DE60209264T2

DE60209264T2 - Herstellung von impfstoffen mittels photosensitizer und licht

Info

Publication number: DE60209264T2
Application number: DE60209264T
Authority: DE
Inventors: P. Raymond Lakewood GOODRICH
Original assignee: Gambro Inc
Current assignee: Terumo BCT Biotechnologies LLC
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2022-12-21
Also published as: WO2003054176A2; EP1456359B1; AU2002366708A8; DE60209264D1; EP1456359A2; WO2003054176A3; AU2002366708A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Zubereitung von Vakzinen. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Inaktivierung infektiöser Partikel in einem Vakzin, ob viraler, bakterieller oder zellulärer Natur. Die infektiösen Partikel werden unter Verwendung von endogenen Photosensibilisatoren und Licht inaktiviert, unter Bedingungen, welche den antigenen Abbau der infektiösen Artikel begrenzen, um eine Immunantwort auszulösen, aber die Replikation der infektiösen Partikel zu verhindern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Jeden Tag wird der Körper mit Bakterien, Viren und anderen infektiösen Mitteln bombardiert. Wenn eine Person mit einem eine Erkrankung hervorrufenden oder infektiösen Mittel infiziert wird, versucht das Immunsystem des Körpers, eine Abwehr gegen es aufzustellen. Wenn die Abwehr erfolgreich ist, resultiert Immunität gegen das infektiöse Mittel. Wenn die Abwehr nicht erfolgreich ist, kann eine Infektion resultieren.
Bei dem Vorgang des Entwickelns von Immunität gegen das infektiöse Mittel produzieren die B-Zellen des Körpers Substanzen, die als Antikörper bekannt sind, welche gegen das spezifische infektiöse Mittel wirken und eine „Erinnerung" dieser Erfahrung schaffen, welche um Schutz gerufen werden kann, wenn er Monate oder Jahre später wiederum demselben infektiösen Mittel ausgesetzt ist. Das nächste Mal, wenn die Person auf dieses bestimmte infektiöse Mittel trifft, erkennen die zirkulierenden Antikörper es schnell und ermöglichen es, dass es aus dem Körper durch andere Immunzellen eliminiert wird, bevor sich Erkrankungszeichen entwickeln. Es wird geschätzt, dass Antikörper, die über 10.000 unterschiedliche Antigene oder infektiöse Fremd- (Nicht-Selbst-)Mittel erkennen können, im Blutstrom zirkulieren.
Ein Vakzin ist in einer ähnlichen Weise tätig, dahingehend, dass es eine immunogene Antwort erzeugt. Anstelle des anfänglichen Erleidens der natürlichen Infektion und Riskierens von Krankheit, um diese schützende Immunität zu entwickeln, erzeugen Vakzine eine ähnliche schützende Immunität, ohne den Körper der Erkrankung auszusetzen.
Die Entwicklung von Vakzinen gegen sowohl bakterielle als auch virale Erkrankungen war eine der Hauptleistungen in der Medizin während des letzten Jahrhunderts. Während wirksame Vakzine für eine große Anzahl von Erkrankungen entwickelt worden sind, bleibt der Bedarf für die Entwicklung von sicheren und effektiven Vakzinen für eine Anzahl von zusätzlichen Erkrankungen bestehen.
Etliche Grundstrategien werden verwendet, um Vakzine herzustellen. Eine Strategie ist auf die Verhinderung von viralen Erkrankungen durch Schwächen oder Abschwächen eines Virus gerichtet, so dass das Virus sich sehr schlecht vermehrt, wenn es erst einmal im Körper ist. Masern-, Mumps-, Röteln- (deutsche Masern) und Windpocken- (Varicella-) Vakzine sind auf diese Weise gemacht. Während natürliche Viren gewöhnlich Erkrankung bewirken, indem sie sich selber viele tausend Mal vermehren, vermehren sich abgeschwächte Vakzin-Viren annähernd 20 Mal. Solch eine niedrige Vermehrungsrate ist allgemein nicht genug, um Erkrankung zu verursachen. Obwohl die Zubereitung lebender, abgeschwächter infektiöser Mittel als Vakzine oftmals eine verbesserte immunologische Reaktivität bereitstellen wird, steigern solche Verfahren das Risiko, dass das Vakzin selber die Ursache von Infektion sein wird und dass der abgeschwächte Organismus sich fortpflanzen wird und ein Reservoir für eine zukünftige Infektion bereitstellen wird. Eine oder zwei Dosen lebender, „abgeschwächter" Viren können für Immunität sorgen, die lebenslang ist; solche Vakzine können jedoch Menschen mit geschwächten Immunsystemen nicht gegeben werden.
Ein anderer Weg, virale Vakzine herzustellen, ist, das Virus zu inaktivieren. Durch dieses Verfahren werden Viren vollständig inaktiviert oder abgetötet unter Verwendung einer Chemikalie. Abtöten des Virus macht das Virus unfähig, sich in einem Körper zu vermehren und Erkrankung hervorzurufen. Polio-, Hepatitis-A-, Influenza- und Rabies-Vakzine sind auf diese Weise gemacht. Die Verwendung von inaktivierten oder abgetöteten bakteriellen oder viralen Mitteln als ein Vakzin, verwendet um eine immunogene Antwort zu induzieren, wird, obwohl allgemein sicher, nicht immer effektiv sein, falls die immunogenen Eigenschaften des Mittels geändert sind. Ein inaktives Virus kann Menschen mit geschwächten Immunsystemen gegeben werden, muss jedoch mehrfach gegeben werden, um Immunität zu erreichen.
Vakzine können auch unter Verwendung von Teilen des Virus gemacht werden. Mit dieser Strategie wird ein Teil des Virus entfernt und als ein Vakzin verwendet. Der Körper ist in der Lage, das Gesamtvirus zu erkennen, basierend auf der anfänglichen Aussetzung an einen Teil des Virus. Das Hepatitis-B-Vakzin zum Beispiel ist aus einem Protein zusammengesetzt, das auf der Oberfläche des Hepatitis-B-Virus sitzt.
Vakzine werden auch gemacht, um dabei zu helfen, durch Bakterien verursachte Erkrankungen zu bekämpfen. Etliche bakterielle Vakzine werden gemacht, indem die von Bakterien hergestellten Toxine genommen werden und sie unter Verwendung von Chemikalien inaktiviert werden. Durch Inaktivieren der Toxine verursachen die Bakterien nicht länger Erkrankung. Diphtherie-, Tetanus- und Pertussis-Vakzine sind auf diesem Weg hergestellt. Eine andere Strategie, bakterielle Vakzine zu machen, ist die Verwendung eines Teils der Zuckerhülle (oder Polysaccharidhülle) der Bakterien, um die immunogene Antwort zu induzieren. Schutz gegen gewisse Bakterien wird auf die ansprechende Immunität auf diesen Zuckerüberzug basiert.
Folglich muss man allgemein wählen zwischen einer verbesserten Wirksamkeit oder einem größeren Maß an Sicherheit, wenn man zwischen den Inaktivierungs- und Abschwächungstechniken für die Vakzinzubereitung wählt. Die Wahl ist besonders schwierig, wenn das infektiöse Mittel gegen Inaktivierung resistent ist und sehr harte Inaktivierungsbedingungen erfordert, von denen wahrscheinlich ist, dass sie die antigenen Eigenschaften abbauen, welche dabei helfen, eine Immunantwort zu induzieren und anschließende Immunität bereitzustellen.
Zusätzlich zu dem toten oder abgeschwächten infektiösen Mittel enthalten Vakzine gewöhnlich steriles Wasser oder Salzlösung. Gewisse Vakzine werden mit einem Konservierungsmittel oder Antibiotikum zubereitet, um bakterielles Wachstum zu verhindern. Vakzine können auch mit Stabilisatoren zubereitet werden, um dabei zu helfen, dass das Vakzin seine Wirksamkeit während der Lagerung bewahrt. Andere Bestandteile können ein Adjuvanz einschließen, welches dabei hilft, die Produktion von Antikörpern gegen das Vakzin zu stimulieren, um es wirksamer zu machen.
Verfahren, um Vakzine heutzutage zuzubereiten, schließen die Behandlung von Proben mit Glutaraldehyd oder Formaldehyd ein, um die Zellen oder infektiösen Partikel zu fixieren oder querzuvernetzen. Solche Behandlungen involvieren allgemein die Denaturierung der nativen Formen der infektiösen Mittel. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Proteinhüllen der infektiösen Partikel durch diesen Vorgang beschädigt werden und folglich durch das Immunsystem nicht erkannt werden können.
Deshalb besteht ein Bedarf für ein Verfahren, Vakzine zuzubereiten, die durch das Immunsystem erkannt werden, sich aber nicht vermehren, wenn sie sich erst einmal innerhalb des Körpers befinden.
Von der Verwendung von Photosensibilisatoren – Verbindungen, welche Licht einer definierten Wellenlänge absorbieren und die absorbierte Energie an einen Energieakzeptor übertragen – ist bekannt, dass sie bei der Sterilisierung von Blutbestandteilen nützlich ist. Zum Beispiel schlägt die Europäische Patentanmeldung 196,515, veröffentlicht am 8. Oktober 1986, die Verwendung nicht-endogener Photosensibilisatoren wie Porphyrine, Psoralene, Acridin, Toluidine, Flavin (Acriflavin-Hydrochlorid), Phenothiazinderivate und Farbstoffe wie Neutralrot und Methylenblau, als Blutadditive vor. Protoporphyrin, welches im Körper natürlich vorkommt, kann metabolisiert werden, um einen Photosensibilisator zu bilden; seine Nützlichkeit ist jedoch beschränkt dahingehend, dass es die gewünschten biologischen Aktivitäten von Proteinen herabsetzt. Chlorpromazin wird auch beispielhaft als ein solcher Photosensibilisator angegeben; seine Nützlichkeit ist jedoch durch die Tatsache beschränkt, dass es nach dem Dekontaminationsvorgehen aus jeder Flüssigkeit entfernt sein sollte, die einem Patienten verabreicht wird, da es eine sedierende Wirkung hat.
Goodrich, R. P. et al., (1997), „The Design and Development of Selective, Photoactivated Drugs for Sterilization of Blood Products", Drugs of the Future 22: 159-171, stellen einen Überblick über gewisse Photosensibilisatoren einschließlich Psoralenen bereit und gewisse Dinge von Wichtigkeit für das Wählen von Photosensibilisatoren für die Dekontamination von Blutprodukten. Die Verwendung von Texaphyrinen für die DNS-Photospaltung ist beschrieben in den US-Patenten Nr. 5,607,924, erteilt am 4. März 1997, und Nr. 5,714,328, erteilt am 3. Februar 1998, an Magda et al. Die Verwendung Sapphyrinen für virale Deaktivierung ist beschrieben im US-Patent Nr. 5,041,078, erteilt am 20. August 1991 an Matthews et al. Die Inaktivierung extrazellulär umhüllter Viren in Blut und Blutbestandteilen durch Phenothiazin-5-ium-Farbstoffe plus Licht ist beschrieben im US-Patent Nr. 5,545,516, erteilt am 13. August 1996 an Wagner. Die Verwendung von Porphyrinen, Hämatoporphyrinen und Merocyaninfarbstoffen als Photosensibilisierungsmittel, um infektiöse Kontaminantien wie Viren und Protozoen aus Körpergeweben wie Körperflüssigkeiten auszurotten, ist im US-Patent Nr. 4,915,683, erteilt am 10. April 1990, und in dem verwandten US-Patent-Nr. 5,304,113, erteilt am 19. April 1994 an Sieber et al., offenbart. Die Reaktivität von Psoralenderivaten mit Viren wurde untersucht. Siehe Hearst und Thiry (1977) Nuc. Acids Res. 4: 1339-1347; und Talib und Banerjee (1982) Virology 118: 430-438. Die US-Patente Nrn. 4,124,598 und 4,196,281 von Hearst et al. schlagen die Verwendung von Psoralenderivaten vor, um RNS-Viren zu inaktivieren, schließen jedoch keine Diskussion der Geeignetheit solcher inaktivierter Viren als Vakzine ein. Das US-Patent Nr. 4,169,204 von Hearst et al. schlägt vor, dass Psoralene ein Mittel zum Inaktivieren von Viren für die Zwecke der Vakzinproduktion bereitstellen könnten, präsentiert jedoch keine experimentelle Unterstützung für diesen Vorschlag. Die Europäische Patentanmeldung 0 066 886 von Kronenberg lehrt die Verwendung von mit Psoralen inaktivierten Zellen, wie zum Beispiel virusinfizierte Säugerzellen, für die Verwendung als immunologische Reagenzien und Vakzine. Hanson (1983) in: Medical Yirology II, de la Maza und Peterson, Hrsg., Elsevier Biomedical, New York, Seiten 45-79, berichtet von Studien, welche vorgeschlagen haben, dass oxidative Photoreaktionen zwischen Psoralenen und Proteinen vorkommen können. Wiesehahn et al. offenbaren in den US-Patenten Nrn. 4,693,981 und 5,106,619 die Verwendung von Psoralenen, um inaktivierte virale Vakzine zuzubereiten. Diese Patente offenbaren die Zubereitung von Vakzinen durch die Behandlung von Viren mit Furocumarinen und UV-Licht langer Wellenlänge für eine Zeitdauer, die ausreichend lange ist, um das Virus nicht-infektiös zu machen, aber kürzer als die Zeitdauer, welche in einer Verminderung seiner antigenen Eigenschaften resultieren würde, unter Bedingungen, welche die Verfügbarkeit von Sauerstoff und anderen Oxidierungsarten begrenzt, Swartz offenbart im US-Patent Nr. 4,402,318 ein Verfahren zum Herstellen eines Vakzins durch Hinzufügen von Methylenblau und Aussetzen des Vakzins an Licht und gleichzeitig an ein elektrisches Feld, um die Viren, Bakterien, Zellen und Toxine vollständig zu inaktivieren. Dorner et al. im US-Patent Nr. 6,165,711 offenbaren einen Vorgang, um Nukleinsäuren zu spalten, um Vakzine durch Aussetzen von biologisch aktivem Material an Phenothiazin und einen Laserstrahl zu machen.
Der Wirkmechanismus von Psoralenen ist beschrieben als eine bevorzugte Bindung an Domänen in Lipiddoppelschichten einschließend, z. B. auf umhüllten Viren und gewissen virusinfizierten Zellen.
Photoexzitation membrangebundener Moleküle von Mitteln führt zu der Bildung von reaktiven Sauerstoffarten wie Singulett-Sauerstoff, der Lipidperoxidation bewirkt. Ein Problem mit der Verwendung von Psoralenen ist, dass sie Zellmembranen von wünschenswerten Bestandteilen von zu dekontaminierenden Fluiden, wie zum Beispiel rote Blutzellen, angreifen, und der während der Reaktion produzierte Singulett-Sauerstoff greift auch erwünschte Proteinbestandteile des zu behandelnden Fluids an.
Das US-Patent Nr. 4,727,027, erteilt am 23. Februar 1988 an Wiesehahn G. P. et al., offenbart die Verwendung von Furocumarinen, einschließend Psoralen und Derivate davon, für die Dekontamination von Blut und Blutprodukten, lehrt jedoch, dass Schritte unternommen werden müssen, um die Verfügbarkeit von gelöstem Sauerstoff und anderen reaktiven Arten zu reduzieren, um die Denaturierung biologisch aktiver Proteine zu inhibieren. Photoinaktivierung von viralen und bakteriellen Blutbestandteilen unter Verwendung von halogenierten Cumarinen ist beschrieben im US-Patent Nr. 5,516,629, erteilt am 14. Mai 1996 an Park et al. Das US-Patent Nr. 5,587,490, erteilt am 24. Dezember 1996 an Goodrich Jr., R. P. et al., und das US-Patent Nr. 5,418,130 von Platz et al. offenbaren die Verwendung von substituierten Psoralenen für die Inaktivierung von viralen und bakteriellen Blutbestandteilen. Das letzte Patent lehrt auch die Notwendigkeit des Kontrollierens freier Radikalschädigung von anderen Blutbestandteilen. Das US-Patent Nr. 5,654,443, erteilt am 5. August 1997 an Wollowitz et al., lehrt neue Psoralenzusammensetzungen, die für die Photodekontamination von Blut verwendet werden. Das US-Patent Nr. 5,709,991, erteilt am 20. Januar 1998 an Lin et al., lehrt die Verwendung von Psoralen für die Photodekontamination von Blutplättchenzubereitungen und die Entfernung von Psoralen danach. Das US-Patent Nr. 5,120,649, erteilt am 9. Juni 1992, und das verwandte US-Patent Nr. 5,232,844, erteilt am 3. August 1993 an Horowitz et al., offenbaren auch den Bedarf für die Verwendung von „Quenchern" in Kombination mit Photosensibilisatoren, welche Lipidmembranen angreifen, und das US-Patent Nr. 5,360,734, erteilt am 1. November 1994 an Chapman et al., geht auch dieses Problem der Verhinderung der Schädigung anderer Blutbestandteile an.
