DE60202869T2

DE60202869T2 - Polymermasse, Materialien hieraus und deren Anwendungen

Info

Publication number: DE60202869T2
Application number: DE60202869T
Authority: DE
Inventors: Dr. Thomas Groth; Dr. Barbara Seifert; Dr. Wolfgang Albrecht; Dr. Günter Malsch; Prof. James McNiven Kirkintilloch Courtney; Dr. John David Stewart Giffnock Gaylor; Dr. Mary Helen Bearsden Grant
Original assignee: GKSS Forshungszentrum Geesthacht GmbH
Current assignee: GKSS Forshungszentrum Geesthacht GmbH
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: EP1400564B1; WO2004024815A1; ATE288461T1; US20060058479A1; US20070093562A1; DE60202869D1; CA2500934A1; EP1400564A1; CA2500934C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine neue Polymere Zusammensetzung, ein Verfahren zu Ihrer Herstellung und ihre Verwendung in der Produktion von Materialien, die in medizinischen oder biologischen Anwendungen Verwendung finden, insbesondere für biohybride oder bioartifizielle Organe, die einen direkten Kontakt des Materials mit Flüssigkeiten und/oder Zellen und/oder Gewebe einschließen.
Biohybride oder bioartifizielle Organe sind zur Unterstützung oder vorübergehenden Ersetzung menschlicher Organe mit Fehlfunktionen konzipiert. Das Hybrid umfasst dabei üblicherweise Membranen, die eine „passive" Trenn-, Filter- oder Trägerfunktion aufweisen, und auch lebende Organzellen mit „aktiven" Transport- und Sekretionseigenschaften.
In künstlichen Organen wie der künstlichen Niere wird bis heute nur die passive Trenn- und Filterfunktion des Organs mit Hilfe spezialisierter Polymermembranen ersetzt. In der gesunden Niere jedoch folgt der Filtrationsprozess einem aktiven Re-Adsorptionsprozess, realisiert durch das Nierenepithel. In diesem Prozess werden Inhaltsstoffe des Primärurins und Wasser gegen einen Konzentrationsgradienten von dem Primärurin zurück ins Blut transportiert. Ferner besitzt das Nierenepithel eine endokrine Funktion, die für die Freisetzung von Erythropoietin, Vitamin D-Hormonen, Angiotensine II, Kininen und Reninen verantwortlich ist, die zur Homöostase des Organismus beitragen.
Analoge Situationen existieren in der Leber, die neben ihrer Entgiftungsfunktion als eine der wichtigsten endokrinen Drüsen des Organismus Hormone und andere Proteine (Albumine, alpha- und beta-Globuline, Fibronogen, Prothrombin, Gerinnungsfaktoren) mit einer Speicherfunktion für Glykogen, Proteine, Vitamine sekretiert. Es ist einsichtig, dass mit Hilfe von Porenmembranen allein passive Filtrations- und Sorptionsfunktionen dieses für die Entgiftung verantwortlichen Organs erreicht und für therapeutische Zwecke verwendet werden können
Daher wurde die Immobilisierung von Organzellen in so genannten biohybriden Organen vorgeschlagen, um die aktiven Transport- und Sekretionsfunktionen von lebensfähigen Zellen zur Unterstützung oder Ersetzung der Funktionen kranker Organe zu verwenden. Bis jetzt sind die erreichten Ergebnisse von geringem therapeutischen Wert, da auf der einen Seite die Lebensfähigkeit der Zellen nicht für die benötigte Zeitspanne aufrecht erhalten werden kann und auf der anderen Seite die bisher erreichte Funktionalität der immobilisierten Zellen nicht der Funktionalität des natürlichen Organs entspricht.
Einer der Hauptgründe für die unbefriedigende Funktionalität rührt von der Membran hinsichtlich ihrer Eigenschaft als Träger von verankerungsbedürftigen Zellen ab. Entsprechend dem heutigen Wissen sollte der Membranträger die folgenden Eigenschaften für eine optimale Funktionalität der Zellen besitzen:

1. Im Allgemeinen steht eine nicht ausreichende Anzahl von Primärzellen des eigenen Organs des Patienten zur Verfügung. Daher müssen in biohybriden Organen Spenderzellen menschlichen oder tierischen Ursprungs verwendet werden. In jedem Fall ist eine Abschirmung des Patienten von allogenen oder xenogenen Zellen im Bioreaktor notwendig, um eine Aktivierung des Wirtimmunsystems zu verhindern. Diese Immun isolierung begrenzt die maximale Porengröße der Membran. Antikörper, Komplementärfaktoren, Viren und so weiter sollten nicht durch die Membran gelangen. Auf der anderen Seite sollte die Permeabilitit der Membran den Austausch von Substanzen erlauben, die für die Versorgung der Zellen notwendig sind (Nährstoffe, einige Proteine, wie zum Beispiel Albumin, Gase, zu entfernende Toxine) und den Abtransport von Zellprodukten (Zellmetabolite, spezifische Proteine, etc.).
