DE602004004134T2

DE602004004134T2 - 2-methylen-19-nor-20(s)-25-methyl-1alpha-hydroxycalciferol und seine verwendungen

Info

Publication number: DE602004004134T2
Application number: DE602004004134T
Authority: DE
Inventors: F. Hector Deerfield DELUCA; K. Pawel Madison GRZYWACZ
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2004-07-06
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2024-07-07
Also published as: JP2007527399A; AU2004260642B2; ES2277293T3; ATE350043T1; WO2005011706A1; DK1641466T3; EP1641466A1; AU2004260642A1; MXPA06000060A; EP1641466B1; CA2531294A1; DE602004004134D1; JP4619360B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft Vitamin D-Derivate, die am Kohlenstoff in der 2-Position substituiert sind, und insbesondere 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol und dessen pharmazeutische Verwendungen.
Das natürliche Hormon 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ und sein Analoges der Ergosterol-Reihe, d. h. 1α,25-Dihydroxyvitamin D₂, stellen bekanntlich hochwirksame Regulatoren der Calciumhomöostase bei Tieren und Menschen dar und ihre Aktivität bei der zellulären Differenzierung wurde ebenfalls festgestellt; Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd, 84 (1987), S. 2610. Zahlreiche Strukturanaloge dieser Metaboliten wurden hergestellt und getestet, einschließlich 1α-Hydroxyvitamin D₃, 1α-Hydroxyvitamin D₂, verschiedene Vitamine mit homologen Seitenketten und fluorierte Analoge. Einige dieser Verbindungen weisen eine interessante Trennung der Aktivitäten bei der Zelldifferenzierung und der Calciumregulierung auf. Dieser Aktivitätsunterschied kann bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, wie renale Osteodystrophie, gegen Vitamin D resistente Rachitis, Osteoporose, Psoriasis und bestimmten malignen Zuständen, wertvoll sein.
Kürzlich wurde eine neue Klasse von Vitamin D-Analogen aufgefunden, d. h. die sog. 19-Norvitamin D-Verbindungen, die durch den Ersatz der exocyclischen Methylengruppe am A-Ring (Kohlenstoff 19), der für das Vitamin D-System typisch ist, durch zwei Wasserstoffatome charakterisiert sind. Ein biologischer Test von derartigen 19-Nor-Analogen (z. B. 1α,25-Dihydroxy-19-nor-vitamin D₃) ergab ein selektives Aktivitätsprofil mit starker Wirkung bei der Induktion der zellulären Differenzierung und einer sehr geringen Calcium-Mobilisierungsaktivität. Somit stellen diese Verbindungen potentiell wertvolle Therapeutika zur Behandlung von malignen Zuständen oder zur Behandlung verschiedener Hautstörungen dar. Es wurden zwei verschiedene Verfahren zur Synthese derartiger 19-Norvitamin D-Analogen beschrieben (Perlman et al., Tetrahedron Lett., Bd. 31 (1990), S. 1823; Perlman et al., Tetrahedron Lett., Bd. 32 (1991), S. 7663; und DeLuca et al., US-Patent 5 086 191).
Im US-Patent 4 666 634 wurden 2β-Hydroxy- und Alkoxy-Analoge (z. B. ED-71) von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ beschrieben und von der Chugai-Gruppe als potentielle Arzneistoffe für Osteoporose und als Antitumormittel geprüft; vergl. auch Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 163 (1989), S. 1444. Weitere in der 2-Stellung des A-Rings substituierte (mit Hydroxyalkyl, z. B. ED-120, und Fluoralkylgruppen) Analoge von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ wurden ebenfalls hergestellt und getestet (Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull., Bd. 41 (1993), 5. 1111, Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl., Bd. 1 (1993), S. 190; Posner et al., J. Org. Chem , Bd. 59 (1994), S. 7855; und J. Org. Chem , Bd. 60 (1995), S. 4617.
Kürzlich wurden auch 2-substituierte Analoge von 1α,25-Dihydroxy-19-nor-vitamin D₃ synthetisiert, d. h. Verbindungen, die in der 2-Position mit Hydroxy- oder Alkoxygruppen substituiert sind (DeLuca et al., US-Patent 5 536 713), die interessante und selektive Aktivitätsprofile aufweisen. Alle diese Studien zeigen, dass die Bindungsstellen in Vitamin D-Rezeptoren verschiedene Substituenten an C-2 in den synthetisierten Vitamin D-Analogen aufnehmen können.
In der Fortsetzung der Bemühungen zur Erforschung der 19-Nor-Klasse von pharmakologisch wichtigen Vitamin D-Verbindungen wurden nunmehr Analoge davon, die durch die Anwesenheit eines Alkylidensubstituenten (insbesondere Methylen) am Kohlenstoff 2 (C-2) charakterisiert sind, d. h. 2-Alkyliden-19-nor-vitamin D-Verbindungen, synthetisiert und getestet. Von besonderem Interesse sind die Analogen, die durch die Transpositionen der exocyclischen Methylengruppe des A-Rings, die im normalen Vitamin D-Gerüst vorhanden ist, vom Kohlenstoff 10 (C-10) zum Kohlenstoff 2 (C-2) charakterisiert sind, d. h. 2-Methylen-19-nor-vitamin D-Verbindungen. Derartige Vitamin D-Analoge erschienen als interessante Ziele, da die relativ kleine Alkylidengruppe (insbesondere Methylen) an C-2 die Bindung an den Vitamin D-Rezeptor nicht beeinträchtigen sollte. Außerdem zeigen molekülmechanische Untersuchungen, die an modellhaften 1α-Hydroxy-2-methylen-19-nor-Vitaminen durchgeführt worden sind, dass eine molekulare Modifikation die Konformation des Cyclohexandiolrings A nicht wesentlich verändern sollte. Jedoch verändert die Einführung der 2-Methylengruppe in das 19-Nor-vitamin D-Kohlenstoffgerüst den Charakter seiner 1α- und 3β-A-Ringhydroxylgruppen. Sie befinden sich nunmehr beide in Allylpositionen, ähnlich der 1α-Hydroxylgruppe (die für die biologische Aktivität entscheidend ist) im Molekül des natürlichen Hormons 1α,25-(OH)₂D₃.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol, dessen biologische Aktivität und verschiedene pharmazeutische Verwendungen dieser Verbindung (nachstehend als "TMM" bezeichnet) abgestellt. Im Gegensatz zu 2-Methylen-19-nor-(20S)-1α,25-dihydroxycholecalciferol weist TMM keine 25-Hydroxylgruppe auf und im Gegensatz zu 2-Methylen-19-nor-(20S)-1α-hydroxycholecalciferol kann TMM in vivo aufgrund der Anwesenheit einer 25-Methylgruppe nicht in der 25-Stellung hydroxyliert werden.
