DE60223133T9

DE60223133T9 - Verfahren zum lokalisieren und identifizieren von epitopen

Info

Publication number: DE60223133T9
Application number: DE60223133T
Authority: DE
Inventors: Ulf Skoglund; Neus Visa
Original assignee: SIDEC TECHNOLOGIES AB
Current assignee: SIDEC TECHNOLOGIES AB
Priority date: 2001-03-05
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2009-05-20
Also published as: JP2004530119A; US20070161044A1; SE0100728D0; EP1366468B1; ATE376697T1; US20040137519A1; EP1366468A1; WO2002071336A1; DE60223133T2; DE60223133D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für dreidimensionale Strukturanalysen von Makromolekülen und Multimolekularkomplexen in vitro und in situ, und zur Analyse der Struktur in ihrem physiologischen Kontext.
HINTERGRUND
Um die Funktion von Molekülen von einem mechanistischen Gesichtspunkt her zu verstehen, ist es von großer Bedeutung, Kenntnis über die Struktur zu erlangen. In den letzten 20 Jahren wurden viele Strukturen von Proteinen und Proteinkomplexen und Nukleinsäuren bestimmt, und zwar hauptsächlich durch NMR- und Röntgenstrahl-Kristallografie. Wenn typische Proteinmoleküle untersucht werden, liefern die Daten, die durch diese Verfahren bereitgestellt werden, für gewöhnlich eine Auflösung, die besser ist als 3 Å. Wenn Großmoleküle und Assoziate von diesen betroffen sind, wird die Auflösung viel schlechter, und in vielen Fällen ist es nicht möglich, diese Großstrukturen zu untersuchen. Für Strukturuntersuchungen, die diese Verfahren einsetzen, ist es auch notwendig, das in Untersuchung befindliche Objekt aus seinem biologischen Kontext (z. B. einer Zelle) zu entnehmen.
Unter Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie ist es möglich, Supramolekularsysteme wie etwa Ribosome oder Spliceosome in zwei Dimensionen zu visualisieren. Eine Variante der Elektronenmikroskopie, die Elektronenmikroskoptomografie (Auer, J. Mol. Med.; 78: 191–202, (2000)) kann verwendet werden, um ein dreidimensionales Bild eines Objekts zu machen. Eine detaillierte dreidimensionale Rekonstruktion des Objekts war aufgrund der erforderlichen hohen Elektronenstrahlung (typischerweise ca. 2000 e^–/Å²/Datensatz) praktisch unmöglich zu erzielen.
Aufgrund der geringen Auflösung, die bei der Herstellung einer 3D-Rekonstruktion erzielt wird, ist es schwierig, Teile der Struktur mit einer spezifischen Funktion in Zusammenhang zu bringen.
Ein Transmissionselektronenmikroskopieverfahren ist für 2D- und/oder 3D-Rekonstruktionen von Einzelobjekten durch Mittelung nach einer Klassifizierung verfügbar. Dieses Verfahren kann eine Auflösung von ca. 1 nm erbringen. Diese Art von Lösungsansatz wurde von Valle et al. (1999) angewandt, um spezifische Bereiche des Verbindungsproteins der Bacteriophage ϕ29 in 2D mit einer Auflösung von ca. 3 nm abzubilden. Dieser Lösungsansatz besitzt gewisse Einschränkungen. Erstens sind die analysierten Moleküle direkt an einer Fläche fixiert, was Veränderungen in ihren strukturellen Eigenschaften bewirken könnte. Zweitens kann das Einzelpartikelrekonstruktionsverfahren keine Objekte auflösen, die kleiner als 100 kDa sind (Henderson, 1995). Drittens liefert dieses Verfahren Durchschnittsstrukturen und ist folglich für Analysen von Strukturen in situ oder Analysen von einzelnen Supramolekularkomplexen nicht zweckmäßig.
Ein alternatives Verfahren zur bildgebenden Antikörpererkennung wurde von Raab et al. (1999) vorgeschlagen. In diesem Fall wird das in Untersuchung befindliche Präparat auch an einer Fläche fixiert. Nach Raab et al. sollte es möglich sein, eine Epitopabbildung im Nanometermaßstab zu erzielen, indem dynamische Kraftmikroskopie genutzt wird. Allerdings werden keine Details dargestellt, wie sich ein solches Ergebnis erzielen lässt.
Vor kurzen wurde ein Algorithmus beschrieben ( SE C 511 737 ), um den Rauschabstand in EM-Versuchen drastisch zu erhöhen. Der Algorithmus wird in einem COMET-Computerprogramm angewendet. Dies ermöglicht Studien unter Verwendung niedrig dosierter Elektronenstrahlung, und die Probe wird dadurch von der Strahlung viel weniger beeinträchtigt und ist deshalb in einem Zustand, der durch den Versuch viel weniger gestört ist. Aber die mit diesem Verfahren erhaltene Auflösung ist immer noch zu gering, um eine unzweideutige Identifizierung spezifischer Teile des Objekts zuzulassen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer dreidimensionalen Rekonstruktion eines makromolekularen Objekts und zur Bestimmung bereitzustellen, wo sich spezifische Epitope auf diesem Objekt befinden. Die wie hier beschriebene Erfindung kann zur Identifizierung von Epitopen in ihrem physiologischen Kontext verwendet werden, indem die Epitope in situ markiert werden, oder die Epitope in vitro identifiziert werden können. Eine Identifizierung der- Epitope bringt die Verwendung von Affinitätsreagenzien, typischerweise Antikörpern, die für einen Teil des betreffenden Moleküls spezifisch sind, die mit kleinen elektronendichten Markern konjugiert sein können oder auch nicht, zusammen mit Elektronentomografie und dem Algorithmus COMET mit sich. Die Verwendung von COMET ermöglicht niedrige Elektronendosen bei der Aufnahme von EMT-Bildern. Etwas überraschend ist, dass diese niedrigen Dosen die Interaktion zwischen dem Affinitätsreagens und seinem Epitop nicht stören. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine genaue Lokalisierung und Identifizierung des Epitops in der 3D-Rekonstruktion eines Einzelmoleküls oder supramolekularen Komplexes, und erfüllt somit einen seit langem bestehenden Bedarf. Die Fähigkeit des Verfahrens, die örtliche Lage spezifischer Epitope genau zu bestimmen, ist in 1C beispielhaft dargestellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für Strukturuntersuchungen makromolekularer Strukturen wie einem Protein, Nukleinsäuren oder Komplexen oder Assoziaten von einem oder mehreren von diesen.
Es lassen sich vier entscheidende Aspekte unterscheiden:

