nukleotidsequenz, die für das reife Peptid codiert, zu verwenden. Innerhalb der Zelle treten häufig proteolytische Modifikationen von Aminosäuresequenzen auf. Das proteolytische Ereignis entfernt Aminosäuren aus dem Vorläuferpeptid, wodurch ein reifes Peptid erhalten wird. Die proteolytische Prozessierung kann in hohem Maße Sequenz-spezifisch sein. Oft sind die Vorläuferpeptide inaktiv, während die reifen Peptide die gewünschte Aktivität besitzen. Somit resultiert die Isolierung eines Peptids auf der Basis von dessen Aktivität in der Isolierung des aktiven, reifen Peptids. Die Entdeckung der Existenz von Vorsequenzen erfolgt, wenn die Nukleotidsequenz, die für das reife Peptid codiert, identifiziert wird. Das offene Leseraster, das für das reife Peptid codiert, codiert auch für die Vorsequenzen, die durch die Zelle entfernt wurden. Eine proteolytische Reifung von Aminosäuresequenzen tritt in mehreren zellulären Orten auf, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, dem endoplasmatischen Reticulum, dem Cytoplasma, den Mitochondrien, den Chloroplasten, dem Kern, dem Golgi-Apparat und der extrazellulären Matrix. Die proteolytische Prozessierung von Peptiden wird diskutiert in Creighton, T. E. (1993) Proteins: Structures & Molecular Properties. W. H. Freeman & Co., USA, und Alberts et al., Hrsg. (1994) Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York. Anstatt darauf zu vertrauen, dass eine Wirtszelle das Polypeptid der Erfindung in geeigneter Weise prozessiert, kann es wünschenswert sein, eine Nukleotidsequenz, die für das reife Peptid codiert, einzusetzen.
Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leadersequenzen in dem Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Derartige Leadersequenzen können zu einer Verstärkung der Translation führen. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z. B. den EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS USA 86:6126–6130); Potyvirus-Leader, z. B. TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Allison et al. (1986); MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaikvirus); Virology 154:9–20) und das humane Immunglobulin-Schwerketten-Bindungsprotein (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90–94); nicht-translatierte Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622–625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Hrsg. Cech (Liss, New York), S. 237–256); und Leader aus dem Chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382–385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965–968. Andere Verfahren, die dafür bekannt sind, die Translation zu verstärken, können ebenso eingesetzt werden, z. B. Introns und dergleichen. Signalpeptide können mit den Krankheitsresistenz-Nukleotidsequenzen der Erfindung fusioniert werden, um den Transport des exprimierten Gen- Produkts aus der Zelle zum gewünschten Wirkort im interzellulären Raum zu steuern. Beispiele für Signalpeptide umfassen jene, die nativ verknüpft sind mit dem Gersten-alpha-Amylaseprotein (BAA), Sporamin, Oryzacystatin-I und jene aus mit der Pathogenese in Pflanzen zusammenhängenden Proteinen, z. B. PR-1, PR-2, usw.
Bei der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und, sofern zweckdienlich, im richtigen Leseraster bereitgestellt werden. Dazu können Adaptoren oder Verknüpfungselemente bzw. Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder andere Manipulationen können einbezogen werden, um für zweckdienliche Restriktionsschnittstellen, die Entfernung von überflüssiger DNA, die Entfernung von Restriktionsschnittstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu diesem Zwecke können in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Anlagerung, Resubstitutionen, z. B. Transitionen und Transversionen, einbezogen werden.
Im Allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen zur Selektion von transformierten Zellen umfassen. Selektierbare Markergene werden zur Selektion von transformierten Zellen oder Geweben eingesetzt. Markergene umfassen Gene, die für eine Antibiotikaresistenz codieren, wie jene, die für Neomycinphosphotransferase II (NEO) und Hygromycinphosphotransferase (HPT) codieren, sowie Gene, die eine Resistenz gegenüber herbiziden Verbindungen, wie Glufosinat-Ammonium, Bromoxynil, Imidazolinonen und 2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D) und Sulfonylharnstoffen (SUs) verleihen. Siehe allgemein Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506–511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314–6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63–72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419–2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, S. 177–220; Hu et al. (1987) Cell 48:555–566; Brown et al. (1987) Cell 49:603–612; Figge et al. (1988) Cell 52:713–722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400–5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549–2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480–483; Gossen (1993) Dissertation, Universität Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917–1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343–3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952–3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072–5076; Wyborski et al. (1991) Nukleic Acids Res. 19:4647–4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143–162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591–1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094–1104; Bonin (1993) Dissertation, Universität Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547–5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913–919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Bd. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721–724.
Die obenstehende Liste von selektierbaren Markergenen soll nicht beschränkend sein. In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges selektierbares Markergen verwendet werden.
Eine Anzahl von Promotoren kann bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden. Die Promotoren können auf der Basis des gewünschten Ergebnisses selektiert werden. D. h., dass die Nukleinsäuren mit konstitutiven, Gewebe-bevorzugten ("tissue-preferred"), induzierbaren oder anderen Promotoren für eine Expression in Pflanzen kombiniert werden können. Derartige konstitutive Promotoren umfassen z. B. den Kernpromotor aus dem Rsyn7-Promotor und andere konstitutive Promotoren, die in WO 99/43838 und im US-Patent Nr. 6 072 050 offenbart sind; den Scp1-Promotor ( US-Patent Nr. 6 072 050 ), Reisactin (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163–171); Ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619–632, und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675–689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581–588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723–2730); den ALS-Promotor ( US-Patent Nr. 5 659 026 ); Mais-h2B (PCT-Anmeldung, Aktenzeichen WO 99/43797 ) und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen z. B. die, die offenbart sind in den US-Patenten Nrn. 5 608 149 , 5 608 144 , 5 604 121 , 5 569 597 , 5 466 785 , 5 399 680 , 5 268 463 , 5 608 142 und 6 177 611 .
Im Allgemeinen wird es günstig sein, das Gen ausgehend von dem induzierbaren Promotor, insbesondere ausgehend von einem Pathogen-induzierbaren Promotor, zu exprimieren. Derartige Promotoren umfassen z. B. jene aus mit Pathogenese zusammenhängenden Proteinen (PR-Proteine), die nach einer Infektion durch ein Pathogen induziert werden; z. B. PR-Proteine, SAR-Proteine, beta-1,3-Glucanase, Chitinase, usw. Siehe z. B. Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245–254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645–656; und Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111–116. Siehe auch WO 99/43819 .
Von Interesse sind Promotoren, die lokal an oder nahe der Stelle der Pathogeninfektion exprimiert werden. Siehe z. B. Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335–342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325–331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427–2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93–98, und Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972–14977. Siehe auch Chen et al. (1996) Plant J. 10:955–966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507–2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191–201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961–968; US-Patent Nr. 5 750 386 (Nematoden-induzierbar); und die darin zitierten Verweise. Von besonderem Interesse ist der induzierbare Promotor für das Mais-PRms-Gen, dessen Expression durch das Pathogen Fusarium moniliforme induziert wird (siehe z. B. Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189–200).
Da Pathogene durch Wunden oder Insektenschädigung Zugang zu Pflanzen finden, kann zusätzlich ein Wund-induzierbarer Promotor in den Konstrukten der Erfindung verwendet werden. Derartige Wund-induzierbare Promotoren umfassen das Kartoffel-Proteinase-Inhibitor (pinII)-Gen(Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425–449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494–498), wun1 und wun2, US-Patent Nr. 5 428 148 ; win1 und win2 (Standford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200–208); Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1570– 1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783–792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73–76); das MPI-Gen (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141–150); und dergleichen.
Chemikalien-regulierte Promotoren können verwendet werden, um die Expression eines Gens in einer Pflanze durch die Anwendung bzw. Applikation eines exogenen chemischen Regulators zu modulieren. In Abhängigkeit von der Aufgabe kann der Promotor ein Chemikalieninduzierbarer Promotor sein, wobei die Anwendung der Chemikalie die Genexpression induziert, oder ein Chemikalien-reprimierbarer Promotor, wobei die Anwendung der Chemikalie die Genexpression reprimiert. Chemikalien-induzierbare Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne Beschränkung darauf, den Mais-In2-2-Promotor, der durch Benzolsulfonamid-Herbizidsafener aktiviert wird, den Mais-GST-Promotor, der durch hydrophobe elektrophile Verbindungen, die als Vorauflaufherbizide verwendet werden, aktiviert wird und den Tabak-PR-1a-Promotor, der durch Salicylsäure aktiviert wird. Andere Chemikalienregulierte Promotoren von Interesse umfassen Steroid-reaktive Promotoren (siehe z. B. der Glucocorticoid-induzierbare Promotor in Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421–10425, und McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247–257), und Tetracyclin-induzierbare und Tetracyclin-reprimierbare Promotoren (siehe z. B. Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229–237, und die US-Patente Nrn. 5 814 618 und 5 789 156 ).
Gewebe-bevorzugte Promotoren können eingesetzt werden, um eine verstärkte Expression eines antimikrobiellen Polypeptids innerhalb eines bestimmten Pflanzengewebes zu targetieren. Siehe z. B. Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255–265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792–803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337–343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157–168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331–1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525–535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513–524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773–778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181–196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129–1138; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586–9590; und Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495–505. Derartige Promotoren können, sofern nötig, für eine schwache Expression modifiziert sein.
Das Verfahren der Transformation/Transfektion ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch; zahlreiche Verfahren der Transformation oder Transfektion sind gegenwärtig verfügbar. Somit kann jedes Verfahren, das für eine wirksame Transformation/Transfektion sorgt, eingesetzt werden. Transformationsprotokolle sowie Protokolle zum Einführen von Nukleotidsequenzen in Pflanzen können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder Pflanzenzelle, d. h., Monocotyl oder Dicotyl, die für die Transformation targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren des Einführens von Nukleotidsequenzen in Pflanzenzellen und der nachfolgenden Insertion in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320–334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602–5606), Agrobacterium vermittelte Transformation (Townsend et al., US-Patent Nr. 5 563 055 ; Zhao et al., US-Patent Nr. 5 981 840 ), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717–2722) und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z. B. Sanford et al., US-Patent Nr. 4 945 050 ; Tomes et al., US-Patent Nr. 5 879 918 ; Tomes et al., US-Patent Nr. 5 886 244 ; Bidney et al., US-Patent Nr. 5 932 782 ; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant, Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923–926); und Lec1-Transformation ( WO 00/28058 ). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421–477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27–37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Phsiol. 87:671–674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923–926 (Sojabohne); Finer und McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175–182 (Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319–324 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736–740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559–563 (Mais); Tomes, US-Patent Nr. 5 240 855 ; Buising et al., US-Patent Nrn. 5 322 783 und 5 324 646 ; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763–764; Bowen et al., US-Patent Nr. 5 736 369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345–5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197–209 (Pollen); Kaepller et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415–418, und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560–566 (Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495–1505 (Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250–255, und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75:407–413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745–750 (Mais über Agrobacterium tumefaciens).
Die Zellen, die transformiert wurden, können gemäß herkömmlicher Weisen zu Pflanzen gezogen werden. Siehe z. B. McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81–84. Diese Pflanzen können dann gezüchtet und entweder mit dem gleichen transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden, und die resultierende Hybride, die eine konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals aufweist, wird identifiziert. Zwei oder mehr Generationen können gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass eine konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals stabil aufrechterhalten und vererbt wird, und anschließend können Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals erzielt worden ist.
Die vorliegende Erfindung kann für die Transformation von beliebigen Pflanzenarten, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, einkeimblättrige und zweikeimblättrige, ver wendet werden. Beispiele für Pflanzen von Interesse umfassen, ohne Beschränkung darauf, Reis (Oryza sativa), Mais (Zea mays), Brassica sp. (z. B. B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere jene Brassica-Arten, die als Quellen für Samenöl verwendbar sind, Alfalfa (Medicago sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z. B. Perlhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliacaeum), Borstenhirse bzw. Kolbenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)), Sonnenblume (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Cassava bzw. Maniok (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitruspflanzen bzw. -bäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Bananen (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen.
Gemüse umfassen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z. B. Lactuca sativa), grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.) und Angehörige der Gattung Cucumis, wie Gurke (C. sativus), Cantaloup- (C. cantalupensis) und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen die Azalee (Rhododendron spp.), Hydrangea bzw. Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiscus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Osterglocken (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), die Nelke (Dianthus caryophyllus), Poinsettia bzw. Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherrima) und Chrysantheme. Koniferen, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen z. B. Kiefern, wie die Weihrauchkiefer (Pinus taeda), karibische Kiefer bzw. "slash eine" (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und die Montereykiefer (Pinus radiata); die Douglasie (Pseudotsuga menziesii); die westamerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis); die Sitka-Fichte (Picea glauca); den (Küsten-) Mammutbaum (Sequoia sempervirens); echte Tannen, wie die Purpurtanne bzw. "silver fir" (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, wie den Riesenlebensbaum (Thuja plicata), und die Nutka-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis). Vorzugsweise sind Pflanzen der Erfindung Nutzpflanzen bzw. Feldpflanzen (z. B. Reis, Mais, Alfalfa bzw. Luzerne, Sonnenblumen, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak usw.).
Prokaryotische Zellen können als Wirte für die Expression verwendet werden. Prokaryonten werden am häufigsten durch zahlreiche Stämme von E. coli wiedergegeben, jedoch können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden. Gewöhnlicherweise verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen, die hierin so definiert sind, dass sie Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosomenbindungssequenzen umfassen, umfassen herkömmlicherweise verwendete Promotoren, wie die beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose (lac) Promotorsysteme (Chang et al. (1977) Nature 198:1056), das Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al. (1980) Nukleic Acids Res. 8:4057) und den lambda-abgeleiteten P L-Promotor und die Ribosomenbindungsstelle des N-Gens (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128). Der Einschluss von Selektionsmarkern in DNA-Vektoren, mit denen E. coli transfiziert wird, ist ebenfalls nützlich. Beispiele für derartige Marker umfassen Gene, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol spezifizieren.
Der Vektor wird so gewählt, dass eine Einführung in die zweckdienliche Wirtszelle ermöglicht wird. Bakterielle Vektoren sind typischerweise von Plasmid- oder Phagenursprung. Zweckdienliche Bakterienzellen werden mit Phagenvektorpartikeln infiziert oder mit nackter Phagenvektor-DNA transfiziert. Falls ein Plasmidvektor verwendet wird, werden die Bakterienzellen mit der Plasmidvektor-DNA transfiziert. Expressionssysteme zum Exprimieren eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung sind verfügbar, wobei Bacillus sp. und Salmonella verwendet werden (Palva et al. (1983) Gene 22:229–235); Mosbach et al. (1983) Nature 302:543–545).
