DE60128487T2

DE60128487T2 - Biomarkierungen des übergangszellkarzinoms der blase

Info

Publication number: DE60128487T2
Application number: DE60128487T
Authority: DE
Inventors: Antonia Vlahou; George L. Virginia Beach WRIGHT
Original assignee: Eastern Virginia Medical School
Current assignee: Eastern Virginia Medical School
Priority date: 2000-09-25
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-09-22
Also published as: JP2004525343A; EP1354203A2; ATE362616T1; EP1354203B1; DE60128487D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Blasenkrebs ist der zweithäufigste urogenitale Tumor, der ungefähr 5% aller neu diagnostizierter Krebserkrankungen in den Vereinigten Staaten ausmacht (Klein et al., Cancer, 82 (2):49-354 (1989)). Mehr als 90% weisen die Histologie eines Übergangszellkarzinoms (TCC) auf. (Stein et al., J. Urol., 160:645-659 (1998)). Derzeit erfolgt der verläßlichste Diagnoseweg und die Überwachung von TCC durch zystoskopische Untersuchung und Blasenbiopsie zur histologischen Bestätigung. Die invasive und arbeitsintensive Art dieses Verfahrens stellt eine Herausforderung zur Entwicklung besserer, weniger kostspieliger und nichtinvasiver diagnostischer Verfahren dar. Harnzytologie war für mehrere Jahre "gold standard" Ende des nichtinvasiven Ansatzes. Sie hat eine hohe Spezifität und bietet gegenüber der Biopsie den Vorteil, das gesamte Urothel zu überprüfen (Klein et al., Cancer, 82 (2): 49-354 (1998); Stein et al., J. Urol., 160: 645-659 (1998)). Ihre hohe Rate an falschen negativen Ergebnissen, insbesondere für Tumore mit geringer Einstufung, hat jedoch ihre Verwendung auf die Ergänzung zu Zystoskopie begrenzt.
Viele nichtinvasive molekulare diagnostische Untersuchungen wurden basierend auf einem ständig wachsenden Wissen über die molekularen Veränderungen, die mit der Pathogenese von Blasenkrebs einhergehen, entwickelt. Die Untersuchungen auf das Blasentumorantigen (BTA) (Schamhart et al., Eur. Urol., 34:99-106 (1998)), das BTA stat (Sarosdy et al., Urology, 50:349-53 (1997)), die Abbauprodukte von Fibrinogen/Fibrin (FDP) (Schmetter et al., J. Urol., 158:801-805 (1997)) und das Kernmatrixprotein-22 (NMP-22) (Soloway et al., J. Urol., 156:363-367)) wurden durch die FDA zur Verwendung im Zusammenhang mit Zystoskopie genehmigt. Siehe Grossman et al., Urol. Oncology, 5:3-10 (2000) für eine Übersicht. Zusätzliche molekulare Untersuchungen, die derzeit nach ihrem diagnostischen/prognostischem Nutzen ausgewertet werden (in 2, 3, 8, 9 rezensiert) sind Untersuchungen der Telomerase (Hoshi et al., Urol. Onc., 5:25-30 (2000)), Immonucyt (Fradet et al., Can J Urol., 1997, 4:400-5 (1997)) und Hyaluronsäure/Hyaluronidase (Pham et al., Cancer Research, 57:778-783 (1997); Lokeshwar et al., Cancer rsearch, 57:773-777 (1997)), Microsatellitenanalyse (Steiner et al., Nat. Med., 6:621-624 (1997) sowie Bestimmungen des Blutgruppenantigens (Golijanin et al., Urology, 46(2):173-177 (1995)), des karzinoembryonischen Antiges (Liu et al., J. Urol., 173:1258 (1987)), von p53 und Retinoblastomproteinen (Grossmann et al., Urol. Oncology, 5:3-10 (2000)), von E Cadherin (Banks et al., J. Clin. Pathol., 48:179-180 (1995), (Protheroe et al., British J. Cancer, 80(1/2):273-8 (1999)) und zahlreiche Wachstumsfaktoren (Halachmi et al., British J. Urology, 82:647-654 (1998)).
WO-A-01/36977 (Stand der Technik gemäß Artikel 54 (3) EPÜ) offenbart die Verwendung von Massenspektrometrie für den Nachweis von zu Blasenkarzinomen gehörenden Proteinmarkern. WO-A-00/19208 und US-A-5,500,347 offenbaren Verfahren zum Nachweis von Blasenkarzinomen, die auf dem Nachweis von spezifischen Proteinmarkern basieren. H. H. Rasmussen et al. (1996), J. Urol. 155, 2113-2119 offenbart eine Datenbank von mehreren in Patienten mit Blasenkarzinomen gefundenen Proteinmarkern und Verfahren zum Nachweis der Marker in Urinproben.
WO-A-98/59360 offenbart die Kombination von Chromatographie von Retentat, Protein-Microarrays und Desorptionsmassenspektroskopie zur Identifizierung einer Vielzahl von in einer komplexen Mischung vorhandenen Analyten. WO-A-00/29987 offenbart eine Strategie, die auf der Kombination von einem MALDI-TOF-Massenspektrometrietest mit Durchsuchen einer Proteinsequenzdatenbank zur Identifizierung von in einer Probe vorhandener Microorganismen, basiert.
Die Effektivität jeder diagnostischen Untersuchung hängt von ihrer Spezifität und ihrer Selektivität ab. Das heißt, was ist das relative Verhältnis von richtigen positiven Diagnosen, richtigen negativen Diagnosen, falschen positiven Diagnosen und falschen negativen Diagnosen? Verfahren zur Steigerung des Prozentsatzes von richtigen positiven und richtigen negativen Diagnosen für jeden Zustand sind wünschenswerte medizinische Ziele. Im Fall von Blasenkrebs sind die derzeitigen diagnostischen Untersuchungen aus den oben beschriebenen Gründen nicht vollständig zufriendenstellend.
Aufgrund der molekularen Heterogenität von TCC Tumoren ist es wahrscheinlich, daß es keine einzelne molekulare Untersuchung geben wird, die Zystoskopie ersetzen wird. Die Identifizierung und gleichzeitige Analyse einer Gruppe von Biomarken, die für die zahlreichen biologischen Merkmale des Krebses repräsentativ sind, hat ein größeres Potential für die Verbesserung des frühen Nachweises/der frühen Diagnose von TCC. Überdies brauchen Krebspatienten behandelnde Ärzte in einem wirtschaftsbewußten Umfeld, in dem kostengünstig Medizin ein vorrangiges Anliegen ist, effiziente Verfahren zur schnellen Diagnose von Blasenkrebs und zur Auswertung der Antworten auf eine Therapie. Die vorliegende Erfindung erreicht dieses und andere Ziele.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt in den angefügten Ansprüchen definierte diagnostische Verfahren zur Verfügung, die auf dem Nachweis von neuen Proteinmarkern basieren, die in Proben von Patienten mit Übergangskarzinomen der Blase (TCC) und in Proben von Kontrolltestpersonen verschieden vorhanden sind. Die Messung dieser Marker in Proben von Patienten, alleine oder in Kombination, stellt Informationen zur Verfügung, die der Diagnostiker mit einer mutmaßlichen Diagnose von TCC oder einer negativen Diagnose (z. B. normal oder ohne Erkrankung) in Beziehung setzen kann. Alle Marker werden durch ihr molekulares Gewicht charakterisiert. Die Marker können von anderen Proteinen in einer Probe durch z. B., chromatographische Trennung gekoppelt mit Massenspektrometrien oder durch herkömmliche Immunotests gelöst werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt der Lösungsansatz Oberflächen unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-/("SELDI") Massenspektrometrie, bei welcher die Oberfläche der Massenspektrometriesonde Adsorptionsmittel umfaßt, die die Marker binden.
Eine erste Gruppe an Markern wird aus Urinproben identifiziert und ist in der Lage an kationische Adsorptionsmittel und andere Adsorptionsmittel zu binden. Diese Marker umfassen Marker UBC-1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker UBC-2: 9,495 kDa ± 233 Da; Marker UBC-3: 44,6 kDa ± 1,9 kDa, Marker UBC-4: 100,120 kDa ± 4,3 kDa, Marker UBC-5: 133,190 kDa ± 3,9 kDa. Diese Marker werden als ein einzelnes Peaksignal detektiert (mit Ausnahme des Markers UBC-1, der als zwei oder drei getrennte Peaksignale detektiert wird). Marker UBC-1 wird auch in Zelllysaten von Barbotagen der Blase gefunden und binden an Metallchelat-Adsorptionsmittel. Eine weitere Analyse zeigte, daß Marker UBC-1 ein Mitglied der Defensin-Peptide ist.
Eine zweite Gruppe an Markern wird auch in Urinproben identifiziert. Diese Marker sind ebenfalls in der Lage an kationische Adsorptionsmittel und andere Adsorptionsmittel zu binden. Dieses Marker umfassen Marker PC-1: ungefähr 4,950-5,150 kDa, Marker PC-2: ungefähr 5,710-6,000 kDa, Marker PC-3: ungefähr 6,758-7,750 kDa, Marker PC-4: ungefähr 15,000-16,000 kDa, Marker PC-5: ungefähr 37,500-40,000 kDa, Marker PC-6: ungefähr 79,500-82,000 kDa und Marker PC-7: ungefähr 85,000-92,000 kDa. Mit Ausnahme von Marker PC-6 werden diese Marker häufiger in Proben von TCC-Patienten nachgewiesen als in Proben von Kontrolltestpersonen (z. B. Testpersonen mit einer negativen TCC-Diagnose). Marker PC-6 wird häufiger in Kontrollproben und anderen Proben ohne TCC-Erkrankung gefunden als in Proben von TCC-Proben.
Obwohl diese Marker zuerst in Urinproben identifiziert wurden, ist die Probe, in welcher diese nachgewiesen werden können, nicht auf Urinproben begrenzt. Diese Marker können in anderen Probenarten, wie Barbotage, Blut, Serum, Tränenflüssigkeit, Speichel, Gewebe, etc. nachweisbar sein. Zum Beispiel ist Marker UBC-1 auch in Zelllysaten von Barbotagen der Blase vorhanden. Auch wenn die erste und zweite Gruppe an Markern unter Verwendung eines kationischen Adsorptionsmittels entdeckt wurden (für Marker UBC-1 auch ein Metallchelat-Adsorptionsmittel) sind diese Marker überdies in der Lage, wie unten beschrieben an andere Arten von Adsorptionsmitteln zu binden. Dementsprechend sind Ausführungsformen der Erfindungen nicht auf die Verwendung von kationischen Adsorptionsmitteln und Metallchelat-Adsorptionsmitteln begrenzt.
Während die absolute Identität dieser Marker (mit Ausnahme von Marker UBC-1) noch nicht bekannt ist, ist ein solches Wissen für ihre Messung in einer Probe eines Patienten nicht notwendig, da sie durch z. B. Masse und Affinitätsmerkmale ausreichend charakterisiert sind. Es wird bemerkt, daß Molekulargewicht und Bindungseigenschaften charakteristische Eigenschaften dieser Marker sind und nicht Beschränkungen der Mittel zum Nachweis und zur Isolierung. Weiter kann die absolute Identität der Marker unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren oder anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Dementsprechend stellt die Erfindung in einem Gesichtspunkt Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von TCC zur Verfügung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
a) Nachweisen wenigstens eines Proteinmarkers in einer Probe, wobei der Proteinmarker ausgewählt ist unter: Marker UBC-1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da; Marker PC-1: ungefähr 4,950-5,150 kDa, Marker PC-2: ungefähr 5,710-6,000 kDa, Marker PC-3: ungefähr 6,758-7,750 kDa, Marker PC-4: ungefähr 15,000-16,000 kDa, Marker PC-5: ungefähr 37,500-40,000 kDa, Marker PC-6: ungefähr 79,500-82,000 kDa und Marker, PC-7: ungefähr 85,000-92,000 kDa und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von TCC.
In einer Ausführungsform berücksichtig das Korrelieren die Menge des Markers oder der Marker in der Probe und/oder die Häufigkeit des Nachweises desselben Markers oder derselben Marker in einer Kontrolle.
In einer anderen Ausführungsform wird Gasphasen-Ionenspektrometrie für den Nachweis des Markers oder der Marker verwendet. Zum Beispiel kann Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie, die zum Nachweis der Marker verwendet wird, (a) Bereitstellen eines Substrates, welches ein daran angebrachtes Adsorptionsmittel umfaßt, (b) Inkontaktbringen der Probe mit dem Adsorptionsmittel und (c) Desorbieren und Ionisieren des Markers oder der Marker von dem Substrat und Nachweisen des/der desorbierten/ionisierten Markers oder Marker mit dem Massenspektrometer. Jedes geeignetes Adsorptionsmittel zum Binden eines oder mehrerer Marker(s) verwendet werden. Zum Beispiel kann das Adsorptionsmittel an dem Substrat ein kationisches Adsorptionsmittel, ein Antikörper-Adsorptionsmittel etc. sein.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Immuntest für das Nachweisen des Markers oder der Marker verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Verfahren weiterhin (a) Erzeugen von Daten über die Probe mit dem Massenspektrometer, das die Intensität des Signals für Masse/Ladungs-Verhältnisse anzeigt, (b) Umwandeln der Daten in computerlesbare Form und (c) Betreiben eines Computers zum Ausführen eines Algorithmuss, wobei der Algorithmus die Genauigkeit der Passung zwischen den computerlesbaren Daten und Daten, die eine Diagnose von TCC oder eine negative Diagnose anzeigen, bestimmt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a-c stellen Proteinmassenspektren von Urinproben dar. 1a stellt charakteristische Proteinmassenspektren einer Urinprobe dar, welche auf einer Anionaustausch-(SAX II) Chipoberfläche verarbeitet wurde. 1b und 1c stellen die Wiederholbarkeit von Proteinnachweisen unter Verwendung der SELDI-TOF-MS-Technik dar. 1-3: Massenspektren (oben) und entsprechende Gelansichten (unten) von Urinproben, die in dreifacher Ausführung verarbeitet wurden. 1 und 2 wurden am selben Tag verarbeitet, 3 hingegen an einem anderen Tag. Zahlangaben entsprechen den Massen der jeweiligen Proteinpeaksignale. m-z: Masse/Ladung (in Dalton).
2a-d stellen den Nachweis von fünf mit TCC in Zusammenhang stehenden Proteinpeaksignalen dar. Massenspektren (oberes Feld) und entsprechende Gelansichten (unteres Feld) von Urin von vier unterschiedlichen Patienten mit TCC (C1-C4), zwei normale Personen (N1-N2) und zwei Patienten mit anderen urogenitalen Erkrankungen (B1-B2). Die mittlere molekulare Masse der fünf Proteine, die in den TCC-Proben als einzigartig oder überexprimiert identifiziert wurden, sind: UBC-1: 3,352/3,432 kDa (a: Pfeil) und gelegentlich 3,47 kDa (a: Pfeilkopf), UBC-2: 9,495 kDa (b: Pfeil), UBC-3: 44,647 kDa (c:Pfeil), UBC-4: 100,120 kDa und UBC-5: 133,190 kDa (d: Pfeile). Zahlen in den Massenspektren stellen die festgestellte Masse des Markers in dieser speziellen Probe dar. M/z: Masse/Ladung.
3a-c stellen Mikrosektionen von Reinpopulationen von Krebszellen aus Blasenwaschungen dar. A: Cytospin von Blasenwaschung. Pfeil zeigt auf eine Anhäufung von Krebszellen, B: selber Cytospin nach Mikrosektion von Krebszellen, C: isolierte Zellen. Gefärbt mit H. & E. bei 40X.
4 stellt Proteinmassenspektren und Gelansichten von drei zusammenpassenden Urinproben (U1-3) und Krebszellen aus Mikrosektionen aus Blasenwaschungen (BW1-BW3) dar, die das Vorhandensein des 3,35/3,43 kDa Proteins (Pfeil) in den Tumorzellen und Urin zeigen. M/z: Masse/Ladung.
5A-F stellen die Identifizierung des 3,3/3,4 kDa (UBC-1) Proteinmarkers als Defensin durch SELDI-Immunotest dar. A-D: Ein TCC-Urin der bei der SELDI-Untersuchung mit direkter Bindung den 3,3/3,4 kDa Marker enthielt, wurde inkubiert mit entweder: A: Defensin-a Ab, B: keinem Ab, C: einem Ab, der mit prostataspezifischem Membranantigen (PSMA) reaktiv ist, D: einem zu einem unbedeutenden Isotyp passenden Kontroll-Immunglobulin, E: normalem Urin, der nicht das 3,3/3,4 kDa Protein mit Defensin Ab enthielt. Beachten Sie, daß das 3,3/3,4 kDa Protein nur in der Probe, die ein Protein dieser Masse enthielt, abgefangen wurde (Feld A); F: reines α-Defensin-Peptid, das mit dem α-Defensin Ab inkubiert wurde. M/z: Masse/Ladung.
Definitionen
Sofern nicht anders angegeben haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutung, die von einem Fachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, gewöhnlich verstanden wird. Die folgenden Literaturnachweise stellen einem Fachmann eine allgemeine Definition vieler in dieser Erfindung verwendeter Begriffe zur Verfügung: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2. Ausg. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker Hrsg., 1988); The Glossary of Genetics, 5. Ausg., R. Rieger et al. (Hrsg.), Springer Verlag (1991) und Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Die folgenden Begriffe haben wie sie hier verwendet werden die ihnen zugeschriebene Bedeutung sofern nicht anders angegeben.
"Übergangszellkarzinom" oder "TCC" bezieht sich auf das Karzinom, das sich in der sehr oberflächlichen Zellauskleidung der Blase entwickelt. Die Stufe des Tumors spiegelt das Ausmaß der Aggressivität der Erkrankung wieder und basiert auf zellulären und Kernbefunden, wie von dem Pathologen definiert. Stufe I wird als die am wenigsten und Stufe III als die aggressivste Variante angesehen. Das Stadium spiegelt das Ausmaß von Invasion und Ausdehnung des Tumors innerhalb der unterschiedlichen Schichten der Blase wieder. In Stadium Ta ist der bösartige Tumor auf die oberflächlichste Schicht (Mukosa) beschränkt, bei T1 dringt es in die Lamina propria ein, in T2 in die Muskelschicht der Schleimhaut, bei T3 in das perivesikale Fett und in Stadium T4 dehnt sich der Tumor zu den angrenzenden Organen aus. CIS (Carzinoma in situ) ist eine flache Beschädigung, die auf die Schleimhaut beschränkt ist.
"Marker" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Polypeptid (mit einem bestimmten scheinbaren molekularen Gewicht), das verschieden in einer von Patienten mit TCC genommenen Probe vorhanden ist im Vergleich zu einer vergleichbaren Probe, die von einer Kontrolltestperson (z. B. einer Person mit einer negativen Diagnose oder einem nicht feststellbaren Krebs, normale oder gesunde Testperson) genommen wurde.
Der Ausdruck in "verschieden vorhanden" bezieht sich auf Unterschiede in der Quantität und/oder der Häufigkeit eines Markers, der in einer von Patienten mit TCC genommenen Probe im Vergleich zu einer Kontrolltestperson vorhanden ist. Zum Beispiel kann ein Marker ein Polypeptid sein, daß in größerer Menge oder in geringerer Menge in Proben von TCC-Patienten vorhanden ist, im Vergleich zu Proben von Kontrolltestpersonen. Alternativ kann ein Marker ein Polypeptid sein, das mit größerer Häufigkeit oder geringerer Häufigkeit in Proben von TCC-Patienten nachgewiesen wird, im Vergleich zu Proben von Kontrolltestpersonen. Ein Marker kann unterschiedlich vorhanden sein in Bezug auf Menge, Häufigkeit oder beides.
Ein Polypeptid ist verschieden vorhanden in den beiden Gruppen an Proben, wenn die Häufigkeit des Nachweises des Polypeptids in den Proben von Patienten mit TCC statistisch signifikant höher oder geringer ist als in den Kontrollproben. Zum Beispiel können zwei Datengruppen unter Verwendung des Student t-Tests verglichen werden und P<0,05 kann als statistisch signifikant angesehen werden. In einem anderen Beispiel ist ein Polypeptid verschieden vorhanden in den zwei Gruppen an Proben wenn es wenigstens ungefähr 120%, wenigstens ungefähr 130%, wenigstens ungefähr 150%, wenigstens ungefähr 180%, wenigstens ungefähr 200%, wenigstens ungefähr 300%, wenigstens ungefähr 500%, wenigstens ungefähr 700%, wenigstens ungefähr 900% oder wenigstens ungefähr 1000% häufiger oder weniger häufig nachgewiesen wird in einer beobachteten Probengruppe als in der anderen Probengruppe.