1) Einsatz niedrigdosierter Elektronenstrahlung.
2) Markierung des in Untersuchung befindlichen Objekts mit Affinitätsreagenzien.
3) Analyse einzelner Objekte und keine Mittelungen vieler Bilder.
4) Analyse von Objekten in situ.

Die Präparierung des in Untersuchung befindlichen Objekts beruht auf einer der folgenden Vorgehensweisen:

1) Im in vitro-Fall handelt es sich bei dem zu analysierenden Objekt um ein Molekül oder einen multimolekularen Komplex in Lösung (z. B. in einer Pufferlösung). Das Affinitätsreagens (AR) wird der Lösung zugesetzt und darf sich an das Zielmolekül binden. Die Probe (in diesem Fall eine Lösung, die das in Untersuchung befindliche Objekt plus das AR enthält) wird dann auf ein Gitter aufgetragen und unter Bedingungen, bei denen sich keine Eiskristalle bilden, gefroren (Vitrifikation durch Eintauchen in flüssiges Ethan). Die gefrorene Probe ist dann fertig zur Datenerfassung.
2) Im in situ-Fall handelt es sich bei dem zu analysierenden Objekt um ein Molekül oder einen multimolekularen Komplex in einem funktional relevanten Kontext (z. B. in einer Zelle). Das in Untersuchung befindliche Objekt muss mit AR markiert und zerschnitten werden, um 25 nm–1 μm (vorzugsweise 70–90 nm) dicke Scheibchen zu erhalten. Es ist aber auch vorstellbar, das Markieren und Zerteilen in einer anderen Reihenfolge vorzunehmen. In einem Fall erfolgt das Markieren vor dem Zerteilen. Dies ermöglicht es dem Untersucher, Objekte in einer lebenden Zelle oder einer ungestörten Probe vor dem Zerteilen zu markieren. In einem anderen Fall erfolgt das Zerteilen in Scheiben vor dem Markieren. In diesem Fall werden dann die Scheiben mit dem AR markiert.