Eine Vielfalt von eukaryotischen Expressionssystemen, wie Hefe, Insektenzelllinien, Pflanzen- und Säugerzellen, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Wie untenstehend kurz erläutert, kann ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in diesen eukaryotischen Systemen exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen werden transformierte/transfizierte Pflanzenzellen, wie infra diskutiert, als Expressionssysteme zur Produktion der Polypeptide der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch mit zahlreichen Expressionsvektoren zur Verwendung beim Transfizieren von Zellkulturen, die z. B. von Säugern, Insekten oder Pflanzen stammen, ligiert werden. Beispielhafte Zellkulturen, die zur Produktion der Peptide verwendbar sind, sind Säugerzellen. Eine Anzahl geeigneter Wirtszelllinien, die zum Exprimieren intakter Proteine befähigt sind, sind auf dem Fachgebiet entwickelt worden und umfassen die HEK293-, BHK21- und CHO-Zelllinien. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen, wie ein Replikationsursprung, einen Promotor (z. B. den CMV-Promotor, einen HSV tk-Promotor oder einen pgk (Phosphoglyceratkinase)-Promotor), einen Enhancer (Queen et al. (1986) Immunol. Rev. 89:49) und notwendige Prozessierungsinformationsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen (z. B. eine Poly A-Additionsstelle vom Typ SV40 large T Ag), und Transkriptionsterminatorsequenzen umfassen. Andere Tierzellen, die zur Produktion von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind z. B. von der American Type Culture Collection erhältlich.
Zweckdienliche Vektoren zum Exprimieren von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in Insektenzellen sind üblicherweise vom SF9-Baculovirus abgeleitet. Geeignete Insektenzelllinien umfassen Moskitolarven-, Seidenraupen-, Heerwurm-, Motten- und Drosophila- Zelllinien, wie eine Schneider-Zelllinie (siehe Schneider (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353–365).
Wie bei Hefe werden, wenn höhere Tier- oder Pflanzenwirtszellen eingesetzt werden, Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminatorsequenzen typischerweise in den Vektor eingebaut. Ein Beispiel einer Terminatorsequenz ist die Polyadenylierungssequenz aus dem bovinen Wachstumshormongen. Sequenzen für ein akkurates Spleißen des Transkripts können ebenso eingeschlossen werden. Ein Beispiel für eine Spleißsequenz ist das VP1-Intron aus SV40 (Sprague et al. (1983) J. Virol. 45:773–781). Zusätzlich können Gensequenzen zum Kontrollieren der Replikation in der Wirtszelle in den Vektor eingebaut werden, wie z. B. jene, die in Vektoren vom Typ des bovinen Papillomavirus gefunden werden (Saveria-Campo (1985) DNA Cloning Bd. II a Practical Approach, D. M. Glover, Hrsg., IRL Press, Arlington, Virginia, S. 213–238).
Tierische und niedere eukaryotische (z. B. Hefe-) Wirtszellen sind kompetent oder werden durch verschiedene Mittel für eine Transfektion kompetent gemacht. Es gibt mehrere gut bekannte Verfahren des Einführens von DNA in Tierzellen. Diese umfassen: Calciumphosphat-Präzipitation, Fusion der Empfängerzellen mit Bakterienprotoplasten, die die DNA enthalten, Behandlung der Empfängerzellen mit Liposomen, die die DNA enthalten, DEAE-Dextrin, Elektroporation, biolistische Herangehensweisen ("biolistics") und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen. Die transfizierten Zellen werden durch Mittel kultiviert, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (Kuchler (1997) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson und Ross, Inc.).
Die Synthese von heterologen Nukleotidsequenzen in Hefe ist gut bekannt (Sherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory). Zwei weithin verwendete Hefen zur Produktion von eukaryotischen Proteinen sind Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Vektoren, Stämme und Protokolle zur Expression in Saccharomyces und Pichia pastoris sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind von kommerziellen Lieferanten (z. B. Invitrogen) erhältlich. Geeignete Vektoren besitzen üblicherweise Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder Alkoholoxidase, und einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen und dergleichen, wie gewünscht.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann, sobald es exprimiert ist, aus Hefe isoliert werden, indem die Zellen lysiert und Standardproteinisolationstechniken auf die Lysate angewendet werden. Die Überwachung des Reinigungsvorgangs kann durch Verwendung von Western-Blot-Techniken, UV-Absorptionsspektren, Radioimmunassay oder andere Immunassay-Standardtechniken bewerkstelligt werden.
Die Erfindung betrifft ein allgemeines Verfahren zum Identifizieren und Herstellen von antimikrobiellen Zusammensetzungen, insbesondere antifungalen Zusammensetzungen. Die Verfahren umfassen das Injizieren einer Suspension eines pflanzenpathogenen Pilzes in ein Insekt, um Insektenpolypeptide, die antimikrobielle Aktivität besitzen, zu induzieren. Derartige Polypeptide werden aus der Insekten-Hämolymphe unter Verwendung einer Kombination von hochauflösender Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrophotometrie isoliert.
Die allgemeine Strategie zur Entdeckung dieser aus Insekten abgeleiteten antimikrobiellen Peptide involviert das Provozieren von Insekten mit einem ausgewählten Pflanzenpathogen und das Gewinnen von Hämolymphe- und Fettkörperproben zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion. Z. B. können Hämolymphe- und Fettkörperproben in Intervallen von etwa 8 Stunden, 16 Stunden, 24 Stunden oder 48 Stunden gesammelt werden. Es wird anerkannt, dass jedes Verfahren zur Proteintrennung und -identifikation verwendet werden kann, um Peptide und die korrespondierenden Nukleinsäuresequenzen zu isolieren.
Obgleich keine Bindung an ein bestimmtes Verfahren besteht, kann eine Identifizierung von antimikrobiellen Peptiden, die gegen das Zielpathogen aktiv sind, bewerkstelligt werden, indem eine integrierte Proteom-bezogene, Genom-bezogene und miniaturisierte Bioassay-Herangehensweise verwendet wird. Diese Herangehensweise besteht in der Auftrennung von Hämolymphe, die aus induzierten Insekten isoliert wurde. Ein beliebiges Trennverfahren, einschließlich HPLC-Auftrennung, kann verwendet werden. Fraktionen aus der HPLC-unterstützten Auftrennung können in 30 Sekundärfraktionen in einem Mikrotiterplattenformat, d. h., einer 96-Well-Mikrotiterplatte, aufgetrennt werden. Auf diese Weise gewonnene Fraktionen werden getrocknet und direkt in einem Pilzwachstums-Assay (FGA) verwendet, bei dem die getrockneten Fraktionen in 100 μl halbkonzentrierter Kartoffeldextrosebouillon, enthaltend eine Suspension des pilzlichen Zielpathogens, resuspendiert werden. Fraktionen, die antimikrobielle Peptide enthalten, werden in dem FGA durch ihre Fähigkeit, das Pilzwachstum nach mehreren Stunden, im Allgemeinen 24–48 Stunden, zu inhibieren, identifiziert. Diese Fraktionen werden einer weiteren Aufreinigung unterworfen, um einzelne Peptide zu isolieren, und das spezifische Peptid, das für die beobachtete Aktivität verantwortlich ist, wird mittels FGA bestimmt. Dieses Peptid wird nachfolgend N-terminal sequenziert, und sein Molekulargewicht wird mittels Massenspektrometrie bestimmt, um Informationen zum Identifizieren des entsprechenden Gens aus Sequenzdaten, die aus den entsprechenden Insekten-cDNA-Bibliotheken stammen, bereitzustellen. Die vollständige Aminosäuresequenz des Peptids wird durch Translation der Nukleinsäuresequenz bestimmt, und das reife Peptid auf der Basis von sowohl der N-terminalen Sequenz als auch der Molekulargewichtsinformation identifiziert.
Die abwehrenden Mittel der Erfindung umfassen die reifen aktiven Peptide sowie nicht-prozessierte oder Präpro-Formen der Peptide. Wenn ein reifes Peptid isoliert worden ist, kann die Präpro-Sequenz oder Signalsequenz mittels einer Anzahl allgemeiner Molekularbiologietechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erhalten werden.
Wie angegeben, können die abwehrenden Mittel aus einem beliebigen Insekt von Interesse isoliert werden. Von besonderem Interesse sind Insekten, die in rauen Umgebungen leben, und Insekten, die natürliche Pflanzenräuber bzw. -schädlinge ("plant predators") sind. Obgleich jedes beliebige Insekt eingesetzt werden kann, kann es günstig sein, Insektenräuber einer be stimmten Pflanze von Interesse zu verwenden. Zum Erhalten abwehrender Mittel zur Verwendung bei Mais können beispielsweise, obgleich jedes beliebige Insekt verwendet werden kann, Mais-Insektenräuber günstig sein.
Obgleich ein abwehrendes Mittel durch ein beliebiges Pathogen induziert werden kann, wird vorhergesagt, dass das abwehrende Mittel gegen einen oder mehrere weitere Pathogene, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, beliebige der oben aufgelisteten Pathogene, wirksam sein kann.
Die Polypeptide werden unter Verwendung von in vitro-Assays, wie hierin an anderer Stelle beschrieben, auf antimikrobielle Aktivität getestet. Isolierte antimikrobielle Polypeptide werden einer Proteolyse unterworfen, und die Aminotermini der resultierenden proteolytischen Fragmente werden sequenziert. Degenerierte Oligonukleotide, die für die aminoterminalen Sequenz-tags codieren, werden verwendet, um die cDNAs, die für antimikrobielle Polypeptide codieren, ausgehend von entsprechenden Pathogen-induzierten Insekten-cDNA-Bibliotheken, zu identifizieren. Die Nukleinsäuremoleküle, die für die antimikrobiellen Polypeptide codieren, werden für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet, um Pflanzen mit verstärkter Krankheitsresistenz zu erzeugen. Zusätzlich können die Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden, um Formulierungen zu erzeugen, die Krankheitsresistenzaktivitäten besitzen.
Verfahren zum Verstärken bzw. Erhöhen einer Pathogenresistenz in einer Pflanze werden bereitgestellt. Die Verfahren umfassen das stabile Transformieren einer Pflanze mit einem DNA-Konstrukt, umfassend eine Nukleotidsequenz für ein abwehrendes Mittel der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der die Expression in einer Pflanze steuert. Derartige Verfahren können in der Agrikultur, insbesondere beim Begrenzen des Einflusses von pilzlichen Pflanzenpathogenen auf Feld- bzw. Nutzpflanzen, Verwendung finden. Die antimikrobiellen Nukleotidsequenzen umfassen die Insekten-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung und funktionelle Varianten und Fragmente davon. Die Wahl des Promotors wird von der gewünschten zeitlichen Abstimmung und Lokalisierung der Expression der antimikrobiellen Nukleotidsequenzen abhängen. Promotoren der Erfindung umfassen konstitutive, induzierbare und Gewebe-bevorzugte Promotoren.
Wie oben diskutiert, codieren die Nukleotidsequenzen der Erfindung für Polypeptide mit antimikrobiellen Eigenschaften, insbesondere fungiziden Eigenschaften. Folglich können die Sequenzen der Erfindung eine Resistenz transgener Pflanzen verstärken, indem zelluläre Funktionen der Pflanzenpathogene, insbesondere pilzliche Pflanzenpathogene, gestört bzw. unterbrochen werden. Es wird jedoch anerkannt, dass die vorliegende Erfindung nicht von einem bestimmten Abwehrmechanismus abhängig ist. Vielmehr wirken die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung so, dass eine Resistenz der Pflanze gegenüber Pathogenen verstärkt wird, unabhängig davon, wie die Resistenz verstärkt oder erzielt wird.
Die Verfahren der Erfindung können mit anderen Verfahren, die auf dem Fachgebiet zum Verstärken der Krankheitsresistenz in Pflanzen verfügbar sind, verwendet werden. Gleicherma ßen können die hierin beschriebenen antimikrobiellen Zusammensetzungen alleine oder in Kombination mit anderen Nukleotidsequenzen, Polypeptiden oder Mitteln zum Schützen von Pflanzen gegen Pflanzenkrankheiten und Pathogene verwendet werden. Obgleich eine Beliebige aus einer Vielfalt von zweiten Nukleotidsequenzen eingesetzt werden kann, umfassen spezifische Ausführungsformen der Erfindung jene zweiten Nukleotidsequenzen, die, wenn sie in einer Pflanze exprimiert werden, die Erhöhung der Resistenz einer Pflanze gegenüber Pathogenen unterstützen.
Proteine, Peptide und Lysozyme, die natürlicherweise in Insekten (Jaynes et al. (1987) Bioassays 6:263–270), Plants (Broekaert et al. (1997) Critical Reviews in Plant Sciences 16:297–323), Tieren (Vunnam et al. (1997) J. Peptide Res. 49:59–66) und Menschen (Mitra und Zang (1994) Plant Physiol. 106:977–981; Nakajima et al. (1997) Plant Cell Reports 16:674–679) vorkommen, sind ebenso eine potentielle Quelle für Pflanzenkrankheitsresistenz (Ko, K. (2000) http://www.scisoc.org/feature/BioTechnology/antimicrobial.html). Beispiele für derartige Pflanzenresistenz-verleihende Sequenzen umfassen jene, die für das rhoGTPase-aktivierende Protein (rhoGAP) der Sonnenblume, Lipoxygenase (LOX), Alkohol-Dehydrogenase (ADH) und das Sclerotinia-induzierbare Protein-1 (SCIP-1) codieren. Diese Nukleotidsequenzen verstärken eine Pflanzenkrankheitsresistenz durch die Modulation der Entwicklung, von Entwicklungswegen und des Pflanzenpathogen-Abwehrsystems. Andere Pflanzenabwehrproteine umfassen jene, die in WO 99/43823 und WO 99/43821 beschrieben sind. Es wird anerkannt, dass derartige zweite Nukleotidsequenzen in Abhängigkeit vom gewünschten Ergebnis entweder in Sinn- bzw. Sense- oder in Gegensinn- bzw. Antisense-Orientierung verwendet werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die Polypeptide der Erfindung mit einem annehmbaren bzw. verträglichen Träger zu (einer) antimikrobiellen Zusammensetzung(en) formuliert werden, die z. B. eine Suspension, eine Lösung, eine Emulsion, ein Stäubepulver, ein dispergierbares Granulat, ein benetzbares Pulver und ein emulgierbares Konzentrat, ein Aerosol, ein imprägniertes Granulat, ein Adjuvans bzw. Hilfsstoff oder eine Beschichtungs-taugliche Paste ("coatable Paste") ist bzw. sind, und auch in Einkapselungen, z. B. (mit) polymeren Substanzen.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die abwehrenden Mittel isolierte Polypeptide der Erfindung. Die abwehrenden Mittel der Erfindung finden Verwendung beim Dekontaminieren von Pflanzenpathogenen während der Bearbeitung von Getreide bzw. Körnern für die Tier- oder Humanernährung ("animal or human food consumption"), während der Bearbeitung von Futterstoffen und während der Bearbeitung von Pflanzenmaterial für die Silage. In dieser Ausführungsform werden die abwehrenden Mittel der Erfindung an Getreide bzw. Körnern, Pflanzenmaterial für die Silage oder einer kontaminierten Nahrungs(mittel)kultur oder während einer zweckdienlichen Stufe der Bearbeitungsverfahrensweise in Mengen präsentiert, die hinsichtlich einer antimikrobiellen Aktivität wirksam sind. Die Zusammensetzungen können auf die Umgebung eines Pflanzenpathogens angewendet werden, beispielsweise durch Sprühen, zer stäuben, (Auf-)Stäuben, Streuen ("scattering"), Benetzen bzw. Beschichten oder Übergießen, Einarbeiten in oder auf den Boden, Einarbeiten in Wasser zur Bewässerung, durch Samenbehandlung oder durch Stäuben zu der Zeit, zu der das Pflanzenpathogen aufzutreten begonnen hat oder vor dem Auftreten von Schädlingen als eine Schutzmaßnahme. Es wird anerkannt, dass beliebige Mittel zum Inkontaktbringen der abwehrenden Polypeptidmittel ("defensive agent polypeptides") mit dem Pflanzenpathogen in der Ausführung der Erfindung verwendet werden können.
Verfahren zum Kontrollieren von Pflanzenpathogenen, die das Anwenden einer dekontaminierenden Menge eines Polypeptids oder einer Zusammensetzung der Erfindung auf die Umgebung des Pflanzenpathogens umfassen, werden bereitgestellt. Die Polypeptide der Erfindung können mit einem annehmbaren Träger zu (einer) Zusammensetzung(en) formuliert werden, die z. B. eine Suspension, eine Lösung, eine Emulsion, ein Stäubepulver, ein dispergierbares Granulat, ein benetzbares Pulver, ein emulgierbares Konzentrat, ein Aerosol, ein imprägniertes Granulat, ein Adjuvans bzw. Hilfsstoff, eine Beschichtungs-taugliche Paste ("coatable Paste") und auch Einkapselungen, z. B. (in) polymeren Substanzen, ist bzw. sind.
Solche obenstehend offenbarten Zusammensetzungen können erhalten werden durch die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels, eines inerten Trägers, eines Konservierungsmittels, eines Feuchthaltemittels, eines Fressstimulans, eines Lockstoffs, eines Einkapselungsmittels, eines Bindemittels, eines Emulgators, eines Farbstoffs, eines UV-Schutzmittels, eines Puffers, eines Fließ(hilfs)mittels oder von Düngern, Mikromerstoffspendern oder anderen Zubereitungen, die das Pflanzenwachstum beeinflussen. Eine oder mehrere Agrochemikalien, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakteriozide, Nematozide, Molluscizide, Acarazide, Pflanzenwachstumsregulatoren, Erntehilfsmittel und Dünger, können mit Trägern, oberflächenaktiven Mitteln oder Adjuvantien bzw. Hilfsstoffen, die herkömmlicherweise auf dem Fachgebiet der Formulierung eingesetzt werden, oder anderen Komponenten zum Erleichtern der Handhabung des Produkts und der Anwendung bzw. Aufbringung für bestimmte Zielmycotoxine kombiniert werden. Geeignete Träger und Adjuvantien bzw. Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den Substanzen, die gewöhnlicherweise in der Formulierungstechnologie eingesetzt werden, z. B. natürliche oder regenerierte mineralische Substanzen, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, klebrigmachende Mittel, Bindemittel oder Dünger. Die aktiven Ingredientien der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in der Form von Zusammensetzungen angewendet und können auf die zu behandelnde Anbaufläche oder Pflanze gleichzeitig mit oder in Folge mit anderen Verbindungen angewendet werden. In einigen Ausführungsformen sind Verfahren der Anwendung eines aktiven Ingrediens der vorliegenden Erfindung oder einer agrochemischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung (die wenigstens eines der Proteine der vorliegenden Erfindung enthält) Anwendung auf das Blattwerk, Überziehen bzw. Beschichten von Samen und Anwendung auf den Boden.
Geeignete oberflächenaktive Mittel umfassen, ohne Beschränkung darauf, anionische Verbindungen, wie ein Carboxylat z. B. eines Metalls; ein Carboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N-Acylsarcosinat; Mono- oder Diester von Phosphorsäure mit Fettalkoholethoxylaten oder Salze von derartigen Estern; Fettalkoholsulfate, wie Natriumdodecylsulfat, Natriumoctadecylsulfat oder Natriumcetylsulfat; ethoxylierte Fettalkoholsulfate; ethoxylierte Alkylphenolsulfate; Ligninsulfonate; Petroleumsulfonate; Alkylarylsulfonate, wie Alkylbenzolsulfonate oder Niederalkylnaphthalinsulfonate, z. B. Butyl-Naphthalinsulfonat; Salze von sulfonierten Naphthalin-Formaldehyd-Kondensaten; Salze von sulfonierten Phenol-Formaldehyd-Kondensaten; komplexere Sulfonate, wie die Amidsulfonate, z. B. das sulfonierte Kondensationsprodukt von Ölsäure und N-Methyltaurin; oder die Dialkylsulfosuccinate, z. B. das Natriumsulfonat oder Dioctylsuccinat. Nicht-ionische Mittel umfassen Kondensationsprodukte von Fettsäureestern, Fettalkoholen, Fettsäureamiden oder Fettsäure-Alkyl- oder -Alkenyl-substituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fettsäureester von mehrwertigen Alkoholethern, z. B. Sorbitanfettsäureester, Kondensationsprodukte von derartigen Estern mit Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, acetylenische Glykole, wie 2,4,7,9-Tetraethyl-5-decin-4,7-diol oder ethoxylierte acetylenische Glykole. Beispiele für ein kationisches oberflächenaktives Mittel umfassen z. B. ein aliphatisches Mono-, Di- oder Polyamin, wie ein Acetat, Naphthenat oder Oleat; oder ein Sauerstoff-enthalendes Amin, wie ein Aminoxid von Polyoxyethylenalkylamin; ein Amid-verknüpftes Amin, hergestellt durch die Kondensation einer Carbonsäure mit einem Di- oder Polyamin; oder ein quaternäres Ammoniumsalz.