Alternativ oder zusätzlich ist ein Polypeptid verschieden vorhanden in den beiden Proben, wenn die Menge des Polypeptids in einer Probe statistisch signifikant verschieden von der Menge des Polypeptids in der anderen Probe ist. Zum Beispiel ist ein Polypeptid verschieden vorhanden zwischen zwei Proben, wenn es wenigstens ungefähr 120%, wenigstens ungefähr 130%, wenigstens ungefähr 150%, wenigstens ungefähr 180%, wenigstens ungefähr 200%, wenigstens ungefähr 300%, wenigstens ungefähr 500%, wenigstens ungefähr 700%, wenigstens ungefähr 900% oder wenigstens ungefähr 1000% mehr vorhanden ist als es in der anderen Probe vorhanden ist, oder wenn es in einer Probe nachweisbar und nicht nachweisbar in der anderen ist.
"Diagnostisch" bedeutet das Identifizieren des Vorhandenseins oder der Art eines pathologischen Zustands. Diagnostische Verfahren unterscheiden sich in ihrer Empfindlichkeit und Spezifität. Die "Empfindlichkeit" einer diagnostischen Untersuchung ist der Prozentsatz der erkrankten Individuen die positiv getestet werden (Prozent von "richtig positiven"). Erkrankte Individuen, die von der Untersuchung nicht erfaßt werden sind "falsch negative". Testpersonen, die nicht erkrankt sind und die in der Untersuchung negativ getestet werden, werden als "richtig negative" bezeichnet. Die "Spezifität" einer diagnostischen Untersuchung ist 1 minus die Menge der falsch positiven, wobei die Menge der "falsch positiven" als der Anteil derer ohne Erkrankung, die positiv getestet werden, definiert ist. Da ein bestimmtes diagnostisches Verfahren nicht eine endgültige Diagnose eines Zustands zu Verfügung stellen mag, ist es ausreichend, wenn das Verfahren einen positiven Hinweis zur Unterstützung bei der Diagnose zur Verfügung stellt.
Eine "Testmenge" eines Markers bezieht sich auf eine Menge ein Markers, die in einer getesteten Probe vorhanden ist. Eine Testmenge kann entweder eine absolute Menge sein (z. B. μg/ml) oder eine relative Menge (z. B. relative Intensität des Signals).
Eine "diagnostische Menge" eines Markers bezieht sich auf eine Menge eines Markers in einer Probe einer Testperson, die mit einer Diagnose von TCC übereinstimmt (z. B. ein gesundes Individuum mit einer negativen Diagnose von TCC). Eine diagnostische Menge kann entweder eine absolute Menge (z. B. μg/ml) oder eine relative Menge (z. B. relative Intensität des Signals) sein.
Eine "Kontrollmenge" des Markers kann irgendeine Menge oder ein Bereich einer Menge sein, die mit einer Testmenge eines Markers verglichen werden soll. Zum Beispiel kann eine Kontrollmenge eines Markers die Menge eines Markers in einer Person ohne TCC sein. Eine Kontrollmenge kann entweder eine absolute Menge (z. B. μg/ml) oder eine relative Menge (z. B. relative Intensität des Signals) sein.
"Sonde" bezieht sich auf eine Vorrichtung, die lösbar in ein Gasphasen-Ionenspektrometer einsetzbar ist und eine Trägersubstanz mit einer Oberfläche zum Präsentieren eines Markers zum Nachweis aufweist. Eine Sonde kann eine einzelne Trägersubstanz oder eine Mehrzahl an Trägersubstanzen umfassen. Begriffe wie ProteinChip^®, ProteinChip^® Array oder Chip werden hier auch zur Bezugnahme auf bestimmte Arten von Sonden verwendet.
"Trägersubstanz" oder "Sondenträgersubstanz" bezieht sich auf eine feste Phase, auf der ein Adsorptionsmittel bereitgestellt werden kann (z. B. durch Anheftung, Abscheiden etc.).
"Adsorptionsmittel" bezieht sich auf jedes Material, das in der Lage ist einen Marker zu adsorbieren. Der Begriff "Adsorptionsmittel" wird hier sowohl als Hinweis auf ein einzelnes Material ("Monoplexadsorptionsmittel") (z. B. eine Verbindung oder funktionelle Gruppe), dem der Marker ausgesetzt wird, als auch auf eine Mehrzahl von unterschiedlichen Materialien ("Muliplexadsorptionsmittel"), welchen der Marker ausgesetzt wird, verwendet. Materialien des Adsorptionsmittels in einem Multiplexadsorptionsmittel werden als "adsorbierende Spezies" bezeichnet. Zum Beispiel kann ein ansteuerbarer Ort auf einer Sondenträgersubstanz ein Multiplexadsorptionsmittel umfassen, das durch viele verschiedene adsorbierende Spezies gekennzeichnet ist (z. B. Anionaustauschermaterialien, Metallchelatoren oder Antikörper), die unterschiedliche Bindungseigenschaften aufweisen. Das Material der Trägersubstanz selbst kann auch die Adsorptionseigenschaften eines Markers beeinflussen.
"Adsorption" oder "Retention" bezieht sich auf die nachweisbare Bindung zwischen einem Adsorptionsmittel und einem Marker entweder vor oder nach dem Waschen mit einem Elutionsmittel (Modifikationsmittel des Selektivitätschwellenwertes) oder einer Waschlösung.
"Elutionsmittel" oder 'Waschlösung" bezieht sich auf ein Agens, das zur Vermittlung der Adsorption eines Markers an ein Adsorptionsmittel verwendet werden kann. Elutionsmittel und Waschlösungen werden auch als "Modifikationsmittel des Selektivitätsschwellenwertes" bezeichnet. Elutionsmittel und Waschlösungen zum Waschen und Entfernen von ungebundenen Materialien von der Oberfläche der Sondenträgersubstanz verwendet werden.
"Lösen", "Auflösung" oder "Auflösung der Marker" bezieht sich auf den Nachweis von wenigstens einem Marker in einer Probe. Auflösen umfaßt den Nachweis einer Mehrzahl von Markern in einer Probe durch Abtrennen und anschließendem differentiellem Nachweis. Auflösung erfordert nicht die komplette Abtrennung von einem oder mehreren Markern von allen anderen Biomolekülen in einer Mischung. Stattdessen reicht jegliche Abtrennung, die die Unterscheidung zwischen wenigstens einem Marker und anderen Biomolekülen ermöglicht, aus.
"Gasphasen-Ionenspektrometer" bezieht sich auf einen Apparat, der Parameter mißt, die in Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse von Ionen übersetzt werden können, die gebildet werden, wenn eine Probe verflüchtigt und ionisiert wird. Im Allgemeinen tragen interessierende Ionen eine einfache Ladung und die Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse werden häufig einfach als Masse bezeichnet. Gasphasen-Ionenspektrometer umfassen zum Beispiel Massenspektrometer, Ionenmobilitätsspektrometer und Vorrichtung zur Messung des gesamten Ionenstroms.
"Massenspektrometer" bezieht sich auf ein Gasphasen-Ionenspektrometer, das ein Einlaßsystem, eine Ionisationsquelle, ein ionenoptisches Bauteil, einen Massenanalysator und einen Detektor umfaßt.
"Laserdesorptionsmassenspektrometer" bezieht sich auf ein Massenspektrometer, welches Laser als Mittel zur Desorption, Verflüchtigung und Ionisierung eines Analyten verwendet.
"Nachweis" bezieht sich auf das Identifizieren des Vorhandenseins, des Nichtvorhandenseins oder der Menge/des zu nachweisenden Gegenstands.
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hier austauschbar zur Bezeichnung eines Polymers aus Aminosäureresten verwendet. Die Begriffe betreffen Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) ein Analoges oder Mimikry einer entsprechend natürlichen Aminosäure ist, sowie natürlich auftretende Aminosäurepolymere. Polypeptide können zum Beispiel durch die Addition von Kohlenhydratresten unter Ausbildung von Glycoproteinen modifiziert werden. Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" umfassen Glycoproteine sowie Nicht-Glycoproteine.
"Nachweisbarer Teil" oder eine "Markierung" bezieht sich auf eine durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel nachweisbarer Zusammensetzung. Zum Beispiel umfassen geeignete Markierungen ³²P, ³⁵S, fluoreszierende Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (z. B. wie üblich bei einem ELISA verwendet), Biotin-Streptavidin, Dioxigenin, Haptene und Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper erhältlich sind, oder Nukleinsäuremoleküle mit einer zu einem Ziel komplementären Sequenz. Der nachweisbare Teil erzeugt häufig ein meßbares Signal, wie ein radioaktives, chromogenes oder flouroreszierendes Signal, das zur Quantifizierung der Menge an gebundenem, nachweisbarem Teil in einer Probe verwendet werden kann. Eine Quantifizierung des Signals wird durch z. B. Scintilfationszählung, Densitometrie oder Durchflusszytometrie erzielt.
"Antikörper" bezieht sich auf einen Polypeptidliganden, der im wesentlichen durch ein Immunglobulingen oder Immunglobulingene oder Fragmente davon, die spezifisch an Epitope binden und diese erkennen (z. B. ein Antigen) codiert werden. Die erkannten Immunglobulingene umfassen die Gene der konstanten Regionen der leichten Kappa- und Lambda-Kette, die Gene der konstanten Regionen der schweren Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und Mu-Kette und die Gene der variablen Region des Myriad-Immunglobulins. Antikörper existieren z. B. als intakte Immunglobuline oder als eine Anzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch Verdauung mit zahlreichen Peptidasen hergestellt werden. Diese umfassen zum Beispiel Fab' und F(ab)'₂-Fragmente. Der Begriff "Antikörper" wie er hier verwendet wird umfaßt auch Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation von gesamten Antikörper hergestellt werden oder solche, die de novo unter Verwendung von Methodiken der rekombinanten DNA synthetisiert werden. Er umfaßt auch polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimere Antikörper, humanisierte Antikörper oder einkettige Antikörper. "Fc"-Teil eines Antikörpers bezieht sich auf den Teil einer schweren Kette eines Immunglobulins, der eine oder mehrere Domänen von konstanten Regionen der schweren Kette, CH₁, CH₂ und CH₃, aber nicht die variable Region der schweren Kette umfaßt.
"Immunotest" ist eine Untersuchung die einen Antikörper, der spezifisch an ein Antigen (z. B. einen Marker) bindet verwendet. Der Immunotest wird durch die Verwendung spezifischer Bindeeigenschaften eines bestimmten Antikörpers zum Isolieren Anzielen und/oder Quantifizieren des Antigens gekennzeichnet.
Der Ausdruck an einen Antikörper "spezifisch (oder selektiv) binden" oder "spezifisch (oder selektiv) immunoreaktiv mit" in Bezug auf ein Protein oder ein Peptid, bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die bestimmend von der Anwesenheit des Proteins in einer heterogen Grundgesamtheit von Proteinen und anderen biologischen Präparaten bestimmt wird. Daher binden spezifische Antikörper unter den vorgesehenen Bedingungen des Immunotests an ein bestimmtes Protein wenigstens zweimal so stark wie der Hintergrund und binden im wesentlichen nicht in einer signifikanten Menge an andere in der Probe vorhandene Proteine. Ein spezifisches Binden an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper voraussetzen, der nach seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt ist. Zum Beispiel können polyklonale Antikörper, die aus spezifischen Arten wie Ratte, Maus oder Mensch gegen Marker UBC-1 gezüchtet wurden, zum Erhalt von ausschließlich solchen polyklonalen Antikörpern ausgewählt werden, die spezifisch immunreaktiv mit Marker UBC-1 sind und nicht mit anderen Proteinen, mit Ausnahme von polymorphen Varianten und Allelen des Markers UBC-1. Diese Selektion kann durch Abziehen von Antikörpern, die mit UBC-1 Markermolekülen aus anderen Arten kreuz-reagieren, erreicht werden. Eine Vielzahl an Ausführungen von Immunotests kann zur Selektion von spezifisch mit einem bestimmten Protein immunreaktiven Antikörpern verwendet werden. Zum Beispiel werden Festphasen ELISA Immunotests routinemäßig zur Selektion von spezifisch mit einem Protein immunreaktiven Antikörpern verwendet (siehe Z. B. Harlow & Lane, Antibodies, A Laborstory Manual (1988), für eine Beschreibung von Ausführungen von Immunotests und Bedingungen, die zur Bestimmung der spezifischen Immunreaktivität verwendet werden können). Üblicherweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion wenigstens zweimal so stark sein wie das Hintergrundsignal oder Rauschen und noch üblicher mehr als das 10 bis 100 -fache des Hintergrunds.
"Energieabsorbierendes Molekül" oder "EAM" bezieht sich auf ein Molekül, das Energie von einer Ionisationsquelle in einem Massenspektrometer absorbiert, und dadurch die Desorption eines Analyten, wie eines Markers, von einer Sondenoberfläche unterstützt. Abhängig von der Größe und von der Art des Analyten kann das energieabsorbierende Molekül wahlweise verwendet werden. Energieabsorbierende Moleküle, die bei MALDI verwendet werden, werden oft als "Matrix" bezeichnet. Zimtsäurederivate, Sinapinsäure ("SPA"), Cyanohydroxyzimtsäure ("CHCA") und Dihydroxybenzoesäure werden oft als energieabsorbierende Moleküle bei der Laserdesorption von bioorganischen Molekülen verwendet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Einleitung
Viele Jahre war die zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese das hauptsächliche Instrument zur Trennung und Analyse von mehreren Proteinen (O'Farrel et al., J. Biol. Chem., 250:4007 (1975)). Diese Methodik, die in der Lage ist tausende von Proteinen in einem Experiment aufzulösen, stellt die höchste Auflösung bei der Proteintrennung zur Verfügung. Sie ist jedoch arbeitsintensiv, erfordert große Mengen an Ausgangsmaterial, mangelt an Reproduzierbarkeit innerhalb eines Labors und ist unpraktisch für die klinische Anwendung. Obwohl die Entwicklung von Bildanalysesoftware zum Vergleich von 2D Gelproteinkarten und die Automatisierung des Ausschneidens von Proteinen (Patterson, Anal. Biochem., 221:1 (1994)) die Analyse der getrennten Proteine erleichtert haben, verbleiben die meisten hauptsächlichen technischen Schwierigkeiten der 2D Gelelektrophorese.
Wesentliche technologische Fortschritte in der Proteinchemie in den letzten zwei Jahrzehnten haben die Massenspektrometrie als ein unverzichtbares Instrument zur Untersuchung von Proteinen eingeführt (Carr et al., Anal. Chem., 63:2802 (1991); Carr et al., "Overview of Peptide and Protein Analysis by Mass Spectrometry, Current Protocols in Molecullar Biology", New York, John Wiley & Sons Inc., Teil 10.21, S. 10.21.1-10.21.27 (1998); Patterson, "Protein Identification and Characterization by Mass Spectrometry. Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., Teil 10.22, S. 10.22.1-10.22.24 (1998)). Auch wenn das Auflösungsvermögen von 2D Gelen unbestritten bleibt, haben die hohe Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit von Massenspektrometrie ihre Anwendung in allen Gesichtspunkten der Proteinanalyse, einschließlich Entdeckung, Identifizierung (d. h. Peptidkartierung, Sequenzierung) und struktureller Charakterisierung verstärkt.
Analog zu den Oligonukleotid-Microarray Techniken, die die Untersuchung von Genexpressionsprofilen ermöglichen, hat Ciphergen Biosystems, Inc. kürzlich die mit "SELDI-TOF-MS (Oberflächen verstärkte Laserdesorption-/Ionisierung-Flugzeit-Massenspektrometrie) gekoppelte ProteinChip^® Technik entwickelt zur Vereinfachung der Profilerstellung von Protein aus komplexen biologischen Mischungen (Hutchens et al., Rapid Comm. Mass Spectrom, 7:576-580 (1993); Kuwata et al., Bioch. Bioph. Res. Comm., 245:764-773 (1998)). Diese Technik verwendet patentierte Chipanordnungen, um individuelle Proteine aus komplexen Mischungen abzufangen, welche anschließend durch Massenspektrometrie aufgelöst werden. Diese erfinderische Technik hat zahlreiche Vorteile gegenüber der 2D-PAGE: Sie ist viel schneller, hat eine hohe Durchlauffähigkeit, erfordert um Größenordnungen kleinere Mengen der Proteinprobe, weist eine Empfindlichkeit zum Nachweis von Proteinen im Picomol- bis Attomol-Bereich auf, kann effektiv Proteine mit geringen Massen auflösen (2000-20000 Da) und ist direkt anwendbar für die Entwicklung von klinischen Untersuchungen.
Die Wirksamkeit der SELDI-Technik bei der Entdeckung von Proteinmarkern von Prostatakrebs in Serum, Plasma von Samen und Zellextrakten, sowie die Entwicklung eines Immunotests zum Nachweis von bekannten Prostatakrebsmarkern wurde kürzlich durch unser Labor gezeigt (Wright et al., Prostate Cancer and Prostate Diseases, 2:264-276 (1999); Paweletz et al., Drug Development Research, 49:34-42 (2000)). Die vorliegende Erfindung beschreibt die neuen in Urin von sowie in anderen Probenarten nachweisbaren TCC-Biomarker und Materialien und Verfahren zur Bewertung dieser Biomarker bei der Diagnose von TCC. Mehrere Änderungen von Protein wurden reproduzierbar im Urin TCC-Patienten gefunden, einschließlich fünf neuer TCC-Biomarker im Urin und 7 Protein-Cluster-Regionen, die aus einer unterschiedlichen Anzahl an in dem Krebs beobachteten Proteinen im Vergleich zu den Kontrollgruppen bestehen. Einer dieser mit TCC verknüpften Proteinbiomarker im Urin wurde als Mitglied der Defensin-Familie von Peptiden identifiziert.
Die mit TCC verknüpften Proteinbiomarker der vorliegenden Erfindung können in zahlreichen Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine oder jede Kombination der Marker zur Unterstützung einer Diagnose von TCC verwendet werden. In einem anderen Beispiel können die Marker zum Durchsuchen nach Verbindungen, die die Expression der Marker in vitro oder in vivo modulieren verwendet werden, wobei diese Verbindungen im Gegenzug bei der Behandlung und Vorbeugung von TCC in Patienten nützlich sein können. In einem anderen Beispiel können die Marker zur Überwachung von Antworten auf bestimmte Behandlungen von TCC verwendet werden. In noch einem anderen Beispiel können die Marker bei Vererbungsstudien verwendet werden. Beispielsweise können bestimmte Marker genetisch verknüpft sein. Dies kann zum Beispiel durch Untersuchen von Proben von einer Grundgesamtheit von TCC-Patienten, deren Familien einen Hintergrund an TCC haben, bestimmt werden. Diese Ergebnisse können dann mit Daten verglichen werden, die zum Beispiel von TCC-Patienten erhalten wurden, deren Familien keinen Hintergrund an TCC haben. Die genetisch verknüpften Marker können als Instrument zur Bestimmung verwendet werden, ob eine Testperson, deren Familie einen Hintergrund an TCC hat, für TCC anfällig ist.
II. Charakterisierung der Marker
Zwei Gruppen an Markern wurden aus Urinproben von TCC-Patienten unter Verwendung von Gasphasen-Ionenspektrometrie identifiziert. Gruppe 1 der Marker stellt Marker dar, die durch Gasphasen-Ionenspektrometrie mit einem einzigen oder definierten Massenwert nachgewiesen wurden. Gruppe 2 der Marker stellt Marker dar, die durch Gasphasen-Ionenspektrometrie als Protein-Cluster mit einem Bereich an Massenwerten nachgewiesen wurden. Jeder Protein-Cluster-Marker aus der Gruppe 2 der Marker kann ein Cluster von unterschiedlichen Proteinen und/oder einen Cluster von demselben Protein in unterschiedlichen Stadien darstellen.
A. Gruppe 1 der Marker