In dem Fall, bei dem das Markieren vor dem Zerteilen stattfindet (z. B. durch Injektion eines Affinitätsreagens in eine Zelle) kann der nächste Schritt darin bestehen, die Probe in einer hydrophoben oder vorzugsweise hydrophilen Substanz zu fixieren und einzubetten, oder die Probe kann alternativ fixiert und gefroren werden.
Die eingebettete oder gefrorene Zelle wird dann in einem Verfahren in Scheibchen zerteilt, das Ultramikrotomie genannt wird und sogenannte Dünnschnittpräparate ergibt, die eine Dicke von typischerweise 20 bis 100 nm haben. Im Fall gefrorener Zellen wird der Zerteilungsverfahren Kryomikrotomie genannt und das sich ergebende Schnittpräparat Kryoschnittpräparat. Die Kryomikrotomie erfolgt unter Bedingungen, in denen etwa das Wasser in der Probe in amorpher Form gehalten wird, das keine Eiskristalle bilden darf. Dies kann dadurch erzielt werden, dass die Probe im Beisein eines Kryo- oder Erstarrungsverhinderers, typischerweise Sucrose, gefroren wird.
Die Probe wird dann einem Elektronenstrahl ausgesetzt. Während der Datenerfassung werden mehrere Bilder von der Probe aufgenommen, und zwar jedes Bild aus einem etwas anderen Winkel. Diese Bilder bilden eine sogenannte Kippreihe. Im in vitro-Fall sollte die Datenerfassung bei niedriger Temperatur erfolgen, um den amorphen Zustand der Probe aufrechtzuerhalten. Im in situ-Fall kann die Datenerfassung entweder bei niedriger Temperatur oder bei Raumtemperatur erfolgen. Die auf eine solche Weise erfassten Daten werden unter Verwendung einer Standard-Software verarbeitet (Skoglund et al., 1996b). Diese Verfahren sind einem Fachmann auf dem Gebiet hinlänglich bekannt.
Die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen 1 bis 13 gekennzeichnet.
Es sollte angemerkt werden, dass es die Vorgehensweise in den vorstehend erwähnten Ausführungsformen ermöglicht, Proben von Molekülen in Lösung oder in ihrem biologischen Lebensumfeld, also in vivo untersuchen zu können.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Affinitätsreagenzien an das in Untersuchung befindliche Objekt gebunden. Diese Affinitätsreagenzien werden unter Verwendung von Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht oder visualisiert, und die Epitope, gegen die sich der Antikörper richtet, können lokalisiert werden.
Der Vorteil, niedrigdosierte Strahlung zu verwenden, ist, dass sogar nicht kovalent gebundene Affinitätsreagenzien zusammen mit ihrem Epitop sichtbar gemacht werden können. Die Affinitätsreagenzien können entweder direkt gegen das betreffende Epitop gerichtet sein, was dann direktes Markieren genannt wird, oder können gegen ein primäres Affinitätsreagens gerichtet sein, das bereits an das betreffende Epitop gebunden ist, wobei dies als indirektes Markieren bezeichnet wird.
Die Beschaffenheit des Affinitätsreagens kann stark variieren und von kleinen Molekülen wie Arzneimitteln oder arzneimittelartigen Molekülen und Kohlenhydraten über Peptide, Nukleotide, Polypeptide und Polynukleotide bis hin zu Proteinen, Hormonen und Antikörpern reichen, wobei die einzige Bedingung darin besteht, dass das Affinitätsreagens vor oder während der Datenerfassung nicht durch die Elektronendosis von seinem Epitop vertrieben wird. Im Falle jedoch, dass es sich bei dem Affinitätsreagens um ein kleines Molekül handelt, kann es notwendig sein, es zum Beispiel mit einem elektronendichten Marker oder irgendeinem anderen Molekül zu markieren, der bzw. das in einem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden kann.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Antikörper, der mit einem elektronendichten Marker gekennzeichnet wurde, als Affinitätsreagens verwendet. Der elektronendichte Marker kann durch das Elektronenmikroskop ohne Weiteres sichtbar gemacht werden.
In einer anderen Ausführungsform kann die Größe des Antikörpers die Erfassung des Antikörpers sogar bei Nichtvorhandensein eines elektronendichten Markers ermöglichen.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein kleines Molekül wie etwa ein in engerer Wahl stehender Arzneistoff (typischerweise mit einer Größe von 200–600 Da) zu einem elektronendichten Marker markiert. Dieser kann dazu verwendet werden, auszumachen, an welche Stelle auf dem Makromolekül sich das kleine Molekül binden kann.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Nukleotid, Polynukleotid, Peptid, Polypeptid oder Protein als Affinitätsreagens verwendet werden, um es dem Untersucher zu ermöglichen, die Interaktionsstelle zwischen der Sonde (dem Affinitätsreagens) und dem in Untersuchung befindlichen Objekt zu lokalisieren und zu identifizieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind zwei oder mehr Sonden gegen verschiedene Epitope auf dem in Untersuchung befindlichen Objekt gerichtet. Dies kann es dem Untersucher ermöglichen, die relativen Positionen separater Epitope in ein und demselben Versuch zu untersuchen.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann es günstig sein, den Kontrast in den Bildern zu erhöhen. Dies kann dadurch geschehen, dass die Probe vor der Datenerfassung mit schweren Atomen angefärbt wird.
BEISPIEL FÜR DIE VERWENDUNG DER ERFINDUNG
Das folgende Beispiel wird wiedergegeben, um die Ergebnisse darzustellen, die durch die Verwendung der Erfindung erzielt werden. Das Beispiel stellt die eingesetzten Verfahren vor und enthält Verweise, so dass ein Fachmann auf dem Gebiet den Versuch wiederholen kann. Dies stellt die Erfindung beispielhaft dar, die im Falle einer Untersuchung in situ eingesetzt wurde.
Einleitung
Das Splicen von prä-messenger-RNA (prä-mRNA) ist ein komplexer Prozess, der durch sogenannte Spliceosome erfolgt. In vitro assemblierte Spliceosome wurden durch Elektronenmikroskopie in Hefe (Clark et al., 1988) und in Säugetieren (Reed et al., 1988) untersucht. Das Spliceosom wird geordnet und schrittweise assembliert und setzt sich aus einer Vielzahl von Proteinen und kleinen nuklearen RNAs (snRNAs) zusammen. Der Assemblierungsprozess und die Struktur von Spliceosomen in vivo sind weniger gut bekannt. Splicing scheint hauptsächlich an oder nahe an den aktiven Genen stattzufinden. Splicingbestandteile wurden sowohl durch Lichtmikroskopie (z. B. Amero et al., 1992; Wu et al., 1993; Zhang et al., 1994; Baurén et al., 1996; Neugebauer und Roth, 1997a) als auch durch Elektronenmikroskopie (Kiseleva et al., 1994; Puvion und Puvion-Dutilleul, 1996; Cmarko et al., 1999) aktiven Genen zugeordnet.
In mehreren Berichten wurde nachgewiesen, dass die RNA-Polymerase II beim Capping, Splicing und bei der Polyadenylierung beteiligt ist (nachzulesen bei Shuman, 1997; Corden und Patturajan, 1997; Steinmetz, 1997; Neugebauer und Roth, 1997b; Bentley, 1999). Zusammengefasste verfügbare Daten zeigen, dass Transkription und prä-mRNA- Processing im Zellkern eng gekoppelt sind, und dass die verlängernde RNA-Polymerase II in einem molekularen Komplex vorhanden sein sollte, der auch das entstehende Transkript und verschiedene RNA-Processingfaktoren enthält.
Im Modell eines Cotranskriptions-RNA-Processings binden sich Prozessierungskomponenten, die Splicing-Faktoren umfassen, an die RNA-Polymerase II (siehe Neugebauer und Roth, 1997b; Bentley, 1999). Verschiedene Aspekte dieses Modells sind jedoch unklar und müssen noch in vivo analysiert werden. In dem Modell ist unklar, wo die RNA-Polymerase II die Splicing-Faktoren aufnimmt und in welchem Ausmaß die verlängernde RNA-Polymerase Splicing-Faktoren insbesondere während der Transkription von Multi-Intron-Genen transportiert. Um mehr über die strukturelle Basis der koordinierten Transkription und des Splicings zu erfahren und die vorstehenden Fragen zu beantworten, ist es von großer Bedeutung, die in vivo-Struktur aktiver Gene zu studieren.
Hier wurde das aktive Balbiani Ring 3-Gen (BR3-Gen) in Speicheldrüsenzellen von Chironomus tentans sichtbar gemacht und strukturell charakterisiert. Das BR3-Gen ist 10,9 kb lang und codiert ein Sekretprotein. 38 Introns sind in etwa gleichmäßig über das ganze Gen verteilt (Paulsson et al., 1990), und es ist bekannt, dass mehr als die Hälfte dieser Introns co-transkriptionell herausgeschnitten werden (Wetterberg et al., 1996). In diesem System ist es möglich, das aktiv transkribierende BR3-Gen in einem Granulat genannten Komplex im morphologisch intakten Zellkern zu identifizieren. Dies ermöglichte den Einsatz von Elektronentomografie, um die dreidimensionale Struktur (3D-Struktur) des aktiven BR3-Gens zu rekonstruieren. Es wurde nachgewiesen, dass Splicing in einem fest umrissenen aber dynamischen supramolekularen Komplex stattfindet.
Zusätzlich und im Kontext der Erfindung noch wichtiger, ist es möglich, zu lokalisieren, wo auf dem Spliceosom sich die RNA-Polymerase und das U2-snRNP befinden.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass es die Erfindung Untersuchern ermöglicht, durch Elektronenmikroskopie genau zu bestimmen, wo sich ein spezifisches Epitop auf einem Molekül befindet.
Strukturelle und immunologische Daten zeigen, dass jedes Granulatteilchen ein wachsendes prä-mRNA-Transkript mit seinen dazugehörigen Trankriptions- und Splicing-Bestandteilen ist. Jedes solche Granulatteilchen wird als "entstehender oder naszierender Transkript- und Splicing-Komplex", also NTS-Komplex bezeichnet.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben:
1 zeigt die Immunlokalisierung des U2-snRNP B'' und der RNA-Polymerase II CTD in NTS-Komplexen.