Strukturell ist dieses 19-Nor-Analoge durch die folgende allgemeine Formel I charakterisiert:
Die vorstehende neue Verbindung weist ein erwünschtes und hochgradig vorteilhaftes biologisches Aktivitätsmuster auf. Diese Verbindung ist durch eine relativ hohe intestinale Calcium-Transportaktivität charakterisiert, verglichen mit der Aktivität von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, während es ferner eine relativ geringe Aktivität, verglichen mit 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ in bezug auf seine Fähigkeit zur Mobilisierung von Calcium aus Knochen besitzt. Somit ist diese Verbindung in ihrer calcämischen Aktivität hochgradig spezifisch. Ihre bevorzugte Aktivität in bezug auf den intestinalen Calciumtransport ermöglicht eine in vivo-Verabreichung dieser Verbindung zur Behandlung von metabolischen Knochenkrankheiten, bei denen ein Knochenverlust eine Hauptsorge darstellt. Aufgrund seiner intestinalen calcämischen Aktivität stellt diese Verbindung ein bevorzugtes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Krankheiten dar, bei denen eine Knochenbildung erwünscht ist, z. B. bei Osteoporose, insbesondere bei Osteoporose mit geringem Knochen- Turnover, durch Steroide induzierter Osteoporose, seniler Osteoporose oder postmenopausaler Osteoporose, sowie bei Osteomalazie und renaler Osteodystrophie. Die Behandlung kann transdermal, oral oder parenteral erfolgen. Die Verbindungen können in einer Zusammensetzung in einer Menge von 0,01 bis 100 μg pro Gramm Zusammensetzung, vorzugsweise von 0,1 bis 50 μg pro Gramm Zusammensetzung, vorliegen und können in Dosierungen von 0,01 μg/Tag bis 100 μg/Tag und vorzugsweise von 0,1 μg/Tag bis 50 μg/Tag verabreicht werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung eignet sich insbesondere zur Therapie und Prophylaxe von humanen Störungen, die durch ein Ungleichgewicht im Immunsystem charakterisiert sind, z. B. bei Autoimmunkrankheiten, einschließlich multipler Sklerose, Diabetes mellitus, Host-versus-graft-Reaktionen und Transplantatabstoßungen; und zusätzlich zur Behandlung von entzündlichen Krankheiten, wie rheumatoider Arthritis, Asthma und entzündlichen Darmkrankheiten, wie Zöliakie und Morbus-Crohn, sowie zur Verbesserung der Heilung von Knochenfrakturen und für verbesserte Knochentransplantate, Akne, Alopezie, Hautzustände, wie trockene Haut (Mangel an dermaler Hydratisierung), unangemessene Hautschlaffheit (unzureichende Hautfestigkeit), unzureichende Talgsekretion und Falten sowie Hochdruck stellen weitere Zustände dar, die mit der erfindungsgemäßen Verbindung behandelt werden können.
Die vorstehende Verbindung ist ferner durch ihre hochgradige Zelldifferenzierungsaktivität charakterisiert. Somit stellt die Erfindung ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Psoriasis oder ein Antikrebsmittel dar, insbesondere gegen Leukämie, Kolonkrebs, Brustkrebs und Prostatakrebs. Die Verbindung kann in einer Zusammensetzung zur Behandlung von Psoriasis und/oder Krebs in einer Menge von 0,01 bis 100 μg pro Gramm Zusammensetzung vorliegen und sie kann topisch, transdermal, oral oder parenteral in Dosierungen von 0,01 μg/Tag bis 100 μg/Tag verabreicht werden.
Erfindungsgemäß werden ferner eine neuartige Synthese zur Herstellung des Endprodukts der Strukturformel I sowie ein neues Ketonzwischenprodukt, das während der Synthese gebildet wird, bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm zur Erläuterung der relativen Aktivität von 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol oder 1α,25- Dihydroxyvitamin D₃ bezüglich der Konkurrenz um die Bindung von [3H]-1,25-(OH)₂-D₃ an den nuklearen Vitamin D-Schweinedarm-Rezeptor.
2 ist ein Diagramm zur Erläuterung der prozentualen HL-60-Zelldifferenzierung als eine Funktion der Konzentration von 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol oder 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃.
3 ist ein Diagramm zur Erläuterung der Konzentration an Calcium im Serum im zeitlichen Verlauf bei Mäusen, denen Träger plus Alendronat, 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ plus Alendronat oder 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol (TMM) plus Alendronat verabreicht worden ist. Da Alendronat die Knochenresorption blockiert, spiegelt der Anstieg des Calciums im Serum nur die intestinale Resorption wieder.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendete Ausdruck "Hydroxyschutzgruppe" bedeutet eine beliebige Gruppe, die üblicherweise für den zeitweiligen Schutz von Hydroxyfunktionen verwendet wird, z. B. Alkoxycarbonyl-, Acyl-, Alkylsilyl- oder Alkylarylsilylgruppen (nachstehend einfach als "Silyl"-Gruppen bezeichnet) und Alkoxyalkylgruppen. Alkoxycarbonyl-Schutzgruppen sind Alkyl-O-CO-Gruppen, wie Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, Butoxycarbonyl, Isobutoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder Allyloxycarbonyl. Der Ausdruck "Acyl" bedeutet eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in allen ihren isomeren Formen oder eine Carboxyalkanoylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Oxalyl, Malonyl, Succinyl oder Glutaryl, oder eine aromatische Acylgruppe, wie Benzoyl, oder eine halogen-, nitro- oder alkylsubstituierte Benzoylgruppe. Der Ausdruck "Alkyl", der in der Beschreibung oder den Ansprüchen verwendet wird, bedeutet einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen in allen seinen isomeren Formen. Alkoxyalkyl-Schutzgruppen sind Gruppen, wie Methoxymethyl, Ethoxymethyl, Methoxyethoxymethyl oder Tetrahydrofuranyl und Tetrahydropyranyl. Bevorzugte Silyl-Schutzgruppen sind Trimethylsilyl, Triethylsilyl, tert.-Butyldimethylsilyl, Dibutylmethylsilyl, Diphenylmethylsilyl, Phenyldimethylsilyl, Diphenyltert.-butylsilyl und analoge alkylierte Silylreste. Der Ausdruck "Aryl" bedeutet eine Phenylgruppe oder eine alkyl-, nitro- oder halogensubstituierte Phenylgruppe.
Bei einer "geschützten Hydroxygruppe" handelt es sich um eine Hydroxygruppe, die mit einer beliebigen der vorstehenden Gruppen, die üblicherweise für den zeitweiligen oder dauerhaften Schutz von Hydroxylfunktionen derivatisiert oder geschützt sind, z. B. Silyl-, Alkoxyalkyl-, Acyl- oder Alkoxycarbonylgruppen gemäß der vorstehenden Definition. Die Ausdrücke "Hydroxyalkyl", "Deuteroalkyl" und "Fluoroalkyl" bedeuten einen Alkylrest, der mit einer oder mehreren Hydroxy-, Deuterium- bzw. Fluorgruppen substituiert ist.
Die Herstellung von 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol mit der Grundstruktur I lässt sich nach einem üblichen allgemeinen Verfahren durchführen, d. h. durch Kondensation eines bicyclischen Ketons II vom Windaus-Grundmann-Typ mit dem Allylphosphinoxid III unter Bildung des entsprechenden 2-Methylen-19-nor-Vitamin D-Analogen IV, wonach sich die Schutzgruppenentfernung an C-1 und C-3 an der letztgenannten Verbindung anschließt:
In den Strukturformeln III und IV bedeuten die Gruppen Y₁ und Y₂ vorzugsweise Hydroxyschutzgruppen, wobei darauf hinzuweisen ist, dass etwaige Funktionalitäten, die empfindlich sein können, oder die Kondensationsreaktion stören, in geeigneter Weise geschützt werden, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist. Das vorstehend dargestellte Verfahren stellt eine Anwendung des konvergenten Synthesekonzepts dar, das in wirksamer Weise zur Herstellung von Vitamin D-Verbindungen angewandt worden ist (z. B. Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, (1978), S. 590; Lythgoe, Chem. Soc. Rev., Bd. 9 (1983), S. 449; Toh et al., J. Org. Chem , Bd. 48 (1983), S. 1414; Baggiolini et al., J. Org. Chem , Bd. 51 (1986), S. 3098; Sardina et al., J. Org. Chem , Bd. 51 (1986), S. 1264; J. Org. Chem , Bd. 51 (1986), S. 1269; DeLuca et al., US-Patent 5 086 191; DeLuca et al., US-Patent 5 536 713).