Eine erste Gruppe an Markern wurde in Urinproben von TCC-Patienten gefunden. Wahlweise wurden Urinproben zuerst durch Größenausschlußchromatographie fraktioniert, gefolgt von einer SELDI-Untersuchung durch Anionaustauschchromatographie. Zum Beispiel wurde die Probe oder eine aus der Größenausschlusschromatographie eluierte Fraktion auf eine Trägersubstanz aufgetragen, die ein kationisches Adsorptionsmittel umfaßt (d. h. SAX2 ProteinChip^®, Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA) und durch Gasphasen-Ionenspektrometrie zur Messung der scheinbaren molekularen Gewichte der in dem Adsorptionsmittel zurückgehaltenen Marker untersucht. Diese Marker waren in Urinproben von TCC-Patienten häufiger vorhanden im Vergleich zu Kontrollproben. Tabelle A zeigt durch Massenspektrometrie gemessene scheinbare molekulare Gewichte jeden Markers. TABELLE A

Marker	scheinbares M.W.
UBC-1	3,353 kDa ± 105 Da 3,432 kDa ± 122 Da 3,470 kDa ± 32 Da
UBC-2	9,495 kDa ± 233 Da
UBC-3	44,6 kDa ± 1,9 kDa
UBC-4	100,120 kDa ± 4,3 kDa
UBC-5	133,190 kDa ± 3,9 kDa

Wie in Tabelle A gezeigt, ist das scheinbare molekulare Gewicht jeden Markers als Bereich dargestellt. Der Schwankungsbereich der Masse jeden Markers (z. B. 233 Da für UBC-2) stellt fünfmal die Standardabweichung der durch Massenspektrometrie gemessenen Massen von mehreren Proben dar (siehe den Beispielabschnitt). Da alle dieser Marker an das kationische Adsorptionsmittel binden, haben diese Marker wahrscheinlich eine negative Nettoladung. Marker UBC-1 wurde auch in aus Urinbarbotage hergestellten Zelllysaten nachgewiesen. Unter diesen Markern wird Marker UBC-1 als die humanen Defensine α2 und 1 identifiziert. Die Identität der anderen Marker ist unbekannt. Andere Merkmale dieser Marker sind unten in dem Beispielabschnitt näher beschrieben.
B. Gruppe 2 der Marker