2. Organzellen wie Hepatozyten sind adhäsionsabhängig und bedürfen einer extrazellulären Matrix an den Kontaktstellen zur Membran, an der sie verankert sind. Allein auf diese Art und Weise bleiben sie über eine längere Zeitperiode lebensfähig, entwickeln ihre normale Morphologie und Funktion und organisieren sich in polaren gewebeähnlichen Strukturen. Die Membran muss demnach eine moderate Adsorption von extrazellulären Matrixproteinen ohne größere Konformationsänderungen und ihre nachfolgende strukturelle Organisation erlauben. Konsequenterweise muss die Membranoberfläche, die die Gewebezellen kontaktiert, extreme Anforderungen erfüllen, um gewebekompatibel zu sein.

Abhängig von dem zu unterstützenden oder zu ersetzenden Organ und den in Ziffer 1 und 2 aufgeführten Anforderungen hat die Proteinadsorptionsfähigkeit der Membran eine entscheidende Bedeutung. Endokrine Organe produzieren Proteine, die dem Blutstrom ohne größere Adsorption während der Passage durch die Membrane zugeführt werden müssen, um ihre Funktion im menschlichen Körper zu erfüllen. Daher darf die Membran nur eine moderate Adsorptionsfähigkeit für Proteine aufweisen.
DE 100 30 307 A offenbart ein Material bestehend aus 70 bis 95 Mol-% von Acrylnitrilmonomeren und N-Vinylpyrrolidon als Comonomer. Membrane, die aus diesem Material durch ein Phaseninversionsprozess hergestellt werden, sind zur Verwendung in medizinischen oder biologischen Anwendungen bestimmt.
Ferner ist ein Hydrogel bekannt, welches durch ein Phaseninversionsverfahren aus einer Polymerlösung hergestellt wird, die ein Copolymer aus Acrylnitril und Natriummethallylsulfonat in einer geeigneten Lösung beinhaltet (J. Honiger et al.: Biomaterials 21, 2000, 1269–74). Dieses Material wird zur Makroeinkapselung von allogenen oder xenogenen Hepatozyten verwendet.
EP 0 559 902 A beschreibt eine Membran, die aus einem Copolymer hergestellt wird, welches aus 90 bis 97 Mol-% aus Acrylnitrilmonomer und wenigstens einer Comonomereinheit, wie zum Beispiel Vinylacetat oder 2-N,N-Diethylaminoethylmethacrylat besteht. Die Membrane werden für die Filtration/Trennung von organischen Substanzen verwendet.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung und ein aus dieser Zusammensetzung hergestelltes Material vorzuschlagen, welche beide für eine Verwendung in Anwendungen geeignet sind, die einen direkten Kontakt mit Zellen, insbesondere Gewebezellen beinhalten. Das aus der Zusammensetzung hergestellte Material sollte eine moderate Adsorption von Zellen unterstützen sowie ihre natürlichen Funktionen fördern. Des Weiteren sollte die Zusammensetzung für die Herstellung von Membranen mit Porengrößen geeignet sein, die den Austausch von für die Versorgung der Zellen notwendigen Substanzen ermöglicht. Gleichzeitig sollte die Porengröße eine effiziente Immunisolierung sicherstellen, um den Patienten von allogenen oder xenogenen Zellen, die an der Membran anhaften, abzuschirmen.
Diese und andere Aufgaben werden durch eine polymere Zusammensetzung erreicht, die mindestens ein acrylisches Copolymer umfasst, dass aus 90 bis 99 Mol-% einer acrylischen Monomereinheit (AC) und aus mindestens einer anionischen, wasserlöslichen Comonomereinheit aufgebaut ist, die 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) ist.
Ferner werden diese und andere Aufgaben durch eine polymere Zusammensetzung bewältigt, umfassend wenigstens ein Polyacrylnitril-Copolymer, bestehend aus 90 bis 99 Mol-% einer Acrylnitril-Monomereinheit (AM) und wenigstens einer wasserlöslichen Comonomereinheit.
Molare Anteile von AMPS in den Copolymeren von 1 bis 10 Mol-%, insbesondere von 3 bis 5 Mol-%, haben sich als vorteilhaft hinsichtlich der oben beschriebenen gewünschten Produktcharakteristika erwiesen.