Beispiele für inerte Materialien umfassen, ohne Beschränkung darauf, anorganische Mineralien, wie Kaolin, Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate, oder botanische Materialien, wie Kork, gepulverte Maiskolben, Erdnussschalen, Maisspelzen und Walnussschalen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form für eine direkte Anwendung oder als ein Konzentrat für eine primäre Zusammensetzung, die eine Verdünnung mit einer geeigneten Menge an Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel vor der Anwendung erfordert, sein. Die dekontaminierende Konzentration wird in Abhängigkeit von der Natur der speziellen Formulierung variieren, insbesondere davon, ob sie als ein Konzentrat oder direkt zu verwenden ist.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zusammensetzungen sowie die Polypeptide der vorliegenden Erfindung vor der Formulierung behandelt werden, um die Aktivität zu verlängern, wenn sie auf die Umgebung eines Pflanzenpathogens angewendet werden, solange die Vorbehandlung nicht nachteilig für die Aktivität ist. Eine derartige Behandlung kann durch chemische und/oder physikalische Mittel erfolgen, solange die Behandlung die Eigenschaften der Zusammensetzung(en) nicht nachteilig beeinflusst. Beispiele für chemische Reagenzien umfassen, ohne Beschränkung darauf, Halogenierungsmittel; Aldehyde, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd; antiinfektiöse Substanzen, wie Zephiranchlorid; Alkohole, wie Isopropanol und Ethanol; und histologische Fixierungsmittel, wie Bouins Fixierungsmittel und Hellys Fixierungsmittel (siehe z. B. Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W. H. Freeman und Co.)).
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung eine Mikrobe, die die Nukleotidsequenz eines abwehrenden Mittels stabil integriert hat. Die resultierenden Mikroben können bearbeitet und als ein mikrobielles Spray verwendet werden. Für diesen Zweck kam ein beliebiger geeigneter Mikroorganismus verwendet werden. Siehe z. B. Gaertner et al. (1993) in Advanced Engineered Pesticides, Kim (Hrsg.). In einer Ausführungsform werden die Nukleotidsequenzen der Erfindung in Mikroorganismen eingeführt, die sich auf Pflanzen vermehren (Epiphyten), um die abwehrenden Mittel an potentielle Ziel(nutz)pflanzen abzugeben. Die Epiphyten können z. B. Gram-positive oder Gram-negative Bakterien sein. Es wird ferner anerkannt, dass ganze, d. h. nicht-lysierte, Zellen des transformierten Mikroorganismus mit Reagenzien behandelt werden können, die die Aktivität des Polypeptids, das in dem Mikroorganismus produziert wurde, verlängern, wenn der Mikroorganismus auf die Umgebung einer Zielpflanze angewendet wird. Eine Sekretionssignalsequenz kann in Kombination mit dem Gen von Interesse verwendet werden, so dass das resultierende Enzym für die Präsentation an die Zielpflanze aus dem Mikroorganismus sekretiert wird.
Auf diese Weise kann ein Gen, das für ein abwehrendes Mittel der Erfindung codiert, über einen geeigneten Vektor in einen mikrobiellen Wirt eingeführt werden, und der transformierte Wirt wird auf die Umgebung, Pflanzen oder Tiere angewendet. Mikroorganismenwirte, die dafür bekannt sind, die "Phytosphäre" (Phylloplane, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizoplane) von einer oder mehreren (Ertrags-)Kulturen bzw. Nutzpflanzen von Interesse zu besetzen, können für die Transformation ausgewählt werden. Diese Mikroorganismen werden so gewählt, dass sie fähig sind, mit den Wildtyp-Mikroorganismen in der speziellen Umgebung erfolgreich zu konkurrieren, um für eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens, das das detoxifizierende Polypeptid exprimiert, und für einen verbesserten Schutz der Enzyme der Erfindung vor Umwelt-bedingtem bzw. Umgebungs-bedingtem Abbau und Umwelt-bedingter bzw. Umgebungs-bedingter Inaktivierung zu sorgen.
Derartige Mikroorganismen umfassen Bakterien, Algen und Pilze. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen, wie Bakterien, z. B. Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter Leuconostoc und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefe, z. B. Saccharomyces, Pichia, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, Aureobasidium und Gliocladium. Von besonderem Interesse sind solche Bakterienarten der Phytosphäre, wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandii; und Hefearten der Phytosphäre, wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pullulans.
Beispielhafte Prokaryonten, sowohl Gram-negativ als auch -positiv, umfassen Enterobacteriacae, wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, wie Rhizobium; Spirillaceae, wie Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, wie Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae; und Nitrobacteracea. Unter den Eukaryonten sind Pilze, wie Phycomyceten und Ascomyceten, die Hefen, wie Saccharomyces und Schizosaccharomyces umfassen; und Basidiomycetes-Hefe, wie Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, und dergleichen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die abwehrenden Mittel der Erfindung als pharmazeutische Verbindung für die Behandlung von pilzlichen und mikrobiellen Pathogenen bei Menschen und anderen Tieren verwendet werden. Krankheiten und Störungen, die durch pilzliche und mikrobielle Pathogene verursacht werden, umfassen, ohne Beschränkung darauf, Pilz-bedingte Meningoencephalitis, oberflächliche Pilzinfektionen, Tinea bzw. Trichophytie ("ringworm"), Fußpilz, Histoplasmose, Candidose, Soor, Coccidioidom, Lungeninfektion mit Cryptococcus, Trichosporonose, Piedra, Tinea nigra, Pilzkeratitis, Onychomykose, Tinea capitis, Chromomykose, Aspergillose, endobronchiale Lungenaspergillose, Mukormykose, Chromoblastomykose, Dermatophytose, Tinea, Fusariose, Pityriasis, Myzetom, Pseudallescheriasis und Sporotrichose.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können als pharmazeutische Verbindungen verwendet werden, um eine Behandlung für Krankheiten und Störungen bereitzustellen, die mit den folgenden pilzlichen Pathogenen, jedoch ohne Beschränkung darauf, zusammenhängen: Histoplasma capsulatum, Candida spp. (C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata/Torulopsis glabrata, C. krusei, C. lusitaniae), Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Cunninghamella spp., Apophysomyces spp., Saksenaee spp., Mucor spp. und Absidia spp. Die Wirksamkeit der Zusammensetzungen der Erfindung als antifungale bzw. antimykotische Behandlungen kann durch antifungale Assays, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Die abwehrenden Mittel können Patienten durch zahlreiche Mittel verabreicht werden. Eine systemische Verabreichung kann auch über transmucosale oder transdermale Mittel erfolgen. Für eine transmucosale oder transdermale Verabreichung werden Durchdringungsmittel ("penetrants"), die für die zu durchdringende Barriere zweckdienlich sind, in der Formulierung verwendet. Derartige Durchdringungsmittel sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen z. B. für die transmucosale Verabreichung Detergentien, Gallensalze und Derivate der Fusidinsäure. Eine transmucosale Verabreichung kann durch Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien bewerkstelligt werden. Für eine transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen in Salben, Unguenta, Gelen oder Cremes formuliert, wie es auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist. Die Verbindungen können auch in der Form von Suppositorien (z. B. mit herkömmlichen Suppositoriengrundlagen, wie Kakaobutter und andere Glyceride) oder Retentionsklistieren für die rektale Abgabe zubereitet werden.
In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern zubereitet, die die Verbindung vor einer raschen Elimination aus dem Körper schützen werden, z. B. eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, einschließlich Implantate und mikroverkapselte Abgabesysteme.
Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure, können verwendet werden. Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen werden für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein. Die Materialien können ebenso im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc., erhalten werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposome, die auf infizierte Zellen targetiert bzw. gerichtet sind, und zwar mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene) können ebenso als pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden. Diese können gemäß Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden, z. B. wie im US-Patent Nr. 4 522 811 beschrieben.
Für eine einfache Verabreichung und die Gleichförmigkeit der Dosierung ist es insbesondere vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Einheitsdosierungsform („dosis unit form") zu formulieren. Eine Einheitsdosierungsform, wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für das zu behandelnde Subjekt geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorherbestimmte Menge der aktiven Verbindung enthält, die so berechnet ist, dass die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger erzielt wird. In Abhängigkeit vom Typ und der Schwere der Krankheit sind etwa 1 μg/kg bis etwa 15 mg/kg (z. B. 0,1 bis 20 mg/kg) an Antikörper eine Anfangskandidatendosierung ("initial candidate dosage") für die Verabreichung an den Patienten, z. B. durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische Tagesdosierung kann von etwa 1 μg/kg bis etwa 100 mg/kg oder mehr reichen, und zwar in Abhängigkeit von den o. g. Faktoren. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung in Abhängigkeit vom Zustand fortgesetzt, bis eine gewünschte Suppression von Krankheitssymptomen auftritt. Jedoch können andere Dosierungsregime nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie wird mittels herkömmlicher Techniken und Assays leicht überwacht. Ein beispielhaftes Dosierungsregime ist in WO 94/04188 offenbart. Die Beschreibung für die Einheitsdosierungsformen der Erfindung wird diktiert und ist direkt abhängig von den einzigartigen Merkmalen der aktiven Verbindung und der zu erzielenden speziellen therapeutischen Wirkung und den Beschränkungen, die dem Fachgebiet des Einarbeitens bzw. Compoundierens einer derartigen aktiven Verbindung für die Behandlung von Individuen inhärent sind.
"Behandlung" ist hierin definiert als die Anwendung oder Verabreichung eines therapeutischen Mittels auf einen/an einem Patienten oder als Anwendung oder Verabreichung eines therapeutischen Mittels auf/an isoliertes Gewebe oder eine Zelllinie aus einem Patienten, der/das/die eine Krankheit, ein Krankheitssymptom oder eine Prädisposition für eine Krankheit aufweist, und zwar mit dem Zweck, die Krankheit, die Krankheitssymptome oder die Prädisposition für eine Krankheit zu kurieren, zu heilen, zu lindem, zu erleichtern, zu ändern, ihr/ihn abzuhelfen, sie zu verbessern, sie zu bessern oder zu beeinflussen. Ein "therapeutisches Mittel" umfasst, ohne Beschränkung darauf, kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, Ribozyme und Antisense- bzw. Gegensinn-Oligonukleotide.
Die abwehrenden Mittel der Erfindung können für jede Anwendung, einschließlich dem Beschichten von Oberflächen zum Targetieren von Mikroben, verwendet werden. Auf diese Weise umfassen Zielmikroben Humanpathogene oder Mikroorganismen. Oberflächen, die mit den abwehrenden Mitteln der Erfindung beschichtet werden könnten, umfassen Teppiche und sterile medizinische Einrichtungen. Polymer-gebundene Polypeptide der Erfindung können zum Beschichten von Oberflächen verwendet werden. Verfahren zum Einarbeiten von Zusammensetzungen mit antimikrobiellen Eigenschaften in Polymere sind auf dem Fachgebiet bekannt. Sehe US-Patent Nr. 5 847 047 .
Ein isoliertes Polypeptid der Erfindung kann als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die abwehrende Mittel binden, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken für die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern. Als Immunogene können die Volllängen-Abwehrmittel verwendet werden oder, alternativ von der Erfindung bereitgestellt, antigene Peptidfragmente der abwehrenden Mittel. Das antigene Peptid eines abwehrenden Mittels umfasst wenigstens 8, vorzugsweise 10, 15, 20 oder 30 Aminosäurereste der in SEQ ID NO:101 gezeigten Aminosäuresequenz und umfasst ein Epitop eines abwehrenden Mittels, so dass ein gegen das Peptid erzeugter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit den antimikrobiellen Polypeptiden bildet. Bevorzugte Epitope, die vom antigenen Peptid umfasst sind, sind Regionen von abwehrenden Mitteln, die auf der Oberfläche des Proteins lokalisiert sind, z. B. hydrophile Regionen.
Demgemäß betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung polyklonale und monoklonale Antikörper, gerichtet gegen ein abwehrendes Mittel, die ein abwehrendes Mittel binden. Polyklonale Abwehrmittel-ähnliche Antikörper können hergestellt werden, indem ein geeignetes Subjekt (z. B. ein Kaninchen, eine Ziege, eine Maus oder ein anderer Säuger) mit einem Abwehrmittelähnlichen Immunogen immunisiert wird. Der Abwehrmittel-Antikörpertiter im immunisierten Subjekt kann über die Zeit hinweg mittels Standardtechniken, wie z. B. mit einem Enzymgekoppelten Immunassay (ELISA) unter Verwendung immobilisierter antimikrobieller Polypeptide, überwacht werden. Zu einer geeigneten Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn die Anti-Abwehrmittel-Antikörpertiter am höchsten sind, können Antikörper-produzierende Zellen aus dem Subjekt erhalten und verwendet werden, um monoklonale Antikörper mittels Standardtech niken herzustellen, z. B. der ursprünglich von Kahler und Milstein (1975), Nature 256:495–497, beschriebenen Hybridomtechnik, der Technik mit einem humanen B-Zellhybridom (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), der EBV-Hybridomtechnik (Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Hrsg. Reisfeld und Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), S. 77–96) oder Triomtechniken. Die Technologie zum Herstellen von Hybridomen ist gut bekannt (siehe allgemein Coligan et al., Hrsg. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Kenneth (1980) in Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY; und Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387–402).
Alternativ zum Herstellen von Hybridomen, die monoklonale Antikörper sekretieren, kann ein monoklonaler Anti-Abwehrmittel-ähnlicher Antikörper identifiziert und isoliert werden, indem eine rekombinante kombinatorische Immunglobulin-Bibliothek (z. B. eine Antikörper-Phagen-Displaybibliothek) mit einem abwehrenden Mittel bzw. Abwehrmittel durchmustert wird, um dadurch Immunglobulin-Bibliotheksmitglieder zu isolieren, die das abwehrende Mittel binden. Kits zum erzeugen und Durchmustern von Phagen-Displaybibliotheken sind im Handel erhältlich (z. B. das Recombinant Phage Antibody System von Pharmacia, Katalog Nr. 27-9400-01; und das SurfZAP^TM Phage Display Kit von Stratagene, Katalog Nr. 240612). Zusätzlich können Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die zur Verwendung beim Erzeugen und Durchmustern einer Antikörper-Displaybibliothek besonders hilfreich sind, z. B. im US-Patent Nr. 5 223 409 , den PCT-Veröffentlichungen mit den Nrn. WO 92/18619 , WO 91/17271 , WO 92/20791 , WO 92/15679 , 93/01288 , WO 92/01047 , 92/09690 und 90/02809 ; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370–1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibad. Hybridomas 3:81–85; Huse et al. (1989) Science 246:1275–1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725–734, gefunden werden. Die Antikörper können verwendet werden, um Homologe der abwehrenden Mittel der Erfindung zu identifizieren.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Erläuterung und nicht zum Zwecke der Einschränkung bereitgestellt.
EXPERIMENTELLES
Beispiel 1. Bioassay auf fungizide Aktivität von Polypeptiden aus der Hämolymphe von Manduca sexta
Nach Auftrennung mittels Flüssigkeitschromatographie (LC) wurden die verschiedenen Fraktionen, enthaltend Pathogen-induzierte Polypeptide aus M. sexta, auf fungizide Aktivität gegen die Pflanzenpathogene M. grisea, R. solani und F. verticilloides getestet. Die LC-Fraktionen wurden zunächst in 96-Well-Mikrotiterplatten lyophilisiert. Eine Suspension von 100 μl M. grisea (oder einem anderen genannten Pathogen) wurde in der Standardkonzentration für den Pilzwachstums-Assay bzw. fungalen Wachstums-Assay (2500 Sporen/ml) zu den Polypeptid-haltigen Mikrotiterplatten-Wells gegeben, und die Platten wurden mit Borden^® Sealwrap^TM verschlossen. Die Platten wurden dann für 24 Stunden bei 28°C in eine Dunkelkammer gegeben.
Das Hyphenwachstum wurde unter Verwendung eines Präpariermikroskops überwacht. Die in den Wells, bei denen ein Hyphenwachstum fehlte oder die im Vergleich zu Kontrollwells reduziertes Hypenwachstum zeigten, enthaltenen Polypeptide wurden als fungizide Aktivität besitzend angesehen. Das Hyphenwachstum wurde 48 Stunden nach der Inokulation für eine abschließende Bestimmung der fungiziden Aktivität erneut bewertet.
Beispiel 2. Induktion einer antimikrobiellen Reaktion in Manduca sexta
M. sexta-Larven im fünften Larvenstadium wurden intersegmental 20 μl einer hochkonzentrierten Suspension von M. grisea-Hyphen und -Sporen, die zuvor von einer Agarplattenkolonie abgeschabt wurden, injiziert. Die Larven wurden dann auf frisches Futter gesetzt und sich erholen gelassen. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurde Hämolymphe aus den Larven gewonnen, indem ein Bauchfuß unter Verwendung einer feinen chirurgischen Schere über einem Blatt Parafilm^TM abgetrennt wurde. Auf diese Weise kann näherungsweise 1 ml/Insekt gesammelt werden. Die Hämolymphe wurde in einen 50 ml-Konuskolben überführt und auf Eis gestellt, während die verbleibenden Larven bearbeitet wurden. Sobald alle Larven bearbeitet worden waren, wurde Phenylthioharnstoff ("phenyl thiolurea") zu einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben. Aprotinin wurde ebenfalls zu der Probe gegeben (Endkonzentration 20 μg/ml). Die Proben wurden für 5 Minuten zentrifugiert (3000 UpM), um die Zellen zu pelletieren. Der verbleibende Überstand (Hämolymphe) wurde einer Festphasenextraktion unter Verwendung von Festphasenextraktionssäulen vom Typ Supelco Discovery^® DSC-18 unterworfen. Die Säulen werden unter Verwendung von 100% Methanol vorkonditioniert, unter Verwendung von 100% Lösungsmittel A (5% Acetonitril, 0,1% TFA; 1 Säulenvolumen) äquilibriert, bevor die Probe aufgebracht wird. Nachdem die Hämolymphe (der Überstand) durchgefiltert bzw. durchgedrungen ist, wird die Säule mit Lösungsmittel A gewaschen, bevor mit einem Säulenvolumen von 60% Lösungsmittel B/40% Lösungsmittel A (Lösungsmittel B: 95% Acetonitril, 0,1% TFA) eluiert wird. Der gesammelte Eluent wird bei –80°C gefroren und bis zur Trockne lyophilisiert. Hämolympheproben werden dann in einem kleinen Volumen Wasser (üblicherweise 200–500 μl) resuspendiert, und ein BCA-Assay wird durchgeführt, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Nach der Stufe der Festphasenextraktion werden die Hämolympheproben mittels HPLC fraktioniert und mittels Bioassay getestet.
Die Induktion von M. sexta mit B. bassiana und R. solani wurde in gleicher Weise durchgeführt. Mit R. solani induzierte M. sexta-cDNA-Bibliotheken wurden gemäß Standardprotokollen konstruiert. Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus den Fettkörpern von Pathogeninduzierter M. sexta isoliert. Die mRNAs wurden unter Verwendung eines mRNA-Reinigungskits (BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des ZAP-cDNA-Synthese-Kits und des pBluescript-Phagemids (Stratagene) konstruiert.
Beispiel 3. HPLC-Fraktionierung von Polypeptiden aus Hämolymphe von Manduca sexta, induziert mit Magnaportha grisea
Hämolymphe aus mit M. grisea induzierten M. sexta-Larven (siehe Beispiel 2) wurde an einer HPLC vom Typ HP-1100 fraktioniert, wobei eine Säule vom Typ Vydack C4 (4,6–250 mm) verwendet wurde (3). Ein Gradientensystem wurde zum Eluieren von gebundenen Proteinen verwendet. Die Gradientenbedingungen sind unten angegeben. Fraktionen wurden in Intervallen von einer Minute in einer 96-Well-Mikrotiterplatte gesammelt und auf fungizide Aktivität gegen M. grisea (siehe Beispiel 1) getestet.
Diesem Protokoll wurde auch zur Fraktionierung von Polypeptiden aus Hämolymphe von M. sexta, induziert mit B. bassiana und R. solani, gefolgt. Der Bioassay auf fungizide Aktivität (Beispiel 1) wurde auch unter Verwendung der Pflanzenpathogene R. solani und F. verticilloides durchgeführt. Gradientenbedingungen: Lösungsmittel