Hydrindanone der allgemeinen Strukturformel II lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen. Ein spezielles Verfahren beginnt mit der Ozonisierung von Vitamin D₂ und wird hier unter Bezugnahme auf die Schemata 1 und 2 beschrieben und erläutert.
Zur Herstellung der erforderlichen Phosphinoxide der allgemeinen Strukturformel III wurde ein neuer Syntheseweg entwickelt, der vom Methylchinicat-Derivat ausgeht, das sich leicht aus handelsüblicher (1R,3R,4S,5R)-(-)-Chinasäure gemäß Perlman et al., Tetrahedron Lett., Bd. 32 (1991), S. 7663, und DeLuca et al., US-Patent 5 086 191, erhalten lässt. Das Gesamtverfahren zur Umwandlung des Ausgangsmethylesters in die erwünschten A-Ringsyntone wird nachstehend unter Bezugnahme auf diese beiden Literaturstellen ausführlich zusammengestellt. Die letzte Stufe bei der Synthese besteht typischerweise in der Hydrolyse der Hydroxyschutzgruppen unter Bildung von 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol (TMM).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. In diesen Beispielen beziehen sich spezielle Produkte, die durch arabische Ziffern (z. B. 1, 2, 3 und dergl.) bezeichnet werden, auf spezielle Strukturen, die in der vorausgehenden Beschreibung und im Schema 1, Schema 2 und Schema 3 mit den gleichen Ziffern bezeichnet werden. Für Beispiel 1 wird auf die Schemata 1 und 2 und für Beispiel 2 auf das Schema 3 Bezug genommen.
Beispiel 1
Herstellung von (20S)-De-A,B-8β-(tert.-butyldimethylsilyl)-oxy-20-(hydroxymethyl)-pregnan (2)
Ozon wurde durch eine Lösung von Vitamin D₂ (3 g, 7,6 mmol) in Methanol (250 ml) und Pyridin (2,44 g, 2,5 ml, 31 mmol) 50 Min. bei –78 °C geleitet. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 15 Min. mit Sauerstoff gespült, um restliches Ozon zu entfernen. Anschließend wurde die Lösung mit NaBH₄ (0,75 g, 20 mmol) behandelt. Nach 20 Min. wurde eine zweite Portion von NaBH₄ (0,75 g, 20 mmol) zugegeben und man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen. Eine dritte Portion NaBH₄ (0,75 g, 20 mmol) wurde sodann zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser (40 ml) abgeschreckt und die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (3 × 80 ml) extrahiert und die vereinigte organische Phase wurde mit wässriger 1 M HCl und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat (75:25) chromatographiert. Man erhielt (20S)-De-A,B-20-(hydroxymethyl)-pregnan-8β-ol 1 (1,21 g, Ausbeute 75 %) in Form von weißen Kristallen.
Tert.-Butyldimethylsilyltrifluormethansulfonat (3,24 ml, 3,72 g, 14,1 mmol) wurde zu einer Lösung des 8β,20-Diols 1 (1g, 4,7 mmol) und 2,6-Lutidin (1,64 ml, 1,51 g, 14,1 mmol) in wasserfreiem DMF (15 ml) von 0 °C gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Argon bei 0 °C und sodann 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser (50 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat (3 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in wasserfreiem THF (8 ml) gelöst und mit Triethylamin (3 ml, 2,17 g, 21,5 mmol) und einer Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF, 6,5 ml, 6,5 mmol) versetzt, wonach frisch aktivierte Molekularsiebe 4A (3 g) zugegeben wurden. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt, anschließend durch eine kurze Celite-Schicht filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (30 ml) gelöst, mit Kochsalzlösung und Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der reine Alkohol 2 (1,42 g, Ausbeute 93 %) wurde durch Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat (97,5:2,5→95:5) isoliert. Man erhielt ein farbloses Öl: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 4,00 (1H, d, J=2,4 Hz, 8α-H), 3,63 (1H, dd, J=10,5, 3,2 Hz, 22-H), 3,39 (1H, dd, J=10,5, 6,8 Hz, 22-H), 1,94 (1H, br d, J=12,5 Hz), 1,02 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H₃), 0,924 (3H, s, 18-H₃), 0,882 (9H, s, Si-tert.-Bu), 0,005 und - 0,010 (jeweils 3H, jeweils s, jeweils Si-Me); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 69,29 (d, C-8), 67,94 (t, C-22), 53,06 (d), 52,80 (d), 42,12 (s, C-13), 40,54 (t), 38,27 (d), 34,39 (t), 26,79 (t), 25,79 (q, SiCMe₃), 23,08 (t), 18,00 (s, SiCMe₃), 17,61 (t), 16,65 (q, C-21), 13,75 (q, C-18), -4,81 und -5,18 (jeweils q, jeweils SiMe).
Herstellung von (20S)-De-A,B-8β-(tert.-butyldimethylsilyl)-oxy-20-formylpregnan (3)
Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex (1,32 g, 8,28 mmol) wurde zu einer Lösung des Alkohols 2 (451 mg, 1,38 mmol) und Triethylamin (960 μl, 697 mg, 6,9 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (20 ml) und wasserfreiem DMSO (5 ml) von 0 °C gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 20 min bei 0 °C unter Argon gerührt und sodann eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat (95:5) gereinigt. Man erhielt den Aldehyd 3 (364 mg, Ausbeute 81 %) in Form eines Öls: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9,55 (1H, d, J=3,1 Hz, CHO), 4,00 (1H, s, 8α-H), 2,33 (1H, m, 20-H), 1,89 (1H, dm, J=12,4 Hz), 1,07 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H₃), 0,939 (3H, s, 18-H₃), 0,862 (9H, s, Si-tert.-Bu), -0,009 und -0,026 (jeweils 3H, jeweils s, jeweils Si-Me); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 205,37 (d, CHO), 68,99 (d, C-8), 52,28 (d), 51,58 (d), 49,15 (d), 42,58 (s, C-13), 40,35 (t), 34,29 (t), 26,16 (t), 25,74 (q, SiCMe₃), 23,27 (t), 17,96 (s, SiCMe₃), 17,52 (t), 14,04 (q, C-21), 13,28 (q, C-18), -4,85 und -5,23 (jeweils q, jeweils SiMe).
Herstellung von (20R)-De-A,B-8β-(tert.-butyldimethylsilyl)-oxy-20-(hydroxymethyl)-pregnan (4)
Der Aldehyd 3 (364 mg, 1,12 mmol) wurde in Methylenchlorid (15 ml) gelöst und mit einer 40 %-igen wässrigen n-Bu₄NOH-Lösung (1,47 ml, 1,45 g, 2,24 mmol) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 16 Stunden unter Argon bei Raumtemperatur gerührt, mit Methylenchlorid (20 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat (95:5) chromatographiert. Man erhielt ein Gemisch aus dem Aldehyd 3 und dessen 20-Epimerem (292 mg, Ausbeute 80 %) in einem Verhältnis von etwa 1:2 (durch ¹H-NMR).