Eine zweite Gruppe an Markern wurde auch in Urinproben von TCC-Patienten gefunden unter Verwendung des Probenverfahrens wie für die Marker UBC-1 bis UBC-5. Urinproben wurden zuerst durch Größenausschlusschromatographie fraktioniert, gefolgt von einer SELDI-Untersuchung auf einem Anionenaustauscherchip. Danach wurde jede Fraktion auf eine Trägersubstanz aufgebracht, welche ein Adsorptionsmittel mit einer kationischen Gruppe umfaßt (d. h. SAX2 ProteinChip^®, Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA), und durch Gasphasen-Ionenspektrometrie zur Messung eines scheinbaren molekularen Gewichts der in dem Adsorptionsmittel zurückgehaltenen Marker untersucht. Mit Ausnahme von Marker PC-6 waren diese Marker häufiger in den Urinproben von TCC-Patienten vorhanden im Vergleich zu Kontrollproben. Im Gegensatz dazu war Marker PC-6 häufiger in den Urinproben der gesunden Kontrollgruppe ohne TCC-Erkrankung vorhanden im Vergleich zu Urinproben der Gruppe mit TCC-Erkrankung. Tabelle B zeigt das scheinbare molekulare Gewicht jeden Markers. TABELLE B

Marker	scheinbares M.W.
PC-1	ungefähr 4,950-5,150 kDa
PC-2	ungefähr 5,710-6,000 kDa
PC-3	ungefähr 6,758-7,750 kDa
PC-4	ungefähr 15,000-16,000 kDa
PC-5	ungefähr 37,500-40,000 kDa
PC-6	ungefähr 79,500-82,000 kDa
PC-7	ungefähr 85,000-92,000 kDa