Lösungsmittel A: 5% Acetonitril, 0,1% TFA

Lösungsmittel B: 95% Acetonitril, 0,1% TFA
Flussrate

0,6 ml/min

Gradient

0–60% B über 70 Minuten

Beispiel 4. Kapillar- bzw. Microbore-Reinigung des fungiziden Polypeptids Mag1
Nach Fraktionierung mittels HPLC wurden jene Fraktionen aus Beispiel 3, die fungizide Aktivität besaßen (Fraktionen von 47–52 min) weiter aufgetrennt mittels Microbore-LC (Michrome Bioresources), wobei eine Säule vom Typ Vydack C4 (1–150 mm) verwendet wurde. Die Gradientenbedingungen sind unten angegeben. Der Säuleneluent wurde derart gesammelt, dass die Peaks mit dem höchsten Polypeptidgehalt am besten getrennt wurden (4). Die eluierten Polypeptide wurden auf fungizide Aktivität gegen M. grisea getestet (siehe Beispiel 1). Die Polypeptidfraktion, die die größte fungizide Aktivität enthielt, ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Gradientenbedingungen: Lösungsmittel

Lösungsmittel A: 5% Acetonitril, 0,1% TFA

Lösungsmittel B: 95% Acetonitril, 0,1% TFA
Flussrate

50 μl/min

Gradient

5–65% Lösungsmittel B über 70 Minuten

Die Polypeptidfraktion, die die größte fungizide Aktivität enthielt (in 4 mit einem Pfeil gekennzeichnet), wurde unter Verwendung von Microbore-LC (Michrome Bioresources) an einer Säule vom Typ Vydack C18 (1–150 mm) weiter aufgetrennt (5). Die Gradientenbedingungen folgen. Wiederum wurden die Polypeptid-haltigen Fraktionen auf fungizide Aktivität gegen M. grisea getestet (siehe Beispiel 1). (Das resultierende gereinigte Polypeptid wurde mit Mag1 bezeichnet). Gradientenbedingungen: Lösungsmittel