Dieses Gemisch von Aldehyden (292 mg, 0,9 mmol) wurde in THF (5 ml) gelöst und mit NaBH₄ (64 mg, 1,7 mmol) versetzt, wonach sich die tropfenweise Zugabe von Ethanol (5 ml) anschloss. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 30 min bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit einer gesättigten wässrigen NH₄Cl-Lösung abgeschreckt. Das Gemisch wurde mit Ether (3×20 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat (96:4→80:20) chromatographiert. Man erhielt den angestrebten, reinen (20R)-Alkohol 4 (160 mg, Ausbeute 55%) in Form eines Öls sowie ein Gemisch aus 4 und dessen 20-Epimerem 2 (126 mg, Ausbeute 43%) in einem Verhältnis von etwa 1:3 (durch ¹H-NMR).
¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 4,00 (1H, d, J=1,9 Hz, 8α-H), 3,70 (1H, dd, J=10,6, 3,2 Hz, 22-H), 3,43 (1H, dd, J=10,6, 7,0 Hz, 22-H), 0,94 (3H, d, J=6,7 Hz, 21-H₃), 0,927 (3H, s, 18-H3), 0,884 (9H, s, Si-tert.-Bu), 0,007 und -0,006 (jeweils 3H, jeweils s, Si-Me); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 69,30 (d, C-8), 66,83 (t, C-22), 53,02 (d), 52,96 (d), 41,91 (s, C-13), 40,12 (t), 37,48 (d), 34,38 (t), 26,71 (t), 25,79 (q, SiCMe₃), 22,85 (t), 18,01 (s, SiCMe₃), 17,64 (t), 16,58 (q, C-21), 14,07 (q, C-18), -4,81 und -5,18 (jeweils q, jeweils SiMe).
Herstellung von (20R)-De-A,B-8β-(tert.-butyldimethylsilyl)-oxy-20-[(p-toluolsulfonyl)-oxymethyl]-pregnan (5)
Eine gerührte Lösung des Alkohols 4 (134 mg, 0,41 mmol), von 4-Dimethylaminopyridin (10 mg, 0,08 mmol) und Triethylamin (258 μl, 187 mg, 1,85 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (6 ml) wurde bei 0 °C mit p-Toluolsulfonylchlorid (118 mg, 0,62 mmol) versetzt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen (4 Stunden) und rührte es weitere 22 Stunden. Methylenchlorid (20 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet (Na2SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat (95:5) chromatographiert. Man erhielt das Tosylat 5 (192 mg, Ausbeute 98 %) in Form eines farblosen Öls: [α]_D + 15,7° (c 1,0, CHCl₃); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,78 (2H, d, J=8,2 Hz, o-H_T _S), 7,33 (2H, d, J=8,2 Hz, m-H_T _S), 4,11 (1H, dd, J=9,3, 3,4 Hz, 22-H), 3,96 (1H, d, J=2,1 Hz, 8α-H), 3,77 (1H, dd, J=9,3, 7,4 Hz, 22-H), 2,443 (3H, s, Me_TS), 0,87 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-H3), 0,864 (9H, s, Sitert.-Bu), 0,810 (3H, s, 18-H₃), -0,009 und -0,027 (jeweils 3H, jeweils s, jeweils Si-Me); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 144,55 (s, p-C_TS), 133,06 (s, i-C_TS), 129,70 (d, m-C_TS), 127,91 (d, o-C_TS), 74,26 (t, C-22), 69,09 (d, C-8), 52,65 (d), 52,51 (d), 41,7 (s, C-13), 39,83 (t), 34,65 (d), 34,16 (t), 26,60 (t), 25,74 (q, SiCMe₃), 22,65 (t), 21,61 (q, Mc_TS), 17,86 (s, SiCMe₃), 17,48 (t), 16,65 (q, C-21), 13,99 (q, C-18), -4,86 und -5,23 (jeweils q, jeweils SiMe); MS (EI) m/z no M⁺, 437 (2, M⁺ – C₃H₇), 423 (1, M⁺ – C₄H₉), 348 (2, M⁺ – tert.-BuMe₂SiOH), 309 (2, M⁺ – OSO₂C₆H₄CH₃), 229 (76), 177 (100, M⁺ – tert.-BuMe₂SiOH – OSO₂C₆H₄CH₃), 135 (33), 121 (38), 107 (27), 95 (41); genaue Masse berechnet für C₂₂H₃₅O₄SSi (M⁺ – C₄H₉) 423,2025, gefunden 423,2036.
Herstellung von (20S)-De-A,B-8β-(tert.-butyldimethylsilyl)-oxy-25-methylcholestan (8)
Magnesiumspäne (0,53 g, 22 mmol), 1-Chlor-3,3-dimethylbutan 6 (1,32 g, 11 mmol) und Iod (2 Kristalle) wurden 6 Stunden in wasserfreiem THF (15 ml) unter Rückfluss erwärmt. Die Lösung des gebildeten Grignard-Reagenz 7 wurde auf –78 °C abgekühlt und tropfenweise über eine Kanüle mit einer Lösung des Tosylats 5 (183 mg, 0,38 mmol) in wasserfreiem THF (3 ml) bei –78 °C versetzt. Anschließend wurden 6 ml einer Lösung von Li₂CuCl₄ (hergestellt durch Lösen von trockenem LiCl (232 mg, 5,46 mmol) und trockenem CuCl₂ (368 mg, 2,75 mmol) in wasserfreiem THF (27 ml) tropfenweise über eine Kanüle dem Reaktionsgemisch bei –78 °C zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt und das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann in eine wässrige 1 M H₂SO₄-Lösung (25 ml) mit einem Gehalt an Eis (etwa 100 g) gegossen. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid (3×50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter wässriger NH₄Cl-Lösung und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit Hexan chromatographiert. Man erhielt das Produkt 8 (130 mg, Ausbeute 87 %) in Form eines farblosen Öls: [α]D + 19,9° (c 2,2, CHCl₃); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 4,00 (1H, d, J=1,5 Hz, 8α-H), 1,94 (1H, dm, J=12,5 Hz), 0,915 (3H, s, 18-H₃), 0,891 (9H, s, Si-tert.-Bu), 0,866 (9H, s, 25-Me₃), 0,81 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-H₃), 0,010 und -0,002 (jeweils 3H, jeweils s, jeweils Si-Me); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 69,52 (d, C-8), 56,46 (d), 53,17 (d), 44,57 (t), 42,20 (s, C-13), 40,68 (t), 36,17 (t), 34,82 (d), 34,51 (t), 30,36 (s, C-25), 29,47 (q, 25-Me₃), 27,27 (t), 25,82 (q, SiCMe₃), 23,01 (t), 20,99 (t), 18,60 (q, C-21), 18,03 (s, SiCMe₃), 17,76 (t), 14,00 (q, C-18), -4,78 und -5,18 (jeweils q, jeweils SiMe); MS (EI) m/z no M⁺, 379 (11, M⁺ – CH₃), 351 (3, M⁺ -), 337 (72), 319 (2), 292 (10), 261 (66), 247 (10), 159 (17), 135 (27), 75 (100); genaue Masse berechnet für C₂₄H₄₇OSi (M⁺ – CH₃) 379,3396, gefunden 379,3398.