Photosensibilisatoren, welche Nukleinsäuren angreifen, sind in der Technik bekannt. Das US-Patent 5,342,752, erteilt am 30. August 1994 an Platz et al., offenbart die Verwendung von auf Acridinfarbstoffen basierten Verbindungen, um parasitische Kontamination in Blutmaterie, einschließend rote Blutzellen, Blutplättchen und Blutplasmaproteinfraktionen, zu reduzieren. Diese Materialien, obwohl sie eine ziemlich geringe Toxizität haben, haben eine gewisse Toxizität z. B. für rote Blutzellen. Dieses Patent vermag es nicht, ein Gerät zu offenbaren für die Dekontamination von Blut auf einer Durchflussgrundlage. Das US-Patent Nr. 5,798,238 von Goodrich Jr. et al. offenbart die Verwendung von Quinolon und Quinolonverbindungen für die Inaktivierung von viralen und bakteriellen Kontaminantien.
Die Bindung von DNS mit photoaktiven Mitteln wurde in Vorgängen ausgenutzt, um Lymphozytenpopulationen im Blut zu reduzieren, wie gelehrt im US-Patent Nr. 4,612,007, erteilt am 16. September 1986, und in dem verwandten US-Patent Nr. 4,683,889, erteilt am 4. August 1987 an Edelson.
Von Riboflavin (7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin) wurde berichtet, dass es Nukleinsäuren angreift. Die an Goodrich et al. erteilten US-Patente Nrn. 6,258,577 und 6,277,337 offenbaren die Verwendung von Riboflavin und Licht, um Mikroorganismen zu inaktivieren, welche im Blut oder in Blutprodukten enthalten sein könnten. Das US-Patent 6,268,120 von Platz et al. offenbart Riboflavinderivate, die verwendet werden können, um Mikroorganismen zu inaktivieren.
Sämtliche Publikationen, auf die hierin Bezug genommen wird, werden hiermit durch Bezugnahme in dem Ausmaß eingeschlossen, in dem es hiermit nicht inkonsistent ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Aspekt dieser Erfindung, verbesserte Verfahren zum Inaktivieren infektiöser Partikel bereitzustellen, wobei diese Verfahren in der Lage sind, sogar die widerstandsfähigsten Partikel unter Bedingungen zu inaktivieren, welche die antigene Struktur der Partikel im Wesentlichen nicht vermindert. Genauer sollten die inaktivierten infektiösen Partikel nützlich sein als Vakzine und frei von Nebenwirkungen zu dem Zeitpunkt der Verabreichung, ebenso wie bei der anschließenden Provokation mit den lebenden infektiösen Mitteln nach zukünftigem Aussetzen.
Ein Verfahren zum Inaktivieren infektiöser Partikel, ohne im Wesentlichen die antigenen Eigenschaften der Partikel zu vermindern, kann die Schritte des Aussetzens der infektiösen Partikel an ein Inaktivierungsfluid einschließen, enthaltend wenigstens einen endogenen Photosensibilisator in einer Menge, die ausreichend ist, die Partikel im Wesentlichen nicht-infektiös zu machen, und des Aussetzens der infektiösen Partikel und des Inaktivierungsfluids an Licht einer ausreichenden Wellenlänge, um die Partikel im Wesentlichen nicht-infektiös zu machen, jedoch weniger, als was in Verminderung der antigenen Eigenschaften der infektiösen Partikel resultieren würde.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins aus wenigstens einem Teil eines oder mehrerer infektiöser Partikel bereit, umfassend:
Inaktivieren der infektiösen Partikel durch Hinzufügen einer effektiven Menge eines Photosensibilisators, welcher ein endogenes Alloxazin oder ein Derivat davon ist, zu dem einen oder mehreren infektiösen Partikeln;
Aussetzen der Partikel an Licht einer ausreichenden Wellenlänge, um die Replikation der infektiösen Partikel zu verhindern, aber nicht wesentlich die Antigendeterminanten der Partikel zu zerstören; und
Suspendieren der inaktivierten Partikel in einer Suspensionslösung, um ein Vakzin zu schaffen.
Die Partikel werden im Wesentlichen nicht-infektiös gemacht durch Beschädigen der Nukleinsäuren der infektiösen Partikel, wodurch die Partikel von der Vermehrung abgehalten werden, wenn sie erst einmal im Inneren des Empfängers des Vakzins sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 bildet das Riboflavinextinktionsspektrum ab.
2 bildet eine Korrelation von Lichtextinktion und beobachtetem und vorhergesagten Hämatokrit für rote Blutzellen und beobachtetem und vorhergesagtem Hämatokrit für Blutplättchen ab.
3 bildet Photoabbau über die Zeit von Riboflavin in dem Antikoagulantium saure Citratdextrose- (ACD-)Lösung ab. Die durchgezogene Linie mit Kreisen zeigt den Prozentsatz des Ausgangsriboflavins, das bei 373 nm verbleibt. Die gestrichelte Linie mit Quadraten zeigt den Prozentsatz des Ausgangsriboflavins, das bei 447 nm verbleibt.
4 bildet das Durchlässigkeitsprofil verschiedener Plastikküvetten als eine Funktion der Wellenlänge ab. Die durchgezogene Linie stellt eine 3,2 mm Acrylküvette dar. Die gepunktete Linie (-----) stellt eine 3,2 mm UV-Acrylküvette dar. Die gestrichelte Linie (––) stellt eine 3,2 mm Polystyrol- (PS-)Küvette dar und die gekreuzte Linie zeigt eine 3,2 mm Polycarbonat- (PC-)Küvette an.
5 bildet den erforderlichen Lichtflux in mW pro cm² als eine Funktion der Fluxrate ab, d. h. der Flux, der erforderlich ist, um einer Probe in der Küvette ein Joule/cm² zu liefern.
6 bildet die Dekontaminationsanordnung dieser Erfindung ab.
7 bildet die Inaktivierung von Bakterien in Blutplättchenzubereitungen unter Verwendung von Vitamin K5 als Photosensibilisator als eine Funktion der Bestrahlungsenergie ab.
8 bildet die Inaktivierung von Bakterien als eine Funktion der Blutplättchenzubereitung und Bestrahlungsenergie ab, unter Verwendung von 90% Blutplättchen und 10% Blutplättchenzusatzlösung (90:10) und 30% Blutplättchen mit 70% Zusatzlösung (30:70).
9 zeigt die Wirkung auf die Inaktivierung von Virus, Bakteriophage und Bakterien nach der Zugabe von Antioxidantien zu Blutplättchenkonzentrat.
10 zeigt die Inaktivierungskurve für das Virus Herpes simplex Typ II als eine Funktion der Konzentration des Photosensibilisators bei einer Bestrahlungsenergie von 20 J/cm² unter Verwendung von einer Hälfte ultraviolettem und einer Hälfte sichtbarem Licht.
11 zeigt die Inaktivierung von S. epidermidis bei variierenden Konzentrationen an Photosensibilisator und Bestrahlungsenergien.
12 zeigt die Inaktivierung von ΦX174 bei variierenden Konzentrationen an Photosensibilisator und Bestrahlungsenergien.
13 zeigt die Inaktivierung von S. aureus und ΦX174 bei variierenden Bestrahlungsenergien unter Verwendung einer 50:50-Mischung aus Ultraviolett- und sichtbarem Licht.
14 zeigt die Inaktivierung von S. epidermidis und HSV-II bei variierenden Bestrahlungsenergien unter Verwendung einer 50:50-Mischung aus Ultraviolett- und sichtbarem Licht.
15 zeigt die Inaktivierung von HSV2-Virus in Blutbeuteln, hin und her bewegt und bestrahlt bei variierenden Energieniveaus.
16 vergleicht Inaktivierungsergebnisse für Vacciniavirus in verschiedenen Fluiden unter Verwendung von Ultraviolettlicht alleine oder von 50:50 sichtbarem und ultraviolettem Licht.
17 vergleicht Inaktivierungsergebnisse mit und ohne Sensibilisator von Vacciniavirus bei variierenden Bestrahlungszeiten.
18 vergleicht die Inaktivierung von extrazellulärem HIV-I bei 5 und 50 μM Photosensibilisator und variierenden Bestrahlungsenergien.
19 vergleicht die Inaktivierung von intrazellulärem HIV-I bei 5 und 50 μM Photosensibilisator und variierenden Bestrahlungsenergien.
20 vergleicht die Inaktivierung von intrazellulärem HIV-I bei 5 und 50 μM Photosensibilisator und variierenden Bestrahlungsenergien unter Verwendung von p24-Antigenspiegeln.
21 vergleicht die Inaktivierung von HSV-II bei variierenden Bestrahlungsniveaus unter Verwendung von Blutplättchenkonzentrat und Blutplättchenkonzentrat in Medien, die Blutplättchenzusatzlösung mit Ascorbat enthalten.
22 zeigt eine Ausführung dieser Erfindung unter Verwendung eines Beutels, um das zu behandelnde Fluid zu enthalten, und eines Photosensibilisators und eines Schütteltisches, um das Fluid hin und her zu bewegen, während es der Photobestrahlung aus einer Lichtquelle ausgesetzt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden für die Impfung von Säugerwirten, einschließend sowohl Tiere als auch Menschen, nützliche Vakzine gegen Infektion bereitgestellt. Die Vakzine können zubereitet werden durch Inaktivierung infektiöser Partikel in einem Inaktivierungsmedium, enthaltend eine Menge eines inaktivierenden endogenen Photosensibilisators oder endogenen Photosensibilisatorderivates, ausreichend, die infektiösen Partikel nach Aussetzen an Bestrahlung zu inaktivieren. Die Verminderung der antigenen Eigenschaften der infektiösen Partikel wird reduziert oder eliminiert durch die Verwendung eines endogenen Photosensibilisators und besonders eines Isoalloxazins oder Isoalloxazinderivates. Geeignete Vakzine können zubereitet werden durch Kombinieren der inaktivierten infektiösen Partikel mit einem physiologisch annehmbaren Träger wie Wasser, Salzlösung oder einem Adjuvanz in einer geeigneten Menge, um eine Immunantwort auf die anschließende Impfung des Wirtes auszulösen, z. B. die Produktion von serumneutralisierenden Antikörpern.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Inaktivieren eines infektiösen Partikels" oder „Mittels" im Wesentlichen Abhalten des infektiösen Partikels oder Mittels vom Replizieren, entweder durch Abtöten der Partikel oder anderweitiges in Wechselwirkung treten mit ihrer Fähigkeit, sich zu vermehren, während die antigenen Eigenschaften der Partikel immer noch bewahrt bleiben.
Die Kontaminationsverfahren dieser Erfindung unter Verwendung von endogenen Photosensibilisatoren oder endogen basierten Photosensibilisatorderivaten zerstören im Wesentlichen nicht die Antigenität auf der Oberfläche der infektiösen Partikel, sondern zerstören im Wesentlichen die Nukleinsäuren der Partikel und deshalb die Vermehrungsfähigkeit der Partikel. Solange die infektiösen Partikel ausreichend Antigenbestimmung behalten, um für ihren beabsichtigten Zweck der Induktion von Immunität in einem Säuger nützlich zu sein, wird von ihren biologischen Aktivitäten nicht gedacht, dass sie „im Wesentlichen zerstört sind".
Infektiösen Partikel oder Mittel, die in einem Vakzin vorhanden sein können, schließen Viren (sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre), Bakterien, Bakteriophagen, Pilze, blutübertragene Parasiten, Protozoen, virusinfizierte Zellen, Krebszellen, dendritische Zellen oder geänderte Immunzellen ein. Beispielhafte Viren, die zu Vakzinen gemacht werden können, schließen erworbenes Immunschwächevirus (HIV), Hepatitis-A-, B- und C-Viren, Sinbis-Virus, Cytomegalovirus, vesikuläres Stomatitisvirus, Herpes-simplex-Virus, z. B. Typen I und II, menschliche T-lymphotrope Retroviren, HTLV-III, Lymphadenopathievirus LAV/IDAV, Parvovirus, Transfusionsübermitteltes (TT) Virus, Epstein-Barr-Virus, Adenovirus, Papovaviren, Pockenviren, Picornavirus, Paramyxovirus, Coronavirus, Calicivirus, Togavirus, Rhabdovirus und andere in der Technik bekannte ein.
Bakteriophagen schließen ΦX174, Φ6, λ, R17, T₄ und T₂ ein.
Beispielhafte Bakterien können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, L. monocytogenes, E. coli, K. pneumonia, S. marcesoens, E. faecalis, B. subtilis, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. viridans, B. cereus, E. aerogenes, Propionabacter, K. pneumoniae, C. perfringes, E. cloacae, P. mirabilis, S. cholerasuis, S. liquifaciens, S. mitis, Y. enterocolitica, P. fluorescens, S. enteritidis, C. freundii.
Beispielhafte Zellen, die verwendet werden können, um Vakzine herzustellen, schließen Tumorzellen, virusinfizierte Zellen und Immunzellen ein, welche dendritische Zellen und T- und B-Zellen einschließen können.
Materialien, die durch die Verfahren dieser Erfindung behandelt werden können, schließen sämtliche Materialien oder Bestandteile von Vakzinen ein, die für Photostrahlung geeignet durchlässig sind, um ausreichend Licht bereitzustellen, um Inaktivierung der infektiösen Partikel zu erzielen, oder welche in Fluiden suspendiert oder gelöst werden können, die eine solche Durchlässigkeit für Lichtstrahlen haben. Beispiele solcher Materialien können das infektiöse Partikel und/oder alle Bestandteile oder Zusammensetzungen sein, die in Vakzinzubereitungen inkludiert sind wie Adjuvanzien, Antibiotika, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Salzlösung und/oder Wasser. Die infektiösen Partikel, die in einem Vakzin verwendet werden können, können als Ganzes verwendet werden (das gesamte infektiöse Partikel) oder es können Teile des Partikels (wie die Proteinhülle eines Virus) verwendet werden.
Der Begriff „biologisch aktiv" bedeutet, in der Lage, eine Änderung in einem lebenden Organismus oder Bestandteil davon zu bewirken. Ähnlich bedeutet „nicht-toxisch" in Bezug auf die Photosensibilisatore, eine geringe oder gar keine Toxizität für Menschen oder andere Säuger und bedeutet nicht nicht-toxisch für die zu inaktivierenden Partikel. „Wesentliche Zerstörung" biologischer Aktivität bedeutet, wenigstens so viel Zerstörung wie durch Porphyrin und Porphyrinderivate, -metabolite und -vorläufer bewirkt wird, von denen bekannt ist, dass sie eine schädigende Wirkung auf biologisch aktive Proteine und Zellen von Menschen und Tieren haben.
Ähnlich bedeutet „im Wesentlichen nicht-toxisch", weniger toxisch als Porphyrin, Porphyrinderivate, -metabolite und -vorläufer.
Ein „Photosensibilisator" ist als jede Verbindung definiert, die die Strahlung mit einer oder mehreren definierten Wellenlänge(n) absorbiert und anschließend die absorbierte Energie ausnutzt, um einen chemischen Prozess durchzuführen. Photosensibilisatoren dieser Erfindung schließen Verbindungen ein, die bevorzugt an Nukleinsäuren adsorbieren, wodurch ihre photodynamische Wirkung auf Mikroorganismen und Viren konzentriert wird, mit einer geringen oder gar keinen Wirkung auf begleitende Zellen oder Proteine. Am bevorzugtesten sind endogene Photosensibilisatoren. Der Begriff „endogen" bedeutet natürlich gefunden in einem Menschen- oder Säugerkörper, entweder als ein Ergebnis von Synthese durch den Körper oder auf Grund von Aufnahme als ein essentieller Nährstoff (z. B. Vitamine) oder wegen der Bildung von Metaboliten und/oder Nebenprodukten in vivo. Die in der Erfindung genutzten endogenen Photosensibilisatoren sind Alloxazine wie 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin (Riboflavin), 7,8,10-Trimethylisoalloxazin (Lumiflavin), 7,8-Dimethylalloxazin (Lumichrom), Isoalloxazin-adenindinukleotid (Flavinadenindinukleotid [FAD]), Alloxazin-mononukleotid (auch bekannt als Flavinmononukleotid [FMN] und Riboflavin-5-Phosphat) und ihre Metabolite und Vorläufer. Der Begriff „Alloxazin" schließt Isoalloxazine ein. Endogenbasierte Photosensibilisatorderivate schließen synthetisch gewonnene Analoga und Homologa endogener Photosensibilisatoren ein, die niedrige (1 bis 5) Alkyl- oder Halogensubstituenten der Photosensibilisatoren, von denen sie abgeleitet sind, haben können oder denen diese fehlen können und welche die Funktion und wesentliche Nicht-Toxizität davon bewahren. Wenn endogene Photosensibilisatoren verwendet werden, besonders wenn solche Photosensibilisatoren nicht an sich toxisch sind oder keine toxischen Photoprodukte nach der Lichtbestrahlung ergeben, ist nach der Dekontamination kein Entfernungs- oder Reinigungsschritt erforderlich und das behandelte Produkt kann direkt einem Patienten durch alle in der Technik bekannten Verfahren verabreicht werden. Bevorzugte endogene Photosensibilisatoren sind:
7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin
7,8-Dimethylalloxazin
7,8,10-Trimethylisoalloxazin
Isoalloxazin-adenindinukleotid
Vitamin K1
Alloxazin-mononukleotid
Vitamin K2
Vitamin-K1-Oxid
Vitamin K5
Vitamin K-S (II)
Vitamin K6
Vitamin K7
Vitamin L
Das Verfahren dieser Erfindung erfordert das Mischen des Photosensibilisators mit dem zu dekontaminierenden Material. Bei dieser besonderen Anwendung ist das bevorzugte Material oder Fluid eines, das infektiöse Partikel enthält, von welchen gewünscht wird, dass ein Vakzin hergestellt wird. Das Mischen kann getan werden, indem einfach der Photosensibilisator oder eine den Photosensibilisator enthaltende Lösung zu einem zu dekontaminierenden FLuid hinzugefügt wird. In einer Ausführung fließt das zu dekontaminierende Material, zu welchem Photosensibilisator hinzugefügt worden ist, an einer Lichtstrahlungsquelle vorbei, und der Fluss des Materials stellt allgemein ausreichend Turbulenz bereit, um den Photosensibilisator durch das zu dekontaminierende Fluid zu verteilen. Ein Mischschritt kann wahlweise hinzugefügt werden. In einer anderen Ausführung werden das Fluid und der Photosensibilisator in einen lichtdurchlässigen Behälter gegeben und chargenweise bestrahlt, vorzugsweise während der Behälter hin und her bewegt wird, um den Photosensibilisator vollständig zu verteilen und die gesamte Flüssigkeit an die Strahlung auszusetzen.
Die Menge des mit dem Fluid zu vermischenden Photosensibilisators wird eine Menge sein, die ausreichend ist, die Vermehrungsfähigkeit eines infektiösen Partikels geeignet zu inaktivieren, aber in vielen Ausführungen immer noch die angegebenen Eigenschaften zu bewahren, die notwendig sind, eine Immunreaktion in einem Säuger zu induzieren und nachfolgend Immunität zu erzeugen. Wie hierin gelehrt, können optimale Konzentrationen für gewünschte Photosensibilisatoren leicht von Fachleuten ohne übermäßige Experimentierung bestimmt werden. Vorzugsweise wird der Photosensibilisator in einer Konzentration von wenigstens ungefähr 1 μM bis zu der Löslichkeit des Photosensibilisators in dem Fluid verwendet und vorzugsweise ungefähr 10 μM. Für 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin wird ein Konzentrationsbereich zwischen ungefähr 1 μM und ungefähr 160 μM bevorzugt, vorzugsweise ungefähr 10 μM.
Das den Photosensibilisator enthaltende Fluid wird an Lichtstrahlung der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt, um den Photosensibilisator zu aktivieren, unter Verwendung einer Lichtstrahlungsmenge, die ausreichend ist, den Photosensibilisator wie oben beschrieben zu aktivieren, jedoch geringer als jene, welche Schaden an den Antigendeterminanten der infektiösen Partikel bewirken würden und das inaktivierte infektiöse Partikel unfähig machen würde, eine Immunantwort in einem Säuger zu induzieren. Die verwendete Wellenlänge wird von dem ausgewählten Photosensibilisator abhängen, wie es in der Technik bekannt ist oder leicht ohne übermäßige Experimentierung nach den Lehren hiervon bestimmbar ist. Vorzugsweise ist die Lichtquelle eine fluoreszierende oder lumineszierende Quelle, die Licht von ungefähr 300 nm bis ungefähr 700 nm und bevorzugter etwa 320 nm bis etwa 447 nm Strahlung bereitstellt. Wellenlängen im ultravioletten bis sichtbaren Bereich sind bei dieser Erfindung nützlich. Die Lichtquelle oder -quellen können Licht im sichtbaren Bereich, Licht im ultravioletten Bereich bereitstellen oder können eine Mischung aus Licht in den sichtbaren und ultravioletten Bereichen sein.
Der aktivierte Photosensibilisator ist in der Lage, die anwesenden infektiösen Partikel zu inaktivieren, wie zum Beispiel durch Wechselwirkung, um ihre Vermehrung zu verhindern. Spezifität der Wirkung des Photosensibilisators wird durch die große Nähe des Photosensibilisators mit der Nukleinsäure des Partikels verliehen, und dies kann aus der Bindung des Photosensibilisators an die Nukleinsäure resultieren. „Nukleinsäure" schließt Ribonukleinsäure (RNS) und Desoxyribonukleinsäure (DNS) ein. Andere Photosensibilisatoren können durch Bindung an Zellmembranen oder durch andere Mechanismen wirken. Der Photosensibilisator kann auch auf zu inaktivierende Partikel durch kovalentes Koppeln an einen Antikörper, vorzugsweise einen spezifischen monoklonalen Antikörper für das Partikel, gerichtet werden.
Das den Photosensibilisator enthaltende Fluid kann in einen lichtdurchlässigen Behälter für die Bestrahlung eingeströmt werden. Der Begriff „Behälter" bezieht sich auf einen umschlossenen oder offenen Raum, der aus einem festen oder flexiblen Material gemacht sein kann, z. B. kann er ein Beutel oder eine Kiste oder Wanne sein. Er kann geschlossen oder offen sein am oberen Ende und kann an beiden Enden Öffnungen haben, z. B. kann er eine Röhre oder Leitung sein, um einen Durchfluss des Fluids darin zu gestatten. Es wurde eine Küvette verwendet, um eine Ausführung der Erfindung zu veranschaulichen, wobei ein Durchflusssystem involviert war. Sammelbeutel wie jene, die mit den Trima^TM- und Spectra^TM-Apharesesystemen von GambroBCT, Inc. verwendet werden, wurden verwendet, um eine andere Ausführung zu veranschaulichen, die eine chargenweise Behandlung des Fluids involviert.
Der Begriff „lichtdurchlässig" bedeutet, dass das Material des Behälters geeignet transparent für Lichtstrahlung der passenden Wellenlänge für die Aktivierung des Photosensibilisators ist. Bei dem Durchflusssystem hat der Behälter eine Tiefe (Dimension, die in die Richtung der Strahlung von der Lichtstrahlungsquelle gemessen wird), die ausreichend ist, der Lichtstrahlung zu erlauben, dass sie geeignet den Behälter durchdringt, um Photosensibilisatormoleküle in allen Abständen von der Lichtquelle zu kontaktieren und die Inaktivierung der infektiösen Partikel in dem zu dekontaminierenden Fluid sicherzustellen, und er hat eine Länge (Dimension in die Richtung des Fluidflusses), die ausreichend ist, eine ausreichende Zeit der Aussetzung des Fluids an die Lichtstrahlung sicherzustellen. Die Materialien für die Herstellung solcher Behälter, die Tiefen und Längen der Behälter können leicht von Fachleuten ohne übermäßige Experimentierung nach den Lehren hiervon bestimmt werden, und zusammen mit der Durchflussrate des Fluids durch den Behälter werden die Intensität der Lichtstrahlung und das Absorptionsvermögen der Fluidbestandteile die Zeitdauer bestimmen, die das Fluid an Lichtstrahlung ausgesetzt zu werden braucht. Für 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin beträgt eine bevorzugte Strahlungsmenge zwischen 1 J/cm² bis 120 J/cm².
In einer anderen Ausführung, die die chargenweise Behandlung involviert, wird das zu behandelnde Fluid in einen lichtdurchlässigen Behälter gegeben, der hin und her bewegt wird und an Lichtstrahlung für eine Zeit ausgesetzt wird, die ausreichend ist, die infektiösen Partikel im Wesentlichen zu inaktivieren, jedoch nicht genug, die Antigenität der Partikel zu zerstören. Der lichtdurchlässige Behälter ist vorzugsweise ein Blutbeutel, hergestellt aus transparentem oder halbtransparentem Plastik, und das hin und her bewegende Mittel ist vorzugsweise ein Schütteltisch. Der Photosensibilisator kann zu dem Behälter in einer pulverisierten oder flüssigen Form hinzugefügt werden, und der Behälter kann hin und her bewegt werden, um den Photosensibilisator mit dem Fluid zu vermischen und um das gesamte Fluid adäquat an Lichtstrahlung auszusetzen, um die Inaktivierung der Partikel sicherzustellen.
Photosensibilisator kann zu dem lichtdurchlässigen Behälter, der die zu inaktivierenden infektiösen Partikel enthält, hinzugefügt werden oder in diesen eingeleitet werden. In einer Ausführung wird der Photosensibilisator zu dem Fluid hinzugefügt, welches verwendet wird, die inaktivierten infektiösen Partikel zu suspendieren, um das Vakzin zu schaffen. In einer anderen Ausführung kann der Photosensibilisator zu den zu inaktivierenden infektiösen Partikeln und dem Suspensionsfluid oder Trägerfluid hinzugefügt werden.
Es können auch Verstärker zu dem Fluid hinzugefügt werden, um den Vorgang effizienter und selektiver zu machen. Solche Verstärker schließen Antioxidantien und andere Mittel ein, um Schaden der gewünschten Fluidbestandteile zu verhindern und um die Inaktivierungsrate der infektiösen Partikel zu verbessern, und sie sind veranschaulicht durch Adenin, Histidin, Cystein, Tyrosin, Tryptophan, Ascorbat, N-Acetyl-L-cystein, Propylgallat, Glutathion, Mercaptopropionylglycin, Dithiothreotol, Nicotinamid, BHT, BHA, Lysin, Serin, Methionin, Glucose, Mannitol, Trolox, Glycerol und Mischungen davon.
Diese Erfindung kann auch Fluide umfassen, die biologisch aktives Protein umfassen, welches verwendet werden kann, um passive Immunität in einem Patienten zu erzeugen. Passive Immunität involviert die Applikation von Antikörpern wie Immunglobulinen, die in Patienten injiziert werden können, um einen kurzzeitigen Schutz für jene Individuen bereitzustellen, die einem spezifischen Pathogen ausgesetzt sind oder es sein werden, und wird typischerweise verwendet bei immungeschwächten Patienten, die nicht in der Lage sind, eine effektive Immunantwort mit aktiver Immunisierung zu erzeugen. Fluide, die biologisch aktive Proteine enthalten und die auch endogene Photosensibilisatoren, endogen basierte Photosensibilisatorderivate oder Photoprodukte davon enthalten, können einem Patienten injiziert werden, um solch eine passive Immunität bereitzustellen. Das Fluid kann inaktivierte Mikroorganismen enthalten.
Bei dem Dekontaminationssystem dieser Erfindung kann die Lichtstrahlungsquelle mit dem lichtdurchlässigen Behälter für das Fluid mittels eines Lichtleiters wie einem Lichtkanal oder einer Faseroptikröhre verbunden sein, der Streuung des Lichtes zwischen der Quelle und dem Behälter für das Fluid verhindert und, wichtiger, das wesentliche Erhitzen des Fluids in dem Behälter verhindert. Das direkte Aussetzen an die Lichtquelle kann Temperaturen um so viel wie 10 bis 15°C erhöhen, besonders, wenn die an das Licht ausgesetzte Fluidmenge klein ist, was eine Denaturierung von Blutbestandteilen bewirken kann. Die Verwendung des Lichtleiters hält jedes Erwärmen auf weniger als ungefähr 2°C. Das Verfahren kann auch die Verwendung von Temperatursensoren und Kühlmechanismen einschließen, wo notwendig, um die Temperatur unterhalb von Temperaturen zu halten, bei welchen gewünschte Proteine in dem Fluid beschädigt werden. Vorzugsweise wird die Temperatur zwischen ungefähr 0°C und ungefähr 45°C, bevorzugter zwischen ungefähr 4°C und ungefähr 37°C und am bevorzugtesten bei ungefähr 22°C gehalten.
Die Lichtstrahlungsquelle kann eine einfache Lampe sein oder kann aus mehreren Lampen bestehen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen strahlen. Die Lichtstrahlungsquelle sollte in der Lage sein, von ungefähr 1 bis wenigstens ungefähr 120 J/cm² zu liefern. Die Verwendung von gemischtem ultraviolettem und sichtbarem Licht ist besonders bevorzugt, wenn der Photosensibilisator einer ist, der nach einer gewissen Expositionszeit seine Fähigkeit verliert, sichtbares Licht zu absorbieren, wie 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin.
Es können alle Mittel, die in der Technik bekannt sind, für das Hinzufügen des Photosensibilisators zu dem zu dekontaminierenden Fluid und um das Fluid in den lichtdurchlässigen Behälter zu geben, verwendet werden, wobei solche Mittel typischerweise Fließleitungen, Durchlässe, Sammelbehälter, Ventile und Ähnliches einschließen.
Bei endogenen Photosensibilisatoren und Derivaten mit Zuckereinheiten wird der pH-Wert der Lösung vorzugsweise niedrig genug gehalten, wie es in der Technik bekannt ist, um Ablösung der Zuckereinheit zu verhindern. Vorzugsweise wird der Photosensibilisator zu dem zu dekontaminierenden Fluid in einer vorgemischten wässrigen Lösung hinzugefügt, z. B. in Wasser, Lagerungspuffer oder Suspensionslösung.
Der lichtdurchlässige Behälter für das Durchflusssystem kann eine transparente Küvette, hergestellt aus Polycarbonat, Glas, Quarz, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyolefin oder einem anderen transparenten Material, sein. Die Küvette kann in einer Strahlenkammer von verspiegelten Wänden umgeben sein. Ein Lichtstrahlungsverstärker, wie eine zweite Lichtstrahlungsquelle oder reflektierende Oberfläche, kann benachbart der Küvette angeordnet sein, um die Menge der das Fluid in der Küvette kontaktierenden Lichtstrahlung zu steigern. Das System schließt vorzugsweise eine Pumpe ein, um die Durchflussrate des Fluids auf gewünschte Maße anzupassen, um eine beträchtliche Dekontaminierung zu sichern, wie oben beschrieben. Die Küvette hat eine Länge, die abgestimmt ist mit der Durchflussrate durch sie hindurch, die ausreichend ist, das Fluid darin einer ausreichenden Lichtstrahlung auszusetzen, um eine beträchtliche Dekontamination davon zu bewirken.
Auch wird die Küvette bevorzugt von der Lichtquelle mit einer ausreichenden Distanz beabstandet, so dass Erhitzen des Fluids in der Küvette nicht geschieht, und Licht wird aus der Lichtquelle zu der Küvette mit Hilfe eines Lichtleiters übertragen.
Die oben beschriebenen Dekontaminationssysteme können als freistehende Einheiten gestaltet sein oder können leicht in bestehende Apparaturen eingebaut sein, die in der Technik für die Inaktivierung infektiöser Partikel bekannt sind, um Vakzine herzustellen.
Die Verwendung endogener Photosensibilisatoren und endogen basierter Photosensibilisatorderivate, um infektiöse Partikel in Vakzinen zu inaktivieren, wie hierin offenbart, ist beschrieben mit Bezugnahme auf die Inaktivierung von Mikroorganismen in Blut, abgesonderten Blutbestandteilen und anderen zellulären Bestandteilen.
Lösungen für Suspensionen der inaktivierten infektiösen Partikel, umfassend endogene Photosensibilisatoren und endogen basierte Photosensibilisatorderivate, wie oben beschrieben, werden hierin auch bereitgestellt. Solche Suspensions- oder Additivlösungen können physiologische Salzlösung, Wasser, Antibiotika, Konservierungsmittel, Stabilisatoren und Adjuvanzien enthalten. Der pH-Wert solcher Lösungen liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 7,0 und 7,4. Diese Lösungen sind nützlich als Träger für inaktivierte infektiöse Partikel, um die Aufrechterhaltung von Qualität und Lebensfähigkeit der inaktivierten infektiösen Partikel während der Lagerung zu erlauben. Der Photosensibilisator kann in solchen Lösungen in jeder gewünschten Konzentration von ungefähr 1 μM bis zur Löslichkeit des Photosensibilisators in der Lösung und vorzugsweise zwischen ungefähr 10 μM und ungefähr 100 μM, bevorzugter ungefähr 10 μM, vorhanden sein. In einer bevorzugten Ausführung umfasst die Suspensionslösung auch Verstärker, wie oben beschrieben.