Lösungsmittel A: 5% Acetonitril, 0,1% HFBA

Lösungsmittel B: 95% Acetonitril, 0,1% HFBA
Flussrate

50 μl/min

Gradient

5–65% Lösungsmittel B über 70 Minuten

Diesem Protokoll wurde auch für die Microbore-Reinigung von fungiziden Peptiden, identifiziert in Hämolymphe von M. sexta, die mit B. bassiana und R. solani induziert wurde, gefolgt. Der Bioassay auf fungizide Aktivität (Beispiel 1) wurde auch unter Verwendung der Pflanzenpathogene R. solani und F. verticilloides durchgeführt.
Beispiel 5. Bestimmung des Molekulargewichts von Mag1
Das Molekulargewicht des isolierten Mag1-Polypeptids von Beispiel 4 wurde unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrophotometrie (LC-MS) bestimmt. Die Molekülmasse von Mag1 wurde unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie an einer Micromass-Plattform, LCZ-Massenspektrometer (Micromass, Manchester, UK), bestimmt. Eine Microbore-LC (Michrom Bioresources, Auburn, CA) lieferte das Protein und mobile Phase (Acetonitril/Wasser), wobei eine Umkehrphasensäule verwendet wurde. Spektren wurden im positiv-Ionen-Modus erhalten, wobei eine Kapillarenspannung von 3,5 kV, eine Konusspannung von 45 V und eine Quellentemperatur von 90°C verwendet wurden. Die Spektren wurden über einen Bereich von 600–3000 bei einer Rate von 3,5 s/Scan abgetastet. Die Molekülmassen wurden unter Verwendung des Algorithmus für maximale Entropiedekonvolution (MaxEnt) zum Transformieren des m/z-Bereichs 600–3000 unter Erhalt eines Spektrums mit echter Massenskala bestimmt. Die Massenkalibration wurde unter Verwendung von Pferdeherzmyoglobin durchgeführt.
Ein ähnliches Protokoll wurde für die anderen Polypeptide der Erfindung durchgeführt.
Beispiel 6. Lys-C-Endoproteinaseverdau von Mag1
Lyophilisierte Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) in Sequenzierungsqualität wurde in 50 μl redestilliertem Wasser rekonstituiert, was in einer Pufferkonzentration von 50 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM EDTA und 0,5 mg/ml Raffinose resultierte. Das Mag1-Polypeptid aus Beispiel 4 wurde im Verdaupuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 nM EDTA) zu einem Verhältnis von 1:50 Lys-C zu Mag1-Polypeptid, bezogen auf das Gewicht, gelöst. Die Reaktion wurde bei 37°C für 20 Stunden fortschreiten gelassen. Das verdaute Polypeptid wurde unter Verwendung einer C4-Säule an einer Microbore-HPLC mit einem Gradienten von 5–65% Acetonitril in 0,1% TFA über 70 Minuten bei einer Flussrate von 50 μl/min fraktioniert (6). Vier isolierte Fragmente wurden gesammelt und zur N-terminalen Sequenzanalyse eingereicht.
Ein ähnliches Protokoll wurde für den Verdau der anderen fungiziden Polypeptide der Erfindung befolgt.
Beispiel 7. N-terminale Aminosäuresequenz-Bestimmung von Mag1-Polypeptidfragmenten
Die N-Termini der isolierten Mag1-Fragmente aus Beispiel 6 wurden an einem Proteinsequenziergerät vom Typ ABI Procise^® 494 sequenziert, das aus einer chemischen Arbeitsstation ("chemistry workstation"), einen PTH-Analysesystem, einer Computersteuerung und einer automatisierten Sequenzbezeichnungs- bzw. Sequenzaufruf-Software ("automated sequence calling software") bestand. Um das System zu betreiben und die Sequenzen zu bestimmen, wurden Standardprotokolle verwendet (siehe 7).
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen von isolierten Fragmenten der anderen Polypeptide der Erfindung wurden auf ähnliche Weise bestimmt.
Die N-terminale Peptidsequenz ist beim Bestimmen der exakten oder genauen Prozessierungsstelle für die Umwandlung des Propeptids in die reife und aktive Form des Proteins (in diesem Beispiel Mag1) kritisch. Dies ist für sekretorische Proteine besonders wichtig.
Die C-terminale Peptidsequenz wurde sowohl aus dem mittels LC-MS des aktiven Proteins erzeugten bzw. dargestellten Molekulargewichts als auch des vorhergesagten Molekulargewichts des gleichen codierten Polypeptids auf der Basis der identifizierten cDNA-Sequenz (in Beispiel 8) abgeleitet.
Durch Kenntnis der genauen Termin des reifen Proteins kann man DNA-Moleküle entwerfen und konstruieren, die für das gesamte aktive reife Protein für die Expression in Pflanzen codieren. Wenn nötig, können zusätzliche Pflanzen-spezifische Kontrollelemente und Targetierungssequenzen maßgeschneidert und in das Gendesign eingebaut werden, um die Expression des reifen Polypeptids in Pflanzen zu verstärken und zu targetieren.
Um die ursprüngliche Spezifität und Funktionalität des z. B. Mag1-Proteins, die in der Pflanze bewahrt wird, sicherzustellen, ist die Expression der aktiven reifen Form des Proteins in der Pflanze essentiell.
Beispiel 8. Isolation des cDNA-Klons, der für Mag1 codiert
Vor der Bearbeitung wurden Fettkörper direkt (unter Einbringung) in flüssigen Stickstoff gesammelt. Gesamt-RNA aus Fettkörpern von provozierter Manduca sexta wurde präpariert, indem das Gewebe mit einem Mörser und einem Pistill in flüssigem Stickstoff pulverisiert und die Zellen in Gegenwart von TRIzol (Life Technologies) gemäß dem Protokoll des Herstellers lysiert wurden. PolyA(+)-RNA wurde mittels Oligo(dT)-Cellulose aus Gesamt-RNA affinitätsgereinigt, wobei das mRNA-Reinigungs-Kit (Amersham Pharmacia Biotech) unter Befolgung des Protokolls des Herstellers bei der Vorbereitung auf die cDNA-Bibliothekskonstruktion verwendet wurde. Die Erststrang-cDNA-Synthese unter Verwendung von Superscript II (Life Technologies) und die nachfolgende Zweitstrangsynthese, die Linkeraddition und die gerichtete Klonierung in Restriktionsschnittstellen von pBlueScript SK+ (Stratagene) wurden gemäß den Instruktionen, die mit dem Stratagene-cDNA-Kit (Stratagene) geliefert wurden, durchgeführt. Die cDNA wurde unter Verwendung einer cDNA-Säule (Life Technologies) unmittelbar vor der Ligation in den Vektor gereinigt.
Die Sequenzierung der cDNA-Bibliotheksklone wurde unter Verwendung des Kits mit der Bezeichnung "ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready kit" mit Polymerase vom Typ FS AmpliTaq DNA (Perkin Elmer) durchgeführt, und es erfolgte eine Analyse an einem automatischen DNA-Sequenziergerät vom Typ ABI Modell 373. Die Mag1-Gensequenz wurde identifiziert, indem etwa 2000 Klone der cDNA-Bibliothek, hergestellt aus mRNA, die aus den Fettkörpern von provozierter M. sexta stammte, sequenziert wurden. Aminosäuresequenzen, abgeleitet aus den Aminotermini des vollständigen Peptids oder der proteolytischen Spaltprodukte, wurden zum Vergleich mit der entsprechenden cDNA-Klon-Sequenzbibliothek, translatiert in die sechs möglichen Raster, verwendet. Sequenzen, die eine 100%ige Identität zu den N-terminalen Aminosäuresequenzen enthielten, wurden vollständig translatiert, und ihr vorhergesagtes MG wurde mit dem MG des gereinigten Mag1-Proteins verglichen. Sequenzen mit vergleichbaren MGs wurden als wahrscheinlich für Mag1 codierend identifiziert.
Beispiel 9. Isolierung des cDNA-Klons, der für ein Polypeptid von Interesse codiert
Die N-terminalen Aminosäuresequenz-tags eines Polypeptids von Interesse werden verwendet, um cDNA-Klone zu identifizieren, die für das Polypeptid codieren. Degenerierte Oligonukleotide, die für die Aminosäuresequenz-tags des Polypeptids codieren, werden als Sonden zum Detektieren von cDNAs, die für das Polypeptid codieren, in einer Pathogen-induzierten M. sexta-cDNA-Bibliothek verwendet (siehe Beispiel 2). Auf diese Weise wird eine Volllängen-cDNA, die für das Polypeptid von Interesse codiert, isoliert und sequenziert. Eine vollständige Sequenzierung des identifizierten cDNA-Klons wird durchgeführt, um zu bestätigen, dass er für das gereinigte Polypeptid codiert. Die Bestätigung wird dadurch erhalten, dass das vorhergesagte Molekulargewicht des cDNA-codierten Polypeptids das gleiche ist, wie das Molekulargewicht, das durch LC-MS generiert wurde.
Beispiel 10. Konstruktion eines rekombinanten Baculovirus, der fungizide Polypeptide exprimiert
Die Nukleotidsequenzen, die für die Polypeptide der Erfindung codieren, können in das Baculovirus-Genom selbst eingeführt werden. Zu diesem Zweck können die Nukleotidsequenzen unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors, des IE1-Promotors oder eines beliebigen anderen der Baculovirus-Promotoren gestellt werden. Die cDNA wird anschließend zusammen mit zweckdienlichen Leadersequenzen in einen Baculovirus-Transfervektor inseriert, wobei Standardtechniken der molekularen Klonierung verwendet werden. Nach Transformation von E. coli DH5α werden isolierte Kolonien ausgewählt, und Plasmid-DNA wird präpariert und mittels Restriktionsenzymanalyse analysiert. Kolonien, die das geeignete Fragment enthalten, werden isoliert, propagiert, und Plasmid-DNA wird für die Cotransfektion präpariert.
Beispiel 11. Expression von fungiziden Polypeptiden in Insektenzellen
Die Polypeptide der Erfindung können in Insektenzellen exprimiert werden. Zu diesem Zweck werden die Spodoptera frugiperda-Zellen (Sf-9 oder Sf-21) in ExCell^® 401-Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder einem ähnlichen Medium, supplementiert mit 3,0% fötalem Rinderserum, propagiert. Lipofectin^® (50 μl bei 0,1 mg/ml, Gibco/BRL) wird zu einem 50 μl-Aliquot des Transfervektors, enthaltend die antimikrobiellen Nukleotidsequenzen (500 ng) und linearisiertes Polyhedrin-negatives AcNPV (2,5 μg, Baculogold^®-Virus-DNA, Pharmigen-San Diego, CA), gegeben. Sf-9-Zellen (näherungsweise 50%ige Monoschicht) werden mit der Virus-DNA/Transfervektor-Lösung cotransfiziert. Die überstehende Flüssigkeit aus dem Cotransfektionsexperiment wird 5 Tage nach der Transfektion gesammelt, und rekombinante Viren werden unter Einsatz von Standardprotokollen zur Plaque-Reinigung isoliert, wobei nur Polyhedrin-positive Plaques ausgewählt werden (O'Reilly et al. (1992), Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman und Company, New York). Sf-9-Zellen in 35 mm Petrischalen (50%ige Monoschicht) werden mit 100 μl einer seriellen Verdünnung der Virussuspension inokuliert, und die überstehenden Flüssigkeiten werden 5 Tage nach der Infektion gesammelt. Um größere Mengen des Virus für eine Charakterisierung herzustellen, werden diese überstehenden Flüssigkeiten verwendet, um größere Gewebekulturen für eine Propagierung von rekombinanten Viren in großem Maßstab zu inokulieren. Die Expression des codierten fungiziden Polypeptids durch das rekombinante Baculovirus kann unter Verwendung eines Bioassays (wie in Beispiel 4 beschrieben) von LC-MS oder von Antikörpern bestätigt werden.
Beispiel 12. Expression von fungiziden Peptiden in Pichia
Die Nukleotidsequenzen, die für die Polypeptide der Erfindung codieren, können in Pichia unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors exprimiert und so targetiert werden, dass sie intrazelluär bleiben oder in das Medium sekretiert werden. Die Nukleotidsequenzen werden in einem Pichia-Expressionsvektor unter Verwendung von molekularen Standardtechniken kloniert. Die Transformation von Pichia-Stämmen (z. B. X-33, GS115, SMD1168, KM71 etc. – Invitrogen, Carlsbad, CA) involviert die Linearisierung des Konstrukts und die Einführung der DNA in Transformations-kompetente Pichia-Zellen durch chemische Mittel oder durch Elektroporation gemäß Standardprotokollen. Transformanten werden entweder anhand ihrer Resistenz gegenüber Zeocin oder Blasticidin oder anhand ihrer Fähigkeit, auf Histidin-defizientem Medium zu wachsen, identifiziert. Expressionstests in kleinem Maßstab werden an ausgewählten Transformanten durchgeführt, um für eine weitere Maßstabsvergrößerung solche zu identifizieren, die die Polypeptide der Erfindung hoch exprimieren. Bei einem induzierbaren System, z. B. wenn das Peptid unter der Kontrolle des AOX1-Promotors steht, werden Transformanten in einem Medium bzw. Medien mit Glycerin als Kohlenstoffquelle gezüchtet und durch Wachstum in einem Medium bzw. Medien, enthaltend Methanol anstelle von Glycerin, induziert. Eine kontinuierliche Induktion über einen Zeitraum von 24–120 Stunden wird durch Zugabe von Methanol (0,5% Endkonzentration) alle 24 h erreicht. Die funktionelle Expression des Polypeptids wird mittels LC-MS-Analyse/Reinigung und Bioassay bestätigt.
Beispiel 13. Expression von fungiziden Polypeptiden in Bakterien
Die Nukleotidsequenzen, die für die Polypeptide der Erfindung codieren, können in Bakterien exprimiert und die Peptide für intrazelluläre oder extrazelluläre Expression targetiert werden. Die cDNAs können in einen geeigneten bakteriellen Expressionsvektor (z. B. pET-Vektoren (Novagen, Madison, WI)) kloniert werden, und zwar unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors, wobei Standardtechniken der molekularen Klonierung verwendet werden. Das Plasmid, das das Gen von Interesse enthält, wird in Transformations-kompetente Bakterienzellen unter Verwendung von Standardprotokollen für die Transformation mit Chemikalien oder Elektroporation eingeführt, und die Transformanten werden unter Verwendung einer Antibiotikaresistenz ausgewählt. Zusätzlich zu traditionellen E. coli-Stämmen, die herkömmlicherweise für die Transformation verwendet werden, können mutante Stämme, wie Origami^TM (Novagen), die eine Disulfid-Brückenbindung ermöglichen, verwendet werden, insbesondere um bei Cystein-reichen Peptiden funktionelle Peptide zu exprimieren. Induzierbare Systeme, wie E. coli-Stämme, die das T7-RNA-Polymerasegen (Lambda-DE3-Lysogen) tragen, können verwendet werden, wobei die Expression des Gens von Interesse unter einem T7-Promotor durch Zugabe von IPTG für variable Zeitspannen induziert wird. Die Expression und die Aktivität der Polypeptide werden mittels LC-MS und Bioassays bestätigt.
Beispiel 14. Transformation von embryogenem Reiskallus durch Bombardierung und Regeneration von transgenen Pflanzen
Embryogene Calluskulturen, die aus dem Scutellum bzw. Schildchen von keimenden Samen stammen, dienen als Ausgangsmaterial bzw. Quelle für Transformationsexperimente. Dieses Material wird erzeugt, indem sterile Reissamen auf einem Callus-Initiationsmedium (MS-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 1,0 mg/l 2,4-D und 10 μM AgNO₃) im Dunklen bei 27–28°C keimen gelassen werden. Embryogener Callus, der aus dem Scutellum der Embryonen proliferiert, wird dann auf CM-Medium (N6-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 1 mg/l 2,4-D, Chu et al., 1985, Sci. Sinica 18:659–668) transferiert. Calluskulturen werden auf CM mittels routinemäßiger Subkultur in zweiwöchigen Intervallen aufrechterhalten und innerhalb von 10 Wochen nach der Initiaition zur Transformation verwendet.
Callus wird für die Transformation vorbereitet, indem im Zentrum eines Kreises aus Papier vom Typ Whatman #541, der auf CM-Medium aufgegeben ist, 0,5–1,0 mm große Stücke, die etwa 1 mm beabstandet in einer kreisförmigen Fläche von etwa 4 cm Durchmesser angeordnet werden, subkultiviert werden. Die Platten mit Callus werden für 3–5 Tage im Dunklen bei 27–28°C inkubiert. Vor der Bombardierung werden die Filter mit dem Callus auf CM, supplementiert mit 0,25 M Mannit und 0,25 M Sorbit, transferiert, und zwar für 3 Stunden im Dunk len. Die Petrischalendeckel werden dann für 20–45 Minuten in einer Sterilbank ("sterile hood") halb offen gelassen, um Feuchtigkeit auf den Platten verschwinden zu lassen.
Zirkuläre Plasmid-DNA von zwei unterschiedlichen Plasmiden, wobei eines den selektierbaren Marker für die Reistransformation enthält und eines das Nukleotid der Erfindung enthält, wird auf der Oberfläche von Goldpartikeln co-präzipitiert. Um dies zu bewerkstelligen, wird eine Gesamtmenge von 10 μg DNA bei einem 2:1-Verhältnis von Merkmals-DNA:DNA für einen selektierbaren Marker zu einem 50 μl-Aliquot von Goldpartikeln, resuspendiert zu einer Konzentration von 60 mg/ml, gegeben. Calciumchlorid (50 μl einer 2,5 M-Lösung) und Spermidin (20 μl einer 0,1 M Lösung) werden anschließend zu der Gold-DNA-Suspension gegeben, wobei das Röhrchen für 3 Minuten einer Vortexbehandlung unterzogen wird. Die Goldpartikel werden für 1 s in einer Kleinzentrifuge ("microfuge") zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die Goldpartikel werden anschließend zweimal mit 1 ml absolutem Ethanol gewaschen und anschließend in 50 μl absolutem Ethanol resuspendiert und für 1 s (Ultra-)Schall-behandelt((Ultra-)Schallbad), um die Goldpartikel zu dispergieren. Die Goldsuspension wird für 5 Minuten bei –70°C inkubiert und (Ultra-)Schall-behandelt((Ultra-)Schallbad), sofern nötig, um die Partikel zu dispergieren. Sechs Mikroliter der DNA-beschichteten Goldpartikel werden anschließend auf Mylar-Makrocarrier-Scheiben geladen, und das Ethanol wird verdampfen gelassen.
Am Ende des Trocknungszeitraums wird eine Petrischale, die das Gewebe enthält, in die Kammer des Geräts mit der Bezeichnung PDS-1000/He gestellt. Die Luft in der Kammer wird anschließend bis zu einem Vakuum von 28–29 Zoll Hg evakuiert. Der Makrocarrier wird mit einer Heliumschockwelle beschleunigt, wobei eine Berstmembran verwendet wird, die birst, wenn der He-Druck im Schockrohr 1080–1100 psi erreicht. Das Gewebe wird näherungsweise 8 cm vom Stoppschirm beabstandet angeordnet, und der Callus wird zweimal bombardiert. Fünf bis sieben Platten Gewebe werden auf diese Weise mit den DNA-beschichteten Goldpartikeln bombardiert. Nach der Bombardierung wird der Callus auf CM-Medium ohne zusätzliches Sorbit oder Mannit transferiert.
Innerhalb von 3–5 Tagen nach der Bombardierung wird das Callusgewebe auf SM-Medium (CM-medium, enthaltend 50 mg/l Hygromycin), transferiert. Um dies zu bewerkstelligen, wird Callusgewebe von Platten in sterile 50 ml-Konusröhrchen transferiert und abgewogen. Geschmolzener Deckagar mit 40°C wird zugegeben, wobei 2,5 ml Deckagar/100 mg Callus verwendet werden. Callusklumpen werden durch wiederholtes Aufziehen bzw. Dispensieren durch eine 10 ml-Pipette zu Fragmenten von weniger als 2 mm Durchmesser gebrochen. Aliquote von 3 ml der Callussuspension werden auf frischem SM-Medium ausplattiert, und die Platten werden im Dunklen für 4 Wochen bei 27–28°C inkubiert. Nach 4 Wochen werden transgene Callusereignisse identifiziert, auf frische SM-Platten transferiert und für weitere 2 Wochen im Dunklen bei 27–28°C kultiviert bzw. gezüchtet.
Wachsender Callus wird für 2 Wochen im Dunklen bei 25°C auf RM1-Medium (MS-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 2% Saccharose, 3% Sorbit, 0,4% Gelrite + 50 ppm hyg B) transferiert. Nach 2 Wochen wird der Callus auf RM2-Medium (MS-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 3% Saccharose, 0,4% Gelrite + 50 ppm hyg B) transferiert und unter kaltweißes Licht (~40 μEm^–2s^–1) mit einer 12-stündigen Photoperiode bei 25°C und 30–40% Luftfeuchte gegeben. Nach 2–4 Wochen im Licht beginnt sich der Callus zu organisieren und bildet Schösslinge. Die Schösslinge werden aus dem umgebenden Callus/Medium entfernt und vorsichtig auf RM3-Medium (1/2 × MS-Salze, Vitamine nach Nitsch und Nitsch, 1% Saccharose + 50 ppm Hygromycin B) in Phytatrays (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) überführt, und die Inkubation wird unter den gleichen Bedingungen, wie sie in der vorigen Stufe beschrieben sind, fortgesetzt.
Die Pflanzen werden von RM3 auf 4''-Töpfe, enthaltend Metro-Mix 350, nach 2–3 Wochen transferiert, wenn ein hinreichendes Wurzel- und Schösslingswachstum aufgetreten ist. Die Pflanzen werden unter einem Licht/Dunkelheit-Zyklus von 12 Stunden/12 Stunden gezogen, wobei ein Tag/Nacht-Temperaturregime von ~30/18°C verwendet wird.
Beispiel 15. Transformation von Mais mittels Partikelbombardierung und Regeneration von transgenen Pflanzen.
Unreife Maisembryonen aus Gewächshaus-Spenderpflanzen werden mit einem Plasmid bombardiert, das eine Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Ubiquitinpromotor und das selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25–37), das Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos verleiht, enthält. Alternativ wird das selektierbare Markergen auf einem separaten Plasmid bereitgestellt. Die Transformation wird wie folgt durchgeführt. Die Rezepte für Medien folgen unten.
Präparation von Zielgewebe
Die Lieschblätter der Kolben werden entfernt, und die Kolben werden in 30%iger Clorox-Bleiche plus 0,5% Mikro-Detergens für 20 Minuten oberflächensterilisiert und zweimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die unreifen Embryonen werden exzidiert und mit den Embryoachsenseiten nach unten (Scutellum- bzw. Schildchenseiten nach oben) zu 25 Embryonen pro Platte für 4 Stunden auf 560Y-Medium aufgegeben und anschließend innerhalb der 2,5 cm-Zielzone zur Vorbereitung der Bombardierung angeordnet.
Präparation von DNA
Ein Plasmidvektor, der die Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Ubiquitin-Promotor umfasst, wird hergestellt. Diese Plasmid-DNA plus Plasmid-DNA, die einen selektierbaren PAT-Marker enthält, wird auf Wolframpellets von 1,1 μm (mittlerer Durchmesser) präzipitiert, wobei eine CaCl₂-Präzipitationsverfahrensweise wie folgt verwendet wird:
100 μl vorbereitete Wolfram-Partikel in Wasser
10 μl (1 μg) DNA in Tris-EDTA-Puffer (1 μg Gesamt-DNA)
100 μl 2,5 M CaCl₂
10 μl 0,1 M Spermidin
Jedes Reagens wird sequenziell zu der Wolframpartikelsuspension gegeben, während diese auf einem Vortexgerät für mehrere Röhrchen ("multitube vortexer") gehalten wird. Das endgültige Gemisch wird kurz (Ultra-)Schall-behandelt und unter konstanter Vortexbehandlung für 10 Minuten inkubieren gelassen. Nach der Präzipitationszeitdauer werden die Röhrchen kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit wird entfernt, es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden zentrifugiert. Wiederum wird die Flüssigkeit entfernt, und 105 μl 100% Ethanol werden zu den endgültigen Wolframpartikelpellets gegeben. Für die Partikelkanonenbombardierung werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz (Ultra-)Schall-behandelt, und 10 μl werden auf das Zentrum von jedem Makrocarrier aufgetüpfelt und vor der Bombardierung etwa 2 Minuten trocknen gelassen.
Partikelkanonenbehandlung
Die Probenplatten werden auf dem Level #4 in der Partikelkanone #HE34-1 oder #HE34-2 bombardiert. Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss bei 650 psi mit einer Gesamtzahl von 10 Aliquoten, die aus jedem Röhrchen präparierter Partikel/DNA entnommen wurden.
Anschließende Behandlung
Nach der Bombardierung werden die Embryonen für 2 Tage auf 560Y-Medium gehalten, anschließend auf 560R-Selektionsmedium, das 3 mg/Liter Bialaphos enthält, transferiert und alle 2 Wochen subkultiviert. Nach näherungsweise 10 Wochen der Selektion werden Selektionsresistente Callusklone auf 288J-Medium transferiert, um die Regeneration von Pflanzen zu initiieren. Nach der Reifung von somatischen Embryonen (2–4 Wochen) werden gut entwickelte somatische Embryonen auf Medium zur Keimung transferiert und in den beleuchteten Kulturraum verbracht. Näherungsweise 7–10 Tage später werden sich entwickelnde Pflänzchen für 7–10 Tage auf Hormon-freies 272V-Medium in Röhrchen transferiert, bis Pflänzchen gut etabliert sind. Die Pflanzen werden anschließend auf Einsätze in Multitopfpaletten (entsprechend einem 2,5''-Topf), die Topferde enthalten, transferiert und für 1 Woche in einer Wachstumskammer gezogen. Anschließend werden sie für weitere 1–2 Wochen im Gewächshaus gezogen, anschließend auf Töpfe vom Typ "Classic 600" (1,6 Gallonen) transferiert und bis zur Reife gezogen. Die Pflanzen werden überwacht und bewertet hinsichtlich der Expression der Nukleotidsequenz, die für das fungizide Polypeptid der Erfindung codiert, oder hinsichtlich des Vorhandenseins des fungiziden Polypeptids mittels immunologischer Verfahren oder hinsichtlich fungizider Aktivität mittels Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie hierin supra beschrieben.