Herstellung von (20S)-De-A,B-25-methylcholestan-8β-ol (9)
Der geschützte Alkohol 8 (100 mg, 254 μmol) wurde in wasserfreiem Methanol (5 ml) gelöst und mit Fluorwasserstoff-Pyridin (2,5 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 3 Tage bei Raumtemperatur unter Argon gerührt und sodann mit Ethylacetat (20 ml) versetzt. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung und Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Hexan verdünnt und an Kieselgel mit Hexan chromatographiert, um das Substrat 8 (16 mg) zu gewinnen. Nach Elution mit Hexan/Ethylacetat (8:2) erhielt man den reinen Alkohol 9 (58 mg, Ausbeute 82 %) in Form eines farblosen Öls:
[α]D + 8,2° (c 1,15, CHCl₃); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) 4,07 (1H, s, 8α-H), 1,98 (1H, dm, J=12,2 Hz), 0,928 (3H, s, 18-H₃), 0,861 (9H, s, 25-Me₃), 0,82 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-H₃), ¹³C-NMR (125 MHz) δ 69,46 (d, C-8), 56,32 (d), 52,68 (d), 44,56 (t), 41,89 (s, C-13), 40,31 (t), 36,09 (t), 34,82 (d), 33,59 (t), 30,35 (s, C-25), 29,45 (q, 25-Me₃), 27,12 (t), 22,43 (t), 20,96 (t), 18,54 (q, C-21), 17,50 (t), 13,74 (q, C-18); MS (EI) m/z 280 (34,M⁺), 265 (15, M⁺ – Me), 247 (18), 237 (1), 166 (28), 135 (30), 111 (100), 97 (37), 81 (23); genaue Masse berechnet für C₁₉H₃₆O (M⁺) 280,2766, gefunden 280,2753.
Herstellung von (20S)-De-A,B-25-methylcholestan-8-on (II)
Pyridiniumdichromat (102 mg, 271 μmol) wurde zu einer Lösung des Alkohols 9 (19 mg, 68 μmol) und von Pyridinium-p-toluolsulfonat (2 mg, 8 μmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (6 ml) gegeben. Die erhaltene Suspension wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Waters-Silica-Sep-Pak-Patrone (2 g) filtriert. Die Patrone wurde mit Hexan/Ethylacetat (8:2) gewaschen. Nach Entfernen der Lösungsmittel erhielt man das Keton II (16 mg, Ausbeute 85%) in Form eines farblosen Öls: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 2,45 (1H, dd, J=11,5, 7,7 Hz), 0,875 (9H, s, 25-Me₃), 0,86 (3H, d, J=5,9 Hz, 21-H₃), 0,638 (3H, s, 18-H₃); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 212,18 (C-8), 62,06, 56,25, 49,95 (C-13), 44,52, 40,96, 38,85, 36,30, 34,90, 30,35 (C-25), 29,42 (25-Me₃), 27,21, 24,06, 20,89, 18,95 (C-21), 18,49, 12,68 (C-18); MS (EI) m/z 278 (66, M⁺), 263 (79, M⁺ – Me), 245 (10, M⁺ – Me – H₂O), 235 (84, M⁺ – Me – CO), 179 (12, M⁺ – C₇H₁₅), 166 (25), 152 (49, M⁺ – C₉H₁₈), 124 (100, M⁺ – CO – C₉H₁₈), 111 (96), 96 (42), 81 (30); genaue Masse berechnet für C₁₉H₃₄O 278,2610, gefunden 278,2606.
Beispiel 2
Herstellung von (205)-2-Methylen-19-nor-25-methyl-1α-hydroxycalciferol (I)
Eine Lösung des Phosphinoxids 10 (45 mg, 77 μmol) in wasserfreiem THF (500 μl) wurde bei –20 °C langsam mit PhLi (1,56 M in Cyclohexan-Ether, 100 μl, 156 μmol) unter Argon und unter Rühren versetzt. Die Lösung färbte sich tief orangefarben. Nach 30 Minuten wurde das Gemisch auf –78 °C gekühlt und mit einer vorgekühlten (–78 °C) Lösung des Ketons II (17 mg, 61 μmol) in wasserfreiem THF (200 + 100 μl) langsam versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden unter Argon bei –78 °C und 18 Stunden bei 0 °C gerührt. Nach Zugabe von Ethylacetat wurde die organische Phase mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde in Hexan gelöst und auf eine Water-Silica-Sep-Pak-Patrone (2 g) aufgesetzt. Die Patrone wurde mit Hexan und Hexan/Ethylacetat (99,5:0,5) gewaschen. Man erhielt das 19-Norvitamin-Derivat 11 (24 mg). Das Sep-Pak wurde sodann mit Hexan/Ethylacetat (96:4) zur Gewinnung des unveränderten C,D-Ringketons II (4 mg) und mit Ethylacetat zur Gewinnung des Diphenylphosphinoxids 10 (21 mg) gewaschen. Das geschützte Vitamin 11 wurde ferner durch HPLC (10×250 mm Zorbax-Silica-Säule, 4 ml/min) unter Verwendung von Hexan/2-Propanol (99,9:0,1) als Lösungsmittelsystem gereinigt. Die reine Verbindung 11 (19,9 mg, Ausbeute 51 %) wurde bei RV=15 ml in Form eines farblosen Öls eluiert: UV (in Hexan) λ_max 262,2, 252,2, 243,3 nm; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 6,22 und 5,83 (1H und 1H, jeweils d, J=11,2 Hz, 6- und 7-H) 4,97 und 4,92 (1H und 1H, jeweils s, =CH₂), 4,41 (2H, m, 1β- und 3α-H), 2,82 (1H, br.d, J=12,3 Hz, 9β-H), 2,53 (1H, dd, J=13,2, 5,8 Hz, 10α-H), 2,46 (1H, dd, J=12,7 4,6 Hz, 4α-H), 2,31 (1H, dd, J=13,2, 2,9 Hz, 10β-H), 2,17 (1H, dd, J=12,7, 8,3 Hz, 4β-H), 2,30-1,93 (2H, m), 1,90-1,80 (1H, m), 0,891 (9H, s, Si-tert.-Bu), 0,862 (9H, s, 25-Me₃), 0,856 (9H, s, Si-tert.-Bu), 0,84 (3H, d, J=6,4 Hz, 21-H₃), 0,535 (3H, s, 18-H₃), 0,076, 0,061, 0,046 und 0,019 (jeweils 3H, jeweils s, 4xSi-CH₃); ¹³C-NMR (125 MHz) δ 152,93 (s, C-2), 141,32 (s, C-8), 132,68 (s, C-5), 122,42 (d, C-6), 116,04 (d, C-7), 106,27 (t, =CH₂), 72,52 und 71,59 (jeweils d, C-1 und C-3), 56,34 (d), 56,17 (d), 47,59 (t), 45,70 (s, C-13), 44,57 (t), 40,47 (t), 38,51 (t), 36,34 (t), 35,61 (d), 30,39 (s, C-25), 29,48 (q, 25-Me₃), 28,76 (t), 18,65 (q, C-21), 18,28 (s, SiCMe₃), 18,18 (s, SiCMe₃), 12,31 (q, C-18), -4,81, -4,87, -5,05 und -5,14 (jeweils q, jeweils SiMe); MS (EI) m/z 642 (8, M⁺), 627 (3, M⁺ – Me), 585 (6, M⁺ – C₄H₉), 510 (100, M⁺ – tert.-BuMe₂SiOH), 495 (5, M⁺ – tert.-BuMe₂SiOH – Me), 453 (3), 366 (24), 257 (7), 234 (9), 197 (7), 197 (10), 73 (46); genaue Masse berechnet für C₄₀H₇₄O₂Si₂ (M⁺) 642,5227, gefunden 642,5206.