Die polymere Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt eine hohe Biokompatibilität für viele Zellen, einschließlich Gewebezellen, insbesondere Epithelzellen. Daher ist die Zusammensetzung für die Herstellung von Biomaterialien geeignet, wie zum Beispiel Membranen, Filmen oder Beschichtungen, die in medizinischen oder biologischen Anwendungen verwendet werden können, die einen direkten Kontakt des Materials mit Körperflüssigkeiten und/oder Zellen und/oder Gewebe, insbesondere mit Hepatozyten, einschließen. Zellen, die an dem Material immobilisiert sind, können leicht durch einen Fluidstrom versorgt werden, der die Zellen mit Nährstoffen versorgt und dadurch den Austausch von Substanzen in die Zellen und aus ihnen heraus ermöglicht.
Es wurde gezeigt, dass Materialien, die aus der Zusammensetzung hergestellt wurden, vorteilhaft in biohybriden und bio artifiziellen Organen eingesetzt werden können, wo sie als selektiv permeable Trennmembran und Träger für adhäsionsabhängige Gewebezellen, wie Leber-, Bauchspeicheldrüsen- oder Lungenzellen, fungieren. Wie durch Experimente mit auf erfindungsgemäßen Membranen immobilisierten Leberzellen gezeigt wurde, halten diese Zellen ein hohes Maß an natürlichem cytochromabhängigen Testosteron- und Ethoxiresorufin-Metabolismus aufrecht und exprimieren ferner Glutathion-S-Transferase.
Wegen ihrer geringen Zytotoxizität und ihrer geringen Neigung zur Proteinadsorption können Materialien, hergestellt aus der polymeren Zusammensetzung, auch für medizinische Anwendungen im Körper verwendet werden. Beispielsweise können Sie für Implantate oder Biosensoren verwendet werden.
Die Zusammensetzung kann einfach durch radikalische Copolymerisation von AN und dem Comonomer in Gegenwart eines geeigneten Radikalstarters hergestellt werden, wie zum Beispiel Ammoniumperoxodisulfat, alles gelöst in einem aprotischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dimethylformamid. Um die geeigneten Produktcharakteristika zu erreichen, wird die Reaktion bevorzugt bei einer Gesamtkonzentration von Monomeren in der Reaktionslösung im Bereich von 1 bis 5 mol/l und einer Konzentration des Radikalstarters von etwa 0,4 bis 4 mmol/l ausgeführt.
Membrane, die bevorzugt eine Wasserflussrate durch die Membran im Bereich von 1 bis 10 l/m²hkPa aufweisen, insbesondere von etwa 2 l/m²hkPa, und einen "cut-off" im Bereich von 150 bis 1000 kDa, insbesondere von 200 bis 600 kDa, speziell von 300 bis 400 kDa, werden bevorzugt durch ein Phaseninversionsverfahren aus den Copolymeren gemäß der Erfindung erhalten. Im Einzelnen wird eine Gießlösung erzeugt, die eine polymere Zusammensetzung mit einem Feststoffgehalt von beispielsweise 15 bis 25 Gew.-%, gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel, enthält. Dann wird die Lösung auf einen Träger gegossen oder durch eine geeignete Düse, insbesondere des so genannten Rohr-in-Mündungs-Typs (tube-in-orifice type), extrudiert; und der Guss oder die extrudierte Lösung wird in einem Koagulationsbad durch ein Nass- oder ein Nass-Trocken-Nass-Verfahren zur Ausbildung einer asymmetrischen Membran koaguliert. Bevorzugt wird die Membran anschließend einer nassen Nachbehandlung in Wasser oder Dampf unterzogen.
Andere bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Unteransprüchen offenbart.
Die Erfindung wird detaillierter durch Beispiele und die folgenden Figuren beschrieben:
1 Zytotoxizitätstest von Membranen, hergestellt gemäß den Beispielen 3 und 4,
2 MTT-Test des 3T3-Fibroblastenwachstums auf Membranen gemäß den Beispielen 3 und 4 (Kontrolle – MC).
Beispiel 1: Polymersynthese
Die Copolymere gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen Polyacrylnitril-Derivate (PAN) funktionalisiert durch das anionische Comonomer 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS).
Die Einführung der Funktionalität wurde mittels freiradikalischer statistischer Copolymerisationstechniken erreicht, um Copolymere zu erhalten, die gut eingestellte Zusammensetzungsverhältnisse und gute Membranausbildungseigenschaften aufweisen. Homopolymerisierte PAN wurde in den Studien als Referenzmaterial eingesetzt.
Vor Benutzung wurde das AN-Basismonomer (MERCK, > 99% Reinheit) inert fraktionierend destilliert. Das AMPS Comonomer (ALDRICH, 98% Reinheit) wurde ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Dimethylformamid (DMF, ALDRICH, 99,8% Reinheit) wurde vor Einsatz als aprotisches Lösungsmittel in der Polymersynthese bei 40 mbar/Siedepunkt 60°C inert Vakuum-destilliert. Die freien Radikalstarter 2,2'-Azoisobutyronitril (AIBN, zweimal aus Wasser bei 30°C re-kristallisiert) oder Ammoniumperoxodisulfat (APS, aus Ethanol bei 40°C fraktioniert kristallisiert) wurden jeweils in Homo- bzw. Copolymerisationen verwendet.