Bombardierung und Kulturmedien
Das Bombardierungsmedium (560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitamingemisch (1000X, SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 120,0 g/l Saccharose, 1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH mit D-I H₂O auf das Volumen aufgefüllt); 2,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Auffüllen auf das Volumen mit D-I H₂O) und 8,5 mg/l Silbernitrat (zugegeben nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf Raumtemperatur). Das Selektionsmedium (560R) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitamingemisch (1000X, SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 30,0 g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D (nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH mit D-I H₂O auf das Volumen aufgefüllt); 3,0 g/l Gelrite (nach Auffüllen des Volumens mit D-I H₂O zugegeben) und 0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf Raumtemperatur zugegeben).
Das Pflanzenregenerationsmedium (288J) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamine-Stammlösung (0,100 g Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, mit hochfiltriertem ("polished") D-I H₂O auf das Volumen aufgefüllt) (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l Myoinosit, 0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (nach Einstellung auf pH 5,6 mit hochfiltriertem D-I H₂O auf das Volumen aufgefüllt); 3,0 g/l Gelrite (nach Auffüllen des Volumens mit D-I H₂O zugegeben) und 1,0 mg/l Indolessigsäure und 3,0 mg/l Bialaphos (zugegeben nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf 60°C). Das Hormon-freie Medium (272 V) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamine-Stammlösung (1,00 g/l Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, mit hochfiltriertem ("polished") D-I H₂O auf das Volumen aufgefüllt), 0,1 g/l Myoinosit und 40,0 g/l Saccharose (nach Einstellung auf pH 5,6 mit hochfiltriertem D-I H₂O auf das Volumen aufgefüllt) und 6 g/l Bacto-Agar (zugegeben nach Auffüllen des Volumens mit hochfiltriertem D-I H₂O), sterilisiert und abgekühlt auf 50°C.
Beispiel 16. Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais und Regeneration von transgenen Pflanzen
Für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais mit einer Pflanzen-optimierten Nukleotidsequenz der Erfindung wird vorzugsweise das Verfahren von Zhao eingesetzt ( US-Patent Nr. 5 981 840 und PCT-Patentveröffentlichung WO98/32326 ). Kurz gesagt, werden unreife Embryonen aus Mais isoliert, und die Embryonen werden mit einer Suspension von Agrobacterium in Kontakt gebracht, wobei die Bakterien dazu fähig sind, die Pflanzenoptimierte Nukleotidsequenz der Erfindung auf bzw. in wenigstens eine Zelle von wenigstens einem der unreifen Embryonen zu transferieren (Stufe 1: die Infektionsstufe). In dieser Stufe werden die unreifen Embryonen vorzugsweise in eine Agrobacterium-Suspension eingetaucht, um die Inokulation zu initiieren. Die Embryonen werden für eine gewisse Zeit mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Stufe 2: die Co-Kultivierungsstufe). Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen nach der Infektionsstufe auf festem Medium kultiviert. Nach dieser Co-Kultivierungszeitdauer wird eine optionale "Ruhe"-Stufe in Erwägung gezogen. In dieser Ruhestufe werden die Embryonen in Gegenwart von wenigstens einem Antibiotikum, das dafür bekannt ist, das Wachstum von Agrobacterium zu inhibieren, ohne Zugabe eines Selektionsmittels für Pflanzentransformanten inkubiert (Stufe 3: Ruhestufe). Die unreifen Embryonen werden vorzugsweise auf festem Medium mit Antibiotikum, jedoch ohne ein Selektionsmittel, kultiviert für die Elimination von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten Zellen. Anschließend werden inokulierte Embryonen auf einem Medium, das ein Selektionsmittel enthält, kultiviert, und wachsender, transformierter Callus wird gewonnen (Stufe 4: die Selektionsstufe). Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen auf einem festen Medium mit einem Selektionsmittel kultiviert, was im selektiven Wachstum von transformierten Zellen resultiert. Der Callus wird anschließend zu Pflanzen regeneriert (Stufe 5: die Regenerationsstufe), und vorzugsweise werden Calli, die auf Selektivmedium gewachsen sind, auf festem Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
Beispiel 17. Transformation von Sojabohnenembryonen und Regeneration von transgenen Pflanzen
Sojabohnenembryonen werden mit einem Plasmid, das eine Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Ubiquitin-Promotor enthält, wie folgt bombardiert. Um somatische Embryonen zu induzieren, werden Keimblätter in einer Länge von 3–5 mm aus oberflächensterilisierten unreifen Samen des Sojabohnenkultivars A2872 dissektiert und unter Licht oder im Dunklen bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium für sechs bis zehn Wochen kultiviert. Somatische Embryonen, die sekundäre Embryonen produzieren, werden anschließend exzidiert und in ein geeignetes Flüssigmedium gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster von somatischen Embryonen, die sich als Embryonen der frühen, globulären Stufe vermehrten, wurden die Suspensionen aufrechterhalten, wie nachstehend beschrieben.
Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können in 35 ml Flüssigmedium auf einem Rotations- bzw. Orbitalschüttler, 150 UpM, bei 26°C mit Fluoreszenzlampen mit einem Tag/Nacht-Zeitplan von 16:8 Stunden aufrechterhalten werden. Die Kulturen werden alle 2 Wochen subkultiviert, indem näherungsweise 35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium inokuliert werden.
Embryogene Sojabohnenkulturen können anschließend mittels des Verfahrens der Partikelkanonenbombardierung (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70–73, US-Patent Nr. 4 945 050 ) transformiert werden. Für diese Transformationen kann ein Gerät mit der Bezeichnung Du Pont Biolistic PDS 1000/HE (Helium-Nachrüstung) verwendet werden.
Ein selektierbares Markergen, das verwendet werden kann, um die Sojabohnentransformation zu erleichtern, ist ein Transgen, bestehend aus dem 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus (Odell et al. (1985) Nature 313:810–812), dem Hygromycin-Phosphotransferasegen aus dem Plasmid pJR225 (aus E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179–188) und der 3'-Region des Nopalinsynthasegens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Die Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit dem Ubiquitin-Promotor umfasst, kann als ein Restriktionsfragment isoliert werden. Dieses Fragment kann anschließend in eine singuläre Restriktionsschnittstelle des Vektors, der das Markergen trägt, inseriert werden.
Zu 50 μl einer 60 mg/ml-Suspension von 1 μm-Goldpartikeln werden gegeben (in dieser Reihenfolge): 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl₂ (2,5 M). Die Partikelpräparation wird anschließend für drei Minuten geschüttelt, in einer Kleinzentrifuge für 10 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden anschließend einmal in 400 μl 70% Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension kann dreimal für jeweils eine Sekunde (Ultra-)Schall-behandelt werden. Fünf Mikroliter der DNA-beschichteten Goldpartikel werden anschließend auf jede Makrocarrierscheibe geladen.
Näherungsweise 300–400 mg einer 2 Wochen alten Suspensionskultur werden in eine leere Petrischale mit den Abmessungen 60 × 15 mm gegeben, und die restliche Flüssigkeit wird mit einer Pipette vom Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden normalerweise näherungsweise 5–10 Platten Gewebe bombardiert. Der Membranberstdruck wird auf 1100 psi eingestellt, und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28 Zoll Quecksilber(säule) evakuiert. Das Gewebe wird näherungsweise 3,5 Zoll vom Rückhalteschirm entfernt angeordnet und dreimal bombardiert. Nach der Bombardierung kann das Gewebe hälftig aufgeteilt und in Flüssigkeit zurückgegeben und wie oben beschrieben kultiviert werden.
Fünf bis sieben Tage nach der Bombardierung kann das Flüssigmedium durch frisches Medium ersetzt werden und elf bis zwölf Tage nach der Bombardierung durch frisches Medium, das 50 mg/ml Hygromycin enthält. Dieses Selektivmedium kann wöchentlich aufgefrischt werden. Sieben bis acht Wochen nach der Bombardierung kann grünes, transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus nicht-transformierten nekrotischen embryogenen Clustern hervorwächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entfernt und in einzelne Kolben inokuliert, um neue, klonal propagierte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen. Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt werden. Diese Suspensionen können anschließend subkultiviert und als Cluster unreifer Embryonen aufrechterhalten oder zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, und zwar durch Reifung und Keimung von einzelnen somatischen Embryonen.
Beispiel 18. Transformation von Sonnenblumen-Meristemgewebe und Regeneration von transgenen Pflanzen
Sonnenblumen-Meristemgewebe werden mit einer Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Ubiquitin-Promotor enthält, wie folgt transformiert (siehe auch Europäisches Patent Nr. EP 0 486233 und Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Science 103:199–207). Reife Sonnenblumensamen (Helianthus annuus L.) werden unter Verwendung einer Dreschvorrichtung für einzelne Weizenähren entspelzt. Die Samen werden für 30 Minuten in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung mit Zugabe von 2 Tropfen Tween 20 pro 50 ml der Lösung oberflächensterilisiert. Die Samen werden zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült.
Explantate mit bzw. nach Spaltung der Embryonalachse werden mittels einer Modifikation von Verfahrensweisen, die von Schrammeijer et al. (Schrammeijer et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:55–60) beschrieben wurden, präpariert. Nach der Oberflächensterilisationsverfahrensweise werden die Samen in destilliertem Wasser für 60 Minuten imbibieren gelassen. Die Keimblätter von jedem Samen werden anschließend abgebrochen, wobei ein sauberer Bruch an der Ebene der Embryonalachse erzeugt wird. Nach Exzision der Wurzelspitze werden die Explantate in Längsrichtung zwischen den Primordialblättern zweigeteilt. Die zwei Hälften werden mit der Schnittfläche nach oben auf GBA-Medium platziert, das aus Mineralelementen nach Murashige und Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant., 15:473–497), Shepard-Vitaminzusätzen (Shepard (1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota)), 40 mg/l Adeninsulfat, 30 g/l Saccharose, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP), 0,25 mg/l Indol-3-essigsäure (IAA), 0,1 mg/l Gibberellinsäure (GA₃), pH 5,6, und 8 g/l Phytagar besteht.
Vor der Agrobacterium-Behandlung werden die Explantate einer Mikroprojektil-Bombardierung unterworfen (Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301–313). Für diese Behandlung werden dreißig bis vierzig Explantate in einem Kreis im Zentrum einer Platte mit den Abmessungen 60 × 20 mm angeordnet. Näherungsweise 4,7 mg 1,8 mm-Wolfram-Mikroprojektile werden in 25 ml sterilem TE-Puffer (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, und Aliquote von 1,5 ml werden je Bombardierung verwendet. Jede Platte wird zweimal durch einen 150 mm Nytex-Schirm, der 2 cm oberhalb der Proben in einem Partikelbeschleunigungsgerät vom Typ PDS 1000^® angeordnet ist, bombardiert.
Der entschärfte Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 wird in allen Transformationsexperimenten verwendet. Ein binärer Plasmidvektor, umfassend die Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit dem Ubiquitin-Promotor enthält, wird über Gefrieren/Tauen in den Agrobacterium-Stamm EHA105 eingeführt, wie von Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet., 163:181–187, beschrieben. Dieses Plasmid umfasst ferner ein selektierbares Kanamycin-Markergen (d. h. nptII). Bakterien für Pflanzentransformationsexperimente werden über Nacht (28°C und 100 UpM kontinuierliches Schütteln bzw. kontinuierliche Bewegungen) in YEP-Flüssigmedium (10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0) mit den für die Aufrechterhaltung des Bakterienstammes und des binären Plasmids erforderlichen Antibiotika gezüchtet. Die Suspension wird verwendet, wenn sie eine OD₆₀₀ von etwa 0,4 bis 0,8 erreicht. Die Agrobacterium-Zellen werden pelletiert und zu einer End-OD₆₀₀ von 0,5 in einem Inokulationsmedium, bestehend aus 12,5 mM MES, pH 5,7, 1 g/l NH₄Cl und 0,3 g/l MgSO₄, resuspendiert.
Frisch bombardierte Explantate werden in eine Agrobacterium-Suspension gegeben, damit gemischt und für 30 Minuten ungestört gelassen. Die Explantate werden anschließend auf GBA-Medium transferiert und mit der Schnittfläche nach unten bei 26°C und 18-Stunden-Tagen co-kultiviert. Nach dreitägiger Co-Kultivierung werden die Explantate auf 374B (GBA-Medium ohne Wachstumsregulatoren und mit einer verringerten Saccharosekonzentration von 1%), supplementiert mit 250 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Kanamycinsulfat, transferiert. Die Explantate werden für zwei bis fünf Wochen auf Selektion(smedium) kultiviert und anschließend auf frisches 374B-Medium ohne Kanamycin für ein bis zwei Wochen der fortgesetzten Entwicklung transferiert. Explantate mit sich differenzierenden, Antibiotika-resistenten Wachstumsbereichen, die keine Schösslinge, die für eine Exzision geeignet sind, produziert haben, werden für eine zweite 3-tätige Phytohormonbehandlung auf GBA-Medium, das 250 mg/l Cefotaxim enthält, transferiert. Blattproben aus grünen, Kanamycin-resistenten Schösslingen werden auf das Vorhandensein von NPTII mittels ELISA und auf das Vorhandensein von Transgenexpression mittels Testen auf die Expression der Nukleotidsequenz, die für das fungizide Polypeptid der Erfindung codiert, die Gegenwart des fungiziden Polypeptids mittels immunologischer Verfahren oder auf fungizide Aktivität mittels Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie supra hierin beschrieben, getestet.
NPTII-positive Schösslinge werden auf in vitro gezüchtete Sonnenblumensämlings-Wurzelstöcke der Pioneer^®-Hybride 6440 gepfropft. Oberflächensterilisierte Samen werden in 48-0-Medium (halbkonzentrierte Salze nach Murashige und Skoog, 0,5% Saccharose, 0,3% Gelrite, pH 5,6) gekeimt und unter den für die Explantatkultur beschriebenen Bedingungen gezogen bzw. wachsen gelassen. Der obere Teil des Sämlings wird entfernt, ein vertikaler Einschnitt von 1 cm wird im Hypokotyl erstellt, und der transformierte Schössling wird in den Schnitt eingeführt. Der gesamte Bereich wird mit Parafilm umwickelt, um den Schössling zu sichern. Gepfropfte Pflanzen können nach einwöchiger in vitro-Kultur auf Erde transferiert werden. Transplantate in Erde werden unter Bedingungen hoher Feuchte aufrechterhalten, gefolgt von einer langsamen Eingewöhnung in die Gewächshausumgebung. Transformierte Sektoren von T₀-Pflanzen (Elterngeneration), die im Gewächshaus reifen, werden mittels NPTII-ELISA und/oder mittels der Analyse der fungiziden Aktivität von Blattextrakten identifiziert, während transgene Samen, die von NPTII-positiven T₀-Pflanzen geerntet werden, mittels der Analyse der fungiziden Aktivität von kleinen Anteilen der Keimblätter von trockenen Samen identifiziert werden.
Ein alternatives Sonnenblumen-Transformationsprotokoll ermöglicht die Gewinnung von transgener Nachkommenschaft ohne die Verwendung eines chemischen Selektionsdrucks. Dieses Verfahren wird allgemein in Fällen verwendet, in denen Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung funktionell mit konstitutiven oder induzierbaren Promotoren verknüpft sind. Samen werden entspelzt und für 20 Minuten in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung mit Zugabe von zwei bis drei Tropfen Tween 20 pro 100 ml Lösung oberflächensterilisiert, anschließend dreimal mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Sterilisierte Samen werden im Dunklen bei 26°C für 20 Stunden auf mit Wasser befeuchtetem Filterpapier imbibieren gelassen. Die Keimblätter und der Wurzelansatz ("root radical") werden entfernt, und die Meristemexplantate werden für 24 Stunden unter Dunkelheit auf 374E (GBA-Medium, bestehend aus MS-Salzen, Shepard-Vitaminen, 40 mg/l Adeninsulfat, 3% Saccharose, 0,5 mg/16-BAP, 0,25 mg/l IAA, 0,1 mg/l GA und 0,8% Phytagar mit pH 5,6) kultiviert. Die Primärblätter werden entfernt, um das Apikalmeristem freizulegen, etwa 40 Explantate werden mit dem Apikalkegel nach oben in einem 2 cm-Kreis im Zentrum von 374M (GBA-Medium mit 1,2% Phytagar) angeordnet und anschließend auf dem Medium für 24 Stunden im Dunklen kultiviert.
Näherungsweise 18,8 mg 1,8 μm Wolframpartikel werden in 150 μl absolutem Ethanol resuspendiert. Nach (Ultra-)Schallbehandlung werden 8 μl davon auf das Zentrum der Oberfläche des Makrocarriers aufgetropft. Jede Platte wird zweimal mit 650 psi-Berstscheiben in dem ersten Einschub bzw. Fach ("shelf") bei 26 mm Hg-Heliumkanonenvakuum bombardiert.
Das Plasmid von Interesse wird in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 über Gefrieren/Tauen, wie zuvor beschrieben, eingeführt. Das Pellet von über Nacht gezüchteten Bakterien, bei 28°C in YEP-Flüssigmedium (10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0) in Gegenwart von 50 μg/l Kanamycin, wird einem Inokulationsmedium (12,5 mM 2-mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, MES, 1 g/l NH₄Cl und 0,3 g/l MgSO₄ mit pH 5,7) bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 4,0 bei OD₆₀₀ resuspendiert. Partikelbombardierte Explantate werden auf GBA-Medium (374E) transferiert, und ein Tröpfchen Bakteriensuspension wird direkt auf die Spitze des Meristems gegeben. Die Explantate werden auf dem Medium für 4 Tage co-kultiviert, wonach die Explantate auf 374C-Medium (GBA mit 1% Saccharose und ohne BAP, IAA, GA3 und supplementiert mit 250 μg/ml Cefotaxim) transferiert werden. Die Pflänzchen werden auf dem Medium für etwa zwei Wochen unter den Inkubationsbedingungen eines 16-Stunden-Tages und von 26°C kultiviert.
Explantate (etwa 2 cm lang) aus der zweiwöchigen Kultur in 374C-Medium werden hinsichtlich der Expression der Nukleotidsequenz der Erfindung oder des Vorhandenseins des codierten Polypeptids der Erfindung mittels immunologischer Verfahren oder fungizider Aktivität oder dergleichen durchmustert. Nachdem positive Explantate identifiziert sind, werden jene Schösslinge, die keine fungizide Aktivität aufweisen, verworfen, und jedes positive Explantat wird in nodale Explantate unterteilt. Ein nodales Explantat enthält wenigstens ein potentielles Nodium. Die nodalen Abschnitte werden für drei bis vier Tage auf GBA-Medium kultiviert, um die Bildung von Nebenknospen aus jedem Nodium zu fördern. Anschließend werden sie auf 374C-Medium transferiert und für weitere vier Wochen entwickeln gelassen. Sich entwickelnde Knospen werden abgetrennt und für weitere vier Wochen auf 374C-Medium kultiviert. Vereinigte Blattproben von jedem neu gewonnenen Schössling werden wiederum mittels des geeigneten Protein-Aktivitätsassays durchmustert. Zu diesem Zeitpunkt werden sich die positiven Schösslinge, die aus einem einzelnen Nodium gewonnen wurden, im Allgemeinen in dem transgenen Sektor, der im Ausgangsassay vor der nodalen Kultur detektiert wurde, angereichert haben.
Gewonnene Schösslinge, die hinsichtlich eines fungiziden Polypeptids der Erfindung positiv sind, werden auf in vitro gezüchtete Sonnenblumensämlings-Wurzelstöcke der Pioneer-Hybride 6440 gepfropft. Die Wurzelstöcke werden auf die folgende Weise präpariert. Samen werden entspelzt und für 20 Minuten in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung mit Zugabe von zwei bis drei Tropfen Tween 20 pro 100 ml Lösung oberflächensterilisiert, und sie werden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen werden für drei Tage auf dem Wasser-befeuchteten Filter keimen gelassen, anschließend werden sie in 48-Medium (halbkonzentrierte MS-Salze, 0,5% Saccharose, 0,3% Gelrite, pH 5,0) transferiert und für drei Tage bei 26°C im Dunklen gezogen, anschließend unter Kulturbedingungen eines 16-Stunden-Tages inkubiert. Der obere Teil eines ausgewählten Sämlings wird entfernt, ein vertikaler Einschnitt wird in jedem Hypokotyl erstellt, und ein transformierter Schössling wird in einen V-förmigen Schnitt ("V-cut") eingeführt. Der Schnittbereich wird mit Parafilm umwickelt. Nach einwöchiger Kultur auf dem Medium werden die gepfropften Pflanzen auf Erde transferiert. In den ersten zwei Wochen werden sie unter Bedingungen hoher Feuchte gehalten, um sie an eine Gewächshausumgebung zu gewöhnen.
Beispiel 19. Herstellung von Antikörpern
Es wurden Standardverfahren für die Produktion von Antikörpern verwendet, wie z. B. jene, die in Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory), beschrieben sind. Spezifisch wurden Antikörper für Polypeptide der Erfindung produziert, indem weiblichen Kaninchen (New Zealand white) (Bethyl Laboratory, Montgomery, Tex.) sechsmal 100 Mikrogramm denaturiertes, gereinigtes Polypeptid injiziert wurden.
Den Tieren wurde in Intervallen von zwei Wochen Blut abgenommen. Die Antikörper wurden mittels Affinitätschromatographie mit Affigel 15 (BioRad) immobilisiertem Antigen gereinigt, wie von Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, NY, beschrieben. Die Affinitätssäule wurde mit gereinigtem Polypeptid im Wesentlichen so hergestellt, wie es von BioRad RTM empfohlen wird. Die Immundetektion von Antigenen auf PVDF-Blots wurde nach dem Protokoll von Meyer et al. (1988) J. Cell. Biol. 107:163 durchgeführt, wobei der ECL-Kit von Amersham (Arlington Heights, Ill.) verwendet wurde.
Beispiel 20. Konstruktion eines Fus1-Transformationsvektors
Eine synthetische Version des Fus1-Gens, die dem reifen Fus1-Peptid entspricht, wurde mit einer Kodonpräferenz, die für Manduca sexta repräsentativ ist, konstruiert (SEQ ID NO:120 und SEQ ID NO:122). Die für Fus1 gewählte Kodonpräferenz wurde der Kazusa-Kodon-Gebrauchsdatenbank (zugänglich unter www.Kazusa.or.jp/codon/) entnommen. Die BAA-Signalsequenz wurde zu Fus1 hinzugefügt, um den Export aus der Zelle heraus und in den interzellulären Raum zu erleichtern (Rahmatullah RJ et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12(1):119–121). Die BAA-Fus1-Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:121 und SEQ ID NO:123 angegeben. Um Fus1 in Geweben, die gegenüber F. verticilloides anfällig sind, zu exprimieren, wurden starke konstitutive Promotoren gewählt. BAA-Fus1 (SEQ ID NO:120) wurde anschließend in die entsprechenden Stellen von Vektoren subkloniert, enthaltend entweder das Mais-Ubiquitin-Promotor:ubi-Intron oder das Mais-h2B-Promotor:ubi-Intron ( US-Patent Nr. 6 177 611 ). BAA- Fus1 wurde hinter den angegebenen Promotor mit einer 3'-Sequenz, die dem pinII-Terminator entspricht, gestellt. Diese Kassette wird von nicht-kompatiblen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert, die dazu konzipiert sind, die Kassette gerichtet in ein binäres Plasmid zu klonieren, das die selektierbare Markergenkassette 35S-PAT-35S enthält. Die Restriktionsenzymschnittstellen wurden zum Subklonieren der Kassette Promotor/Intron:BAA-Fus1:pinII ter in ein binäres Plasmid für die Transformation von Mais bzw. Getreide verwendet.
Beispiel 21. Konstruktion von Fus2-Transformationsvektoren