Wie in Tabelle B gezeigt wird das scheinbare molekulare Gewicht jeden Markers (gemessen durch Massenspektrometrie) mit "ungefähr" bezeichnet, da das molekulare Gewicht eines Proteins üblicherweise mit einem Vertrauensbereich von ungefähr 0,5% Abweichung durch Massenspektrometrie aufgelöst wird. Daher bezieht sich "ungefähr" in Zusammenhang des Massenbereichs der Marker PC-1 bis PC-7 auf 0,5% Abweichungen der vermerkten Werte. Zum Beispiel ist der Bereich des scheinbaren molekularen Gewichts von Marker PC-1 4,950 kDa ± 25 Da bis 5,150 kDa ± 26 Da. Für die Marker PC-2 bis PC-7 sind die scheinbaren molekularen Bereiche der Marker wie folgt: Marker PC-2: 5,710 kDa ± 29 Da bis 6,000 kDa ± 30 Da, Marker PC-3: 6,758 kDa ± 34 Da bis 7,750 kDa ± 39 Da, Marker PC-4: 15,000 kDa ± 75 Da bis 16,000 kDa ± 80 Da, Marker PC-5: 37,500 kDa ± 186 Da bis 40,000 kDa ± 200 Da, Marker PC-6: 79,500 kDa ± 398 Da bis 82,000 kDa ± 410 Da und Marker PC-7: 85,000 ± 425 Da kDa bis 92,000 kDa ± 460 Da.
Da alle diese Marker an das kationische Adsorptionsmittel binden, haben diese Marker wahrscheinlich eine negative Nettoladung. Die Identität dieser Marker ist unbekannt. Andere Merkmale dieser Marker sind in dem Beispielabschnitt näher beschrieben.
Während die Marker ursprünglich in einer Urinprobe identifiziert wurden, können die Marker in anderen Arten von Proben vorhanden sein (z. B. Barbotage, Blut, Serum, Speichel, Gewebe, etc.). Daher sind die Proben, in welchen die Marker nachgewiesen werden können, nicht auf Urinproben beschränkt. Während die Marker ursprünglich unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken identifiziert wurden, ist überdies der Nachweis der Marker nicht auf diese Techniken beschränkt und andere Techniken (z. B. ELISA Immunotests) können verwendet werden.
III. Nachweis der Marker
Gemäß eines anderen Gesichtspunktes stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Markern, die verschieden in den Proben eines TCC-Patienten und einer Kontrolle (z. B. Testpersonen, in denen TCC nicht nachweisbar ist) vorhanden sind, zur Verfügung. Die Marke können in einer Anzahl von biologischen Proben nachgewiesen werden. Bevorzugt ist die Probe eine flüssige biologische Probe. Beispiele für eine bei dieser Erfindung nützliche, flüssige biologische Probe umfassen Urin, Blasenbarbotage, Blut, Plasma, Tränen, Speichel, Gewebe, etc. Da alle Marker in Urin gefunden werden, ist Urin eine bevorzugte Probenquelle für Ausführungsformen der Erfindung.
Jedes geeignete Verfahren kann zum Nachweis von einem oder mehrerer der hier beschriebenen Marker verwendet werden. Zum Beispiel kann Gasphasen-Ionenspektrometrie verwendet werden. Diese Technik umfaßt zum Beispiel Laserdesorptions-/Ionisierungs-Massenspektrometrie. In einigen Ausführungsformen kann die Probe zur Unterstützung des Nachweises der Marker vor der Gasphasen-Ionenspektrometrie z. B. durch Vorfraktionierung, zweidimensionale Gelchromatographie, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, etc. vorbereitet werden. Ein Nachweisen der Marker kann durch Verwenden anderer Verfahren als Gasphasen-Ionenspektrometrie erreicht werden. Zum Beispiel können herkömmliche Immunotests (z. B. ELISA) zum Nachweisen der Marker in einer Probe verwendet werden. Diese Nachweisverfahren sind unten genau beschrieben.
A. Nachweis durch Gasphasen-Ionenspektrometrie
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die in einer Probe vorhandenen Marker unter Verwendung von Gasphasen-Ionenspektrometrie nachgewiesen und mehr bevorzugt unter Verwendung von Massenspektrometrie. In einer Ausführungsform kann Matrix gestützte Laserdesorptions-Ionisations-("MALDI")Massenspektrometrie verwendet werden. Bei MALDI wird die Probe unter Verwendung von Proteintrennungsverfahren, wie zweidimensionaler Gelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), unter Erhalt einer Fraktion, die im wesentlichen aus einem Marker oder Markern besteht, üblicherweise gewissermaßen aufgereinigt.
In einer anderen Ausführungsform kann Oberflächen unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie ("SELDI") verwendet werden. SELDI verwendet eine Trägersubstanz, die Adsorptionsmittel zum Abfangen von Markern umfaßt, welche dann während der Massenspektrometrie direkt von der Trägersubstanzoberfläche desorbiert und ionisiert werden können. Da die Oberfläche des Trägermaterial bei SELDI Marker abfängt, muß eine Probe nicht wie bei MALDI gewissermaßen aufgereinigt sein. Jedoch kann es in Abhängigkeit von der Komplexität einer Probe und der Art des Adsorptionsmittels wünschenswert sein, eine Probe vor der SELDI-Untersuchung zur Verringerung ihrer Komplexität vorzubereiten.
Zahlreiche Probenvorbereitungsverfahren zur Unterstützung des Nachweises von Markern in einer Probe und Gasphasen-Ionenspektrometrie Verfahren sind unten genau beschrieben.
1. Vorbereitung einer Probe vor der Gasphasen-Ionenspektrometrie
Wahlweise kann eine oder eine Kombination der unten beschriebenen Verfahren oder andere in der Technik bekannte Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zur weiteren Unterstützung des Nachweises und der Charakterisierung von Markern in einer Probe verwendet werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Probe vorfraktioniert werden, um vor der Untersuchung durch Gasphasen-Ionenspektrometrie eine weniger komplexe Probe zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel kann eine Urinprobe gemäß der Größe der Proteine vorfraktioniert werden, um die Komplexität der Proteine in der Probe zu verringern. Überdies können Protokolle zur Vorfraktionierung zusätzliche Informationen hinsichtlich physikalischer und chemischer Merkmale von Markern zur Verfügung stellen. Wenn zum Beispiel eine Probe unter Verwendung einer Anionenaustausch-Zentrifugationssäule vorfraktioniert wurde und wenn ein Marker bei einem bestimmten pH eluiert wird, stellt diese Elutionscharakteristik eine Information in Bezug auf die Bindungseigenschaften des Markers zur Verfügung. In einem anderen Beispiel kann eine Probe durch Entfernen von Proteinen oder anderen Molekülen in der Probe, die in hoher Menge vorhanden sind oder bei dem Nachweis eines Markers in einer Probe stören können, vorfraktioniert werden. Andere geeignete Probenvorbereitungsprotokolle sind dem Fachmann offensichtlich und können auch in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
a) Größenausschlußchromatographie
In einer Ausführungsform kann eine Probe unter Verwendung von Größenausschlußchromatographie gemäß der Größe an Proteinen in einer Probe vorfraktioniert werden. Bei einer biologischen Probe, bei der die Menge der erhältlichen Probe klein ist, wird bevorzugt eine nach Größe selektierende Zentrifugationssäule verwendet. Zum Beispiel kann eine K-30 Zentrifugationssäule (Ciphergen Biosystems, Inc.) verwendet werden. Im allgemeinen hat die erste von der Säule eluierte Fraktion ("Fraktion 1") den höchsten Prozentsatz an Proteinen mit hohem Molekulargewicht, Fraktion 2 hat einen geringeren Prozentsatz an Proteinen mit hohem Molekulargewicht, Fraktion 3 hat einen noch geringeren Prozentsatz an Proteinen mit hohem Molekulargewicht, Fraktion 4 hat die geringste Menge an großen Proteinen, usw. Jede Fraktion kann dann zum Nachweis von Markern durch Gasphasen-Ionenspektrometrie untersucht werden.
b) Abtrennung von Biomolekülen durch Gelelektrophorese
In einer anderen Ausführungsform können Biomoleküle in einer Probe durch hochauflösende Elektrophorese, z. B. ein- oder zweidimensionale Gelelektrophorese, getrennt werden. Eine einen Marker enthaltende Fraktion kann isoliert und weiter durch Gasphasen-Ionenspektrometrie untersucht werden. Bevorzugt wird zweidimensonale Gelelektrophorese zum Erzeugen einer zweidimensionalen Anordnung von Punkten von Biomolekülen, einschließlich einem oder mehreren Marker(n), verwendet. Siehe z. B. Jungblut und Thiede, Mass Spectr. Rev. 16:145-162 (1997).
Die zweidimensionale Gelelektrophorese kann unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Siehe Z. B. Deutscher Hrsg., Methods In Enzymology Band 182. Üblicherweise werden Biomoleküle in einer Probe durch z. B. isoelektrische Fokussierung getrennt, während welcher Biomoleküle in einer Probe in einem PH-Gradienten getrennt werden bis sie einen Punkt erreichen, an dem ihre Nettoladung null ist (d.h. isoelektrischer Punkt). Dieser erste Trennungsschritt ergibt eine eindimensionale Anordnung an Biomolekülen. Die Biomoleküle in einer eindimensionalen Anordnung werden weiter getrennt, wobei eine Technik verwendet wird, die im allgemeinen unterschiedlich von der in dem ersten Trennungsschritt verwendeten Technik ist. Zum Beispiel werden in der zweiten Dimension durch isoelektrische Fokussierung aufgetrennte Biomoleküle weiter unter Verwendung eines Polyacrylamidgels wie Z. B. eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese, in der Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) aufgetrennt. SDS-PAGE ermöglicht die weitere Trennung basierend auf der molekularen Masse von Biomolekülen. Üblicherweise kann zweidimensionale Gelelektrophorese chemisch unterschiedliche Biomoleküle in einem Bereich der molekularen Masse von 1000-200.000 Da in komplexen Mischungen trennen.
Biomoleküle in der zweidimensionalen Anordnung können unter Verwendung irgendeines geeigneten, in der Technik bekannten Verfahrens nachgewiesen werden. Zum Beispiel können Biomoleküle in einem Gel markiert oder gefärbt werden (z. B. Coomassie Blau oder Silberfärbung). Wenn eine Gelelektrophose Punkte erzeugt, die dem molekularen Gewicht von einem oder mehreren Marker(n) der Erfindung entsprechen, kann der Punkt weiter durch Gasphasen-Ionenspektrometrie untersucht werden. Zum Beispiel können Punkte aus dem Gel ausgeschnitten und durch Gasphasen-Ionenspektometrie untersucht werden. Alternativ kann das Biomoleküle enthaltende Gel durch Anlegen eines elektrischen Feldes auf eine inerte Membran transferiert werden. Dann kann ein Punkt auf der Membran, der ungefähr dem molekularem Gewicht eines Markers entspricht, durch Gasphasen-Ionenspektrometrie untersucht werden. Bei der Gasphasen-Ionenspektrometrie können die Punkte unter Verwendung irgendeiner geeigneten Technik, wie MALDI oder SELDI wie detailliert unten beschrieben analysiert werden (z. B. unter Verwendung von ProteinChip^® Array).
Vor der Gasphasen-Ionenspektrometrieuntersuchung kann es wünschenswert sein, die Biomoleküle in dem Punkt in kleinere Fragmente unter Verwendung von spaltenden Reagenzien, wie Proteasen (z. B. Trypin) zu spalten. Der Verdau von Biomolekülen in kleine Fragmente stellt einen Fingerprint der Massen der in dem Punkt vorhandenen Biomoleküle zur Verfügung, welcher sofern gewünscht zur Bestimmung der Identität von Markern verwendet werden kann.
c) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
In noch einer anderen Ausführungsform kann Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Trennung einer Mischung aus Biomolekülen in einer Probe basierend auf ihren unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften, wie Polarität, Ladung und Größe, verwendet werden. HPLC-Geräte bestehen üblicherweise aus einem Vorratsgefäß an mobiler Phase, einer Pumpe, einem Injektor, einer Trennungssäule und einem Detektor. Biomoleküle in einer Probe werden durch Einspritzen eines Aliquots der Probe auf die Säule getrennt. Unterschiedliche Biomoleküle in der Mischung durchlaufen die Säule mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgrund ihrer unterschiedlicher Aufteilungseigenschaften zwischen der mobilen flüssigen Phase und der stationären Phase. Eine Fraktion, die dem Molekulargewicht und/oder physikalischen Eigenschaften von einem oder mehreren Markern entspricht, kann gesammelt werden. Die Fraktion kann dann durch Gasphase-Ionenspektrometrie zum Nachweis von Markern untersucht werden. Zum Beispiel können die Punkte unter Verwendung von entweder MALDI oder SELDI (z. B. unter Verwendung von ProteinChip^® Array) wie unten genau beschrieben untersucht werden.
d) Modifikation des Markers vor einer Analyse
Wahlweise kann ein Marker vor der Analyse zur Verbesserung seiner Auflösung und zur Bestimmung seiner Identität modifiziert werden. Zum Beispiel können die Marker vor der Untersuchung einem proteolytischen Verdau unterzogen werden. Irgendeine Protease kann verwendet werden. Proteasen wie Trypsin, die wahrscheinlich die Marker in eine bestimmte Anzahl an Fragmenten spalten, sind besonders nützlich. Die aus dem Verdau entstehenden Fragmente funktionieren als Fingerprint für die Marker, wobei sie deren Nachweis indirekt ermöglichen. Dies ist besonders nützlich, wenn Marker mit ähnlichen molekularen Massen vorhanden sind, die mit dem fraglichen Marker verwechselt werden können. Proteolytische Fragmentierung ist auch für Marker mit hohem molekularem Gewicht nützlich, da kleinere Marker leichter durch Massenspektrometrie aufgelöst werden. In einem anderen Beispiel können Biomoleküle zur Verbesserung der Auflösung des Nachweises modifiziert werden. Zum Beispiel kann Neuraminidase zum Entfernen von endständigen Sialsäuregruppen von Glycoproteinen zur Verbesserung der Bindung an ein anionisches Adsorptionsmittel (z. B. kationische Austausch-ProteinChip^® Arrays) und zur Verbesserung der Auflösung des Nachweises verwendet werden. In einem anderen Beispiel können die Marker durch Anheften einer Markierung mit bestimmtem molekularen Gewicht, die spezifisch an molekulare Marker bindet, wobei sie weiter gekennzeichnet werden, modifiziert werden. Wahlweise kann nach dem Nachweisen solcher modifizierter Marker die Identität der Marker weiter durch Abgleichen der physikalischen und chemischen Merkmale der modifizierten Marker in einer Proteindatenbank (z. B. SWISS-PRO) bestimmt werden.
2. Inkontaktbringen einer Probe mit einer Trägersubstanz zur Gasphasen-Ionenspektrometrie-Analyse
Eine Prob oder eine wie oben beschrieben vorbereitete Probe kann mit einer Trägersubstanz in Kontakt gebracht werden. Eine Trägersubstanz kann eine Sonde sein, die für die Verwendung mit einem Gasphasen-Ionenspektrometer angepaßt ist. Alternativ kann eine Trägersubstanz ein getrenntes Material sein, das auf eine Sonde angebracht werden kann, die für die Verwendung mit einem Gasphasen-Ionenspektrometer angepaßt ist. Zum Beispiel kann eine Trägersubstanz eine feste Phase sein, wie eine polymere, paramagnetische, Latex- oder Glasperle, die z. B. eine funktionelle Gruppe zum Binden von Markern umfaßt. Die Trägersubstanz kann dann auf eine Sonde aufgebracht werden.
Eine Sonde kann jede geeignete Form haben, sofern sie für die Verwendung mit einem Gasphasen-Ionenspektrometer angepaßt ist (z. B. lösbar einbringbar in ein Gasphasen-Ionenspektrometer). Zum Beispiel kann die Sonde in der Form eines Streifens, einer Platte oder Schale mit einer Reihe von Vertiefungen an vorbestimmten ansteuerbaren Stellen sein. Die Sonde kann auch für die Verwendung mit Einlaßsystemen und Detektoren eines Gasphasen-Ionenspektrometers geformt sein. Zum Beispiel kann die Sonde für die Befestigung in einem horizontal und/oder vertikal verschiebbaren Schlitten angepaßt sein, der die Sonde horizontal und/oder vertikal in eine nachfolgende Position bewegt, ohne eine Umpositionierung der Sonde von Hand zu erfordern.
Das Trägermaterial der Sonde kann aus jedem geeigneten Material bestehen. Zum Beispiel kann das Material der Trägersubstanz der Sonde isolierende Materialien (z. B. Glas, wie Siliiziumoxid, Plastik, Keramik), halbleitende Materialien (z. B. Silizium Halbleiterscheiben) oder elektrisch leitende Materialien (z. B. Metalle, wie Nickel, Messing, Stahl, Aluminium, Gold oder elektrisch leitende Polymere), organische Polymere, Biopolymere oder irgendwelche Kombinationen davon umfassen, ist aber nicht beschränkt darauf. Das Material der Trägersubstanz der Sonde kann auch kompakt oder porös sein. Für Ausführungsformen der Erfindung geeignete Sonden sind z. B. in dem US-Patent No. 5,617,060 (Hutchens und Yip) und WO98/59360 (Hutchens und Yip) beschrieben.
a) Analyse von Proben auf einer inerten Trägersubstanz
Wenn die Komplexität einer Probe unter Verwendung der oben beschriebenen Vorbereitungsmethoden wesentlich verringert wurde, kann die Probe mit jeder geeigneten Trägersubstanz zur Gasphasen-Ionenspektrometrie in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel kann die Oberfläche der Trägersubstanz inert sein und muß nicht Adsorptionsmittel zum Binden von Markern umfassen, da eine weitere Auftrennung von anderen Biomolekülen von Markern nicht notwendig ist. In einigen Ausführungsformen wird eine Probe bevorzugt durch zweidimensionale Gelelektrophorese oder HPLC unter Erhalt einer Fraktion, die Markerproteine enthält, vor dem Inkontaktbringen der Fraktion mit einem Trägermaterial vorbereitet. Die Marker in dem Punkt oder der Fraktion können unter Verwendung von Gasphasen-Ionenspektrometrie (z. B. herkömmliche MALDI) ohne weiter Fraktionierung oder unter Verwendung von anderen in der Technik bekannten Verfahren aufgelöst werden.
Vor der Analyse durch Gasphasen-Ionenspektrometrie wird üblicherweise ein energieabsorbierendes Molekül ("EAM") oder ein Matrixmaterial auf die Marker auf der Oberfläche der Trägersubstanz aufgebracht. Die energieabsorbierenden Moleküle können die Absorption von Energie von einer Energiequelle eines Gasphasen-Ionenspektrometers unterstützen und können die Desorption der Marker von der Sondenoberfläche unterstützen. Beispielhafte energieabsorbierende Moleküle umfassen Zimtsäurederivate, Sinapinsäure ("SPA"), Cyanohydroxyzimtsäure ("CHCA") und Dihydroxybenzoesäure. Andere geeignete energieabsorbierende Moleküle sind dem Fachmann bekannt. Siehe z. B. US-Patent No. 5,719,060 (Hutchens & Yip) für eine weitere Beschreibung von energieabsorbierenden Molekülen.