Durch freie Radikale eingeleitete Lösungspolymerisation wurde als Upscaling-Verfahren (5 l Batchgröße) unter Verwendung eines konventionellen Fünf-Hals-Glasreaktors mit doppelwandigem Mantel und mit äußerer Thermostatisierung ausgeführt. Von den Rezepturzutaten wurde zuerst die Hauptportion des aprotischen DMF-Lösungsmittels in den Reaktor gefüllt und unter kontinuierlichem Rühren (150 U/min) in einer inerten Atmosphäre auf die gewünschte Temperatur erhitzt. Nachfolgend wurden AN und das Comonomer und schließlich der Initiator, gelöst in dem restlichen DMF, dem Batch hinzugegeben. Die Reaktionszeit wurde individuell reguliert von 360 min (PAN) bis 1800 min (AMPS), um den gewünschten Umsatz zu erhalten. Im Fall der durch APS eingeleiteten Copolymerreihe wurde die Polymerisationstemperatur auf 45 C eingestellt, wohingegen im Fall der durch AIBN eingeleiteten AN-Homopolymerisation die Temperatur 54 C betrug, wie durch kinetische Berechnungen zur Einstellung der Homo- und Copolymer Molekulargewichte bestimmt wurde.
Wegen der Starterdifferenzierung kann definitiv angenommen werden, dass die mit AIBN erhaltene PAN-Referenz frei von irgendwelchen Funktionalitäten ist, sogar in der Endposition des Initiators.
Die verwendeten Gesamtmonomerkonzentrationen von [M] = 3,8 mol/l für PAN und 5,0 mol/l für AMPS Copolymer beinhaltet gut abgestufte Molverhältnisse des Comonomers im Zustrom (Feed), die von Null für die PAN-Referenz bis zu 5,0 Mol-% für den AMPS-angereicherten Zustrom reicht.
Die Gesamtmonomerkonzentrationen und Starterkonzentrationen von 8 mmol/l (AIBN für PAN) oder 4 mmol/l (APS für die Copolymerreihe) wurden so abgestimmt, dass mittlere Molekularmassen von höher als 30,000 g/mol zur Erlangung membranformender Polymere erhalten wurden, die für die benötigte Ultrafiltrationsporenstruktur geeignet sind.
Nach dem Ende der Reaktion wurden die Polymerlösungen in einen großen Überschuss von als Fällungsmittel eingesetztem Ethanol geschüttet. Das ausgefällte Polymer wurde gefiltert, mehrfach gewaschen und mit dehydratisiertem Ethanol gespült, welches vor einer eingehenden Vakuumtrocknung an der Luft vorgetrocknet wurde, bis ein konstantes Gewicht erreicht wurde.
Beispiel 2: Polymercharakteristika
Die gemäß Beispiel 1 aus AN und AMPS synthetisierten Polymere wurden bezüglich der Copolymerzusammensetzung durch Elementaranalyse und bezüglich des mittleren Molekulargewichts durch Membranosmometrie charakterisiert. PAN wurde als Referenzmaterial verwendet. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1:
Beispiel 3: Membranformation
Die Membrane wurden durch ein Phaseninversionsprozess aus einer Lösung der Polymere gemäß den Beispielen 1 und 2 in Dimethylformamid ausgebildet. Die Polymerkonzentration variierte von 10 bis 22,5 Gew.-%. Die Lösung wurde auf einen Vliesträger (AMPS1/1, 1/2 und 2/1) oder direkt auf ein Edelstahlband mit einem Gießschlitz von 300 μm und einer Ziehgeschwindigkeit von 2 bis 4 m/min gegossen. Nach Durchlaufen eines Wasserfällungsbades bei 5 C oder Raumtemperatur wurden die Membrane in Wasser für 10 min getempert (Tabelle 2).
Tabelle 2:
Die Ausbildung von Membranen aus AMPS1/3 mit Polymerkonzentrationen von weniger als 15% zur Erlangung einer größeren Porenstruktur war nicht durchführbar, da das Material hoch quellfähig ist. Daher wurden Blendmembrane aus PAN und AMPS1/3 mit variierenden Porenstrukturen ausgebildet. Es wurde ange nommen, dass PAN ein verbundenes Polymernetzwerk umgeben von dem Copolymer AMPS1/3 bildet. Daten dieses Membranbildungsprozesses sind in Tabelle 3 gegeben.