Die vorliegende Erfindung ist geeignet für die Herstellung von Vakzinen für eine große Varietät von Viren, einschließlich Menschenviren und Tierviren wie Hunde-, Katzen-, Rinder-, Schweine-, Pferde- und Schafviren. Das Verfahren ist geeignet für die Inaktivierung von Viren mit doppelsträngiger DNS, Viren mit einzelsträngiger DNS, Viren mit doppelsträngiger RNS und Viren mit einzelsträngiger RNS, einschließend sowohl umhüllte als auch nicht umhüllte Viren. Die folgende Liste enthält einige repräsentative Viren, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung inaktiviert werden können.

Viren, die inaktiviert werden können	Repräsentative Viren

dsDNS
Adenoviren	Adenovirus, Hunde-Adenovirus 2
Herpesviren	Herpes-simplex-Viren, Katzen-Herpes I
Papovaviren	Polyoma, Papilloma, Pockenviren, Vaccinia

ssDNS
Parvovirus	Hunde-Parvovirus, Katzenpanleukopenie

dsRNS
Orbiviren	Blauzungenvirus
Reoviren	Reovirus

ssRNS
Calicivirus	Katzen-Calicivirus
Coronavirus	Infektiöse Katzenperitonitis
Myxovirus	Influenzavirus
Paramyxovirus	Masernvirus, Mumpsvirus, Newcastle-Disease-Virus, Canine Distemper Virus (Hundestaupe), Hunde-Parainfluenza-2-Virus
Picornavirus	Poliovirus, Maul- und Klauenseuchevirus
Retrovirus	Katzenleukämievirus, menschliches T-Zell-Lymphomvirus, Typen I, II und III
Rhabdovirus	Vesikuläres Stomatitisvirus, Rabies
Togavirus	Gelbfiebervirus, Sindbisvirus, Encephalitisvirus