Die energieabsorbierenden Moleküle und die Marker enthaltenden Proben können auf irgendeine geeignete Art in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel wird ein energieabsorbierendes Molekül mit einer Marker enthaltenden Probe gemischt und die Mischung auf die Oberfläche der Trägersubstanz aufgebracht, wie bei dem herkömmlichen MALDI-Verfahren. In einem anderen Beispiel können energieabsorbierende Moleküle auf die Oberfläche der Trägersubstanz aufgebracht werden, bevor die Oberfläche der Trägersubstanz mit einer Probe in Kontakt gebracht wird. In einem anderen Beispiel kann eine Probe auf die Oberfläche der Trägersubstanz aufgebracht werden, bevor die Oberfläche der Trägersubstanz mit einem energieabsorbierenden Molekül in Kontakt gebracht wird. Die Marker können dann desorbiert, ionisiert und wie unten genau beschrieben nachgewiesen werden.
b) Analyse von Proben auf einer Oberfläche einer Trägersubstanz, die Adsorptionsmittel umfaßt
In einigen Ausführungsformen kann die Komplexität einer Probe unter Verwendung einer Trägersubstanz, die Adsorptionsmittel aufweist, die in der Lage sind einen oder mehrere Marker zu binden, weiter verringert werden. Adsorptionsmittel müssen nicht biospezifisch für Marker sein (z. B. Antikörper, die spezifisch Marker binden), sofern die Adsorptionsmittel Bindungseigenschaften haben, die geeignet sind für die Bindung von Markern. Zum Beispiel können Adsorptionsmittel eine hydrophobe Gruppe, eine hydrophile Gruppe, eine kationische Gruppe, eine anionische Gruppe, eine mit Metallionen chelatbildende Gruppe, Lektin, Heparin oder Antikörper oder irgendeine Kombination davon umfassen. Bevorzugt ist das Adsorptionsmittel kationisch oder umfaßt für Marker spezifische Antikörper.
Beispiele verschiedener Arten an Adsorptionsmitteln sind in der Technik gut bekannt. Zum Beispiel umfassen Adsorptionsmittel, die eine hydrophobe Gruppe umfassen Bindemittel mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen, z. B. C₁-C₁₈ aliphatische Kohlenwasserstoffe und Bindemittel mit aromatischen funktionellen Kohlenwasserstoffgruppen, wie Phenylgruppen. Adsorptionsmittel, die eine hydrophile Gruppe umfassen, umfassen Z. B. Glas (z. B. Siliziumoxid) oder hydrophile Polymere, wie Polyethylenglycol, Dextran, Agarose oder Cellulose. Adsorptionsmittel, die eine kationische Gruppe umfassen, umfassen zum Beispiel Bindemittel aus sekundären, tertiären oder quaternären Aminen. Adsorptionsmittel, die eine anionische Gruppe umfassen, umfassen zum Beispiel Bindemittel aus Sulfatanionen (SO₃ ^–) und Bindemittel aus Carboxylatanionen (COO^–) oder Phosphatanionen (OPO₃ ^–). Adsorptionsmittel, die mit Metallchelatbildende Gruppen umfassen, umfassen zum Beispiel organische Moleküle, die eine oder mehrere Elektronendonorgruppen haben, welche mit Metallionen, wie Kupfer, Nickel, Kobalt, Zink, Eisen oder anderen Metallionen, wie Aluminium und Calcium, koordinierte kovalente Bindungen bilden. Adsorptionsmittel, die einen Antikörper umfassen, umfassen zum Beispiel einen Antikörper, der spezifisch an irgendeinen der hier zur Verfügung gestellten Marker bindet. Sonden mit einigen dieser Adsorptionsmittel sind im Handel erhältlich (z. B. Normal Phase ProteinChip^®, SAX2 ProteinChip^®, IMAC3 ProteinChip^®, etc., alle von Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA) erhältlich). In bevorzugten Ausführungsformen sind die Adsorptionsmittel im wesentlichen ähnlich zu oder die gleichen Adsorptionsmittel, welche ursprünglich zur Anreicherung und Identifizierung der Marker aus einer Urinprobe verwendet wurden (z. B. SAX2 ProteinChip^®).
Die Sonden können unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens, abhängig von der Auswahl des Materials der Trägersubstanz und/oder der Adsorptionsmittel hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Metalloberfläche mit Siliziumoxid, Titanoxid oder Gold beschichtet werden und die beschichtete Oberfläche kann zum Beispiel mit einem bifunktionalen Verbindungsstück zum Binden und Anbringen an ein Adsorptionsmittel derivatisiert werden. Zum Beispiel kann ein Ende eines bifunktionalen Verbindungsstücks kovalent mit einer funktionalen Gruppe auf der Oberfläche binden und das andere Ende kann weiter mit Gruppen derivatisiert werden, die als ein Adsorptionsmittel fungieren. In einem anderen Beispiel kann eine poröse Siliziumoberfläche, die aus kristallinem Silizium erzeugt wurde, chemisch für das Einschließen von Adsorptionsmittel zur Bindung von Markern modifiziert werden. In einem anderen Beispiel können Adsorptionsmittel direkt auf der Oberfläche der Trägersubstanz durch in situ-Polymerisierung einer Lösung von Monomeren, die z. B. substituierte Acrylamidmonomere, substituierte Acrylatmonomere oder Derivate davon umfaßt, die eine gewählte funktionelle Gruppe als ein Adsorptionsmittel umfassen, gebildet werden. Die Polymerisierung der Lösung von Monomeren kann Hydrogel-Adsorptionsmittel zur Verfügung stellen, mit einer größeren Kapazität zur Bindung von Biomolekülen.
Marker bindende Adsorptionsmittel können auf die Trägesubstanz nach jedem geeigneten Schema (z. B. kontinuierlich oder diskontinuierlich) aufgebracht werden. Zum Beispiel können ein oder mehrere Adsorptionsmittel auf der Oberfläche der Trägersubstanz vorhanden sein. Wenn mehrere Arten von Adsorptionsmitteln verwendet werden, kann die Oberfläche der Trägersubstanz so beschichtet werden, daß eine oder mehrere Bindungscharakteristiken in einem ein- oder zweidimensionalen Gradienten variieren. Sofern es diskontinuierlich ist, können mehrfache Adsorptionsmittel auf der Oberfläche der Trägersubstanz an vorbestimmten ansteuerbaren Stellen sein. Die ansteuerbaren Stellen können in irgendeinem Muster angeordnet sein, aber bevorzugt in einem regelmäßigen Muster, wie Linien, orthogonale Anordnungen oder regelmäßige Kurven (z. B. Kreise). Zum Beispiel kann eine Sonde diskontinuierliche Punkte an Adsorptionsmitteln umfassen. Jede ansteuerbare Stelle kann das gleiche oder unterschiedliche Adsorptionsmittel umfassen. Die Punkte sind "ansteuerbar" dadurch, daß während der Massenspektrometrie eine Energiequelle, wie ein Laser, darauf gerichtet wird oder jeden Punkt zum Desorbieren und Ionisieren von Markern "ansteuert".
Eine Probe wird mit einer ein Adsorptionsmittel umfassenden Trägersubstanz auf irgendeine geeignete Art in Kontakt gebracht, z. B. Baden, Durchtränken, Eintauchen, Sprühen, Darüber waschen oder Pipeltieren, etc. Im allgemeinen ist ein Probenvolumen, das zwischen ein paar Attomol bis 100 Picomol eines Markers in ungefähr 1 μl bis 500 μl enthält, ausreichend zur Bindung an das Adsorptionsmittel. Die Probe kann mit der ein Adsorptionsmittel umfassenden Trägersubstanz der Sonde für einen für das Binden des Markers an das Adsorptionsmittel ausreichenden Zeitraum in Kontakt kommen. Üblicherweise werden die Probe und die das Adsorptionsmittel umfassende Trägersubstanz für einen Zeitraum von zwischen ungefähr 30 Sekunden und ungefähr 12 Stunden und bevorzugt zwischen ungefähr 30 Sekunden und ungefähr 15 Minuten in Kontakt gebracht. Üblicherweise wird die Probe mit der Trägersubstanz der Sonde unter Bedingungen bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck in Kontakt gebracht. Für einige Proben können jedoch veränderte Temperaturen (üblicherweise 4 °C bis 37 °C) und Druckbedingungen wünschenswert sein, wobei die Bedingungen von einem Fachmann bestimmbar sind.
Nachdem die Trägersubstanz mit der Probe oder Probenlösung in Kontakt gekommen ist, ist es bevorzugt, daß ungebundenes Material auf der Oberfläche der Trägersubstanz weggewaschen wird, so daß nur gebundene Materialien auf der Oberfläche der Trägersubstanz verbleiben. Ein Waschen der Oberfläche der Trägersubstanz kann zum Beispiel durch Baden, Tränken, Eintauchen, Abspülen, Sprühen oder Waschen der Oberfläche der Trägersubstanz mit einem Elutionsmittel erreicht werden. Ein Microfluidik-Verfahren wird bevorzugt verwendet wenn ein Elutionsmittel auf kleine Punkte von Adsorptionsmittel auf der Sonde aufgebracht wird. Üblicherweise kann ein Elutionsmittel eine Temperatur von zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 4 °C und 37 °C haben. In einigen Ausführungsformen kann das Waschen des ungebundenen Materials von der Sondenoberfläche nicht notwendig sein, wenn die an der Sondenoberfläche gebundenen Marker durch Gasphasen-Ionenspektrometrie ohne eine Waschung aufgelöst werden können.
Jedes geeignete Elutionsmittel (z. B. organisch oder wäßrig) kann zum Waschen der Oberfläche des Trägermaterials verwendet werden. Bevorzugt wird eine wäßrige Lösung verwendet.
Beispielhafte wäßrige Lösungen umfassen einen HEPES-Puffer, einen Tris-Puffer oder einen Phosphat-Puffer, etc. Zur Steigerung der Stringenz der Waschung der Puffer können Additive in den Puffern enthalten sein. Diese umfassen, sind aber nicht begrenzt auf Ioneninteraktions-Modifikationsmittel (sowohl Ionenstärke als auch pH), Wasserstruktur-Modifikationsmittel, Modifikationsmittel der hydrophoben Interaktion, chaotrope Reagenzien, Verdrängungsmittel der Affinitätsinteraktion. Spezifische Beispiele dieser Additive können in z. B. PCT Veröffentlichung WO98/59360 (Hutchens und Yip) gefunden werden. Die Auswahl eines bestimmten Elutionsmittels oder Additivs zu einem Elutionsmittel hängt von anderen Versuchsbedingungen ab (z. B. Arten der verwendeten Adsorptionsmittel oder zu nachzuweisenden Marker) und kann von einem Fachmann bestimmt werden.
Vor der Desorption und Ionisation von Biomolekülen einschließlich Markern von der Oberfläche der Sonde wird üblicherweise ein energieabsorbierendes Molekül ("EAM") oder ein Bindemittelmaterial auf Marker auf der Oberfläche der Trägersubstanz aufgebracht. Die Arten von EAM und die Verfahren zum Aufbringen von EAM werden oben besprochen und nicht in diesem Abschnitt wiederholt.
3. Desorption/Ionisation und Nachweis
Marker auf der Oberfläche der Trägersubstanz können unter Verwendung von Gasphasen-Ionenspektrometrie desorbiert und ionisiert werden. Jedes geeignete Gasphasen-Ionenspektrometer kann verwendet werden, sofern es ein Auflösen der Marker auf der Trägersubstanz ermöglicht. Bevorzugt ermöglichen Gasphasen-Ionenspektrometer die Quantifizierung von Markern.
In einer Ausführungsform ist ein Gasphasen-Ionenspektrometer ein Massenspektrometer. Bei einem üblichen Massenspektrometer werden eine Marker auf ihrer Oberfläche umfassende Trägersubstanz oder eine Sonde in ein Einlaßsystem des Massenspektrometers eingebracht. Die Marker werden dann durch eine Desorptionsquelle, wie Laser, Bombardierung mit schnellen Atomen, energiereiches Plasma, Elektrospray-Ionisation, Thermospray-Ionisation, flüssige Sekundärionen-MS, Feld-Desorption, etc. desorbiert. Die erzeugten desorbierten, verflüchtigten Spezies bestehen aus vorgeformten Ionen oder Neutralen, die als unmittelbare Konsequenz des Desorptionsereignisses ionisiert werden. Erzeugte Ionen werden durch eine ionenoptische Anordnung gesammelt und ein Massenanalysator dispergiert und analysiert dann die durchtretenden Ionen. Die den Massenanalysator verlassenden Ionen werden durch einen Detektor nachgewiesen. Der Detektor übersetzt dann die Information der nachgewiesenen Ionen in Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse. Ein Nachweis des Vorhandenseins von Markern oder anderen Substanzen umfaßt üblicherweise den Nachweis einer Signalintensität. Dies kann im Gegenzug die Quantität und Eigenschaft eines an die Trägersubstanz gebundenen Markers wiedergeben. Jeder der Bestandteile eines Massenspektrometers (z. B. eine Desorptionsquelle, ein Massenanalysator, ein Detektor, etc.) kann mit anderen geeigneten hier beschriebenen oder anderen in der Technik bekannten Bestandteilen in Ausführungsformen der Erfindung kombiniert werden.
Bevorzugt wird ein Laserdesorptions/-Flugzeit-Massenspektrometer bei Ausführungsformen der Erfindung verwendet. Bei der Laserdesorption-Massenspektrometrie wird eine Marker umfassende Trägersubstanz oder Sonde in ein Einlaßsystem eingebracht. Die Marker werden desorbiert und durch Laser der Ionisierungsquelle in die Gasphase ionisiert. Die erzeugten Ionen werden durch eine ionenoptische Anordnung gesammelt und in einem Flugzeit-Massenanalysator werden Ionen dann durch ein kurzes Hochspannungsfeld beschleunigt und können in eine Hochvakuumkammer driften. In dem hinteren Ende der Hochvakuumkammer treffen die beschleunigten Ionen eine empfindliche Detektoroberfläche zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt. Da die Flugzeit eine Funktion der Masse der Ionen ist, kann die zwischen der Ionenbildung und dem Aufprall auf den Ionendetektor vergangene Zeit zur Identifizierung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Markern mit einem spezifischen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Ionenmobilitätsspektrometer zum Nachweisen von Markern verwendet werden. Das Prinzip der Ionenmobilitätsspektrometrie basiert auf unterschiedlichen Mobilitäten von Ionen. Im einzelnen bewegen sich durch Ionisation erzeugte Ionen einer Probe mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgrund ihrer Unterschiede in z. B. Masse, Ladung oder Form durch eine Röhre unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes. Die Ionen (üblicherweise in der Form eines Stroms) werden an dem Detektor erfaßt, welcher dann zur Identifizierung eines Markers oder anderer Substanzen in einer Probe verwendet werden kann. Ein Vorteil der Ionenmobilitätsspektrometrie ist, daß sie bei Atmosphärendruck Druck arbeiten kann.
In noch einer anderen Ausführungsform kann eine Meßvorrichtung für den gesamten Ionenstrom zum Nachweisen und Charakterisieren von Markern verwendet werden. Diese Vorrichtung kann verwendet werden, wenn die Trägersubstanz nur eine einzige Art von Marker aufweist. Wenn eine einzige Arte von Marker auf der Trägersubstanz ist, spiegelt der durch die ionisierten Marker erzeugte Gesamtstrom die Quantität und andere Eigenschaften des Markers wieder. Der gesamte durch den Marker erzeugte Ionenstrom kann dann mit einer Kontrolle verglichen werden (z. B. einem gesamten Ionenstrom einer bekannten Verbindung). Die Quantität oder andere Eigenschaften des Markers können dann bestimmt werden.
4. Analyse der Daten
Durch Desorption und Nachweis von Markern erzeugte Daten können unter Verwendung irgendeines geeigneten Mittels analysiert werden. In einer Ausführungsform werden Daten durch die Verwendung eines programmierbaren digitalen Computers analysiert. Das Computerprogramm enthält im Allgemeinen ein lesbares Medium, daß Codes speichert. Ein bestimmter Code kann einem Speicher gewidmet sein, der den Ort jeder Eigenschaft auf einer Sonde, die Identität des Adsorptionsmittels bei dieser Eigenschaft und die für die Waschung des Adsorptionsmittels verwendeten Elutionsbedingungen umfaßt. Der Computer enthält auch einen Code, der als Eingabe Daten über die Stärke des Signals und zahlreiche molekulare Massen, die von einer bestimmten ansteuerbaren Stelle auf der Sonde erhalten wurden, erhält. Diese Daten können die Anzahl der nachgewiesenen Marker, einschließlich der Stärke des von jedem Marker erzeugten Signals, angeben.
Eine Datenanalyse kann die Stufen, eine Signalstärke eines detektierten Markers zu bestimmen (z. B. Höhe des Peaksignals) und "outerliers" zu entfernen (von einer vorbestimmten statistischen Verteilungabweichende Daten), umfassen. Die beobachteten Peaksignale können normalisiert werden, ein Vorgang, bei dem die Höhe jedes Peaksignals in Bezug auf irgendeine Referenz berechnet wird. Zum Beispiel kann eine Referenz ein durch Geräte und Chemikalien erzeugtes Hintergrundrauschen sein (z. B. energieabsorbierendes Molekül), welches in der Skala auf null gesetzt wird. Dann kann die für jeden Marker oder andere Biomoleküle detektierte Signalstärke in Form von relativen Intensitäten auf der gewünschten Skala (z. B. 100) dargestellt werden. Alternativ kann ein Standard (z. B. Rinderserumalbumin) mit der Probe zugegeben werden, so daß ein Peaksignal von dem Standard als Referenz zur Berechnung der relativen Intensitäten der für jeden Marker oder andere nachgewiesene Marker beobachteten Signale.
Der Computer kann die entstehenden Daten in zahlreiche Formate zur Darstellung transformieren. In einem Format, das als "Spektrenansicht oder Retentatkarte" bezeichnet wird, kann eine Standardspektralansicht dargestellt werden, wobei die Ansicht die Quantität des den Detektor erreichenden Markers bei jedem bestimmten molekularen Gewicht darstellt. In einem anderen Format, daß als "Peakkarte" bezeichnet wird, werden nur die Peaksignalhöhen und Masseninformationen von der Spektrenansicht zurückbehalten, wobei ein klareres Bild erhalten wird und ein einfacheres Erkennen von Markern mit annähernd identischem Molekulargewicht ermöglicht wird. In noch einem anderen Format, daß als "Gelansicht" bezeichnet wird, kann jede Masse der Peaksignalansicht in ein Grauskalenbild umgewandelt werden, das auf der Höhe jedes Peaksignals basiert, und ein den Banden auf einem Elektrophoresegel ähnliches Erscheinungsbild ergibt. In noch einem anderen Format, das als "3D-Überlagerungen" bezeichnet wird, können mehrere Spektren zur Untersuchung von feinen Veränderungen der relativen Peaksignalhöhen überlagert werden. In noch einem anderen Format, daß als "Differenz Kartenansicht" bezeichnet wird, können zwei oder mehrere Spektren verglichen werden, wobei einzigartige Marker oder zwischen den Proben hinauf- oder herunterregulierte Marker in geeigneter Weise hervorgehoben werden. Markerprofile (Spektren) von zwei beliebigen Proben können visuell verglichen werden. In noch einem anderen Format kann ein "Spotfire Scatter Plot" verwendet werden, wobei detektierte Marker als ein Punkt in einem Diagramm dargestellt werden, wobei eine Achse des Diagramms die scheinbaren molekularen Gewichte der nachgewiesenen Marker und eine andere Achse die Signalintensität der nachgewiesenen Marker darstellt. Für jede Probe können nachgewiesene Marker und die in der Probe vorhandenen Mengen von Markern auf einem computerlesbaren Speichermedium gespeichert werden. Diese Daten können dann als eine Kontrolle verglichen werden (z. B. ein Profil oder Quantität von in einer Kontrolle nachgewiesener Marker, z. B. in Testpersonen, in denen TCC nicht nachweisbar ist).