Tabelle 3:
Beispiel 4: Siebcharakteristika der Membrane
4.1 Wasserpermeabilität und Kontaktwinkel
Die gemäß Beispiel 3 gebildeten Membrane wiesen die in Tabelle 4 dargestellten Wasserpermeabilitäten und Wasserkontaktwinkel auf. Der Wasserflux der Membrane wurde mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung – einer Berghoff-Rührzelle – mit destilliertem Wasser bestimmt. Die Wasserflüsse der AMPS-Membrane waren geringer als die der PAN-Membrane, hauptsächlich in Folge der höheren Polymerkonzentration bei der AMPS-Membranformation, die in einer dichteren Struktur resultiert. Verglichen mit PAN wurden für die AMPS-Copolymere signifikante Unterschiede in den ansteigenden (benetzend) und den abfallenden (entnetzend) Wasserkontaktwinkeln gemessen, was eine hydrophilere Oberfläche der letzteren Materialien indiziert.
Tabelle 4:
Die Wasserfluxraten der AMPS-Blendmembrane steigen mit geringerer Polymerkonzentration und höherem PAN-Gehalt in der Gießlösung an. Die Separationsparameter von PAN/AMPS1/3 290 liegen dicht an den Anforderungen an eine Membran für die Nährstoffversorung und Abfallentsorgung von Gewebezellen (Wasserflux ungefähr 2 l/m²hkPa) und kann an gewünschte Werte angepasst werden.
Für die aktive Oberfläche der Blendmembrane wurden ansteigende und abfallende Wasserkontaktwinkel von 0° gefunden, was auf eine hoch hydrophile Oberfläche hinweist.
4.2 Membranperformance
Zur Demonstration der Fähigkeit, Porositäts- und Transporteigenschaften während des Membranbildungsprozesses selektiv zu verändern, wurden AMPS-Blendmembrane mit verschiedenen Polymerkonzentrationen und Zusammensetzungen in Gießlösungen gemäß den Beispielen 1 bis 3 ausgebildet.
Die Filtrationseigenschaften der Membrane wurden in einer Berghoff-Rührzelle mit destilliertem Wasser und einer Lösung einer Testsubstanzmixtur (Dextrane mit Molekulargewichten von 650 bis 215.000) bestimmt. Die Molekulargrößenverteilungen der Dextrane in den Permeaten, in den Retentaten und in der Origi nallösung wurden durch Verwendung einer Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt.
Aus dem Ergebnis der GPC wurde der mittlere Porendurchmesser (D₅₀), der maximale Porendurchmesser (D₁₀₀) und das entsprechende Molekulargewicht (cut-off) unter der Annahme einer logarithmischen Normalverteilung der Porengröße berechnet (Tabelle 5).
Tabelle 5:
Die Separationsparameter von PAN/AMPS1/3 (3:1) liegen dicht an den Anforderungen an eine Membran für die Immunoisolation (cut-off 300 bis 400 kDa) und können in Richtung gewünschter Werte verändert werden.
Die Membranpermeabilität wurde durch Messungen der Albuminpermeabilität untersucht. Eine 3 mM Albuminlösung wurde als Testlösung und PBS als Puffer auf der Permeatseite ("sink side") der Membrantestzelle verwendet. Proben wurden alle 20 min von der Permeatseite entnommen und wurden hinsichtlich einer Zunahme der Albuminkonzentration mittels eines Lowry-Assays gemessen (Tabelle 6).
Tabelle 6:
Beispiel 5: Allgemeine Biokompatibilität – Kontakt mit 3T3-Fibroblasten
Zum Testen der allgemeinen Biokompatibilität der gemäß den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Membrane wurden Experimente mit 3T3-Fibroblasten durchgeführt. Die Zytotoxizität wurde gemäß ISO10993-5 mit Membranextrakten, die nach 1, 3 und 7 Tagen der Inkubation der Proben in einem Zellkulturmedium (DMEM) erhalten wurden, getestet. Wie durch den Neutralrot-Test gezeigt, zeigten konfluente Schichten der 3T3-Fibroblasten keine Hemmung der Lebensfähigkeit nach 24 Stunden Inkubation mit diesen Extrakten, was keine zytotoxischen Eigenschaften anzeigt (1).
Nach den Beispielen 1 bis 4 hergestellte Membrane wurden nach 2 und 4 Tagen direktem Kontakt mit 3T3-Fibroblasten auf Biokompatibilität getestet. Die Ergebnisse wurden mit einem Referenzmaterial verglichen (Millicell^® Zellenkulturbeigabe durch Millipore). 2 zeigt durch das "MTT-Assay" abgeschätzte Wachstumsraten von 3T3-Fibroblasten. Verglichen mit dem Referenzmaterial PAN haben die Copolymermembranen weniger vorteilhafte Oberflächeneigenschaften für Fibroblasten. Die erste Charge (AMPS1/1) liefert noch signifikant kleinere Wachstumsraten für diese Zellen.
