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Die
vorliegende Erfindung betrifft In-vitro-Verfahren zum Beurteilen
der Nephropathia diabetica, die das Feststellen der Schwere der
Nephropathia diabetica ermöglichen.
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Nephropathie
ist eine häufige
Komplikation bei Diabetes-Patienten und erfordert in schweren Fallen
lebenslange Hämodialyse-Behandlung.
Die notwendigen regelmäßigen Krankenhausbesuche
für die
zeitaufwändige
Hämodialyse-Behandlung
beeinträchtigen
das tägliche
Leben der Patienten. Daher ist es wichtig, Nephropathie früh zu erkennen
und ihr Voranschreiten durch Chemotherapie zu verhindern, um keine
Hämodialyse-Behandlung
durchführen
zu müssen.
Nephropathie wird herkömmlich
durch Messen des Creatinins [Y. Tsukusa et al., Nihon Rinsho, Beilage „Immuntest
mit chemischen Blut-/Urin-Untersuchungen" (Nr. 1), S. 407 (1989)] oder des Harn-Albumins
[Current Medical, Jg. 43, japanische Ausgabe, Nikkei BP (2004)]
beurteilt. Es werden eine frühere
Diagnose und eine exakte Beurteilung der Nephropathie gefordert.
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Daher
wird, wie bereits erwähnt,
ein Verfahren zur Frühdiagnose
der Nephropathia diabetica gefordert.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden heraus, dass Patienten
mit koronarer Herzkrankheit höhere
Serotoninspiegel im plättchenarmen Plasma
und niedrigere Serotoninspiegel im Vollblut als gesunde Personen
zeigen (
JP-A-2002-277461 ). Es
wird angenommen, dass in arteriosklerotischen Schädigungen
speziell stimulierte Plättchen
Serotonin freisetzen und so den Serotoninspiegel außerhalb
der Plättchen
(Serotoninspiegel im plättchenarmen
Plasma) erhöhen
und der anschließende
Verbrauch von Serotonin in den arteriosklerotischen Schädigungen
zu einer Senkung des Serotoninspiegels im Gesamtblut (Serotoninspiegel
im Vollblut) führt.
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Es
besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen der Änderung
des Blutserotoninspiegels und dem Fortschreiten einer Arteriosklerose.
Arteriosklerose ist eine mögliche
Hauptursache für
Nephropathia diabetica, die auftritt, wenn Nierenkapillaren geschädigt sind.
Daher ist der Blutserotoninspiegel als Hinweis auf Nephropathie
sehr vielversprechend. Unter diesen Umständen führten die Erfinder der vorliegenden
Erfindung umfangreiche Forschungsarbeit durch und haben die vorliegende
Erfindung realisiert.
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Und
zwar stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Beurteilen
der Nephropathia diabetica bei einem Diabetes-Patienten mit einem
Serumcreatininspiegel von höchstens
2,0 mg/dl zur Verfügung, bei
dem der Serotoninspiegel im Vollblut, Serum oder plättchenreichen
Plasma gemessen wird und der Serotoninspiegel auf einer solchen
Ebene beurteilt wird, dass je niedriger er ist, die Nephropathia
diabetica umso schwerer ist. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein
Verfahren zum Beurteilen der Nephropathia diabetica bei einem Diabetes-Patienten
mit einem Serumcreatininspiegel von höchstens 1,2 mg/dl zur Verfügung, das
das Messen des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma und das Beurteilen des
Serotoninspiegels auf einer solchen Ebene umfasst, dass je höher er ist,
die Nephropathie umso schwerer ist. Die vorliegende Erfindung stellt
außerdem
ein Verfahren zum Beurteilen der Nephropathia diabetica bei einem
Diabetes-Patienten mit einem Serumcreatininspiegel von höchstens
1,2 mg/dl zur Verfügung,
das folgende Schritte umfasst: a) Messen des Serotoninspiegels im
Vollblut, Serum oder plättchenreichen
Plasma bei einem Diabetes-Patienten mit einem Serumcreatininspiegel
von höchstens
1,2 mg/dl; b) Messen des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma bei diesem
Patienten; und c) Beurteilen des Anteils des bei b) ermittelten
Serotoninspiegels im plättchenarmen
Plasma an dem bei a) ermittelten Serotoninspiegel im Vollblut, Serum
oder plättchenreichen
Plasma auf einer solchen Ebene, dass je größer der Anteil ist, die Nephropathie
diabetica umso schwerer ist.