Von besonderem Interesse sind jene Viren, für welche übliche Vakzinansätze nicht erfolgreich oder nur kaum erfolgreich waren. Bei solchen Viren resultieren Inaktivierungsvorgänge, die ausreichend hart sind, Totalverlust an Infektiosität sicherzustellen, oftmals in einer teilweisen oder vollständigen Zerstörung der antigenen Eigenschaften des Virus. Mit solch einem Verlust antigener Eigenschaften sind die Viren nicht in der Lage, eine schützende Immunität auszulösen, wenn sie einem empfänglichen Wirt verabreicht werden. Während es möglich wäre, weniger harte Inaktivierungsbedingungen zu nutzen, um die antigene Integrität des Virus zu bewahren, ist dieser Ansatz nicht wünschenswert, da es in einer unvollständigen Inaktivierung des Virus resultieren kann und die mögliche Infektionsgefahr des Empfängers durch das unvollständig inaktivierte Virus erhöht wird.
Die Verfahren dieser Erfindung können auch verwendet werden, um Vakzine aus Bakterien oder Teilen von Bakterien zu erzeugen. Gewisse Bakterien, welche verwendet werden können, um Vakzine zu erzeugen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Diphtherie, Tetanus, Pertussis, Haemophilus influenzae B, Pneumococcus, Vibrio cholerae, Salmonella typhi und Neisseria meningiditis.
Vakzine können gemacht werden, um unter Verwendung der Verfahren dieser Erfindung von Insekten übertragene Erkrankungen zu behandeln, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf Typhus, Malaria, Denguefieber, Gelbfieber, Chagus babesin [Anmerkung des Übersetzers: gemeint ist wohl Chagas-Krankheit], Rickettsien und West-Nil-Virus.
Vakzine und Verfahren, um Vakzine aus inaktivierten Krebszellen zu erzeugen, werden auch durch diese Erfindung ins Auge gefasst. Zum Beispiel können Vakzine aus autologen Tumorzellen gemacht werden, um eine Langzeit-Antitumorimmunantwort auszulösen, bekannt als aktive spezifische Immuntherapie. Ein Tumor kann chirurgisch aus einem Patienten entfernt werden und die Tumorzellen können unter Verwendung jedes in der Technik bekannten Verfahrens gereinigt werden. Ein solches Verfahren, um autologe Tumorvakzine zuzubereiten, das bei dieser Erfindung verwendet werden kann, ist beschrieben in Hanna et al. (Hanna M G Jr., Brandhorst J S, Peters L C, Specific immunotherapy of established visceral micrometastases by BCG-tumour cell vaccine alone or as an adjunct to surgery. Cancer 1978; 42: 2613-25) und Peters et al. (Peters L C, Brandhorst J S, Hanna M G Jr., Preperation of immunotherapeutic autologous vaccines form solid tumors. Cancer Respondents 1979; 39: 1353-60), welche beide hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit bis zu dem Maß, in welchem es hiermit nicht inkonsistent ist, eingeschlossen wird. Die gereinigten Tumorzellen können dann mit einer Menge an endogenem Photosensibilisator und Licht behandelt werden, ausreichend, um die Nukleinsäure der Tumorzellen vom Vermehren abzuhalten, jedoch nicht genug, um die Antigendeterminanten auf der Oberfläche der Tumorzellen zu beschädigen. Wenn die Tumorzellen erst einmal inaktiviert worden sind, können sie sofort in den Patienten zurück injiziert werden oder können für die zukünftige Verwendung eingefroren werden.
Ein Verfahren, welches verwendet werden kann, um ein Vakzin für die Verhinderung der Vermehrung von lebenden Tumorzellen in einem Säuger zu machen, schließt die Entfernung eines Tumors aus einem Säuger mit einem Tumor ein, Aufreinigen von wenigstens einigen der Tumorzellen aus dem Tumor, Inaktivieren der Tumorzellen durch Aussetzen der Tumorzellen an einen endogenen Photosensibilisator und Licht bei einer Wellenlänge, die ausreichend ist, die Vermehrung der Tumorzellen zu verhindern aber nicht wesentlich die Antigendeterminanten der Tumorzellen zu zerstören, und Suspendieren der inaktivierten Tumorzellen in einer Suspensionslösung. Der Photosensibilisator kann Riboflavin, Lumiflavin, Lumichrom, Naphthochinone, Naphthene und Naphthaline einschließen, aber jeder Photosensibilisator, der die Vermehrung der Tumorzellen verhindert, aber nicht wesentlich die Antigendeterminanten der Zellen zerstört, kann verwendet werden. Die Suspensionslösung kann jede in der Technik bekannte Lösung sein.
Um infektiöse Partikel in einem Vakzin zu inaktivieren, kann ein Photosensibilisator zu den infektiösen Partikeln hinzugefügt werden und an Licht einer geeigneten Welle ausgesetzt werden, um die infektiösen Partikel zu inaktivieren, während die Antigeneigenschaften der Partikel vor der Suspension in einem sterilen, physiologisch annehmbaren Medium bewahrt werden. Alternativ kann ein Photosensibilisator nach der Zugabe des Mediums hinzugefügt werden. Die infektiösen Partikel werden nach der Zugabe des Photosensibilisators bestrahlt.
Die inaktivierten infektiösen Partikel können in einer Reihe von Wegen für die Verwendung als ein Vakzin formuliert werden. Die Konzentration der infektiösen Partikel in dem Vakzin wird in einer Menge sein, die ausreichend ist, die Produktion von Antikörpern durch den Körper zu induzieren, um eine Langzeitimmunität bereitzustellen, wie es Fachleuten bekannt ist. Das Vakzin kann Zellen einschließen oder kann zellfrei sein. Das Vakzin kann auch Teile infektiöser Partikel enthalten. Die inaktivierten infektiösen Partikel können in einem inerten, physiologisch annehmbaren Medium, wie ionisiertes Wasser, phosphatgepufferte Salzlösung, Salzlösung oder Ähnliches, resuspendiert werden oder können in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren immunologischen Adjuvanz verabreicht werden, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf Mineralöle, Pflanzenöle, Mineralsalze wie Aluminium und Immunverstärker wie Muramyldipeptid. Ein Stabilisator kann auch hinzugefügt werden, um dem Vakzin dabei zu helfen, seine Wirksamkeit während der Lagerung zu bewahren. Das Vakzin kann subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, oral oder nasal verabreicht werden. Gewöhnlich wird eine spezifische Gesamtdosierung an einer spezifischen Stelle sich von ungefähr 0,1 ml bis 4 ml erstrecken, wobei sich die Gesamtdosis von ungefähr 0,5 ml bis 8 ml bewegen wird. Die Anzahl an Injektionen und ihre zeitliche Beabstandung können hochvariabel sein und werden von der Wirksamkeit des Vakzins abhängen und wie gut das Immunsystem des Empfängers auf das Vakzin anspricht.
Es sollte bemerkt werden, dass alle kontaminierenden Mikroorganismen in einem bereits existierenden, durch jedes bekannte Verfahren hergestellten Vakzin inaktiviert werden können, wie durch die Verfahren dieser Erfindung gelehrt.
Die folgenden Beispiele werden im Wege der Erläuterung angeboten, nicht im Wege der Beschränkung. Die unten stehenden Beispiele zeigen, dass mit Pathogenen kontaminierte Blutzellen, welche mit den Verfahren dieser Erfindung behandelt worden sind, ihre biologische Aktivität bewahren, während die Pathogenmenge wesentlich reduziert wird. Nach der Behandlung mit Photosensibilisator und Licht bewahren die als ein Vakzin zu verwendenden infektiösen Partikel ihre Antigenität, sind aber nicht in der Lage, sich zu vermehren.
Das Dekontaminationsverfahren dieser Erfindung, unter Verwendung von endogenen Photosensibilisatoren und endogen basierten Photosensibilisatorderivaten, wird hierin veranschaulicht unter Verwendung von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin als Photosensibilisator, es kann jedoch jeder Alloxazin-Photosensibilisator verwendet werden, der in der Lage ist, durch Lichtbestrahlung aktiviert zu werden, um Inaktivierung von infektiösen Partikel zu bewirken. Der Photosensibilisator muss einer sein, der gewünschte Bestandteile des dekontaminiert werdenden Fluids nicht zerstört, und auch bevorzugt einer, der sich als ein Ergebnis der Lichtbestrahlung nicht in Produkte zerlegt, die signifikant gewünschte Bestandteile zerstören oder eine signifikante Toxizität haben. Die Wellenlänge, bei welcher der Photosensibilisator aktiviert wird, wird, wie hierin beschrieben, bestimmt unter Verwendung von Literaturquellen oder durch direkte Messung. Seine Löslichkeit in dem zu dekontaminierenden Fluid oder in einer Kombination von Trägerfluid und dem zu kontaminierenden Fluid wird ebenfalls so bestimmt. Die Fähigkeit zur Lichtbestrahlung bei der aktivierenden Wellenlänge, um das zu dekontaminierende Fluid zu durchdringen, muss ebenfalls, wie hierin gelehrt, bestimmt werden. Geeignete Temperaturen für die Reaktion des Photosensibilisators mit seinem Substrat werden bestimmt, ebenso wie die Temperaturbereiche, Lichtstrahlungsintensität und -dauer und Photosensibilisatorkonzentration, was die Mikrobeninaktivierung optimieren und Schädigung erwünschter Proteine und/oder zellulärer Bestandteile in dem Fluid minimieren wird. Die Beispiele 1 bis 7 und die 1 bis 5 erläutern die Bestimmung der Information, die erforderlich ist, ein Durchflussdekontaminationssystem dieser Erfindung zu entwickeln.
Wenn erst einmal solche Systemerfordernisse für Durchflusssysteme bestimmt worden sind, können Geräte gestaltet werden, welche die richtigen Durchflussraten, Photopermeabilitäten und Lichtintensitäten bereitstellen, um Inaktivierung von in dem Fluid vorhandenen Mikroorganismen zu bewirken, wie es hierin gelehrt wird. Das zu dekontaminierende Fluid wird mit Photosensibilisator gemischt und dann mit einer ausreichenden Menge an Lichtstrahlung bestrahlt, um den Photosensibilisator zu aktivieren, um mit Mikroorganismen in dem Fluid zu reagieren, so dass Mikroorganismen in dem Fluid inaktiviert werden. Die Mikroorganismen in dem Fluid erreichende Lichtstrahlung wird kontrolliert durch Auswählen einer geeigneten Lichtstrahlungsquelle, einer passenden Distanz der Lichtstrahlungsquelle von dem zu dekontaminierenden Fluid, welche durch die Verwendung von Lichtleitern erhöht werden kann, um die Lichtstrahlung direkt in den Behälter für das Fluid zu tragen, einem geeigneten lichtdurchlässigen Material für den Behälter des Fluids, einer geeigneten Tiefe, um eine vollständige Penetration der Lichtstrahlung in den Behälter zu erlauben, Lichtstrahlungsverstärker wie eine oder mehrere zusätzliche Lichtstrahlungsquellen, vorzugsweise auf der der ersten Seite gegenüberliegenden Seite des Behälters, oder Reflektoren, um Licht von der Strahlungsquelle zurück in den Behälter zu reflektieren, geeignete Flussraten für das Fluid in den Behälter und eine geeignete Behälterlänge, um eine ausreichende Zeit für die Inaktivierung von vorhandenen Mikroorganismen zu erlauben. Temperaturüberwachungen und -steuerungen können auch erforderlich sein, um das Fluid bei optimalen Temperaturen zu halten. 6 bildet ein Dekontaminationssystem dieser Erfindung als Teil eines Gerätes für die Abtrennung von Blutbestandteilen ab und 7 stellt Details eines bevorzugten Dekontaminationssystems bereit.
Für Batch-Systeme wird bevorzugt, das zu dekontaminierende Fluid gemeinsam mit dem Photosensibilisator in Beutel zu geben, die lichtdurchlässig sind oder zumindest ausreichend lichtdurchlässig sind, um einer ausreichenden Bestrahlung zu erlauben, ihre Bestandteile zu erreichen, um den Photosensibilisator zu aktivieren. Ausreichend Photosensibilisator wird zu jeden Beutel hinzugefügt, um Inaktivierung bereitzustellen, vorzugsweise, um eine Photosensibilisatorkonzentration von wenigstens ungefähr 10 μM bereitzustellen, und der Beutel wird während der Bestrahlung hin und her bewegt, vorzugsweise bei ungefähr 1 bis ungefähr 120 J/cm² für einen Zeitraum von zwischen ungefähr 6 und ungefähr 36 Minuten, um Aussetzen von im Wesentlichen dem gesamten Fluid an Bestrahlung sicherzustellen. Vorzugsweise wird eine Kombination aus sichtbarem Licht und Ultraviolettlicht gleichzeitig verwendet. Der Photosensibilisator kann in pulverisierter Form hinzugefügt werden.
Das Verfahren verwendet bevorzugt endogene Alloxazin-Photosensibilisatoren, welche durch Wechselwirkung mit Nukleinsäurereplikation wirken. 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin ist der für die Verwendung bei dieser Erfindung bevorzugte Photosensibilisator. Man nimmt an, dass die Chemie, die zwischen 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin und Nukleinsäuren geschieht, nicht über einen von Singulett-Sauerstoff abhängigen Prozess (d. h. Typ-II-Mechanismus) fortschreitet, sondern eher durch direkte Wechselwirkungen zwischen Sensibilisator und Substrat (Typ-I-Mechanismen). Cadet et al., (1983) J. Chem. 23: 420-429, zeigen deutlich, dass die Wirkungen von 7,8-Dimethyl- 10-ribitylisoalloxazin an Nicht-Singulett-Sauerstoffoxidation von Guanosinresten liegen. Zusätzlich scheinen Adenosinbasen auf die Wirkungen von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin plus UV-Licht empfindlich zu sein. Dies ist wichtig, da Adenosinreste verhältnismäßig unempfindlich sind für von Singulett-Sauerstoff abhängige Prozesse. 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin scheint keine großen Mengen an Singulett-Sauerstoff nach Aussetzen an UV-Licht zu produzieren, sondern übt seine Wirkungen eher durch direkte Wechselwirkungen mit Substrat (z. B. Nukleinsäuren) durch Elektronenübertragungsreaktionen mit Sensibilisatorarten im angeregten Zustand aus. Da eine nicht unterscheidende Schädigung an Zellen und Proteinen hauptsächlich aus Singulett-Sauerstoffquellen stammt, erlaubt dieser mechanistische Weg für die Wirkung von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin eine größere Selektivität bei seiner Wirkung, als es der Fall ist mit Verbindungen wie die Psoralene, welche eine signifikante Typ-II-Chemie besitzen.
7 bildet eine freistehende Version der Dekontaminierungsanordnung dieser Erfindung ab. Das zu inaktivierende infektiöse Partikel enthaltende Vakzinprodukt (auf das nachfolgend Bezug genommen wird als das Produkt) 180 ist mit der Produktleitung 186 verbunden, welche durch die Pumpe 184 zu der Dekontaminationsküvette 164 führt. Der Photosensibilisatorspeicher 166 ist mit der Photosensibilisatoreinlassleitung 168, ausgerüstet mit einer Einlasspumpe 170, verbunden und führt in die Produktleitung 168 stromaufwärts der Dekontaminationsküvette 164. Die Dekontaminationsküvette 164 ist eine lichtdurchlässige Küvette mit einer Tiefe (d) und einer Länge (l), die so ausgewählt sind, dass die Dekontamination sichergestellt ist. Ein Kühlsystem 190, kombiniert mit einer Temperaturüberwachung 192, wird mit der Dekontaminationsküvette 164 verbunden, um die Temperatur des Fluids zu kontrollieren. Die Dekontaminationsküvette 164 ist über den Lichtleiter 162 mit der Lichtstrahlungsquelle 160 verbunden. Ein Lichtstrahlungsverstärker 163 ist benachbart zu (entweder berührend oder davon beabstandet) der Dekontaminationsküvette 164 angeordnet, um die Menge der Lichtstrahlung zu steigern, die das Blutprodukt in der Küvette erreicht. Die dekontaminierte Produktleitung 188 führt von der Dekontaminationsküvette 164 zur dekontaminierten Produktsammlung 182.
Im Betrieb wird das Produkt 180 in die Produktleitung 186 geführt, wo es auf Photosensibilisator aus dem Photosensibilisatorreservoir 166 trifft, das mit einer Rate fließt, die von der Photosensibilisatoreinlasspumpe 170 in die Photosensibilisatoreinlassleitung 68, die sich mit der Produktleitung 186 vereinigt, kontrolliert wird. Die Flussrate in der Produktleitung 186 wird durch die Pumpe 184 mit einer Rate kontrolliert, die ausgewählt ist, um die Dekontamination in der Dekontaminationsküvette 164 sicherzustellen. Die Temperaturüberwachung 192 misst die Temperatur des Fluids in der Küvette 164 und kontrolliert das Kühlsystem 190, welches die Temperatur in der Küvette innerhalb einem für einen optimalen Betrieb erforderlichen Bereich hält. Das Produkt in der Dekontaminationsküvette 164 wird durch Lichtstrahlung von der Lichtstrahlungsquelle 160, die im Lichtleiter 162 geführt wird, bestrahlt. Die Lichtstrahlungsquelle kann zwei oder mehr tatsächliche Lichtquellen umfassen. Die Pfeile zeigen Lichtstrahlung von dem Ende des Lichtleiters 162, die sich in dem Produkt innerhalb der transparenten Dekontaminationsküvette 164 fortpflanzt. Benachbart zu der Dekontaminationsküvette 164 befindet sich ein Lichtstrahlungsverstärker 163, der eine zusätzliche Lichtstrahlungsquelle oder eine reflektierende Oberfläche sein kann. Die Pfeile vom Lichtstrahlungsverstärker 163, die in Richtung zur Dekontaminationsküvette 164 zeigen, zeigen Lichtstrahlung aus dem Lichtstrahlungsverstärker 163, die auf das Produktmaterial in der Küvette 164 scheint. Dekontaminierendes Produkt verlässt die Dekontaminationsküvette 164 über die dekontaminierte Produktleitung 188 und ist bei der dekontaminierten Produktsammlung 182 vereinigt.
In einer Ausführung unter Verwendung von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin von Sigma Chemical Company als der Photosensibilisator wird ein Lichtleiter der EFOS Corporation, Williamsville, NY, zusammengesetzt aus optischen Fasern, verwendet. Das System ist in der Lage, einen gebündelten Lichtstrahl mit einer Intensität von 6.200 mW/cm² in dem Bereich von 355 bis 380 nm zu liefern. Es ist auch möglich, austauschbare Filter mit dem System zu verwenden, um Ausgangsleistungen von 4.700 mW/cm² in der Spektralregion von 400 bis 500 nm zu erreichen. In beiden Fällen ist der Lichtausstoß in der Region von 320 nm und niedriger vernachlässigbar. Lichtleiter variierender Dimensionen (3, 5 und 8 mm) sind mit diesem System erhältlich. Das Licht verlässt die Lichtleiterspitze mit einer Ausbreitung von 21 Grad. Der 8 mm-Lichtleiter ist geeignet, korrekt platziert, die Fläche der bevorzugten Dekontaminationsküvette, welche eine Standardküvette ist, die auf Cobe Spectra⁷-Wegwerfsätzen von Industrial Plastics, Inc., Forest Grove, OR, verwendet werden, zu beleuchten.
Die Durchflussrate ist variabel und wird durch die Menge an Lichtenergie bestimmt, von der beabsichtigt ist, dass sie der Probe zugeführt wird. Die Durchflussrate wird mittels einer Rollkolbenpumpe der Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL, kontrolliert. Durchflussraten und Art des Einlassstromes können über einen Computerprozessor kontrolliert werden, wie es in der Technik bekannt ist.
22 bildet eine Ausführung dieser Erfindung ab, in welcher zu dekontaminierendes Fluid in einen Beutel 284 gegeben wird, der mit einer Einlassöffnung 282 ausgestattet ist, durch welche Photosensibilisator in Pulverform 284 von einem Kolben 286 über die Ausgussschnauze 288 hinzugefügt wird. Der Schütteltisch 280 wird aktiviert, um den Beutel 284 hin und her zu bewegen, um den Photosensibilisator 290 zu lösen, während die Lichtstrahlungsquelle 260 aktiviert wird, um das Fluid und den Photosensibilisator im Beutel 284 zu bestrahlen. Alternativ kann der Beutel vorgepackt bereitgestellt werden, damit er Photosensibilisator enthält, und das Fluid wird danach zu dem Beutel hinzugefügt.
Die Verfahren dieser Erfindung erfordern nicht die Verwendung von Verstärkern, wie Quencher oder Sauerstofffänger, diese können jedoch verwendet werden, um den Prozess durch Reduzieren des Ausmaßes von unspezifischer Zellchemie oder Proteinschädigungschemie oder durch Verstärken der Rate der Pathogeninaktivierung zu steigern. Weiter erfordern bevorzugte Verfahren unter Verwendung von nicht-toxischen endogenen Photosensibilisatoren und endogen basierten Photosensibilisatorderivaten nicht das Entfernen von Photosensibilisator aus dem Fluid nach der Lichtbestrahlung. Testergebnisse zeigen eine geringe oder gar keine Schädigung anderer Blutbestandteile, z. B. bleiben Blutplättchen fünf Tage nach der Behandlung biologisch aktiv.
BEISPIELE
Beispiel 1
Extinktionsprofil von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin
Eine Probe aus 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin (98% Reinheit) wurde von Sigma Chemical Company erhalten. Eine Portion dieser Probe wurde für die Analyse unter Verwendung eines UV-Abtastspektrophotometers übermittelt. Der untersuchte Bereich deckte die Region von 200 bis 900 nm ab. Für die Analyse wurde die Probe in destilliertem Wasser gelöst. Ein Probenspektrum aus dieser Analyse ist in 1 gezeigt.
Die Ergebnisse standen in Übereinstimmung mit jenen, die in der Literatur für die Absorptionsmaxima und Extinktionskoeffizienten für 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin berichtet worden sind.