Beispiel 6: Membrane im Kontakt mit Hepatozyten
6.1. Platierungseffizienz und Aufrechterhaltung des Cytrochrominhalts
Primärkulturen von Hepatozyten sind für ihre phenotypische Instabilität bekannt. Ferner werden die Konzentration des Gesamtcytrochroms P450 und die Aktivität seiner Isoenzyme als die labilsten Funktionen angesehen, als extrem empfindlich hinsichtlich der Kulturumgebung. Daher wurden Hepatozyten verwendet, um die Aufrechterhaltung der Funktionen der Primärkulturen auf Membranen gemäß den Beispielen 1 bis 4 zu bestimmen. Wenn die Membranen die Aufrechterhaltung dieser Funktionen erlaubten, wird angenommen, dass sie wahrscheinlich geeignet seien, die meisten der Hepatozytenfunktionen zu unterstützen.
Hepatozyten wurden aus männlichen Sprague-Dawley-Ratten (180 bis 220 g) durch Collagenase-Perfusion isoliert. Die Lebensfähigkeit von 80 bis 90% der isolierten Zellen wurde durch Trypan-Blau-Ausschluss bestätigt. Hepatozyten wurden mit 1,6 × 10⁶ lebenden Zellen pro Membran gesät (Durchmesser der Membranscheibe 40 mm) oder mit 3 × 10⁶ lebenden Zellen je kollagenbeschichteter (25 μg/cm² Typ-1-Kollagen, isoliert aus Rattenschwanzsehnen) 60-mm-Durchmesser-Polystyrol-Petrischale (als Kontrollschale). Die Zellen wurden in Chee's Medium, das mit 5% (v/v) fötalem Kälberserum angereichert war, in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft kultiviert. Vier Stunden nach der Animpfung wurden die Kulturen gewaschen, um die nicht haftenden Zellen zu entfernen, und ein frisches Medium wurde zu diesem Zeitpunkt und noch einmal nach 24 Stunden zugeführt. Zur Bewertung der Membrane wurden Proben nach 48 Stunden genommen. Die Plattenkultureffizienz wurde durch Messung des Gesamtzellproteins mittels Lowry-Assay bestimmt. Cytochrom P450 und b5 wurden durch ein modifiziertes Verfahren von Omura und Sato gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gegeben.
Tabelle 7:
6.2 Cytochrom-P450-abhängiger Testosteronmetabolismus und O-Deethylierung von Ethoxyresorufin (EROD)
Die Biokompatibilität der Membrane nach den Beispielen 1 bis 4 hinsichtlich der Unterstützung von Primärkulturen von Rattenhepatozyten wurde durch Messen des Cytochrom-P450-abhängigen Metabolismus von Testosteron und Ethoxyresorufin bestimmt.
Primärrattenhepatozyten, isoliert gemäß Beispiel 6.1, wurden mit einer Dichte von 1,6 × 10⁶ Zellen pro Membran (Kulturen auf Membranscheiben, 40 mm Durchmesser) und 3 × 10⁶ Zellen je kollagenbeschichteter 60-mm-Durchmesser-Petrischalen als Kontrollen ausgesät. Die Zellen wurden in Chee's Medium mit 5% fötalem Kälberserum kultiviert. Nach 48 Stunden in Kultur wurden die Zellen auf den Membranen und die Kontrollen mit 100 μM Testosteron in einem serumfreien Medium für 60 min inkubiert. Die Produkte wurden mittels HPLC analysiert. In einem zweiten Test wurden die für 48 Stunden kultivierten Zellen gewaschen, in einen Natriumphosphatpuffer geschabt und unter Verwendung von 7 Takten (strokes) eines motorbetriebenen Homogenisierers homogenisiert. 0,5 ml der Homogenisate wurden mit 6 μM Ethoxyresorufin in Gegenwart von NAPDH für 10 min inkubiert. Die Bildung von Resorufin wurde fluorimetrisch gemessen.
Tabelle 8 zeigt einen hohen, für Rattenhepatozyten auf der AMPS1/1-Membran gefundenen Testosteronmetabolismus, obwohl diese Funktionalität von Leberzellen auf den erfindungsgemäßen Membranen geringer ist als die auf der Kollagenkontrolle. Jedoch war die Spanne von hydroxylierten Metaboliten, die auf der AMPS1/1Membran gebildet waren, die beste von allen getesteten Membranen. Zellen auf dieser Membran bildeten 6-beta-Hydroxy-, 16-alpha-Hydroxy-, 16-beta-Hydroxytestosteron und Androstenedione, wohingegen die meisten der anderen Membrane einschließlich der PAN-Membran nur die Konversion von Testosteron in Androstenedione unterstützten. Tabelle 9 zeigt, dass die EROD-Aktivität höher in Zellen ist, die auf PAN- oder AMPS1/1-Membranen kultiviert wurden, als auf den Kontrollen.