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1 zeigt
die Beziehung zwischen den IMT-Werten (IMT: Dicke der Halsschlagader-Intima und -Media)
und den Serotoninspiegeln im Vollblut, die im Beispiel 1 ermittelt
wurden.
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2 zeigt
die im Beispiel 2 ermittelten Serotoninspiegel im Vollblut in den
einzelnen Gruppen.
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3 zeigt
die im Beispiel 2 ermittelten Serotoninspiegel im plättchenarmen
Plasma in den einzelnen Gruppen.
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4 zeigt
die Anteile des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma am Serotoninspiegel im
Vollblut, die im Beispiel 2 ermittelt wurden, in den einzelnen Gruppen.
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung näher
beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung liefert neue Hinweise für die Beurteilung der Nephropathie
diabetica. Insbesondere ermöglicht
sie es, die Nephropathie diabetica durch Messen der Serotoninspiegel
im Vollblut, Serum oder plättchenreichen
Plasma und im plättchenarmen
Plasma zu beurteilen und ihren genauen pathologischen Zustand zu
ermitteln. Außerdem
ermöglicht
sie es, die Nephropathie diabetica anhand des Anteils des Serotoninspiegels
im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut, Serum oder plättchenreichen
Plasma zu beurteilen und ihren genauen pathologischen Zustand zu
ermitteln.
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In
der vorliegenden Erfindung ist Serum der Überstand des Bluts, der nach
der Gerinnung und Zentrifugierung erhalten wird. Da bei der Blutgerinnung
Serotonin aus den Plättchen
freigesetzt wird, widerspiegelt das Serotonin im Serum das Serotonin im
Vollblut, d. h. das Serotonin im Gesamtblut.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet plättchenreiches Plasma der Überstand
des Bluts, das mit einem Antikoagulans zur Gerinnungshemmung nach
leichtem Zentrifugieren gewonnen worden ist. „Leichtes Zentrifugieren" bedeutet Zentrifugieren
unter Bedingungen, die eine Ablagerung von Erythrozyten gestatten,
aber eine Ablagerung von Plättchen verhindern,
beispielsweise 5-minütiges
Zentrifugieren mit 450 g. Serotonin im plättchenarmen Plasma spiegelt
das Serotonin im Vollblut, d. h., das Serotonin im Gesamtblut, wider.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet plättchenarmes Plasma der Überstand
des Bluts, das mit einem Antikoagulans zur Gerinnungshemmung nach starker
Zentrifugieren gewonnen worden ist. „Starkes Zentrifugieren" bedeutet Zentrifugieren
unter Bedingungen, die eine Ablagerung aller Hämozyten, unter anderem von
Plättchen,
gestatten, beispielsweise 30-minütiges Zentrifugieren
mit 1000 g.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
erfordern das Messen des Serotoninspiegels im Vollblut, Serum oder
plättchenreichen
Plasma oder des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma. Die Messung
kann mit jedem beliebigen Verfahren ohne besondere Einschränkungen,
beispielsweise durch Flüssigchromatographie
oder Immunoassay, durchgeführt
werden. Zum Messen des Serotonins im Gesamtblut durch Flüssigchromatographie,
dem normalerweise eine Deproteinierung der Proben vorangeht, ist
es üblich,
Vollblut zu verwenden, das in einem Blutsammelrohr gesammelt worden
ist, das ein Antikoagulans als Probe enthält. Beim Messen des Serotonins
im Gesamtblut durch Immunoassay wird meistens eine Serumprobe verwendet,
die nicht durch Deproteinierung vorbehandelt worden ist.