Das geschützte Vitamin 11 (1,7 mg, 2,6 μmol) wurde in wasserfreiem THF (3 ml) gelöst und eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF, 50 μl, 50 μmol) wurde zugegeben. Anschließend wurde frisch aktiviertes Molekularsieb 4A (300 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt, sodann mit 2 ml Hexan/Ethylacetat (6:4) verdünnt und auf eine Waters-Silica-Sep-Pak-Patrone (2 g) aufgesetzt. Nach Elution mit dem gleichen Lösungsmittelsystem erhielt man das rohe Produkt I, das weiter durch HPLC (10×250 mm Zorbax-Silica-Säule, 9 ml/min) unter Verwendung von Hexan/2-Propanol (9:1) als Lösungsmittelsystem gereinigt wurde. Analytisch reines 2-Methylen-19-norvitamin I (768 μg, Ausbeute 71 %) wurde bei R_V = 26 ml in Form eines farblosen Öls gewonnen: UV (in EtOH) λ_max 261,2, 251,3, 243,1 nm; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 6,36 und 5,89 (1H und 1H, jeweils d, J=11,3 Hz, 6- und 7-H), 5,11 und 5,09 (jeweils 1H, jeweils s, =CH₂), 4,48 (2H, m, 1β- und 3αH), 2,85 (1H, dd, J=13,3, 4,7 Hz, 10β-H), 2,82 (1H, br d, J=13,0 Hz, 9β-H), 2,57 (1H, dd, J=13,3, 3,8 Hz, 4α-H), 2,33 (1H, dd, J=13,3, 6,2 Hz, 4β-H), 2,29 (1H, dd, J=13,3, 8,3 Hz, 10α-H), 2,05-1,95 (2H, m , 1,90-1,82 (1H, m) , 0, 866 (9H, s, 25-Me₃), 0,84 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-H₃), 0,548 (3H, s, 18-H₃); MS (EI) m/z 414 (100, M⁺), 399 (8, M⁺ – Me), 396 (5, M⁺ – H₂O), 381 (8, M⁺ – Me – H₂O), 363 (2, M⁺ – Me – 2H₂O), 329 (28, M⁺ – C₆H₁₃), 287 (36, M⁺ – C₉H₁₉), 261 (24), 192 (14), 161 (19), 147 (37), 135 (51), 107 (42); genaue Masse berechnet für C₂₈H₄₆O₂ 414,3498, gefunden 414,3515.
Biologische Aktivität von 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol
Eine kompetitive Bindung des Analogen an den Schweinedarm-Rezeptor wurde gemäß dem Verfahren von Dame et al. (Biochemistry, Bd. 25 (1986), S. 4523-4534) durchgeführt.
Die Differenzierung von HL-60-Promyelozyten zu Monozyten wurde gemäß Ostrem et al. (J. Biol. Chem., Bd. 262 (1987), S. 14164-14171) bestimmt. Die kompetitive Bindung von 1α,25-(OH)₂D₃ und des synthetisierten Vitamin D-Analogen an Schweinedarm-Vitamin D-Rezeptor wurde im Dreifachversuch zu zwei verschiedenen Gelegenheiten durchgeführt. Die ED₅₀-Werte lassen sich aus den Dosis/Reaktions-Kurven (1) ableiten und geben die Konzentration des Analogen wieder, die für eine 50 %-ige Verdrängung des radioaktiv markierten 1α,25-(OH)₂D₃ vom Rezeptorprotein erforderlich ist. Das Bindungsverhältnis kann aus dem Verhältnis des Mittelwerts ED₅₀ des Analogen zum ED₅₀-Wert für 1α,25-(OH)₂D₃ bestimmt werden.
Die Induktion der Differenzierung von HL-60-Promyelozyten zu Monozyten durch 1α,25-(OH)₂D₃ und durch das synthetisierte Vitamin D-Analoge wurde durch Messen des prozentualen Anteils an Zellen, die Nitroblautetrazolium (NBT) reduzieren, bestimmt. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. Die ED₅₀-Werte lassen sich aus den Dosis-Reaktionskurzven (2) ableiten und geben die Konzentration des Analogen wieder, die zur Induktion einer 50 %-igen Reifung befähigt ist. Das Differenzierungs-Aktivitäts-Verhältnis lässt sich aus dem Verhältnis des Mittelwerts ED₅₀ des Analogen zum ED₅₀-Wert für 1α,25-(OH)₂D₃ bestimmen.
Beispiel 3
Ziel: Es soll bestimmt werden, ob TMM eine Knochencalcium-Mobilisierungsaktivität besitzt oder nicht und wie es sich im Vergleich zu 1,25-(OH)₂D₃ und 2-Methylen-19-nor-20(S)-1α,25-(OH)₂D₃ (nachstehend als 2MD abgekürzt) verhält.
Tiere:
CD-1-Mäuse in einem Alter von 5-6 Wochen wurden in den +D-Mäuseraum gebracht und erhielten "Chow"-Futter. Es wurde eine 5-tägige Akklimatisierungsdauer eingehalten, bevor man auf ein gereinigtes Futter gemäß den Angaben von Yang et al. (Arch. Biochem. Biophys., Bd. 303 (1993), S. 98) mit einem Gehalt an 0,02 % Calcium und 0,3 % P überging.
Zwei Tage nach der Futterumstellung wurde mit der Dosierungsverabreichung begonnen.
Versuchsdurchführung:
Sämtliche Tiere wurden vor der Verabreichung gewogen. Die Tiere wurden in Gruppen mit jeweils fünf Tieren/Gruppe eingeteilt. Sämtliche Tiere erhielten den Arzneistoff einmal täglich mit einer oralen Sonde.

Die Dosis wurde in 100 μl Neobee-Öl/25 g Maus verabreicht. Blut (etwa 80 μl) wurde vor der Verabreichung sowie 24, 48 und 72 Stunden nach der Verabreichung aus dem retroorbitalen Sinus entnommen. Gesamtes Calcium im Serum wurde unter Anwendung von Atomabsorptionsspektrometrie gemessen.