A) Ist Teil eines Schnitts durch den aktiven BR3-Genlocus. Die 6 nm dicken Goldpartikel (Pfeile) zeigen eine Markierung mit dem Antikörper Anti-U2-snRNP B''. Nur aktiv transkribierende BR3-Gensegmente sind markiert. Keine oder nur sehr wenige Goldpartikel sind über dem inaktiven, kompakten Chromatin (Chr) in der rechten Hälfte des Bilds zu sehen. Es sind auch vier große Goldpartikel zu sehen. Bei diesen handelt es sich um Marker, die auf dem Präparat abgeschieden sind, und die zur Ausrichtung der Bilder in einer Kippreihe verwendet werden, die zur 3D-Rekonstruktion genutzt wird. Der Strich gibt eine Länge von 100 nm an.
B) Ist eine Projektion einer 3D-Rekonstruktion eines Bereichs, der aktive BR3-Gensegmente enthält, die mit dem Antikörper Anti-U2-snRNP B'' markiert sind. Die Rekonstruktion wurde aus mit ca. 0,5 Elektronen/Å²/Bild niedrigdosierten Daten hergestellt. Pfeile zeigen einige der 6 nm dicken Goldpartikel, die an den sekundären Antikörper gebunden sind. Ein großer Goldpartikel, der zur 3D-Rekonstruktion verwendet wird, ist auch zu sehen (oben links). Der Strich gibt eine Länge von 50 nm an.
C) Ist eine 3D-Rekonstruktion des Goldpartikels, der in B (großer Pfeil) angegeben ist, und des markierten NTS-Komplexes, der als Oberflächendarstellung bei einer Auflösung von 5 nm gezeigt ist. Die Antikörperverbindung zwischen dem Goldpartikel (gelb) und dem NTS-Komplex (blau) ist in rot gezeigt. Die unterbrochene Linie gibt die Chromatinachse an. Der 6 nm dicke Goldpartikel erscheint nach der Rekonstruktion etwas größer, weil es sich bei ihm um ein nicht transparentes Objekt handelt. Der Strich gibt eine Länge von 10 nm an.
D) Ist eine Projektion einer 3D-Rekonstruktion eines Bereichs, der aktive BR3-Gensegmente enthält, die mit den Antikörpern Anti-RNA Polymerase II CTD markiert sind. Die Rekonstruktion wurde aus mit ca. 0,5 Elektronen/Å²/Bild niedrigdosierten Daten hergestellt. Die Pfeile zeigen die 6 nm dicken Goldpartikel, die an den sekundären Antikörper gebunden sind. Es sind auch zwei große Goldpartikel zu sehen, die zur 3D-Rekonstruktion verwendet werden. Der Strich gibt eine Länge von 50 nm an.
E) Ist eine 3D-Rekonstruktion des Goldpartikels, der in D (großer Pfeil) angegeben ist, und des markierten NTS-Komplexes, der als Oberflächendarstellung bei einer Auflösung von 5 nm gezeigt ist. Die Farbcodierung ist wie in C. Die unterbrochene Linie gibt die Chromatinachse an. Der Strich gibt eine Länge von 10 nm an.