Eine synthetische Version von Fus2 in funktioneller Verknüpfung mit einem modifizierten Signalpeptid von Gersten-alpha-Amylase (BAA) wurde mit einer Kodonpräferenz, die für Streptomyces coelicolor repräsentativ ist, konstruiert (SEQ ID NO:124 und SEQ ID NO:126). Der S. coelicolor-Kodongebrauch wurde wegen seiner insgesamten Ähnlichkeit zu dem Kodon gebraucht, der bei Pflanzen beobachtet wird, gewählt. Die für Fus2 gewählte Kodonpräferenz wurde der Kazusa-Kodongebrauchsdatenbank (zugänglich unter www.Kazusa.or.jp/codon/) entnommen. Siehe auch die Tabellen 1 und 2. Die BAA-Signalsequenz wurde zu Fus2 hinzugefügt, um den Export von Fus2 aus der Zelle heraus und in den interzellulären Raum zu erleichtern. Es wurden Modifikationen am 3'-Ende des Signalpeptids durchgeführt, um eine korrekte Signalpeptidabspaltung, wie durch das SIGNALP-Programm (Version 1.1) (Center for Biological Sequence Analyses, Technische Universität von Dänemark) zu erhalten. Die BAA-Fus2-Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:125 und SEQ ID NO:127 angegeben. Das synthetische Gen wurde unter Verwendung einer Reihe von überlappenden komplementären Oligonukleotiden konstruiert, die aneinander angelagert wurden, mit dem Klenow(-Fragment) zum Reparieren der Lücken behandelt und mittels PCR amplifiziert wurden, wobei Primer, die dem 5'- und dem 3'-Ende des synthetischen Gens entsprachen, verwendet wurden. In die PCR-Primer wurden Restriktionsenzymschnittstellen eingebaut, um die Genklonierung zu erleichtern. Das PCR-Produkt wurde in pCR2.1 (Invitrogen) TOPO kloniert, und seine Sequenz wurde verifiziert. Ein Restriktionsenzymfragment, das BAA-Fus2 enthielt, wurde anschließend in die entsprechenden Schnittstellen von Vektoren, enthaltend entweder das Mais-Ubiquitin-Promotor:ubi-Intron oder das Mais-h2B-Promotor:ubi-Intron, subkloniert. Die Vektoren enthielten eine 3'-Sequenz, die dem pinII-Terminator entsprach. Das BAA-Fus2-Fragment wurde zwischen den angegebenen Promotor und den pinII-Terminator kloniert. Um Fus2 in gegenüber F. verticilloides anfälligen Geweben zu exprimieren, wurden starke konstitutive Promotoren gewählt. Die Kassette Promotor/Intron:BAA-Fus2:pinII ter wird von nicht-kompatiblen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert, die dazu konzipiert sind, die Kassette gerichtet in ein binäres Plasmid, das einen selektierbaren Marker enthält, zu klonieren. Die Restriktionsenzymschnittstellen wurden zum Subklonieren der Kassette Promotor/Intron:BAA-Fus2:pinII ter in ein binäres Plasmid für die Transformation von Mais bzw. Getreide verwendet.