B. Nachweis durch Immunotest
In einer anderen Ausführungsform kann ein Immunotest zum Nachweisen und Analysieren von Markern in einer Probe verwendet werden. Dieses Verfahren umfaßt folgendes: (a) Bereitstellen eines Antikörpers, der spezifisch an einen Marker bindet, (b) Inkontaktbringen einer Probe mit dem Antikörper und (c) Nachweisen des Vorhandenseins eines Komplexes aus an den Marker gebundenem Antikörper in der Probe.
Zur Herstellung eines spezifisch an einen Marker bindenden Antikörper können aufgereinigte Marker oder deren Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der Marker können durch eine weitere Charakterisierung dieser Marker erhalten werden. Zum Beispiel kann für jeden Marker mit einer Anzahl von Enzymen (z. B. Trypsin, V8-Protease etc.) eine Peptidkarte erstellt werden. Die molekularen Gewichte der Verdaufragmente jedes Markers können zum Durchsuchen der Datenbanken, wie der SWISS-PRO Datenbank, nach Sequenzen, die den molekularen Gewichten der durch zahlreiche Enzyme erzeugten Verdaufragmente entsprechen, verwendet werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens können Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen anderer Marker identifiziert werden, sofern diese bekannte Proteine in den Datenbanken sind.
Alternativ können die Proteine unter Verwendung von Sequenzierung einer Proteinleiter sequenziert werden. Proteinleitern können zum Beispiel durch Fragmentieren der Moleküle und erzeugt werden oder durch andere Verfahren, die schrittweise eine einzelne Aminosäure vom Ende des Fragments entfernen. Verfahren zum Herstellen von Proteinleitern sind z. B. in der Internationalen Veröffentlichung WO93/24834 (Chait et al.) und in dem US-Patent 5,792,664 (Chait et al.) beschrieben. Die Leiter wird dann durch Massenspektrometrie analysiert. Die Unterschiede der Massen der Leiterfragmente identifizieren die vom Ende des Moleküls entfernte Aminosäure.
Wenn die Marker nicht unbekannte Proteine in den Datenbanken sind, können Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen mit der Kenntnis sogar eines Teils der Aminosäuresequenz des Markers bestimmt werden. Zum Beispiel können basierend auf der N-endständigen Aminosäuresequenz des Markers die degenerierte Sonden erstellt werden. Diese Sonden können dann zum Durchsuchen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek, die aus einer Probe gemacht wurde, in der ein Marker ursprünglich nach gewiesen wurde, verwendet werden. Die positiven Clone können identifiziert, vervielfältigt und ihre rekombinanten DNA-Sequenzen können unter Verwendung von gut bekannten Techniken untercloniert werden. Siehe z. B. Current Protocols for Molecular Biology (Ausubel et al., Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience 1989) und Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausg. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laborstory, NY 1989).
Unter Verwendung der aufgereinigten Marker oder ihrer Nukleinsäuresequenzen können Antikörper, die spezifisch an einen Marker binden unter Verwendung von irgendwelchen in dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Siehe Z. B. Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laborstory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausg. 1986), und Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Derartige Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Antikörperherstellung durch Selektion von Antikörpern aus Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen- oder ähnlichen Vektoren sowie Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern durch Immunisieren von Kaninchen oder Mäusen (siehe Z. B. Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989), Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)).
Nachdem der Antikörper zur Verfügung gestellt wurde kann ein Marker unter Verwendung irgendeines geeigneten, immunologischen, in dem Gebiet bekannten Bindungstests nachgewiesen und/oder quantifiziert werden (siehe Z. B. US-Patent Nos. 4,366,241 , 4,376,110 , 4,517,288 , und 4,837,168 ). Geeignete Tests umfassen zum Beispiel einen Enzymimmunotest (EIA), wie einen heterogenen Enzymimmunotest (ELISA), einen Radioimmunotest (RIA), einen Western-Blot-Test oder ein Slot-Blot-Test. Diese Verfahren werden auch in z. B. Methods in Cell Biology: Anibodies in Cell Biology, Band 37 (Asai, Ausg. 1993), Basic and Clinical Immunology (Sities & Terr, Hrsg., 7. Ausg. 1991), und Harlow & Lane, supra, beschrieben.
Im Allgemeinen kann eine von einer Testperson erhaltene Probe mit dem Antikörper, der spezifisch den Marker bindet, in Kontakt gebracht werden. Wahlweise kann der Antikörper an einer festen Unterlage fixiert werden, um das Waschen und eine anschließende Isolierung des Komplexes vor dem Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer Probe zu vereinfachen. Beispiele einer festen Unterlage umfassen Glas oder Plastik in der Form von z. B. einer Mikrotiterplatte, eines Stabes, eines Kügelchens oder eines Mikrokügelchens. Antikörper können auch an eine Trägersubstanz einer Sonde oder ProteinChip^® Array angeheftet werden und können durch Gasphasen-Ionenspektrometrie wie oben beschrieben analysiert werden. Die Probe ist bevorzugt eine flüssige biologische Probe, die von einer Testperson genommen wurde. Beispiele biologischer Proben umfassen Urin, Barbotage, Blut, Serum, Plasma, Tränen, Speichel, Gewebe, etc. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen biologische Flüssigkeiten Urin. Vor dem Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper kann die Probe mit einem geeigneten Elutionsmittel verdünnt werden.
Nach dem Inkubieren der Probe mit Antikörpern wird die Mischung gewaschen und der gebildete Antikörper-Marker-Komplex kann nachgewiesen werden. Dies kann zum Beispiel durch Inkubieren der gewaschenen Mischung mit einem Nachweisreagenz erreicht werden. Dieses Nachweisreagenz kann zum Beispiel ein zweiter Antikörper, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, sein. Beispielhafte nachweisbare Markierungen umfassen magnetische Kügelchen (z. B. DYNABEADS^TM), fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Markierungen, Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere üblicherweise bei einem ELISA verwendete), und kolorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastikkügelchen. Alternativ kann der Marker in der Probe unter Verwendung eines indirekten Tests nachgewiesen werden, wobei zum Beispiel ein zweiter markierter Antikörper zum Nachweis von an Marker gebundenen spezifischen Antikörper verwendet wird, und/oder in einem Kompetitions- oder Inhibitionstest, wobei zum Beispiel ein monoklonaler, an ein bestimmtes Epitop des Markers bindender Antikörper gleichzeitig mit der Mischung inkubiert wird.
Während des gesamten Tests können Inkubations- und/oder Waschstufen nach jeder Kombination an Reagenzien erforderlich sein. Inkubationsstufen können zwischen ungefähr 5 Sekunden bis mehreren Stunden variieren, bevorzugt von ungefähr 5 Minuten bis ungefähr 24 Stunden. Die Inkubationszeit hängt jedoch von der Testausführung, dem Marker, dem Lösungsvolumen, den Konzentrationen und ähnlichem ab. Üblicherweise werden die Tests bei Raumtemperatur ausgeführt werden, obwohl sie über einen Bereich an Temperaturen, wie 10 °C bis 40 °C, durchgeführt werden können.
Immunotests können zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Markers in einer Probe sowie der Quantität eines Markers in einer Probe verwendet werden. Zunächst kann eine Testmenge eines Markers in einer Probe unter Verwendung der oben beschriebenen Immunotestverfahren nachgewiesen werden. Wenn ein Marker in der Probe vorhanden ist, wird er unter geeigneten, oben beschriebenen Inkubationsbedingungen einen Antikörper-Marker-Komplex mit einem spezifisch an den Marker bindenden Antikörper bilden. Die Menge eines Antikörper-Marker-Komplexes kann durch Vergleichen mit einem Standard bestimmt werden. Ein Standard kann zum Beispiel eine bekannte Verbindung oder ein anderes Protein, von dem bekannt ist, daß es in einer Probe vorhanden ist, sein. Wie oben angemerkt, muß die Testmenge eines Markers nicht in absoluten Einheiten gemessen werden, sofern die Einheit der Messung mit einer Kontrolle verglichen werden kann.
Die Verfahren zum Nachweis dieser Marker in einer Probe haben viele Anwendungen. Zum Beispiel können ein oder mehrere Marker zur Unterstützung einer TCC-Diagnose oder Prognose gemessen werden. In einem anderen Beispiel können die Verfahren zum Nachweis der Marker zum Überwachen der Antworten einer Testperson auf eine Krebsbehandlung verwendet werden. In einem anderen Beispiel können die Verfahren zum Nachweis von Markern zum Untersuchen auf und zum Identifizieren von Verbindungen, die die Expression dieser Marker in vivo oder in vitro beeinflussen, verwendet werden.
IV. Diagnose von TCC
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung Verfahren zur Unterstützung einer TCC-Diagnose unter Verwendung von einem oder mehreren Marker(n) in Gruppe 1 der Marker oder Gruppe 2 der Marker zur Verfügung. Diese Marker können alleine oder in Kombination mit anderen Markern in beiden Gruppen oder mit völlig unterschiedlichen Markern (z. B. dem Blasentumorantigen oder NMP-22) beim Unterstützen einer TCC-Diagnose verwendet werden. Die Marker in Gruppe 1 der Marker und Gruppe 2 der Marker sind verschieden in Proben eines TCC-Patienten und einer normalen Testperson, in welcher TCC nicht nachweisbar ist, vorhanden. Zum Beispiel sind alle Marker (mit Ausnahme von Marker PC-6) mit größerer Häufigkeit in TCC-Patienten vorhanden als in normalen Testpersonen. Daher würde der Nachweis einer oder mehrerer dieser Marker in einer Person nützliche Informationen hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit, daß diese Person TCC hat zur Verfügung stellen.
Dementsprechend umfassen Ausführungsformen der Erfindung Verfahren zur Unterstützung einer TCC-Diagnose, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen wenigstens eines Markers in einer Probe, wobei der Marker ausgewählt ist aus: Marker UBC-1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± ; Marker UBC-2: 9,495 kDa ± 233 Da Marker UBC-3: 44,6 kDa ± 1,9 kDa; Marker UBC-4: 100,120 kDa ± 4,3 kDa; Marker UBC-5: 133,190 kDa ± 3,9 kDa, Marker PC-1: ungefähr 4,950-5,150 kDa, Marker PC-2: ungefähr 5,710-6,000 kDa, Marker PC-3: ungefähr 6,758-7,750 kDa, Marker PC-4: ungefähr 15,000-16,000 kDa, Marker PC-5: ungefähr 37,500-40,000 kDa, Marker PC-6: ungefähr 79,500-82,000 kDa und Marker PC-7: ungefähr 85,000-92,000 kDa und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von TCC. Die Korrelation kann die Menge des Markers oder der Marker in der Probe im Vergleich zu einer Kontrollmenge des Markers oder der Marker (z. B. in normalen Testpersonen, in denen TCC nicht nachweisbar ist) berücksichtigen. Die Korrelation kann das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein des Markers in einer Testprobe und die Häufigkeit des Nachweises desselben Markers in einer Kontrolle berücksichtigen. Die Korrelation kann beide dieser Gesichtspunkte zur Vereinfachung der Bestimmung, ob eine Testperson TCC hat oder nicht, berücksichtigen.
Irgendwelche geeignete Proben können von einer Testperson zum Nachweis der Marker erhalten werden. Bevorzugt ist eine Urinprobe von der Testperson. Sofern gewünscht kann die Probe zur Verbesserung der Nachweisbarkeit der Marker wie oben beschrieben vorbereitet werden. Zum Beispiel kann zur Steigerung der Nachweisbarkeit von Marker UBC-1 bis UBC-5 eine Urinprobe der Testperson wahlweise Z. B. durch Größenausschlusschromatographie fraktioniert werden. Probenvorbereitungen, wie Vorfraktionierungsverfahren, sind wahlweise und verbessern nicht notwendigerweise die Nachweisbarkeit des Markers, abhängig von den verwendeten Nachweisverfahren. Zum Beispiel kann eine Probenvorbereitung unnötig sein, wenn spezifisch an Marker bindende Antikörper zum Nachweis des Vorhandenseins von Markern in einer Probe verwendet werden.
Jedes geeignete Verfahren kann zum Nachweis eines Markers oder von Markern in einer Probe verwendet werden. Zum Beispiel kann Gasphasen-Ionenspektrometrie oder ein herkömmlicher Immunotest (z. B. ELISA) wie oben beschrieben verwendet werden. Unter Verwendung dieser Verfahren kann ein oder können mehrere Marker nachgewiesen werden. Bevorzugt wird eine Probe auf das Vorhandensein einer Vielzahl an Markern untersucht. Nachweisen des Vorhandenseins einer Vielzahl an Markern anstatt eines einzelnen Markers alleine würde dem Diagnostiker mehr Information zur Verfügung stellen. Im einzelnen würde der Nachweis einer Vielzahl an Markern in einer Probe den Prozentsatz von richtigen positiven und richtigen negativen Diagnosen steigern und den Prozentsatz an falschen positiven oder falschen negativen Diagnosen senken.
Der Nachweis des Markers oder der Marker wird dann mit einer wahrscheinlichen Diagnose von TCC korreliert. In einigen Ausführungsformen ist der Nachweis des bloßen Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Markers ohne Quantifizierung der Menge an Marker geeignet und kann mit einer mutmaßlichen Diagnose von TCC korreliert werden. Zum Beispiel werden alle Marker (mit Ausnahme von Marker UBC-6) häufiger in TCC-Patienten als in normalen Testpersonen nachgewiesen. Daher zeigt ein bloßer Nachweis eines Markers oder mehrere dieser Marker in einer untersuchten Testperson an, daß die Testperson eine höhere Wahrscheinlichkeit hat, TCC zu haben.
In anderen Ausführungsformen kann der Nachweis von Markern eine Quantifizierung der Marker umfassen, zur Korrelation des Nachweises von Markern mit einer mutmaßlichen Diagnose von TCC. Zum Beispiel können einige oder alle dieser Marker in einer höheren Menge in Urinproben von TCC-Patienten vorhanden sein als in Urinproben von normalen Testpersonen. Wenn die Menge der in einer untersuchten Testperson nachgewiesenen Marker höher ist im Vergleich zu einer Kontrollmenge hat daher die untersuchte Testperson eine höhere Wahrscheinlichkeit, TCC zu haben.
Eine Analyse der Daten zeigt, daß ein Nachweis von einem der Marker UBC-1 bis UBC-5 und PC-1 bis PC-5 und PC-7 (oder ein Nichtvorhandensein von Marker PC-6) nicht stark mit einer positiven Diagnose von TCC korreliert ist. Die Chance einer positiven Diagnose steigt jedoch signifikant mit dem Nachweis von mehreren (z. B. zwei, drei, vier usw.) der Marker UBC-1 bis UBC-5 und PC-1 bis PC-5 und PC-7. Weiter ist das Ausbleiben des Nachweises irgendeiner dieser Marker UBC-1 bis UBC-5 und PC-1 bis PC-5 und PC-7 (oder ein Nachweis des Markers PC-6) nicht stark mit einer negativen Diagnose von TCC korreliert. Das Ausbleiben eines Nachweises vieler dieser Marker ist jedoch stark korreliert mit einer negativen Diagnose von TCC.
Wenn die Marker quantifiziert werden, können sie mit einer Kontrolle verglichen werden. Eine Kontrolle kann zum Beispiel die durchschnittliche oder mittlere Menge von in vergleichbaren Proben von normalen Testpersonen, bei welchen TCC nicht nachweisbar ist, vorhandenem Marker sein. Die Kontrollmenge wird unter den selben oder im Wesentlichen ähnlichen experimentellen Bedingungen gemessen, wie beim Messen der Testmenge. Wenn zum Beispiel eine Testprobe aus einer Urinprobe einer Testperson erhalten wird und ein Marker unter Verwendung einer bestimmten Sonde nachgewiesen wird, dann wird eine Kontrollmenge des Markers bevorzugt aus einer Urinprobe eines Patienten unter Verwendung derselben Sonde bestimmt. Es ist bevorzugt, daß die Kontrollmenge an Marker basierend auf einer signifikanten Anzahl an Proben von normalen Testpersonen, die nicht TCC haben, bestimmt wird, so daß sie Schwankungen der Markermengen in dieser Grundgesamtheit wiederspiegelt.
Durch Massenspektrometrie erzeugte Daten können dann durch eine Computersoftware analysiert werden. Die Software kann einen Code umfassen, der ein Signal des Massenspektrometers in eine computerlesbare Form umwandelt. Die Software kann auch einen Code umfassen, der ein Algorithmus auf die Analyse des Signals anwendet, zur Bestimmung, ob das vorhandene Signal ein "Peaksignal" in dem Signal darstellt, das mit einem Marker dieser Erfindung oder anderen geeigneten Markern korrespondiert. Die Software kann auch einen Code umfassen, der ein Algorithmus ausführt, der ein Signal von einer Testprobe mit einer typischen Signalcharakteristik von "normal" und TCC vergleicht und die Genauigkeit der Passung zwischen den zwei Signalen bestimmt. Jeder geeignete Algorithmus kann verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Programm mit künstlicher Intelligenz, wie Fuzzylogik, Clusteranalyse von neuronalen Netzwerken (ANN), verwendet werden. Siehe z. B. Qureshi et al., J. Urol., 163: 630-633 (2000); Snow, et al., J. Urol., 152:1923 (1994). Die Software kann auch einen Code umfassen, der angibt, welchem die Testprobe am nächsten ist, wobei eine wahrscheinliche Diagnose zur Verfügung gestellt wird.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
I. Testpersonen
Urinproben wurden über einen Zeitraum von mehreren Monaten von Patienten in der Abteilung für Urologie, Esstern Virginia Medical School (EVMS) gesammelt. Die Urinproben wurden sofort aliquotiert und bei –80 °C in der Gewebe- und Körperflüssigkeitenbank des Virginia Prostate Center bis zum Untersuchen gelagert. Insgesamt wurden 94 Urintestmaterialien gesammelt. Die demographischen Merkmale der TCC-Patienten und Kontrollgruppen werden in Tabelle 1 wie unten gezeigt zur Verfügung gestellt. TABELLE 1