2 zeigt Ergebnisse, die im Vergleichsbeispiel erhalten wurden. Diese Figur ist Nummer 1 im Manuskript (Mirailles et al., 2000).
In den Figuren sind Fasern dargestellt, die mit BR-Partikeln im Nukleoplasma der Speicheldrüsenzellen zusammenhängen. (b) zeigt zwei Beispiele nukleoplasmischer BR-Partikel in einem Kryodünnschnittpräparat einer Speicheldrüse, die mit Uranylacetat eingefärbt und im EM beobachtet wurde. Die BR-Partikel erscheinen als dichte Granulatteilchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm. Die Pfeile zeigen auf Fasern, die den BR-Partikel zu berühren scheinen und sich in das umgebende Nukleoplasma erstrecken. (c) zeigt zwei Beispiele von Fasern, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein Protein, das sich in den Fasern befindet, und einem goldkonjugierten sekundären Antikörper immunmarkiert wurden. Das obere Feld zeigt einen BR-Partikel, der sich im Nukleoplasma befindet, und zwar weit weg sowohl vom BR-Gen als auch von der Kernhülle. Der Striche gibt eine Länge von 50 nm an.
3 zeigt Ergebnisse, die im Vergleichsbeispiel erhalten wurden. Diese Figur ist Nummer 6 im Manuskript (Mirailles et al., 2000). Lokalisierung von hrp65 in Fasern. (a) Immun-EM-Lokalisierung von hrp65 auf Kryodünnschnittpräparaten von Speicheldrüsen. Die Schnittpräparate wurden mit Antikörpern gegen hrp65 und mit einem goldkonjugierten sekundären Antikörper inkubiert. Drei Beispiele von Fasern (b und c), Immun-EM-Lokalisierung von hrp23 bzw. hrp36 auf Kryodünnschnittpräparaten von Speicheldrüsen. Der Strich gibt eine Länge von 50 nm an. Es wäre anzumerken, dass diese Figuren (2 und 3) zweidimensionale Darstellungen sind, und dass das Antigen, das durch den Goldmarker bezeichnet ist, irgendwo um das Gold herum in einem Kreis mit einem Radius von ca. 15 nm vorhanden ist, aber nicht mit größerer Genauigkeit lokalisiert werden kann.
4d zeigt Ergebnisse, die im Vergleichsbeispiel erhalten wurden. Diese Figur ist Nummer 2d im Manuskript (Mirailles et al., 2000). In dieser Figur wurde eine dreidimensionale Rekonstruktion hergestellt. Die Figuren I–V zeigen BR-Partikel bei einer höheren Auflösung. Es wäre jedoch anzumerken, dass die spezifischen Komponenten der Partikel aufgrund fehlender Identifizierungskriterien nicht genau bestimmt werden können. Der Strich gibt eine Länge von 20 nm an.
Definitionen und Abkürzungen