Gruppe 1:	Neobee-Öl
Gruppe 2:	50 μg 1,25(OH)₂D₃/kg Körpergewicht
Gruppe 3:	450 μg 1,25(OH)₂D₃/kg Körpergewicht
Gruppe 4:	0,5 μg 2MD/kg Körpergewicht
Gruppe 5:	1,5 μg 2MD/kg Körpergewicht
Gruppe 6:	4,5 μg 2MD/kg Körpergewicht
Gruppe 7:	13,5 μg 2MD/kg Körpergewicht
Gruppe 8:	0,5 μg TMM/kg Körpergewicht
Gruppe 9:	1,5 μg TMM/kg Körpergewicht
Gruppe 10:	4,5 μg TMM/kg Körpergewicht
Gruppe 11:	13,5 μg TMM/kg Körpergewicht

Ergebnisse:
Tabelle 1 zeigt den Anstieg des Serumcalciums bei Mäusen, die mit der 0,02 % Calcium-Diät gefüttert wurden und den Träger, Träger plus 1α,25-(OH)₂D₃, Träger und 2MD oder Träger plus TMM erhielten. Der Anstieg des Serumcalciums ergibt sich aufgrund der Knochenmobilisierung nur aus dem Grund, dass kein Calcium aus dem Darm verfügbar ist. Tabelle 1 Knochencalcium-Mobilisierungsaktivität
Mäuse, die mit einer 0,02 %-igen Calcium-Diät gefüttert werden, können ihren Calciumspiegel im Serum nur durch Resorption aus dem Knochen erhöhen, da durch intestinale Resorption kein Calcium verfügbar ist. Die Daten in Tabelle 1 zeigen, dass TMM in vivo nur bei der höchsten Dosis eine Knochenresorption hervorrief. Bei geringeren Dosen gab es keine signifikante Erhöhung des Serumcalciums. Im Gegensatz dazu erwies sich 1,25-(OH)₂D₃ bei Dosen von 50 μg/kg und 450 μg/kg Körpergewicht als wirksam. Somit ist TMM etwa gleich wirksam wie 1,25-(OH)₂D₃ in bezug auf eine Erhöhung des Serumcalciums, zeigt aber diesbezüglich nur 1/10 der Aktivität von 2MD. Somit wird die Bedeutung der 25-Hydroxylgruppe für die Mobilisierung von Knochencalcium dargelegt.
3 zeigt, dass TMM in Bezug auf die Darmresorption von Calcium um einen Faktor von etwa 10 aktiver als 1,25-(OH)₂D₃ ist. Bei dieser Messung wurde Alendronat verwendet, um die Knochenresorption zu blockieren, so dass der Anstieg im Serumcalcium auf eine erhöhte Calciumresorption aus dem Darm zurückzuführen ist.
Beispiel 4
Ziel: Es soll bestimmt werden, ob TMM eine Aktivität auf den intestinalen Calciumtransport zeigt oder nicht und wie seine Wirkung im Vergleich zu 1,25-(OH)₂D₃ ist.
Tiere:
CD-1-Mäuse im Alter von 5-6 Wochen wurden in den +D-Mäuseraum gebracht und erhielten "Chow"-Futter. Nach einer Akklimatisierungszeit von 7 Tagen wurde eine Umstellung auf ein Futter mit einem Gehalt an 0,47 % Calcium vorgenommen.
Versuchsdurchführung:

Sämtliche Tiere wurden vor der Verabreichung gewogen und in Gruppen mit fünf Tieren/Behandlungsgruppe eingeteilt. Pro Käfig wurden zwei oder drei Tiere gehalten. Sämtliche Tiere erhielten eine Verabreichung des Vitamin D-Analogen mit einer oralen Sonde einmal täglich sowie eine einmalige intraperitoneale Injektion von Alendronat. Die Dosen wurden in 100 μl Neobee-Öl/25 g Maus (Vitamin D-Analoge) und 100 μl PBS/Maus verabreicht (Alendronat). Alendronat wurde 1 Tag vor Verabreichung der Vitamin D-Analogen gegeben, damit sich dessen Wirkung auf den Knochen vor der Verabreichung der knochenaktiven Verbindungen entfaltete. Blut (etwa 80 μl) wurde vor der Dosierung und 24, 48 und 144 Stunden nach der Dosierung aus dem retroorbitalen Sinus entnommen. Nachdem sämtliche Blutentnahmen durchgeführt worden waren, wurde das Serum 1:50 in 0,1 % "Lanthum Chloride" verdünnt und durch Atomabsorptionsspektrometrie zur Bestimmung der Gesamtmenge des Serumcalciums analysiert.

Gruppe 1:	Neobee-Öl + Alendronat (1,75 mg/kg Körpergewicht)
Gruppe 2:	40,5μg 1,25(OH)₂D₃/kg Körpergew. + Alendronat (1,75 mg/kg Körpergew.)
Gruppe 3:	4,5μg TMM/kg Körpergew. + Alendronat (1,75 mg/kg Körpergew.)
Gruppe 4:	13,5μg TMM/kg Körpergew. + Alendronat (1,75 mg/kg Körpergew.)
Gruppe 5:	40,5μg TMM/kg Körpergew. + Alendronat (1,75 mg/kg Körpergew.)

Ergebnisse:
3 zeigt, dass im Gegensatz zur Knochencalcium-Mobilisierungsaktivität TM eine stärkere intestinale Calcium-Transportaktivität als 1,25-(OH)₂D₃ aufweist.
Die biologischen Daten der 1–3 und von Tabelle 1 lassen sich folgendermaßen zusammenfassen:
Die Bindung des 25-Methylderivats TMM an den rekombinanten Ratten-Vitamin D-Rezeptor zeigt, dass TMM im Vergleich zum nativen Hormon 1,25-(OH)₂D₃ nur 1/10 der Bindungsstärke an den Vitamin D-Rezeptor aufweist. Dies ist überraschend, da bei TMM eine 25-Hydroxylgruppe fehlt. Wenn jedoch TMM in bezug auf die HL-60-Differenzierung getestet wurde, ergab sich eine im wesentlichen gleichstarke Aktivität wie bei 1,25-(OH)₂D₃. Somit ist TMM auch ohne eine 25-Hydroxylgruppe sehr stark wirksam. Von großem Interesse sind die bei CD-1-Mäusen erhaltenen in vivo-Daten. Die Daten von Tieren im Anschluss an eine einzige Dosis der Verbindung in den angegebenen Mengen zeigen, dass TMM nur eine sehr geringe Knochencalcium-Mobilisierungsaktivität aufweist. Die Knochencalcium-Mobilisierung (Serum-Calciumspiegel) war minimal, selbst bis zu 13,5 μg TMM/kg Körpergewicht. Somit lag seine Aktivität nicht nur weit unter der von 2-Methylen-19-nor-20(S)-1α,25-(OH)₂D₃ oder 2MD, sondern auch unter der des nativen Hormons 1,25-(OH)₂D₃. Von erheblichem Interesse ist jedoch, dass TMM eine sehr starke Wirkung auf die intestinale Calciumresorption ausübt. Die Aktivität von TMM auf die intestinale Calciumresorption ist 10-fach größer als die von 1,25-(OH)₂D₃, von dem früher gezeigt worden ist, dass es in etwa die gleiche Aktivität wie 2-Methylen-19-nor-20(S)-1α,25-(OH)₂D₃ hat. Somit zeigt TMM eine Selektivität in bezug auf die Aktivität auf den Darm, wo eine Verwertung von Calcium aus der Umgebung hochgradig erwünscht ist, ohne dass damit eine Knochencalcium-Mobilisierung verbunden ist. Es kann als eine Vitamin D-Aufrechterhaltungsverbindung bei Patienten verwendet werden, bei denen ein Knochenverlust aufgrund von Knochenmobilisierung nicht erwünscht ist. Bei einem derartigen Zustand kann es sich um eine beliebige Form von Osteoporose handeln. Die Aktivität von TMM in bezug auf eine Verursachung einer zellulären Differenzierung und Unterdrückung des HL-60-Zellwachstums ist auch konsistent mit dessen Verwendung bei der Behandlung von malignen Krankheiten oder bei der Behandlung von Psoriasis, einer Hautkrankheit unter Hyperproliferation von Keratinozyten.