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Beispiele
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch keineswegs auf diese speziellen
Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1 (nicht Bestandteil der vorliegenden
Erfindung)
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Bei
24 Diabetes-Patienten wurden die Serotoninspiegel im Vollblut und
im plättchenarmen
Plasma gemessen, und die Dicke der Halsschlagader-Intima und -Media
(IMT) wurde durch Sonografie gemessen. Patienten in Hämodialyse-Behandlung
wurden vorher ausgeschlossen. Die Serotoninspiegel im Vollblut und
plättchenarmen
Plasma wurden nach Y. Hirowatari et al., Clin Biochem, 37, S. 191
(2004), gemessen. Die IMT wurde an drei Stellen mit einem Aloka
SSD-1700 gemessen, und daraus wurde der Mittelwert ermittelt. Creatinin
in Serumproben wurde mit dem Reagens AquaAuto CRE-II von Kainos
gemessen. Die IMT wurde mit dem Vollblut-Serotoninspiegel, dem Serotoninspiegel
im plättchenarmen Plasma
und dem Anteil des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma am Serotoninspiegel
im Vollblut verglichen und hatte nur mit dem Blutserotoninspiegel
eine Korrelation. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Der Serotoninspiegel im Vollblut zeigte mit zunehmendem Anstieg
der IMT eine signifikante Abnahme (Korrelationskoeffizient –0,37, signifikanter
Unterschied 0,55). Die statistischen Analysen wurden mit dem Rangkorrelationstest
nach Spearman durchgeführt.
Die Volllinien in 1 geben die Korrelationslinie,
die 95-%-Konfidenzintervalle und die 95-%-Prognose-Intervalle an.
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Die
gute Korrelation zwischen dem Serotoninspiegel im Vollblut und der
IMT, die die Schwere der Arteriosklerose widerspiegelt, lässt darauf
schließen,
dass ein niedrigerer Serotoninspiegel im Vollblut möglich ist,
wenn die Arteriosklerose schwerer ist.
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Beispiel 2
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Bei
38 gesunden Personen und 52 Diabetes-Patienten wurde der Serotoninspiegel
im Vollblut und im plättchenarmen
Plasma gemessen. Bei den Diabetes-Patienten wurde auch Creatinin
gemessen. Die Messungen wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel
1 durchgeführt.
Patienten in Hämodialyse-Behandlung
wurden vorher ausgeschlossen. Alle Personen wurden in die sechs
Gruppen gesunde Personen, Diabetes-Patienten mit höchstens
1,2 mg/dl Creatinin, Diabetes-Patienten mit höchstens 2,0 mg/dl Creatinin,
Diabetes-Patienten mit höchstens
4,0 mg/dl Creatinin, Diabetes-Patienten mit höchstens 6,0 mg/dl Creatinin
und Diabetes-Patienten mit höchstens
8,0 mg/dl Creatinin eingeteilt, und diese Gruppen wurden entsprechend
als Gruppen 0 bis 5 bezeichnet. Zwischen den Gruppen wurde der Anteil
des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma
am Serotoninspiegel im Vollblut verglichen. Die Ergebnisse sind
in 2 dargestellt. 2 zeigt, dass
der Serotoninspiegel im Vollblut die Tendenz hatte, bei den Diabetes-Patienten
niedriger als bei den gesunden Personen zu sein, und dass es unter den
Diabetes-Gruppen die Tendenz gab, dass der Serotoninspiegel im Vollblut
mit steigendem Creatinin abnimmt. Der Signifikanztest ANOVA zeigte
gute signifikante Unterschiede (P = 0,003), insbesondere P < 0,05 zwischen Gruppe
0 (Gesunde) und Gruppe 1 (Creatinin höchstens 1,2 mg/dl) und zwischen Gruppe
0 (Gesunde) und Gruppe 2 (Creatinin höchstens 2,0 mg/dl). Bei Diabetes
mellitus besteht ein hohes Risiko für Nephropathie, und ein erhöhter Creatininspiegel
weist auf eine fortschreitende Nephropathia diabetica hin. Daher
widerspiegelt ein erniedrigter Serotoninspiegel im Vollblut Nephropathia
diabetica.
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Der
Serotoninspiegel im plättchenarmen Plasma
und der Anteil des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma am Serotoninspiegel
im Vollblut sind für
jede Gruppe in 3 bzw. 4 gezeigt.