AR

– Affintitätsreagens

PVA

– Polyvinylalkohol

EM

– Elektronenmikroskopie

TEM

– Transmissionselektronenmikroskopie

EMT

– Elektronenmikroskoptomografie

COMET

– Constrained Maximum Entropy Tomography

3D

– dreidimensional

So wie der Begriff "Probe" hier verwendet wird, bezieht er sich auf eine biologische oder chemische Probe wie etwa eine Zelle, Gewebe, oder eine Probe, die sich in einem beliebigen Behälter oder Reagenzglas befindet.
So wie der Begriff "Affinitätsreagens" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Moleküle, die sich speziell an bestimmte Epitope binden. Solche Affinitätsreagenzien umfassen typischerweise Antikörper, Peptide, Polypeptide, Nukleotide, Polynukleotide, Arzneimittel, Arzneimittelvorläufer, Kohlenhydrate, Fettsäuren, Proteine oder Hormone.
So wie er Begriff "Sonde" hier verwendet wird, lässt er sich mit derselben Bedeutung einsetzen wie "Affinitätsreagens".
So wie der Begriff "direktes Markieren" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Verfahren, bei dem das Affinitätsreagens mit einem Marker gekennzeichnet wird.
So wie der Begriff "elektronendicht" hier verwendet wird, bezieht er sich auf eine Eigenschaft von Objekten, die eine hohe Elektronendichte besitzen. Beispiele für solche Objekte umfassen Iod, Ferritin und schwere Atome wie Gold, Uran oder Wolframat.
So wie der Begriff "Epitop" hier verwendet wird, bezieht er sich auf eine spezifische Bindungsstelle auf einem Molekül, die durch ein Affinitätsreagens erkannt wird.
So wie der Begriff "indirektes Markieren" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Verfahren, bei dem der Marker an einem sekundären Affinitätsreagens fixiert wird, das sich an das primäre Affinitätsreagens bindet, das an das betreffende Epitop gebunden ist.
So wie der Begriff "niedrigdosiert oder niedrige Dosis" hier verwendet wird, bezieht er sich auf eine Elektronendosis, die 35 e^–/Å²/Datensatz nicht überschreitet.
So wie der Begriff "3D-Rekonstruktion" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Verfahren, bei dem ein dreidimensionales Bild aus mehreren zweidimensionalen Bildern rekonstruiert wird.
So wie der Begriff "Datenerfassung" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Verfahren, bei dem die Probe Elektronen ausgesetzt und das hergestellte Bild aufgezeichnet wird.
So wie der Begriff "Kippreihe" hier verwendet wird, bezieht er sich auf einen Datensatz, der aus einem Elektronentomografieversuch erfasst wurde. Eine Kippreihe ist eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Bildern, die in Abfolge aufgenommen werden. Für jedes Bild wird die Kamera in verschiedenem Winkeln im Hinblick auf das Objekt angeordnet.
So wie der Begriff "Processing-Daten" hier verwendet wird, umfasst er Abgleich, Rekonstruktion und Verfeinern der erfassten Daten, wie in Skoglund et al., 1996b, beschrieben ist.
So wie der Begriff "chemisches Fixieren" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Verfahren, bei dem die Probe mit Verbindungen, typischerweise Glutaraldehyd oder Formaldehyd behandelt wird, die Proteine und/oder Nukleinsäuren vernetzen.
So wie der Begriff "Kryo" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Niedrigtemperaturbedingungen, unter denen eine massive Entstehung von Eiskristallen verhindert wird. Dies ist dem Fachmann auf dem Gebiet hinlänglich bekannt. Ein Beispiel für eine solche Bedingung wäre eine Temperatur unter –170°C bei einem Druck von 1 Atmosphäre, oder –100°C im Beisein von 2,3 M Sucrose.
So wie die Begriffe "Ultrakryomikrotomie" oder "Kryomikrotomie" hier verwendet werden, beziehen sie sich auf ein Verfahren, bei dem eine Probe unter Kryobedingungen in dünne (20–90 nm) Scheibchen zerschnitten wird.
Material und Methoden
Isolieren von Speicheldrüsen und chemisches Fixieren Speicheldrüsen von im vierten Stadium befindlichen Larven von C. Tentans wurden in 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Kakodylat-Puffer, der 0,05 M Sucrose (pH 7,2) enthielt, 2 Stunden lang bei 4°C fixiert, und dann 4 × 15 Minuten im selben Puffer ohne Glutaraldehyd gewaschen.
Isolierung von Chromosomen und Antikörpermarkierung
Speicheldrüsen wurden 2 Minuten lang in 2% Paraformaldehyd in TKM (10 mM Triethanolamin-HCl, pH 7,0, 100 mM KCl, und 1 mM MgCl₂) bei 4°C fixiert, bevor das Chromosom IV isoliert wurde, indem mit kleinen Glaspipetten auf- und abpipettiert wurde (Björkroth et al., 1988; Kiseleva et al., 1994). Das Chromosom wurde dann auf einen mit Silicon beschichteten Objektträger übertragen und 30 Minuten lang in TKM, das 4% Paraformaldehyd enthielt, bei Raumtemperatur fixiert, bevor die Immunreaktion erfolgte, wie durch Sun et al., (1998) beschrieben wurde. Die Chromosomen wurden eine Stunde lang in 2% Glutaraldehyd in TKM nachfixiert. Die nicht immunmarkierten Chromosomen wurden nach der Isolierung direkt in Glutaraldehyd in TKM fixiert. Die RNA-Polymerase II CTD und sämtliche hnRNP-Proteine und Splicing-Faktoren, die wir zu testen in der Lage waren (zwei SR-Proteine, zwei hnRNP-Proteine, U1-snRNP und U2-snRNP) blieben unter diesen Bedingungen an die aktiven BR3-Gensegmente gebunden.
Der Ziegenantikörper Anti-Drosophila RNA-Polymerase IIo (d. h. die hyperphosphorylierte CTD der großen Untereinheit von RNA-Polymerase II), "gAPα-PCTD" war ein großzügiges Geschenk von Dr. Arno L. Greenleaf (Duke University Medical Center, USA). Der Mäuseantikörper Anti-U2-snRNP B'' wurde bei ICN Pharmaceuticals, Inc. gekauft. Beide Antikörper sind bei Western-Blots spezifisch. Sekundäre IgG-Antikörper, die mit 6 nm dicken Goldpartikeln konjugiert waren, wurden bei Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. gekauft.
Einbetten, Einfärben und Herstellung von Schnittpräparaten
Nach der Fixierung mit Glutaraldehyd wurden sämtliche Proben (intakte Zellen und isolierte Chromosomen) dehydriert und auf dieselbe Weise eingebettet (Björkroth et al., 1988). Die isolierten Chromosomen wurden auf der Oberseite eines mit Silicon beschichteten Objektträgers aus Glas eingebettet. Der Kunststoff mit den isolierten Chromosomen wurde nach einer Abkühlung in Flüssigstickstoff mit einer Rasierklinge vom Glas entfernt. Der betreffende Bereich wurde ausgeschnitten, aufgespannt und entweder in 60 nm oder 100 nm dicke Schnittpräparate zerteilt. Die Schnittpräparate wurden auf EM-Gitter gelegt (es waren serienmäßige Schnittpräparate bestellt) und 5 Minuten lang mit 2% Uranylacetat in Ethanol eingefärbt. Kolloidale 10 nm große Goldmarker (Auroprobe EM GAD IgG G19, Amersham), die in der Anordnung als Marker verwendet wurden, wurden auf den Oberseiten der Schnittpräparate hinzugefügt. Die Goldmarker wurden 1:3 verdünnt und 8–10 Minuten lang mit den Gittern inkubiert. Die Gitter wurden schließlich dreimal in Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
Datenerfassung
Die Kippreihe (der Datensatz) der Chromosomen wurde in zerschnittenen Kernen manuell in einem Transmissionselektronenmikroskop Zeiss EM 902 bei 80 kV Beschleunigungsspannung unter Verwendung des unelastischen Streufilters aufgezeichnet, nachdem die Präparate vorbestrahlt worden waren, was zu einer anfänglichen Schrumpfung von 20% in der Strahlrichtung und dazu führte, dass jegliche weitere Schrumpfung während der Kippreihe verhindert wurde. Eine 32000-fache Vergrößerung wurde verwendet, und alle 5 Grad von +60°C bis –60°C wurde eine Aufzeichnung gemacht, was insgesamt 25 Projektionen ergab. Vor und nach der Kippreihe wurden zwei zusätzliche Null-Grad-Kippaufnahmen aufgezeichnet, um eine Probenschädigung durch Strahlung zu überprüfen. Nur für gut befundene Kippreihen wurden weiter verarbeitet, und die Negative wurden mit einem Trommel-Scanner Optronics P-1000 mit einem Rastermaß von 25 μm abgetastet.