Tabelle 8:
Tabelle 9:
6.3 Glutathion-S-Transferase (GST)
Die Expression von alpha- und pi-Isoenzymen der Glutathion-S-Transferase (GST) verändert sich mit der Entdifferenzierung und mit dem Alter der Leberzellen in Kultur. Mit der Kultivierungszeit nimmt die alpha-GST Expression ab, wohingegen die von pi-GST ansteigt. Die Expression dieser beiden GST-Proteine wurde in Zellen, die auf den Membranen gemäß der vorliegenden Erfindung wuchsen, durch Immunoblotting unter Verwendung spezifischer Antikörper detektiert. Tabelle 10 zeigt die Expression von alpha-GST und pi-GST in auf PAN- und AMPS1/1-Membranen gewachsenen Zellen. Alpha-GST wurde in Zellen, gewachsen auf beiden Membranen, gut erhalten. Zellen auf AMPS1/1-Membran wiesen ein besonders niedriges Niveau von pi-GST auf, was auf einen höheren Grad der Differenzierung hinweist.
Tabelle 10:
6.4 Langzeitperformance
Am Tag 7 und 16 des Kultivierens von Hepatozyten auf der AMPS1/1-Membran wurden die Zellfunktionen mittels des EROD-Assays, mittels Testosteronmetabolismus und GST-Expression bestimmt. Der Effekt einer Kollagenbeschichtung auf der AMPS1/1-Membran auf die Funktion der Zellen wurde ebenso untersucht. Wie bei der Petrischalenkontrolle wurde Kollagen mit 25 μg/cm² auf die Membran aufgetragen. Die Ergebnisse sind jeweils in den Tabellen 11 und 12 für den Testosteronmetabolismus gezeigt, in Tabelle 13 für die EROD-Aktivität und in Tabelle 14 für die GST-Aktivität. Sowohl nach 7 als auch nach 16 Tagen war der Gesamtmetabolismus von Testosteron geringer in Zellen kultiviert auf der Membran als in Zellen kultiviert auf der Petrischale. Die Kollagenbeschichtung der Membran verbesserte die Spanne der Metaboliten gebildet aus den Zellen, die 7 Tage auf der Membran kultiviert wurden, aber machte kaum einen Unterschied nach 16 Tagen. Am Tag 7 unterstützte die kollagenbeschichtete Membran auch Zellen, die eine geringere EROD-Aktivität zeigten, aber wieder konnte dieser Effekt nicht nach 16 Tagen beobachtet werden. Die Kollagenbeschichtung verbesserte auch die Expression von alpha-GST in Zellen kultiviert auf der AMPS1/1-Membran nach 7 Tagen, aber nicht nach 16 Tagen der Kultur. Jedoch gab es auch ein hohes Niveau von pi-GST-Expression in Zellen nach 7 Tagen Kultur auf der Kollagenbeschichteten Membran, aber keine pi-GST war nach 16 Tagen mit Kollagenbeschichtung nachweisbar.
Eine Langzeitkultur von Zellen auf der AMPS1/1-Membran zeigte, dass diese Membran lebensfähige Zellen erhalten konnte, die Testosteron und Ethoxyresorufin metabolisieren und ein hohes Level an alpha-GST- und ein niedriges Level an pi-GST-Isoenzymen über 16 Tage exprimieren. Die Kollagenbeschichtung der Membran verbesserte ihre Leistung für bis zu 7 Tage, aber nach 16 Tagen machte die Kollagenbeschichtung nur einen geringen Unterschied hinsichtlich der Enzymaktivitäten der auf der AMPS1/1-Membran kultivierten Zellen.
Tabelle 11:
Tabelle 12:
Tabelle 13:
Tabelle 14:
6.5 Morphologie
Gemäß Beispiel 6.1 isolierte und kultivierte Hepatozyten wurden auf der AMPS1/1-Membran gemäß den Beispielen 1 bis 4 aus gesät und für bis zu 20 Tage inkubiert. Einige der Membrane wurden vor der Aussaat der Zellen mit Kollagen beschichtet. Als Kontrolle wurde Hepatozyten auch auf kollagenbeschichteten Petrischalen kultiviert. Die Morphologie der Hepatozyten auf der AMPS1/1-Membran mit und ohne Kollagenbeschichtung wurde mit den Kontrolle verglichen. Die Zelllebensfähigkeit wurde nach 7, 16 und 20 Tagen der Kultur unter Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) und konfokaler Mikroskopie bestimmt. Lebensfähige Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt erhalten. Die erfindungsgemäße Membran unterstützte die Zelllebensfähigkeit, genauso wie die kollagenbeschichteten Petrischalen. Auf AMPS1/1-Membranen zeigten die Zellen eine gute Morphologie mit hochentwickelten cannaliculi biliferi.