Literaturwert λmax (ε) Gemessen λmax (ε)

267 (32.359) 222 (30.965)

265 (33.159)

373 (10.471) 373 (10.568)

447 (12.303) 445 (12.466)
Geeignete Wellenlängen für die Bestrahlung sind 373 und 445 nm. Die bei diesen Extinktionsmaxima beobachteten Extinktionskoeffizienten sind ausreichend, um eine adäquate Aktivierung des Sensibilisators in Lösung sicherzustellen.
Beispiel 2
Löslichkeit von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin
Löslichkeit in Isolyte-S-Medium, pH 7,4
Die maximale Löslichkeit von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin in Isolyte-S-Medium wurde wie folgt bestimmt:
7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin wurde mit Isolyte S solange vermischt, bis ein Präzipitat gebildet worden ist. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde hin und her bewegt und unter Verwirbelung vermischt, um eine vollständige Lösung des suspendierten Materials sicherzustellen. Zusätzliches 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin wurde hinzugefügt, bis trotz zusätzlicher Wirbelmischung eine feste Suspension verblieb. Diese Suspension wurde dann zentrifugiert, um ungelöstes Material zu entfernen. Der Überstand aus dieser Zubereitung wurde entfernt und analysiert unter Verwendung eines Spektrophotometers. Die Extinktionswerte der Lösung wurden bei 447 nm und 373 nm bestimmt. Aus den Extinktionskoeffizienten, die kürzlich bestimmt worden sind, war es möglich, die Konzentration der gesättigten Lösung zu bestimmen:
Konzentration (373) = 110 μM = 42 μg/ml
Konzentration (447) = 109 μM = 40,9 μg/ml
Löslichkeit in ACD-A-Antikoagulanz
Dasselbe oben beschriebene Vorgehen wurde wiederholt unter Verwendung von ACD-A-Antikoagulanz. Die aus diesen Messungen erhaltenen Werte waren wie folgt:
Konzentration (373) = 166 μM = 63 μg/ml
Konzentration (447) = 160 μM = 60,3 μg/ml
Die aus diesen Studien gewonnen Werte zeigen eine obere Löslichkeitsgrenze der Verbindung, welche erwartet werden kann.
Beispiel 3
Photolytische Zerstörung von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin in wässrigem Medium
Eine Lösung aus 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin in Sigma-ACD-A wurde mit einer Konzentration von 63 μg/ml zubereitet. Diese Zubereitung wurde in eine Glaspipette gegeben und in den Strahlengang einer UV-Lichtquelle gegeben (λmax: 365 nm, mit Filtern, um Licht unter 320 nm zu entfernen). Die Suspension wurde für spezifische Intervalle bestrahlt, zu welchen Aliquoten für die spektroskopische Analyse entfernt worden sind. Die Extinktion des gelösten 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazins wurde bei 373 und 447 nm zu jedem Zeitintervall überwacht. Die Ergebnisse sind in 3 und Tabelle 1 abgebildet. Tabelle 1: Photolytische Zerstörung von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin nach Aussetzen an UV-Licht (365 nm) in sauerer Lösung
Das Absorptionsprofil für die Lösung bei 373 nm zeigt, dass kein signifikanter Abbau des Reagenz über die gesamte Bestrahlungsdauer geschah. Die Extinktion von Licht bei dieser Wellenlänge entspricht π-π*-Elektronenübergängen. Das Fehlen einer Abnahme in der Intensität dieses Peaks über die Zeit zeigt, dass die Ringstruktur des Moleküls trotz verlängerter Bestrahlung unter diesen Bedingungen intakt ist. Die Extinktion des Moleküls bei 447 nm liegt an π-π*-Elektronenzustandsübergängen. Die Abnahme in der Extinktion des Moleküls bei dieser Wellenlänge mit steigenden Bestrahlungszeiten ist für feine Änderungen in der Resonanzstruktur des Moleküls anzeigend. Diese Änderung liegt am wahrscheinlichsten an dem Verlust von Ribose aus der Ringstruktur des 7,8-Dimethylisoalloxazin-Gerüstes und der Bildung von 7,8-Dimethylribitylisoalloxazin als ein Ergebnis. Diese Änderungen stehen in Übereinstimmung mit Literaturberichten über das Verhalten des Moleküls nach Bestrahlung mit UV-Licht.
Das ersichtliche Fehlen von Abbau der Ringstruktur des Moleküls steht in starkem Gegensatz zu Beobachtungen mit auf Psoralen basierten Verbindungen unter ähnlichen Bedingungen. Während Bestrahlung wurde eine signifikante Fluoreszenz des Moleküls in Lösung beobachtet. Dieses Verhalten des Moleküls steht in Übereinstimmung mit Resonanzeigenschaften der Ringstruktur und stellt ein Mittel für Zerstreuung von Energie in dem Molekül im angeregten Zustand in einer nicht destruktiven Weise bereit.
Beispiel 4
Beurteilung des Durchflusssystemkonzeptes
Lichtdurchlässigkeitseigenschaften einer existierenden Spectra-Küvette
Die existierende Spectra-Küvette besteht aus Polycarbonat. Die Lichtdurchlässigkeitseigenschaften dieser Küvette wurden bei 373 und 447 nm gemessen, indem die Küvette in den Strahlengang eines UV-Spektrophotometers gegeben wurde. Die gewonnenen Werte waren wie folgt:

Wellenlänge des Lichts Durchlässigkeit in%

373 nm 66%

447 nm 80%
Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit jenen, die in der Literatur für Polycarbonatplastik berichtet worden sind (siehe 4). Die Literaturwerte zeigen eine steile Schulter für den Durchgang von Licht durch Polycarbonate in dem Bereich von 300 nm. Für den Bereich über 350 nm sind die Lichtdurchlässigkeitseigenschaften für diese Anwendung geeignet.
Als eine Funktion von Durchflussraten berechnete Lichtfluxerfordernisse
Damit ein Durchflusssystem machbar ist, muss die Probe mit einem adäquaten Lichtflux während ihrer Anwesenheit in dem Strahlengang versorgt werden. Falls die vorgeschlagene Spectra-Küvette für diesen Zweck dienlich sein sollte, dann ist es möglich, die Lichtfluxerfordernisse als eine Funktion von Durchflussraten durch die Küvette wie folgt abzuschätzen:
Das in der Bestrahlungszone der Küvette vorhandene Lösungsvolumen ist ca. 0,375 ml. Die Durchgangszeit für eine Zelle in dieser Region der Küvette kann bestimmt werden aus der folgenden Gleichung:
Bei 100 ml pro Minute wäre die Durchgangszeit (T) 0,00375 Min. = 0,225 Sekunden.
Die Energie, an welche eine Probe ausgesetzt wird, hängt von dem Flux gemäß der folgenden Gleichung ab:
Falls wir annehmen, dass 1 Joule/cm² erforderlich ist, den Sensibilisator geeignet zu aktivieren, und dass die Durchgangszeit (T) 0,22 Sekunden ist (d. h. Durchflussrate von 100 ml/min durch die Küvette), dann ist der erforderliche Flux während dem Durchgang der Probe = s durch die Küvette 4.545 mW/cm². Eine Grafik, die die Beziehung des erforderlichen Fluxes von der Lichtquelle zu Durchflussraten durch die Küvette abbildet, ist in 5 bereitgestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass, damit ein Durchflusssystem sauber arbeitet, UV-Quellen mit Ausgangsleistungen in der Region von Watt/cm² erforderlich sind.
2 zeigt, wie die Extinktion mit den Blutplättchenkonzentrationen variieren sollte.
Beispiel 6
Wirkung der Virusinaktivierungsbehandlung auf In-vitro-Parameter von Blutplättchen
Es wurden die Wirkungen der Virusinaktivierungsbehandlung auf Blutplättchen-in-vitro-Parameter beurteilt. Blutplättchenzubereitungen wurden mit 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin in Kombination mit UV-Licht behandelt. Zahlreiche In-vitro-Parameter wurden als Kontrollparameter der Blutplättchenfunktion verwendet, um das Ausmaß an durch die Behandlungsbedingungen induzierten Änderungen zu bestimmen. Faktoren wie Energieniveau der UV-Licht-Exposition, Dosis des verwendeten 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazins und Probenverarbeitungsbedingungen wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Blutplättchenqualität nach der Behandlung untersucht. Ergebnisse aus dieser Studie werden verwendet, um ein geeignetes Behandlungsfenster für die Inaktivierung von HIV-I zu etablieren, ohne die Blutplättchenfunktion zu beeinträchtigen.
Proben wurden mit drei verschiedenen Konzentrationen von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin zubereitet. Aus einer Standard-Spectra-LRS-Sammlung erhaltene Blutplättchen wurden für diese Studien verwendet.
Ausgangsproben wurden zentrifugiert, um das Blutplättchenpellet zu konzentrieren. Das Pellet wurde in einer 70:30-Lösung (Isolyte S, pH 7,4; McGaw, Inc., Medien:Plasma) resuspendiert. 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin mit der spezifizierten Konzentration war in der Plasma-/Medienmischung vorhanden. Die Blutplättchensuspension wurde dann durch eine UV-Bestrahlungskammer bei einer von drei spezifizierten Durchflussraten geführt. Die Durchflussraten wurden direkt mit dem Energieniveau der Exposition in Beziehung gesetzt für die Mischung aus Zellen und Medien, welche durch die Bestrahlungskammer geführt wurde. Nachdem sie durch die Bestrahlungskammer geflossen sind, wurden Proben in einem Citrat-Plastikprobenbeutel für die nachfolgende Analyse gelagert.
Nach der Bestrahlung wurden In-vitro-Messungen der Blutplättchenfunktion, einschließlich hypotoner Schockantwort (HSR), GMP-140-Expression, pH, pCO₂, pO₂, Blutplättchenwirbel und Zellzahl beurteilt, um die Wirkungen des Behandlungsprotokolls auf die Zellqualität zu bestimmen.
Die Blutplättchenqualität wurde als eine Funktion der Bestrahlungsbedingungen (Sensibilisatorkonzentration und Durchflussraten/Energieniveaus) überwacht. Die Blutplättchenqualität schloss Parameter wie HSR-Antwort, GMP-140-Aktivierung etc. ein.
Die untersuchten Durchflussraten können mit der Expositionsenergie wie folgt in Beziehung gesetzt werden:

F_r = Durchflussrate (ml/min)
0,375 ml = Küvettenvolumen (ml)

Die Wirkung der Energie der UV-Exposition und -Konzentration von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin auf die Stabilität und Lebensfähigkeit behandelter Blutplättchen wurde beurteilt. Es wurden drei Energieniveaus und drei Konzentrationsniveaus wie folgt beurteilt:
Energieniveaus: 1, 5, 9 J/cm²
7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin-Konzentrationen: 1, 50 100 μM Tabelle 4: Energieexpositionsniveau als eine Funktion der Durchflussrate durch die Bestrahlungskammer

Flux = 3640 mW/cm²; Kammervolumen = 0,117 ml.

Die Werte von behandelten Proben wurden mit Kontrollgruppen verglichen. Die Kontrollproben schlossen die Folgenden ein:
Unbehandelte Probe in Plasma (historische Kontrolle)
+Durchfluss-UV-7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin
Vorgehensweise
Ein normales Donor-Blutplättchen-Apharese-Produkt wurde von einer AABB-akkreditierten Blutbankeinrichtung erhalten. Die Probe wurde unter Verwendung von Standard-Spectra-LRS-Vorgehen gesammelt. Alle unten beschriebenen Manipulationen oder Vorgehensweisen wurden mit Standardlaborsicherheitsvorgehen und -verfahren durchgeführt. Einheitennummer und Bluttyp wurden aufgenommen. Sämtliche Proben wurden innerhalb von 24 Stunden nach dem Sammeln verwendet. Es wurde für sämtliche Probenübertragungen und Verarbeitungsschritte aseptischer Vorgehensweise gefolgt.
Die Probe wurde in eine 500 ml umfassende PVC-Transferpackung übertragen und bei 5000 × g für fünf Minuten zentrifugiert, um die Blutplättchen zu verdichten. Plasma wurde dann von dem Blutplättchenpellet unter Verwendung einer Standardplasmapresse entfernt. Das Plasma wurde für die weitere Verwendung aufbewahrt. Das von dem Zellpellet entfernte Plasma wurde dann mit einer Stammlösung aus Isolyte S, pH 7,4, McGaw, Inc., vermischt. Diese Stammlösung aus Medium wurde zubereitet durch Hinzufügen einer vorher bestimmten Menge 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin zu Isolyte S, um Endkonzentrationen mit 1,43, 71,4 und 143 μM vorzusehen. Nach der Zugabe von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin wurde die Stammlösung durch ein 0,22 μM-Sterilfilter filtriert. Die Stammlösung wurde dann mit autologem Plasma in einem Verhältnis von 70:30 (v:v) vermischt, um Endkonzentrationen von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin von 1, 50 bzw. 100 μM bereitzustellen. Während der Zubereitung der 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin-Stammlösungen wurde Vorsicht walten gelassen, um Aussetzen an Licht zu vermeiden. Die Proben wurden wie folgt zubereitet:

1 μM 2 Proben

100 μM 2 Proben

50 μM 1 Probe
Das Blutplättchenpellet wurde dann in der Plasma:Medium-Mischung auf das ursprüngliche Volumen der Ausgangsprobe resuspendiert. Die Probe wurde an ein Durchflussgerät angeschlossen, umfassend einen Behälter für Zellen und Photosensibilisator, einen Behälter für Medium, wobei diese Behälter über mit Ventilen versehenen Leitungen mit einer einzelnen Leitung für vermischte Zellen/Sensibilisator und Medium verbunden waren, ausgestattet mit einer Pumpe. Vermischte Zellen/Sensibilisator und Medium wurden in eine Küvette, die in einem Halter mit einer verspiegelten Wand gehalten wurde, bestrahlt von einer Lichtquelle, einfließen gelassen. Diese Bestrahlungskammer war mit einer Temperatursonde ausgestattet. Nachdem es durch die Küvette hindurchgeführt worden ist, wurde das Fluid in einem Produktbeutel gesammelt.
Der Schlauchsatz wurde mit Isolyte-S-Medium vorgefüllt. Fünf Minuten vor dem Start des Testprobenflusses wurde die Lichtquelle aktiviert. Die Temperatur wurde während dieses Intervalls überwacht und niedriger als 32°C in der Bestrahlungskammer gehalten.
Die Flussrate für die Probe durch die Bestrahlungskammer wurde bestimmt durch die Skala der Tabelle 4. Durchflussraten, welche Gesamtbestrahlungsenergieniveaus von 1, 5 und 9 J/cm² bereitstellen, wurden gemäß der folgenden Testmatrix genutzt:

Probenlauf #1: 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin-Konzentration = 1 μM A. +7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, +1 J/cm² B. +7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, +9 J/cm²
Probenlauf #2: 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin = 100 μM A. +7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, +1 J/cm² B. +7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, +9 J/cm²
Probenlauf #3: 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin = 50 μM A. +7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, +5 J/cm²
Probenlauf #4: Kontrollprobe, 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin = 0 μM A. +Fluss, -UV, -7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin

Sämtliche Proben waren durch die Laufnummer und Probenbuchstabenbezeichnung, entsprechend den Behandlungsbedingungen (d. h. 1A), identifiziert. Jeder Probensatz wurde insgesamt für zwei Wiederholungen laufen gelassen. Die Reihenfolge, in welcher die Proben behandelt worden sind, wurde durch Zuordnung gemäß einem Zufallsgenerator bestimmt.
Ein Probenvolumen aus 20 ml pro Laufbedingung wurde für jede Probe gesammelt. Diese Proben wurden in Citrat-Plastikprobenbeutel (53 ml Gesamtvolumen) gesammelt und für die Analyse gelagert. Die Temperatur der Probe und der Bestrahlungskammer wurde beim Start, in der Mitte und am Ende jedes Laufes notiert.
Eine Startaliquote aus jeder Zubereitung wurde nach der Behandlung für die Analyse entfernt. Parameter für die Analyse schlossen Zellzahl, pH, pCO₂, pO₂, Blutplättchenwirbel, HSR und GMP-140-Analyse ein. Der verbleibende Teil der Probe wurde in einen End-over-End-Blutplättchenschüttler in einem +22-Inkubator gegeben und für fünf Tage nach der Behandlung gelagert. Am Tage 5 wurde eine zweite Aliquote entnommen und für dieselben In-vitro-Parameter analysiert.
Es wurde die folgende Ausrüstung verwendet: Das Mikroskop Labophot von Nikon; das Hämatologieanalysegerät System 9000 von Serono-Baker; Analysenwaage; Blutplättcheninkubator (+22°C) und -rotator; Laborkühlschrank (+4°C); Zentrifuge Mistral 3000i; Corning-Blutgas-Analysegerät; Durchflusscytometer FACSCALIBUR von Becton-Dickinson; UV-Bestrahlungskammer; UV-Radiometer (UVX-Radiometer, UVP, Inc.); EFOS Ultracure 100SS Plus (365 nm Maximalausgabe und 340 nm Bandbreitenfilter); und Temperatursonde (Thermopaar).
Ergebnisse für jeden Satz an Testvariablen wurden für die definierten Bedingungen der Expositionsenergie und Konzentration von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin verglichen. Ein direkter Vergleich mit der unbehandelten Kontrollprobe wurde gemacht, und signifikante Unterschiede wurden durch eine Wahrscheinlichkeit von p > 0,05 aus einer gepaarten, einseitigen Student's T-Test-Analyse definiert.
Die Ergebnisse aus diesen Studien waren zusammengefasst wie folgt:

01 Bei Sensibilisatorkonzentrationen von mehr als 10 μM und Blutplättchenkonzentrationen oberhalb von 1,5 E+06/ml gab es einen Abfall im Proben-pH-Wert am Tag 2. Der pH-Wert nahm gleichmäßig jenseits des Tages 2 der Lagerung ab, wobei unannehmbare Werte (< 6,5) am Tage 3 der Lagerung erreicht wurden. Sämtliche anderen In-vitro-Parameter folgten dem mit dem Proben-pH-Wert beobachteten Muster.
02 Diese Abnahme im Proben-pH-Wert geschah ungeachtet davon, ob die Probe an UV-Licht ausgesetzt worden war oder nicht.
03 Bei Blutplättchenkonzentration von 5,4 E+05/μl gab es keinen Abfall im Proben-pH-Wert nach verlängerter Lagerung bei irgendeiner untersuchten Sensibilisatorkonzentration bis zu 100 μM.

Bei Sensibilisatorkonzentrationen von bis zu 10 μM, Blutplättchenkonzentrationen über 1,5 E+06/μl und UVA-Stärken von bis zu 10 J/cm² waren die gemessenen Blutplättcheneigenschaften mit jenen der Kontrolle, unbehandelte Zellen, vergleichbar. Diese blieben mit Kontrollspiegeln nach fünf oder mehr Tagen Lagerung nach der Behandlung vergleichbar.
Diese Studien der Blutplättchenfunktion nach der Behandlung sorgten für ein eindeutiges Fenster, in welchem Zelleigenschaften auf Niveaus gehalten worden sind, die mit unbehandelten Zellen vergleichbar waren. Die Ergebnisse zeigten auch, dass dieses Fenster durch Variieren der Lagerungs- oder Behandlungsbedingungen für die Zellen ausgedehnt werden kann. Der beobachtete Effekt von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin mit oder ohne UV-Licht auf den Proben-pH-Wert legt eine metabolische Wirkung dieses Additivs nahe, die durch Änderungen in den Lagerungs- oder Verarbeitungsbedingungen der Proben gemäßigt werden kann.
Beispiel 7
Messungen von Scherbeanspruchung auf rote Blutzellen als eine Funktion der Durchflussrate und des Probenhämatokrits
Die niedrigen Stärken an UV-Licht-Durchdringung in roten Blutzellproben bei hohen Hämatokritwerten steigerten den Bedarf, die Wirkungen des Passierens roter Blutzellen durch enge Öffnungen in den Strahlengang zu verstehen. Reduktion der Probendicke im Strahlengang sollte die Zufuhr von UV-Dosen bei hohen Probenhämatokritwerten steigern. Um diesen Ansatz zu bestätigen, wurden etliche Druckabfallmessungen unternommen unter Verwendung von Öffnungen mit variierenden Dimensionen. Ein Druckmesser wurde in Reihe mit einer Rollkolbenpumpe sowohl stromabwärts als auch stromaufwärts der verengten Öffnungen platziert. Gesamtblut mit variierenden Hämatokritwerten wurde durch die Öffnungen mit kontrollierten Durchflussraten geführt. Unterschiede in den Druckablesewerten an beiden Örtlichkeiten erlaubten die direkte Messung des Druckabfalls über die Öffnung. Unter Verwendung dieses Wertes und der Dimensionen der Öffnung war es möglich, die durch die roten Blutzellen erfahrene Scherbeanspruchung, wenn sie durch die verengte Zelle geführt werden, unter Verwendung der folgenden Gleichung zu bestimmen:
Für Blut,