Die Kippreihe der isolierten Chromosomen einschließlich immunmarkierter Chromosomen wurde in einem Transmissionselektronenmikroskop Philips CEM200 FEG unter Verwendung des TVIPS-Erfassungssystems (TVIPS GmbH, Gauting, Deutschland) und der Software Emmenu automatisch aufgezeichnet. Diese Software steuert das Kippen, Fokussieren, Nachführen und die Datenerfassung. Die Beschleunigungsspannung betrug 200 kV, die Vergrößerung das 26700-fache, und die Bilder wurden direkt auf einem CCD-Chip mit 2048×2048 Pixeln mit einem Rastermaß von 14 μm aufgezeichnet. 61 Bilder wurden gemacht, und zwar alle 2 Grad zwischen +60°C bis –60°C. Die Gesamtdosis für eine volle Kippreihe betrug weniger als 30 Elektronen/Å². Unter diesen Bedingungen kann keine Schrumpfung entdeckt werden (Mirailles et al., 2000).
Die Kippreihen von Chromosomen in situ wurden mit einer Pixelgröße von 7,8 Å digitalisiert, und die Kippreihen isolierter Chromosomen wurden mit einer Pixelgröße von 5,2 Å digitalisiert. Die Gesamtgröße des digitalisierten Bereichs von Chromosomen in schnittpräparierten Kernen betrug 1,25 × 1,25 μm, und 1,97 × 1,07 μm, was die isolierten Chromosomen betraf.
3D-Rekonstruktion
Die Daten wurden verarbeitet (abgeglichen, rekonstruiert und verfeinert), und zwar unter Verwendung des ET-Softwarepakets Version 3.4 (Skoglund et al., 1996b). Die gesamte Bildverarbeitung erfolgte auf einem Compaq-Arbeitsplatzrechner (500a) und einem GS60-Server.
Es wurden 10 nm große, kolloidale Goldmarker zum Abgleich der verschiedenen Projektionen verwendet. Der mittlere Abgleichsfehler betrug weniger als 5 Å. Der gesamte digitalisierte in situ-Bereich wurde unter Verwendung des gefilterten Rückprojektionsprinzips rekonstruiert. Die einzelnen Rekonstruktionen wurden unter Verwendung von COMET weiter verfeinert (Skoglund et al., 1996a), um eine bessere Anpassung an die Versuchsdaten zu ergeben, den Rauschabstand zu verbessern und nur signifikante Dichten beizubehalten. Schließlich wurden die rekonstruierten Dichten zu einer homogenen Auflösung tiefpassgefiltert.
Zuerst wurden ca. 300 × 300 × 100 nm große Bereiche bei einer Auflösung von 7,5 nm analysiert. Ausgewählte Strukturen wurden weiter rekonstruiert und bei 5 nm analysiert. Bob (Ken Chin-Purcell, Minnesota Supercomputing Center Inc., Freeware) wurde zur Volumendarstellung verwendet, und XTV (Skoglund et al., 1996b) und AVS/Express Version 4.0 (Advanced Visual Systems, Inc.) wurden jeweils zur Oberflächendarstellung verwendet. Die Volumina einzelner NTS-Komplexe wurden gemessen, indem Volumenelemente oder Voxel in einer maßgeschneiderten Hülle hinzugefügt wurden (nur die interessierende Dichte wurde unter Verwendung der XTV-Software ausgeschnitten). Nur die Voxel über einem Dichteschwellenwert, für gewöhnlich 2 Standardabweichungen über Durchschnittsdichte, wurden hinzugefügt. Die lineare Erstreckung von Gensegmenten aus eingebetteten isolierten Chromosomen im Vergleich zu in situ-Schnittpräparaten wies eine ca. 20%-ige Schrumpfung bei den isolierten Chromosomen auf, die höchstwahrscheinlich auf die verschiedenen Behandlungen der Proben zurückzuführen ist. Die lineare Schrumpfung entspricht einer isotropischen Schrumpfung beim Volumen von ca. 50% im Vergleich zu den in situ-Schnittpräparaten.
VERGLEICHSBEISPIEL AUS DEM STAND DER TECHNIK
In Mirailles et al., (2000), J. Cell Biol. 148, 271–282 sind Informationsbeispiele gezeigt, die vor dieser Erfindung erhalten wurden. 1 und 6 zeigen typische Beispiele von Bildern mit geringer Auflösung, die ohne Verwendung von COMET erzielt wurden. Die Antikörper, die in diesem Beispiel verwendet werden, werden nicht im Kontext einer 3D-Rekonstruktion der Bilder verwendet und sind von geringer Auflösung. In 2d sind Ergebnisse gezeigt, die erzielt werden, wenn COMET zur 3D-Rekonstruktion der Bilder verwendet wird. In 2d wurden keine Antikörper zur Identifizierung von Epitopen verwendet; es ist deshalb unmöglich, spezifische Bestandteile des Objekts zu identifizieren.
Immunologische Lokalisierung der RNA-Polymerase II CTD und des Proteins U2-snRNP B''
Die örtlichen Lagen der CTD von RNA-Polymerase II und das U2-snRNP-spezifische B''-Protein in den BR3-Gensegmenten wurden durch immunologisches Markieren bestimmt.
Das isolierte Chromosom IV wurde in diesen Versuchen verwendet, weil im Vergleich zu Schnittpräparaten von Drüsenzellen die Antikörperreaktion wirkungsvoller war. Eine spezifische Goldmarkierung der aktiven BR3-Gensegmente wurde sowohl für den Antikörper Anti-RNA Polymerase II CTD als auch den Antikörper Anti-U2-snRNP B'' erhalten. Mehr als 99% (Antikörper Anti-U2-snRNP B'') und mehr als 97% (Antikörper Anti-RNA Polymerase II CTD) der Goldpartikel waren mit den aktiven Gensegmenten assoziiert, und nur sehr wenige Goldpartikel wurden in anderen Bereichen gefunden (siehe 1A). In der 3D-Rekonstruktion der Goldpartikel, die sich komplett innerhalb des Abschnitts befanden, hatten mehr als 83% (was den RNA Polymerase II CTD-Antikörper betraf) und mehr als 97% (was den Antikörper Anti-U2-snRNP B'' betraf) eine spezifische Verbindung mit NTS-Komplexen (siehe unten). Wenn ein unspezifischer Antikörper (Daten nicht gezeigt) verwendet wird, waren sehr wenige Goldpartikel (weniger als 1% und 3% der Anzahl, die beim Antikörper Anti-U2-snRNP B'' bzw. beim Antikörper Anti-RNA Polymerase II CTD festzustellen waren) zu sehen, und diese Goldpartikel waren in Bezug auf andere Teile des Chromosoms zufällig verteilt.
Die Gold-Immunmarkierung war klar für die transkribierenden BR3-Gensegmente (1A) spezifisch, aber es war in zwei Dimensionen nicht möglich, genau zu entscheiden, welche Teile der aktiven Gensegmente markiert waren (1B und D). Die 3D-Rekonstruktion des immunmarkierten aktiven BR3-Gens ermöglichte einen hohen Grad an Präzision bei der Lokalisierung des Antigens in NTS-Komplexen. Im Allgemeinen ermöglicht es die Kombination aus Immunmarkierung und 3D-Rekonstruktion, dass Epitope abgebildet werden können, was deutlich bessere Möglichkeiten zum Lokalisieren einzelner Komponenten in supramolekularen Strukturen und auf diese Weise zum Zerlegen der Zusammensetzung solcher Strukturen ergibt.
Eine unzweideutige dünne elektronendichte Verbindung ausgehend von den meisten Goldpartikeln wurde in der 3D-Rekonstruktion gefunden. Diese Verbindung erstreckte sich 10–20 nm von einem Goldpartikel, und beim Antikörper U2-snRNP B'' wurde nur der NTS-Komplex beobachtet, da er markiert war. Die meisten Verbindungen bestanden in diesem Fall mit dem Teil des Komplexes, der von der Chromatinachse weg gewandt war (1C). Zusätzlich wurde beim Antikörper Anti-RNA Polymerase II CTD nur die Markierung des NTS-Komplexes in den Gensegmenten beobachtet. Die Chromatinachse zwischen den NTS-Komplexen war nicht markiert. Dies unterstützt die Interpretation aus dem Aufbau der aktiven Gensegmente, dass jeder NTS-Komplex ein naszierendes Transkript enthält, und daraus folgt, dass eine RNA-Polymerase II in jedem NTS-Komplex vorhanden ist. Die meisten Verbindungen zwischen den Goldpartikeln, die an die Antikörper Anti-RNA Polymerase II CTD gebunden waren, und dem NTS-Komplex wurden in dem Bereich des NTS-Komplexes beobachtet, welcher der Chromatinachse am nächsten ist (1E).
Diese Immunmarkierungsversuche zeigen, dass die CTD der großen Untereinheiten von RNA Polymerase II und des U2-snRNP B'' jeweils an den NTS-Komplexen entlang der Chromatinachse lokalisiert werden kann. Darüber hinaus, und das ist für diese Erfindung relevant, sind die Daten von ausreichend hoher Auflösung, um die verschiedenen örtlichen Lagen der beiden Komponenten innerhalb der Komplexe genau zu bestimmen:
die RNA Polymerase II CTD ist der Chromatinachse am nächsten und U2-snRNP liegt weiter im Inneren des Komplexes.
Literaturnachweis