Tabelle 1. Streptomyces coelicolor A3(2) [gbbct]: 6257 CDSs(2043281 Kodons)
Felder: [Triplet] [Frequenz: pro Tausend] ([Anzahl])
UUU	0,4	(863)	UCU	0,6	(1266)	UAU	1,0	(1962)	UGU	0,7	(1448)
UUC	26,0	(53065)	UCC	20,2	(41262)	UAC	19,5	(39789)	UGC	7,0	(14341)
UUA	0,1	(128)	UCA	1,0	(2137)	UAA	0,1	(290)	UGA	2,4	(4878)
UUG	2,4	(4935)	UCG	13,8	(28229)	UAG	0,5	(1089)	UGG	15,1	(30770)

CUU	1,5	(3129)	CCU	1,5	(2995)	CAU	1,6	(3366)	CGU	5,5	(11183)
CUC	36,6	(74736)	CCC	25,4	(51951)	CAC	21,5	(44018)	CGC	39,1	(79956)
CUA	0,3	(657)	CCA	1,3	(2633)	CAA	1,3	(2593)	CGA	2,5	(5124)
CUG	61,3	(125241)	CCG	33,6	(68652)	CAG	25,1	(51248)	CGG	32,0	(65332)

AUU	0,6	(1228)	ACU	1,1	(2347)	AAU	0,7	(1436)	AGU	1,5	(3030)
AUC	27,6	(56340)	ACC	39,6	(80826)	AAC	16,2	(33191)	AGC	12,3	(25187)
AUA	0,7	(1367)	ACA	1,6	(3194)	AAA	1,0	(2041)	AGA	0,8	(1574)
AUG	15,8	(32271)	ACG	18,9	(38697)	AAG	19,7	(40293)	AGG	3,7	(7488)

GUU	1,4	(2905)	GCU	2,9	(5908)	GAU	2,9	(6024)	GGU	9,3	(18920)
GUC	47,2	(96460)	GCC	78,6	(160548)	GAC	58,0	(118595)	GGC	61,4	(125467)
GUA	2,7	(5416)	GCA	5,3	(10890)	GAA	8,5	(17445)	GGA	7,1	(14608)
GUG	35,3	(72144)	GCG	49,8	(101831)	GAG	48,5	(99056)	GGG	18,2	(37288)

Codierendes GC 72,38%, GC an 1. Position 72,74%, GC an 2. Position 51,39%, GC an 3. Position 93,00%

Tabelle 2. Streptomyces coelicolor [gbbct]: 2110 CDSs (646333 Kodons)
Felder: [Triplet] [Frequenz: pro Tausend] ([Anzahl])
UUU	0,5	(329)	UCU	0,8	(496)	UAU	1,0	(676)	UGU	0,8	(517)
UUC	25,7	(16596)	UCC	20,1	(12971)	UAC	19,4	(12521)	UGC	7,3	(4734)
UUA	0,1	(49)	UCA	1,2	(797)	UAA	0,2	(105)	UGA	2,6	(1650)
UUG	2,6	(1696)	UCG	13,5	(8729)	UAG	0,5	(355)	UGG	15,2	(9813)

CUU	1,9	(1228)	CCU	1,8	(1178)	CAU	1,9	(1251)	CGU	5,6	(3602)
CUC	36,2	(23411)	CCC	25,4	(16419)	CAC	22,6	(14594)	CGC	39,2	(25310)
CUA	0,5	(304)	CCA	1,6	(1018)	CAA	1,7	(1076)	CGA	2,9	(1885)
CUG	59,3	(38346)	CCG	32,7	(21145)	CAG	25,8	(16671)	CGG	31,5	(20333)

AUU	0,8	(497)	ACU	1,4	(925)	AAU	0,8	(515)	AGU	1,6	(1023)
AUC	27,8	(17997)	ACC	39,9	(25804)	AAC	16,2	(10447)	AGC	12,7	(8194)
AUA	0,7	(444)	ACA	1,9	(1245)	AAA	1,3	(829)	AGA	0,8	(537)
AUG	16,1	(10392)	ACG	19,1	(12377)	AAG	19,8	(12795)	AGG	3,8	(2441)

GUU	1,7	(1086)	GCU	3,8	(2429)	GAU	3,5	(2251)	GGU	9,1	(5867)
GUC	46,3	(29904)	GCC	77,5	(50098)	GAC	58,2	(37624)	GGC	58,8	(38034)
GUA	2,7	(1767)	GCA	6,7	(4302)	GAA	9,6	(6215)	GGA	7,3	(4689)
GUG	33,9	(21929)	GCG	48,6	(31399)	GAG	47,9	(30970)	GGG	17,8	(11502)

Codierendes GC 71,94%, GC an 1. Position 72,38%, GC an 2. Position 51,28%, GC an 3. Position 92,14%

Alle Druckschriften und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt werden, geben den Kenntnisstand von Fachleuten auf dem Gebiet, das diese Erfindung betrifft, an.
Obgleich die vorstehende Erfindung auf dem Wege von Erläuterung und Beispielen zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses in einigem Detail beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angehängten Ansprüche durchgeführt werden können. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus: (a) einer Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:100 oder 102 angegeben ist; (b) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, das in SEQ ID NO:101 oder 103 angegeben ist; (c) einer Nukleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen von (b), wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; (d) einer Nukleotidsequenz, die unter hoch stringenten Bedingungen mit einer beliebigen der Nukleotidsequenzen von (a) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid, das antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt, codiert, und wobei die hoch stringenten Bedingungen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einem Waschschritt in 0,1 × SSC bei 60 bis 65°C umfassen; (e) einer Nukleotidsequenz mit 99% Identität zu einer Nukleotidsequenz, die für eine beliebige der Aminosäursequenzen von (b) codiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid codiert, das antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; (f) einer Nukleotidsequenz, umfassend wenigstens 25 zusammenhängende Nukleotide von einer beliebigen der Nukleotidsequenzen von (a); wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid codiert, das antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; und (g) einer Nukleotidsequenz, bestehend aus einem Komplement von einer beliebigen der Nukleotidsequenzen in (a), (b), (c), (d), (e) oder (f).
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ferner Vektornukleinsäuresequenzen umfasst.
Nichtmenschliche Wirtszelle, verändert zum Exprimieren des Polypeptids, das durch ein beliebiges der Nukleinsäuremoleküle von Anspruch 1 codiert wird.
Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle eine prokariotische, pilzliche, Hefe- oder Pflanzenzelle ist.
Virus, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure funktionell mit einem Promotor, der Expression in einer Pflanzenzelle steuert, verknüpft ist.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus: (a) einer Aminosäuresequenz nach Anspruch 1 (b); (b) einer Aminosäuresequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen von (a), wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; (c) einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 35 zusammenhängende Aminosäuren von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen von (a) umfasst, wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt.
Zusammensetzung, umfassend das isolierte Polypeptid von Anspruch 7.
Transformierte Pflanze, umfassend in ihrem Genom wenigstens eine stabil eingebaute Expressionskassette, umfassend eine Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der Expression in der Pflanzenzelle steuert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus: (a) einer Nukleotidsequenz, die in Anspruch 1(a) angegeben ist; (b) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid, angegeben in Anspruch 1(b), codiert; (c) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen von (b) codiert, wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; und (d) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid, umfassend wenigstens 35 zusammenhängende Aminosäuren einer Sequenz von (b), codiert, wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt.
Expressionskassette nach Anspruch 6 oder transformierte Pflanze nach Anspruch 9, wobei der Promotor aus konstitutiven, induzierbaren und gewebebevorzugten Promotoren ausgewählt ist.
Expressionskassette oder transformierte Pflanze nach Anspruch 10, wobei der Promotor ein pathogen-induzierbarer Promotor ist.
Transformierte Pflanze nach Anspruch 9, wobei die Pflanze aus Reis, Mais bzw. Getreide, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse und Tabak ausgewählt ist.
Transformierter Samen der Pflanze nach Anspruch 9, umfassend eine Expressionskassette, wie in Anspruch 9 definiert.
Verfahren zur Verstärkung von Pflanzenkrankheitsresistenz gegen pilzliche Pathogene, wobei das Verfahren umfasst: (a) Transformieren einer Pflanze mit wenigstens einer stabil eingebauten Expressionskassette, umfassend eine Nukleotidsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der Expression in einer Zelle der Pflanze steuert, wobei die Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus: (i) einer Nukleotidsequenz, die in Anspruch 1(a) angegeben ist; (ii) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid, das in Anspruch 1(b) angegeben ist, codiert; (iii) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen von (a)(ii) codiert, wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; (iv) einer Nukleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid, umfassend wenigstens 35 zusammenhängende Aminosäuren einer beliebigen der Sequenzen von (a) (ii) wobei das Polypeptid antimikrobielle abwehrende Aktivität besitzt; und (b) Feststellen des Levels der erhöhten Resistenz gegen den pilzlichen Pathogen in der Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Pflanze aus Reis, Mais bzw. Getreide, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse und Tabak ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Pflanze erhöhte Resistenz gegen Magnaportha grisea, Rhizoctonia solani oder Fusarium verticilloides besitzt.
Antikörper, der selektiv an ein isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 35 zusammenhängende Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus einer beliebigen der Sequenzen von Anspruch 1(b), umfasst, bindet.