μ: = Viskosität = 0,0125/(1-Hämatokrit)
g: = Gravitationskonstante = 981
Q: = Durchflussrate = ml/s
l, w, d: = Dimensionen der Öffnung in cm

In vorangegangenen Experimenten wurde bestimmt, dass Scherbeanspruchungen von 1.000 bis 2.000 Dyn/cm² für Intervalle von 1 bis 10 Minuten oder Stärken von 5.000 bis 7.000 Dyn/cm² für Intervalle von annähernd 10 ms ausreichend waren, rote Blutzellhämolyse zu induzieren. Nur in dem Falle des höchsten Probenhämatokrits (62%) und der höchsten Durchflussrate (16,9) überschritten die Werte 1.000 Dyn/cm². Dies geschah nur für Öffnungen mit der engsten Weite (0,008 Inch).
Die Werte für die Lichteindringungstiefe unter Verwendung der vorgeschlagenen Konfiguration zeigen, dass die Zufuhr von ausreichend UV-Energie, um Virusaktivierungsprozesse anzutreiben, sogar für Proben mit hohen Hämatokritwerten erreichbar ist.
Ergebnisse aus der Scherbeanspruchungsanalyse auf rote Blutzellproben, die Durchfluss ausgesetzt sind, zeigen, dass die Dimensionen des Durchflussweges signifikant reduziert werden können und dass hohe Durchflussraten aufrecht erhalten werden können, ohne rote Blutzellhämolyse zu riskieren.
Referenzbeispiel 8
Ein Blutplättchenkonzentrat wurde mit der Blutplättchenadditivlösung Isolyte S in einem Verhältnis von 20:80 Blutplättchenkonzentrat:Isolyte S vermischt. Auf Mischungen von Blutplättchenkonzentraten und Blutplättchenadditivlösungen wird hierin Bezug genommen als in „Medien". Auf Blutplättchenkonzentrat ohne zugesetzte Lösung wird hierin Bezug genommen als in „Plasma". Beides wurde Listeria monocytogenes zugesetzt. Vitamin K5 wurde dann zu jedem hinzugefügt in der Menge von 300 μg/ml B. Jedes wurde dann an UV-Licht, sichtbares oder Raumlicht in dem Küvettengerät der 6 ausgesetzt mit den in Tabelle 6 gezeigten Ergebnissen. Tabelle 6

UV-Licht = 365 nm
Sichtbares (VIS-) Licht = 419 nm
Pathogen = Listeria monocytogenes
Konzentration von K5 = 300 μg/ml

Referenzbeispiel 9
Den Medien und Plasma, wie oben beschrieben, enthaltend Vitamin K5, wurden Bakterien zugesetzt und bestrahlt oder nur an Raumlicht ausgesetzt (K5-Licht), wie in Tabelle 7 gezeigt, und das Wachstum wurde nach drei Tagen Inkubation beurteilt. Inaktivierung gewisser Arten wurde in der Abwesenheit von Bestrahlung gesehen. Tabelle 7

UV-Licht = 365 nm, 40 J/cm²
+ = Wachstum nach drei Inkubationstagen detektiert
– = kein Wachstum nach drei Inkubationstagen detektiert
Konzentration von K5 = 300 μg/ml

Beispiel 10
Medien, die hergestellt wurden unter Verwendung eines wie in Beispiel 8 beschriebenen Blutplättchenkonzentrates und Isolyte S mit einem Verhältnis von Isolyte S zu Blutplättchenkonzentrat von 70:30 und enthaltend 300 μg/ml Vitamin K5, wurden mit etlichen Bakterienarten versehen und bestrahlt mit Energiestärken von 30 und 60 J/cm². Inaktivierung als eine Funktion der Bestrahlungsenergie ist in Tabelle 8 und 7 dargestellt. Tabelle 8
Beispiel 11
Zu dem Blutplättchenkonzentrat, wie beschrieben in Beispiel 8, und zu den 70:30-Medium, wie beschrieben in Beispiel 10, wurden 10 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Das Blutplättchenkonzentrat und die Medien wurden mit S. aureus oder S. epidermidis versehen und bestrahlt bei 80 J/cm² und 30 J/cm² und die Inaktivierung wurde wie oben gemessen. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
Beispiel 12
Zu dem wie in Beispiel 8 beschriebenen Plasmakonzentrat, enthalten in einem Standardblutbeutel, wurden 25 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin in Pulverform hinzugefügt. Der Beutel wurde mit Bakterien versehen, wie in Tabelle 9 gezeigt, hin und her bewegt und an 120 J/cm² Bestrahlung ausgesetzt. Inaktivierungsergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9

Pathogen Log Inaktivierung (cfu/ml)

S. aureus 1,7 Log

S. epidermidis 3,5 Log

P. aeruginosa 3,6 Log

E. coli 4,1 Log
Beispiel 13
Zu dem wie in Beispiel 8 beschriebenen Blutplättchenkonzentrat wurden 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, Alloxazin-mononukleotid oder 7-8-Dimethylalloxazin hinzugefügt, gefolgt von dem Zusatz von S. aureus oder S. epidermidis und Bestrahlung bei 80 J/cm². Inaktivierungsergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10
Beispiel 14
Zu dem Blutplättchenkonzentrat von Beispiel 8 wurden 10 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Aliquoten enthielten kein Additiv, 10 mM Ascorbat oder 10 mM KI as einen Aquencher@ oder Antioxidanz. Die Lösungen wurden versehen mit HSV-2, ΦX174, S. epidermidis oder S. aureus und bei 80 J/cm² bestrahlt. Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Beispiel 15
Zu den Blutplättchenkonzentrationen von Beispiel 8 wurden variierende Konzentration 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Diese Lösungen wurden mit dem Herpes-simplex-Virus Typ II (HSV-II) versehen, einem doppelsträngigen umhüllten DNS-Virus. Bestrahlung wurde bei 80 J/cm² gemacht. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. In sämtlichen drei Versuchen wurde eine vollständige Inaktivierung erreicht. Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
Beispiel 16
Es wurde dem Protokoll von Beispiel 15 gefolgt unter Verwendung von S. epidermidis anstelle von HSV II bei Bestrahlungsenergien von 40, 80 und 120 J/cm². Inaktivierungsergebnisse sind in 11 gezeigt.
Beispiel 17
Es wurde dem Protokoll von Beispiel 15 gefolgt unter Verwendung von ΦX174, einer einzelsträngigen DNS-Bakteriophage, bei variierenden Konzentrationen von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin und Bestrahlungsenergien. Inaktivierungsergebnisse sind in 12 gezeigt.
Beispiel 18
Zu Blutplättchenkonzentraten von Beispiel 8 wurden 10 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Diese wurden mit S. aureus oder ΦX174 versehen und bei variierenden Bestrahlungsenergien mit einer 50:50-Mischung aus sichtbarem und ultraviolettem Licht bestrahlt. Inaktivierungsergebnisse sind in 13 gezeigt.
Beispiel 19
Es wurde dem Protokoll von Beispiel 18 gefolgt unter Verwendung von S. epidermidis und HSV II als die Mikroorganismen. Eine 50:50-Mischung aus ultraviolettem und sichtbarem Licht wurde durch eine DYMAX-Lichtquelle geliefert. Inaktivierungsergebnisse sind in 14 gezeigt.
Beispiel 20
Zu Blutplättchenkonzentraten von Beispiel 8 wurden 10 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin in pulverisierter Form hinzugefügt. Tests mit und ohne hinzugefügtem Ascorbat wurden durchgeführt. 150 ml der Testlösungen wurden in einen Spectra^TM-Blutbeutel gegeben und geschüttelt und an variierende Bestrahlungsenergien unter Verwendung einer 50:50-Mischung sichtbares:ultraviolettes Licht ausgesetzt. Nach Erreichen von 40 J/cm² wurden die Inhalte jedes Beutels in einen neuen Beutel übertragen, um Fehler aufgrund von Mikroorganismen zu vermeiden, die in der Zusetzöffnung des Beutels verblieben sein könnten. Inaktivierungsergebnisse sind in 15 gezeigt. Nach unten weisende Pfeile zeigen Inaktivierung bis zu dem Maß an, zu welchem es möglich war, sie nachzuweisen (2,5 Log Titer).
Beispiel 21
Zu Blutplättchenkonzentrat von Beispiel 8 und dem Blutplättchenkonzentrat in Isolyte S mit 30:70 B1utplättchenkonzentrat:Isolyte S wurden 20 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Diese wurden mit Vacciniavirus versehen, einem doppelsträngigen, umhüllten DNS-Virus, und an 60 J/cm² sichtbares Licht ausgesetzt oder gemischtes (50:50) sichtbares und ultraviolettes Licht unter Verwendung einer DYMAX 2000 UV-Lichtquelle für 30 Minuten. Die Detektionsgrenze war 1,5 Log. Inaktivierungsergebnisse sind in 16 gezeigt. Vergleiche wurden gemacht unter Verwendung von keinem Photosensibilisator, Photosensibilisator in Isolyte-S-Medien allein, Blutplättchen in Isolyte-S-Lösung, Blutplättchen in Isolyte-S-Lösung unter Verwendung von 8-Methoxypsoralen anstelle von 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin und Blutplättchenkonzentrat in Isolyte-Medien (30:70).
Beispiel 22
Proben aus Blutplättchenkonzentrat in Isolyte-S-Medien 30:70, mit und ohne 10 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, wurden mit Vacciniavirus versehen und bei 60 J/cm² mit 50:50 sichtbares:UV-Licht für variierende Zeitdauern bestrahlt, und die Inaktivierungsergebnisse wurden, wie in 17 gezeigt, verglichen.
Beispiel 23
Zu Proben aus Blutplättchenkonzentrat, wie beschrieben in Beispiel 8, wurden 5 μM oder 50 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Proben wurden mit HIV 1 versetzt. Unter Verwendung der Küvettendurchflusszelle, gezeigt in 6, wurden Proben mit 50:50 sichtbares:UV-Licht bestrahlt bei variierenden Energien unter Verwendung eines EFOS-Lichtsystems. Inaktivierungsergebnisse sind in 18 gezeigt.
Beispiel 24
HIV-infizierte ACH-2-Zellen wurden zu Proben aus in Beispiel 8 beschriebenen Blutplättchenkonzentraten zugefügt. 5 oder 50 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin wurden zu den Proben hinzugefügt. Es wurden dem Protokoll von Beispiel 23 gefolgt und die Inaktivierungsergebnisse sind in 19 gezeigt. Die Anwesenheit von HIV wurde durch seine cytopathische Wirkung auf Testzellen untersucht.
Beispiel 25
Es wurde dem Protokoll von Beispiel 24 gefolgt und die Anwesenheit von HIV wurde durch Quantifizieren des Maßes an p24-Antigenproduktion untersucht. Inaktivierungsergebnisse sind in 20 gezeigt.
Beispiel 26
Zu Proben aus Blutplättchenkonzentrat, wie beschrieben in Beispiel 8, und Medien, enthaltend 30% Blutplättchenkonzentrat und 70% PASIII^TM-Medien, wurden 6 mM Ascorbat und 14 μM 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin hinzugefügt. Proben wurden mit HSV-II versehen. Inaktivierungsergebnisse sind in 21 und Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11
Es wird von Fachleuten leicht verstanden werden, dass die vorangegangene Beschreibung nur für Zwecke der Erläuterung war und dass eine Reihe von Änderungen gemacht werden kann, ohne von dem Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel können andere Photosensibilisatoren als jene erwähnten verwendet werden, vorzugsweise Photosensibilisatoren, die an Nukleinsäure binden und sie dadurch vom Replizieren abhalten, und bevorzugter jene, die nicht toxisch sind und keine toxischen Abbauprodukte haben. Zusätzlich können äquivalente Strukturen zu jenen hierin beschriebenen für die Konstruktion eines Durchflusssystems für die Dekontaminierung von Fluiden unter Verwendung von Photosensibilisatoren leicht ohne ungehörige Experimentierung von Fachleuten unter Befolgung der Lehren hiervon erdacht werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Vaccins bzw. Impfstoffes aus mindestens einem Teil von einem oder mehreren infektiösen Partikeln, umfassend: das Inaktivieren der infektiösen Partikel durch Zusetzen einer wirksamen Menge eines Fotosensibilisators, bei dem es sich um ein endogenes Alloxazin oder ein Derivat davon handelt, zu dem einen oder den mehren infektiösen Partikel(n); Exponieren der Partikel an Licht einer ausreichenden Wellenlänge, um die Replikation der infektiösen Partikel zu verhindern, jedoch die antigenen Determinanten nicht wesentlich zu zerstören, und Suspendieren der inaktivierten Partikel in einer Suspensionslösung zur Erzeugung eines Vaccins.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die infektiösen Partikel Viren sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die infektiösen Partikel Bakterien sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die infektiösen Partikel Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Zellen Tumorzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Viren lebende Viren sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Partikel nicht infektiös gemacht werden, in dem man die Replikation der infektiösen Partikel verhindert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das endogene Alloxazin ein endogenes Isoalloxazin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Suspensionslösung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Salzlösung und Wasser.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Suspensionslösung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antibiotikum und einem Konservierungsmittel.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Suspensionslösung zusätzlich ein Adjuvans enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das endogene Alloxazin 7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloxazin ist.
Zusammensetzung zum Induzieren der Immunität in einem Säuger, umfassend: einen inaktivierten infektiösen Partikel; ein nicht-toxisches Fotoprodukt, abgeleitet von einem endogenen Alloxazin oder einem Derivat davon; und eine Suspensionslösung.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Suspensionslösung wie in einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, worin der inaktivierte infektiöse Partikel ein Virus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, worin der inaktivierte infektiöse Partikel ein Bakterium ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, worin der inaktivierte infektiöse Partikel eine Zelle ist.