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Claims

Verfahren zum Lokalisieren und Visualisieren spezifischer Epitope, die sich auf einem Molekül in einer Probe befinden, die folgenden Schritte umfassend: (a) Durchführen einer Affinitätskennzeichnung, indem ein erstes Affinitätsreagens an spezifische Epitope des Moleküls in der Probe gebunden wird; (b) Festlegen der räumlichen Verhältnisse zwischen dem Molekül und anderen Bestandteilen der Probe durch Einfrieren und/oder Einbetten; (c) Aufbringen der Probe auf ein Elektronenmikroskopiegitter; (d) Bestrahlen der Probe mit einer Dosis, die 35 e^–/Å² Elektronenstrahlung nicht überschreitet, in einem Transmissionselektronenmikroskop; (e) Sammeln von Daten aus einer Kippreihe; (f) Analysieren der gesammelten Daten, um die Strukturen einzelner Moleküle in drei Dimensionen zu rekonstruieren; (g) Verfeinern der Rekonstruktionen unter Verwendung von Constrained Maximum Entropy Tomography (COMET), um die spezifischen Epitope der Probe zu lokalisieren und visualisieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Affinitätsreagens, das sich gegen zwei oder mehr Epitope auf dem Molekül richtet, zur Affinitätskennzeichnung verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste Affinitätsreagens mit einem elektronendichten Marker gekennzeichnet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein zweites Affinitätsreagens an das Affinitätsreagens gebunden wird, das an das Molekül gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste Affinitätsreagens in eine Zelle oder in Gewebe injiziert wird, in der bzw. dem sich das Molekül befindet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle oder das Gewebe, die bzw. das das erste Affinitätsreagens enthält, in dünne Abschnitte mit einer Dicke im Bereich von 25 nm–1 μm geschnitten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe vor der Affinitätskennzeichnung in Abschnitte mit einer Dicke im Bereich von 25 nm–1 μm geschnitten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe nach der Affinitätskennzeichnung und vor dem Bestrahlen mit der Elektronenstrahlungsdosis eingefroren wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Probe geschnitten und eingebettet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die räumlichen Verhältnisse zwischen den Molekülen und anderen Bestandteilen der Probe vor dem Einfrieren und/oder Einbetten durch chemisches Fixieren fixiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, darüber hinaus vor dem Zerschneiden ein Festlegen der räumlichen Verhältnisse zwischen Bestandteilen der Probe durch Einbetten und/oder Einfrieren umfassend.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe, nachdem sie auf das Elektronenmikroskopiegitter gelegt wurde, und bevor sie mit der Elektronenstrahlung bestrahlt wird, eingefroren wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe vor der Datenerfassung mit schweren Atomen angefärbt wird.