Für Behandlungszwecke kann die neue Verbindung der Erfindung, die durch die Formel I definiert wird, für pharmazeutische Anwendungen in Form einer Lösung in unschädlichen Lösungsmitteln oder als Emulsion, Suspension oder Dispersion in geeigneten Lösungsmitteln oder Trägern, oder in Form von Pillen, Tabletten oder Kapseln zusammen mit festen Trägern gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zubereitet werden. Beliebige derartige Zubereitungen können auch weitere pharmazeutisch verträgliche und nicht-toxische Exzipientien, z. B. Stabilisatoren, Antioxidationsmittel, Bindemittel, farbgebende Mittel oder emulgierende oder geschmacksbildende Mittel enthalten.
Die Verbindung kann oral, topisch, parenteral oder transdermal verabreicht werden. Die Verbindung wird in vorteilhafter Weise durch Injektion oder durch intravenöse Infusion von geeigneten sterilen Lösungen oder in Form von flüssigen oder festen Dosen über den Ernährungskanal oder in Form von Cremes, Salben, Pflastern oder ähnlichen Trägern, die sich für transdermale Anwendungen eignen, verabreicht. Dosen von 0,01 μg bis 100 μg der Verbindung pro Tag eignen sich für Behandlungszwecke, wobei derartige Dosen entsprechend der zu behandelnden Krankheit, deren Schwere und der Reaktion des Subjekts gemäß üblicher Praxis eingestellt werden. Da die neue Verbindung eine spezifische Wirkung aufweist, kann sie in geeigneter Weise allein oder zusammen mit abgestuften Dosen einer anderen aktiven Vitamin D-Verbindung (z. B. 1α-Hydroxyvitamin D₂ oder D₃ oder 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃) in Situationen verabreicht werden, wo unterschiedliche Grade der Knochen-Mineralmobilisierung und der Calciumtransport-Stimulierung als vorteilhaft angesehen werden.
Verbindungen zur Verwendung bei der vorstehend beschriebenen Behandlung von Psoriasis und anderen malignen Erscheinungen umfassen eine wirksame Menge der 2-Methylen-19-nor-vitamin D-Verbindung gemäß der vorstehenden Formel I als Wirkstoff und einen geeigneten Träger. Eine wirksame Menge einer derartigen Verbindung zur erfindungsgemäßen Verwendung beträgt 0,01 bis 100 μg pro Gramm Zusammensetzung und kann topisch, transdermal, oral oder parenteral in Dosierungen von 0,01 μg/Tag bis 100 μg/Tag verabreicht werden.
Die Verbindung kann zu Cremes, Lotionen, Salben, topischen Pflastern, Pillen, Kapseln oder Tabletten oder in flüssiger Form als Lösung, Emulsion, Dispersion oder Suspension in pharmazeutisch unschädlichen und verträglichen Lösungsmitteln oder Ölen zubereitet werden. Derartige Präparate können zusätzlich weitere pharmazeutisch unschädliche oder günstige Bestandteile, wie Stabilisatoren, Antioxidationsmittel, Emulgatoren, farbgebende Mittel, Bindemittel oder Geschmacksstoffe, enthalten.
Die Verbindung wird vorteilhafterweise in Mengen verabreicht, die zur Erzielung einer Differenzierung von Promyelozyten zu normalen Makrophagen ausreichen. Die vorstehend angegebenen Dosierungen sind geeignet, wobei darauf hinzuweisen ist, dass die angegebenen Mengen je nach der Schwere der Krankheit, dem Zustand und der Reaktion des Subjekts gemäß üblicher Praxis anzupassen sind.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen umfassen einen Wirkstoff in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür und gegebenenfalls weitere therapeutische Bestandteile. Der Träger muss in dem Sinn "verträglich" sein, dass er mit den übrigen Bestandteilen der Zubereitungen verträglich ist und für den Empfänger unschädlich ist.
Erfindungsgemäße Zubereitungen, die sich für die orale Verabreichung eignen, können in Form von diskreten Einheiten als Kapseln, Dragees, Tabletten oder Pastillen vorliegen, die jeweils eine vorgegebene Wirkstoffmenge enthalten; sowie in Form von Pulvern und Granalien; in Form einer Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit; oder in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasserin-Öl-Emulsion.
Zubereitungen für die rektale Verabreichung können in Form eines Suppositoriums vorliegen, das den Wirkstoff und einen Träger, wie Kakaobutter, enthält, oder in Form eines Klistiers.
Für die parenterale Verabreichung geeignete Zubereitungen umfassen zweckmäßigerweise ein steriles öliges oder wässriges Präparat des Wirkstoffes, das vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Für die topische Verabreichung geeignete Zubereitungen umfassen flüssige oder halbflüssige Präparate, wie Einreibemittel, Lotionen, Anwendungsmittel, Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie Cremes, Salben oder Pasten; oder Lösungen oder Suspensionen, wie Tropfen; oder Sprühmittel.
Für die Asthmabehandlung kann man sich der Inhalation eines Pulvers, von selbst-treibenden oder Sprühzubereitungen bedienen, die mit einer Sprühdose, einem Vernebelungsgerät oder einem Zerstäubungsgerät abgegeben werden. Die Zubereitungen weisen bei der Abgabe vorzugsweise eine Teilchengröße im Bereich von 10 bis 100 μm auf.
Die Zubereitungen können zweckmäßigerweise in Dosiseinheitsform dargereicht werden. Sie können nach beliebigen Verfahren, die auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind, zubereitet werden. Unter dem Ausdruck "Dosiseinheit" ist eine Einheitsdosis, d. h. eine einzelne Dosis, zu verstehen, die einem Patienten in Form einer physikalisch und chemisch stabilen Einheitsdosis verabreicht werden kann, die entweder den Wirkstoff als solches oder ein Gemisch des Wirkstoffes mit festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmitteln oder Trägern umfasst. Schema 1
Schema 2
Schema 3

Claims

Verbindung der Formel
wobei Y₁ und Y₂, die gleich oder verschieden sein können, jeweils aus Wasserstoff und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt sind.
2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, umfassend 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol in einer Menge von 0,01 μg bis 100 μg pro g Zusammensetzung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, umfassend 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol in einer Menge von 0,1 μg bis 50 μg pro g Zusammensetzung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer metabolischen Knochenkrankheit, wobei es erwünscht ist, die Knochenmasse aufrechtzuerhalten oder zu vermehren.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Krankheit um senile Osteoporose, postmenopausale Osteoporose, steroidinduzierte Osteoporose, Osteoporose unter geringem Knochen-Turnover, Osteomalazie oder renale Osteodystrophie handelt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Verbindung oral, parenteral oder transdermal zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Verbindung in einer Dosierung von 0,01 μg bis 100 μg pro Tag zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Verbindung um 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol handelt.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Psoriasis.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Verbindung um 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Verbindung in einer Dosierung von 0,01 μg/Tag bis 100 μg/Tag zu verabreichen ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer krebsartigen Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Krankheit um Leukämie, Kolonkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs handelt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Verbindung oral, parenteral oder transdermal zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Verbindung um 2-Methylen-19-nor-20(S)-25-methyl-1α-hydroxycalciferol handelt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Verbindung in einer Dosierung von 0,01 μg bis 100 μg pro Tag zu verabreichen ist.
(20S)-De-A,B-25-methylcholestan-8-on der Formel