Die 3 und 4 zeigen, dass es einige Fälle in den Gruppen
1 (Creatinin höchstens
1,2 mg/dl) bis 4 (Creatinin höchstens
6,0 mg/dl) gibt, die deutlich höhere
Werte (einen Serotoninspiegel im plättchenarmen Plasma von mindestens
20 mmol/l und einen Anteil des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma
am Serotoninspiegel im Vollblut von mindestens 5%) als gesunde Personen
(Gruppe 1) zeigten. Die meisten von ihnen waren in Gruppe 1 (Creatininspiegel
höchstens
1,2 mg/dl) zu finden, die 8 Patienten mit einem Serotoninspiegel
im plättchenarmen Plasma
von 20 mmol/l oder mehr und 4 Patienten mit einem Anteil des Serotoninspiegels
im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut von 5% oder mehr enthielt.
Hingegen enthielt Gruppe 5 keine Patienten mit einem Serotoninspiegel
im plättchenarmen
Plasma von 20 mmol/l oder mehr und einem Anteil des Serotoninspiegels
im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut von 5% oder mehr. Das lässt darauf
schließen,
dass der Serotoninspiegel im plättchenarmen
Plasma und der Anteil des Serotoninspiegels im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut im Anfangsstadium der Nephropathia
diabetica steigen und dann mit fortschreitender Nephropathie wieder
normal werden.
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Der
Serotoninspiegel im Vollblut war in Gruppe 5 wesentlich niedriger
als bei gesunden Personen. Es wird angenommen, dass im Anfangsstadium
der Nephropathia diabetica starke lokale Gefäßentzündungen auftreten, sodass es
zu einer Aktivierung der Plättchen
in den entzündeten
Bereichen kommt und dadurch der Serotoninspiegel im plättchenarmen Plasma
ansteigt und dass in den späteren
Phasen der Nephropathia diabetica (im chronischen Stadium der Arteriosklerose)
die lokalen Gefäßentzündungen von
zahlreichen schwachen Entzündungen
in allen Blutgefäßen abgelöst werden,
wobei es nicht zu einer Stimulation von Plättchen kommt, was zu einem
Anstieg des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma führt, sondern
der Serotoninspiegel im Vollblut durch den Verbrauch von Serotonin
in so vielen entzündeten
Bereichen sinkt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine frühe Nephropathia
diabetica durch den Serotoninspiegel im plättchenarmen Plasma oder den
Anteil des Serotoninspiegels im plättchenarmen Plasma am Serotoninspiegel
im Vollblut erkannt werden kann. Außerdem kann der genaue pathologische
Zustand der Nephropathia diabetica durch Messen des Serotoninspiegels
im plättchenarmen
Plasma oder des Anteils des Serotoninspiegels im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut sowie des Serotoninspiegels
im Vollblut ermittelt werden.
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Mit
den statistischen ANOVA-Analysen wurde zwar kein signifikanter Unterschied
für den
Serotoninspiegel im plättchenarmen
Plasma oder den Anteil des Serotoninspiegels im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut ermittelt, aber der Vergleich
der einzelnen Gruppen mittels t-Test zeigte einen signifikanten
Unterschied von P ≤ 0,05
zwischen Gruppe 0 (gesunde Personen) und Gruppe 1 (Creatinin höchstens
1,2 mg/dl) beim Serotoninspiegel im plättchenarmen Plasma und zwischen
Gruppe 0 (gesunde Personen) und den Gruppen 1, 2, 4 und 5 beim Anteil
des Serotoninspiegels im plättchenarmen
Plasma am Serotoninspiegel im Vollblut.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
es, die Nephropathia diabetica mühelos
zu beurteilen, und sie ist insbesondere insofern zweckmäßig, als
die Nephropathia diabetica durch Messen der Serotoninspiegel im
Vollblut, Serum oder plättchenreichen Plasma
und im plättchenarmen
Plasma beurteilt werden kann und ihr genauer pathologischer Zustand
ermittelt werden kann. Außerdem
ist sie auch insofern zweckmäßig, als
die Nephropathia diabetica anhand des Anteils des Serotoninspiegels
im plättchenarmen Plasma
am Serotoninspiegel im Vollblut, Serum oder plättchenreichen Plasma beurteilt
werden kann und ihr genauer pathologischer Zustand ermittelt werden kann.