Claims

Polymere Zusammensetzung, umfassend mindestens ein acrylisches Copolymer, das aus 90 bis 99 Mol-% einer acrylischen Monomereinheit (AC) und aus mindestens einer anionischen, wasserlöslichen Comonomereinheit aufgebaut ist, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Comonomer 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) ist.
Polymere Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein Acrylnitril-Copolymer, das aus 90 bis 99 Mol-% Acrylnitril-Monomereinheiten (AN) und aus 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) aufgebaut ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend AMPS mit einem molaren Gehalt in dem Copolymer von 1 bis 10 Mol-%, insbesondere von 3 bis 5 Mol-%.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 3, umfassend Copolymerisation von Acrylnitril-Monomeren (AN) mit mindestens einem anionischen, wasserlöslichen Comonomer in Gegenwart eines geeigneten Radikalstarters in einem geeigneten Lösungsmittel, wobei das mindestens eine Comonomer 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Radikalstarter Ammoniumperoxodisulfat (APS) ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei eine Gesamtkonzentration von Monomeren in der Reaktionslösung von 1 bis 5 mol/l, insbesondere von etwa 4 mol/l, und eine Konzen tration des Radikalstarters von 0,4 bis 4 mmol/l, insbesondere von etwa 4 mmol/l, eingestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 6, wobei das Lösungsmittel ein aprotisches Lösungsmittel, insbesondere Dimethylformamid (DMS) ist.
Material, hergestellt aus einer Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 3, für medizinische oder biologische Anwendungen, die einen direkten Kontakt des Materials mit Fluiden und/oder Zellen und/oder Geweben einschließen.
Material nach Anspruch 8, wobei das Material eine Membran, eine Folie oder eine Oberflächenbeschichtung ist.
Material nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Material als Träger für Zellen, insbesondere Gewebezellen, verwendet wird und die Zellen in Kontakt mit einem Fluidstrom stehen, welcher die Zellen mit Nährstoffen versorgt und einen Austausch von Substanzen in und aus den Zellen ermöglicht.
Material nach Anspruch 10, wobei die Gewebezellen Hepatozyten sind.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 11, wobei das Material in biohybriden oder bioartifiziellen Organen verwendet wird.
Material nach Anspruch 12, wobei das Material eine Membran mit immobilisierten Organzellen ist, wie etwa Leber-, Bauchspeicheldrüsen-, Lungenzellen, und worin die Zellen von dem Fluidstrom separiert sind.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 11, wobei das Material für medizinische Anwendungen innerhalb des Körpers eingesetzt wird, wie etwa für Implantate oder Biosensoren.
Membran, Folie oder Beschichtung, im Wesentlichen bestehend aus einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Membran, Folie oder Beschichtung, umfassend einen Blend aus einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und Polyacrylnitril (PAN).
Membran nach Anspruch 15 oder 16, hergestellt durch ein Phaseninversionsverfahren.
Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche 15 bis 17, wobei die Membran eine asymmetrische Membran ist, die eine äußere dichte Schicht mit einer mittleren Porengröße von 1 bis 50 nm umfasst, insbesondere von 3 bis 20 nm, speziell von 5 bis 12 nm.
Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche 15 bis 17, umfassend eine Flach- oder eine Hohlfasermembran mit mindestens einer zweischichtigen Querschnittsstruktur, die im Wesentlichen aus einer dichten Oberflächenschicht und einer porösen Hauptschicht besteht, welche fingerartige, mit der dichten Schicht kommunizierende Poren aufweist.
Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche 15 bis 19 mit einer Wasserflussrate durch die Membran im Bereich von 1 bis 10 l/m²hkPa, insbesondere etwa 2 l/m²hkPa.
Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche 15 bis 20 mit einem Cut-off im Bereich von 150 bis 1.000 kDa, insbesondere von 200 to 600 kDa, speziell von 300 bis 400 kDa.
Verfahren zur Herstellung einer Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche 15 bis 21, umfassend die Schritte (a) Herstellen einer Gießlösung, die eine in einem geeigneten Lösungsmittel gelöste polymere Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 3 enthält; (b) Gießen der Lösung auf einen Träger oder Extrudieren der Lösung durch eine geeignete Düse und (c) Koagulieren des Gusses oder der extrudierten Lösung in einem Koagulationsbad unter Ausbildung einer asymmetrischen Membran.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die asymmetrische Membran einer nassen Nachbehandlung in Wasser oder Dampf unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Gießlösung mit einem Feststoffgehalt der polymeren Zusammensetzung von 15 bis 25 Gew.-% hergestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 22 bis 24, wobei das Lösungsmittel ein polares Lösungsmittel ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 22 bis 25, wobei die Koagulation durch ein Nass- oder ein Nass-Trocken-Nass-Verfahren ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 22 bis 26, wobei die Gießlösung durch eine Düse eines Rohr-in-Mündung-Typs (tube-in-orifice type) extrudiert wird.