TCC Normal Andere

Anzahl der Proben Altersbereich mittleres Alter 30 42-86 69,4 34 23-71 55 30 41-82 68,5
Gesunde Kontrollen (n=34) umfaßten Freiwillige mit keinem Merkmal an Erkrankung und gesunde Individuen (d.h. kein Hintergrund oder Hinweis auf Krebs im urologischen Bereich), die an dem Prostatakrebs-Durchsuchungsprogramm an der EVMS teilnahmen. TCC (n=30 Patienten) wurde histologisch oder zytologisch zum Zeitpunkt der Testmaterialiennahme bestätigt. Bei Rückfällen hatte keiner der Patienten innerhalb von 3 Monaten vor Testmaterialiennahme eine Chemo- oder Immuntherapie erhalten.
Eine Einstufung wurde unter Verwendung des Systems der World Health Organization (WHO) festgelegt. Tumorstadien und Stufe der Patienten mit TCC sind in Tabelle 2 unten gezeigt. TABELLE 2

Stadium Anzahl an Proben Stufe Anzahl an Proben

Ta 14 I 4

T1 8 II 5

T2 5 III 21

T3 1

CIS 8
Vier Patienten mit Ta, einer mit T1 und einer mit T2 Tumoren hatten begleitend ein Carcinoma in situ (CIS). Andere urogenitale Erkrankungen (n=30 Patienten) umfaßten klinisch oder pathologisch bestätigte Prostataentzündungen (n=6), Prostatismus (n=9), Infektionen der Harnwege (n=1), benigne Prostatahyperplasie (BPH) (n=12), Amyloidose (n=1), Entzündung von Prostata und Blase (n=1), Blasenabflußstörung (n=1) und Prostatakrebs (n=1). Ein Patient mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) und einer mit Prostatismus hatte eine begleitende Prostataentzündung.
II. Statistische Analyse
Empfindlichkeit wird als das Verhältnis der TCC-Patienten, die den Biomarker enthielten zu der Gesamtanzahl an TCC-Patienten, die von der Studie umfaßt waren, definiert. Spezifität wird definiert als das Verhältnis der Individuen, die das Proteinpeaksignal haben und nicht TCC haben, zu der Gesamtanzahl an Individuen ohne TCC. Ein positiver Vorhersagewert wird als die Wahrscheinlichkeit definiert, daß ein Individuum mit dem Biomarker TCC hat. Ein negativer Vorhersagewert wird als die Wahrscheinlichkeit definiert, daß ein Individuum ohne den Biomarker nicht TCC hat. Statistiken wurden unter Verwendung des Chi-Quadrat-Tests durchgeführt, nachdem die Daten in zweidimensionalen Kontingenztafeln eingeordnet und auf Unabhängigkeit von Variablen überprüft wurden. Ein Vergleich der Anzahl an Peaks zwischen den verschiedenen Gruppen wurde unter Verwendung des Student t-Tests durchgeführt. In allen Fällen wurde P<0,05 als statistisch signifikant angesehen.
III. Protein-Biochip Herstellung
A. SAX-2 ProteinChip^® (starker Anionenaustauscher, kationische Oberfläche)
SAX-2 ProteinChip^® ist eine starke Anionenaustauscheranordnung mit einer hochleistungsfähigen Oberfläche aus quaternärem Ammonium zum Binden von anionischen Proteinen. Anionische Anordnungen binden Proteine durch elektrostatische Interaktion von negativ geladenen Aminosäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure. Eine Bindung tritt üblicherweise bei hohem pH mit wenig Salz auf und eine Bindung nimmt ab, wenn der pH abnimmt und die Salzkonzentration steigt.
SAX-2 ProteinChip^® kann wie folgt hergestellt werden. Die Oberfläche der metallischen Trägersubstanz wird konditioniert und mit einer Glasbeschichtung wie oben beschrieben beschichtet. 3-(Methacryloylamino-)Propyltrimethylammoniumchlorid (15,0 Gew.-%) und N,N'-Methylenbisacrylamid (0,4 Gew.-%) werden unter Verwendung von (–)-Riboflavin (0,01 Gew.-%) als ein Photoinitiator und Ammoniumpersulfat (0,2 Gew.-%) als ein Beschleuniger photopolimerisiert. Die Monomerlösung wird auf eine rau geätzte, mit Glas beschichtete Trägersubstanz abgeschieden (zweimal 0,4 μl) und wird für 5 Minuten mit einem System zur Bestrahlung im nahen UV-Bereich bestrahlt (Hg-Kurzbogenlampe, 20 mW/cm² bei 365 nm). Die Oberfläche wird mit einer Natriumchloridlösung (1 M) gewaschen und dann wird die Oberfläche zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen.
B. IMAC3 ProteinChip^® (immobilisierte Metall-Affinitätsimmobilisierung, Nitrilotriessigsäure auf Oberfläche)
IMAC3 ProteinChip^® enthält eine Oberfläche zur hochleistungsfähigen Metallbindung und anschließenden Affinitätsimmobilisierung von Proteinen mit metallbindenden Resten. Immobilisierte Metall-Affinitätsimmobilisierungs-Anordnungen binden Proteine und Peptide, die eine Affinität für Metalle haben; Proteine mit exponiertem Histidin, Tryptophan und/oder Cystein binden üblicherweise an immobilisierte Metalle auf diesen Chipoberflächen. Eine Bindung tritt üblicherweise bei pH 6-8 und hohem Salz auf und eine Bindung nimmt ab, wenn die Konzentration an Immidazol und Glycin ansteigt.
Ein IMAC3 Proteinchip^® kann wie folgt hergestellt werden. Die Oberfläche der Trägersubstanz aus Metall wird konditioniert und wie oben beschrieben mit einer Glasbeschichtung beschichtet. 5-Methacylamido-2-(N,N-biscarboxymethylamino)-valeriansäure (7,5 Gew.-%), Acryloyltri-(hydroxymethyl-)methylamin (7,5 Gew.-%) und N,N'-Methylenbisacrylamid (0,4 Gew.-%) werden unter Verwendung von (–)-Riboflavin (0,02 Gew.-%) als Photoinitiator photopolymerisiert. Die Lösung von Monomeren wird auf eine rau geätzte, mit Glas beschichtete Trägersubstanz abgeschieden (zweimal 0,4 ml) und für 5 Minuten mit einem Belichtungssystem im nahen UV-Bereich bestrahlt (Hg-Kurzbogenlampe, 20mW/cm² bei 365 nm). Die Oberfläche wird mit einer Natriumchloridlösung (1 M) gewaschen und dann zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen.
IMAC3 Proteinchip^® mit Nickel kann wie folgt mit Nickelmetallionen aktiviert werden. Die Oberfläche wird mit einer Lösung aus 100 mM Nickelsulfat auf jeden Punkt behandelt und auf einem Hochfrequenzschüttler bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Nach dem Entfernen der Lösung wurde die Oberfläche mit Wasser gespült. 5 μl von 0,5 M NaCl in PBS (oder ein anderer Bindepuffer, der wenigstens 0,5 M NaCl enthält) kann auf jeden Punkt gegeben werden und auf einem Schüttler für 5 Minuten inkubiert werden. Die Punkte werden trocken gewischt.
IV. Protein-Biochip-SELDI-Analyse von Urin
A. Urinprobenvorbereitung und SELDI-Analyse
Urinproben wurden aufgetaut und zum Entfernen von Zellmaterial kurz zentrifugiert. Die Proteinkonzentration der Überstände wurden unter Verwendung des BCA-Kits (Pierce) abgeschätzt. Die Proben wurden auf eine Endproteinkonzentration von 2 mg/ml mit Bindepuffer (20 mM Tris pH 9, 0,4 M NaCl, 0,1% Triton X 100) verdünnt und einer Fraktionierung nach Proteingrößen unter Verwendung einer K30 Mikrozentrifugationssaule (Ciphergen Biosystems, Inc.) unterzogen. Im Anschluß an eine 30-minütige Inkubation auf Eis wurden die verdünnten Urinproben auf die Zentrifugationssäulen gegeben und für 3 Minuten bei 720 g zentrifugiert. Die ProteinChip^® SELDI-Analyse wurde ähnlich dem in einem früheren Bericht Beschriebenen durchgeführt (Wright et al., Prostate Cancer and Prostate Diseases, 2:264-276 (1999)). In Kürze, 5 μl Aliquots des Durchflusses (Fraktion) und der nicht aufgetrennten, in 20 mM Tris pH 9,0, 0,1% Triton-X 100 verdünnten Probe wurden direkt auf unterschiedliche Anordnungen eines SAX2-Chips aufgebracht, der aus einer starken Anionenaustauscherchemikalie besteht. Im Anschluß an ein kurzes Waschen mit H₂O wurden 0,5 μl einer gesättigten Matrixlösung (alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in 50% Acetonitril – 0,5% Trifluoressigsäure) auf die Anordnung gegeben und an der Luft trocknen gelassen. Die Chips wurden dann in das PBS-I-Massenlesegerät gebracht, in dem Nanosekunden-Laserpulse durch einen Stickstofflaser (337 nm) erzeugt werden. Die Spektren wurden mit durchschnittlich 60 Laserschüssen erzeugt, wobei jeder die folgenden Laserintensitäten (L) hatte: 15 (filter in), 30 (filter in) und 55 (filter out). Für die Berechnung der Anzahl der Proteinpeaksignale, die bei geringer Laserintensität aufgelöst wurden, wurden bei 115 und 130 aufgenommene Spektren unter Verwendung der SELDI-Software (0,5% Abweichung) kombiniert. Eine externe Kalibrierung wurde unter Verwendung von Rinderinsulin (5733,6 Da), Rindercytochrom C (12230,9 Da) und Rinderserumalbumin (66410 Da) als Standards (Ciphergen Biosystems) durchgeführt.
94 Urinproben wurden mit SELDI-Massenspekrometrie untersucht. Eine Verarbeitung auf einer starken Anionenaustauscher-Chipoberfläche löste bis zu 70 Proteinpeaksignale auf. 1a ist ein typisches Proteinspektrum, das Proteinmassen zwischen 2,000-150,000 Da eines einzelnen Urintestmaterials zeigt. Ein Erzeugen von Spektren wurde bei Laserintensitäten von 15-30 und 55 durchgeführt, um jeweils besser Proteine mit niedriger und höhere molekularer Masse aufzulösen. Wie gezeigt war die SELDI-Technik insbesondere wirksam beim Auflösen von Proteinen und Polypeptiden mit niedrigem molekularem Gewicht (<10 kDa). Interessanterweise schienen Urinproben von TCC-Patienten eine hohe Anzahl an Proteinpeaksignalen zu haben. Eine Erfassung von Daten bei Laserintensitäten von 15 und 30 erzeugte jeweils durchschnittlich 33 Proteinpeaksignale aus TCC-Urinproben im Vergleich zu durchschnittlich 21 und 22 für die normalen Personen und andere urogenitale Erkrankungen (P<0,001). in ähnlicher Weise hatten bei hohen Laserintensitäten (d.h. 55 filter out) TCC-Proben durchschnittlich 34 Proteinpeaksignale, im Vergleich zu 27 und 20 in den normalen Personen und anderen Gruppen mit urogenitalen Erkrankungen (P<0,001 für die normalen Personen und P=0,008 für die anderen Erkrankungen).
Alle Proben wurden entweder doppelt oder dreifach verarbeitet, um die Reproduzierbarkeit der Auflösung der Proteine aus Urin zu bestätigen. 1b-c zeigen, daß die Reproduzierbarkeit ziemlich annehmbar war. Das Mittel, die Standardabweichung (SD) und der Variationskoeffizient (CV) wurden für vier markante Peaksignale bestimmt, die als Proteine 1-4 bezeichnet sind. Die Reproduzierbarkeit innerhalb einer Untersuchen, d.h. die mittlere Masse, SD (%CV) war für Protein 1 6440,6 ± 0,92 Da (0,014%), für Protein 2, 7914 ± 3,32 Da (0,042%), für Protein 3, 13262 ± 0,78 Da (0,006%) und für Protein 4, 66288 ± 69,3 Da (0,1%) (1b-c, Spektren 1 und 2). Die Reproduzierbarkeit zwischen den Untersuchungen wurde bestimmt als 6443,3 ± 3,85 Da (0,06%) für Protein 1, 7918,3 ± 6,12 Da (0,08%) für Protein 2, 13267 ± 8,42 Da (0,06%) für Protein 3 und 66277 ± 15,56 Da (0,023%) für Protein 4 (1b-c, Spektren 1 und 2 gegen 3).
B. Gruppe 1 der Marker: UBC-1 bis UBC-5
Eine Analyse von Urintestmaterialien von Patienten mit TCC, Patienten mit anderen Erkrankungen des urogenitalen Trakts und normalen Individuen ergab, daß fünf markante Proteinpeaks bevorzugt bei TCC exprimiert wurden. Repräsentative Massenspektren und Gelansichten dieser Proteine sind in 2 gezeigt. Eines der Proteine wurde als ein Doublet oder gelegentlich als ein Triplet-Proteinpeaksignal beobachtet (2a), mit jeweils einer durchschnittlichen Masse von 3,353 (SD:21 Da), 3,432 (SD:24,4 Da) und 3,470 kDa (SD:6,32 Da). Dieses Protein wird als Marker UBC-1 bezeichnet. Die durchschnittlichen mit SELDI bestimmte Massen, die zu den anderen vier mit TCC in Verbindung gebrachten Proteinen gehören sind UBC-2: 9,495 kDa (SD: 46,5 Da); UBC-3: 44,6 kDa (SD:372,8 Da), UBC-4: 100,120 kDa (SD: 866,8); und UBC-5: 133,190 kDa (SD: 772,9 Da) (2b-d).
Tabelle 3 unten verdeutlicht die statistische Analyse des Nachweises der fünf mit TCC in Verbindung gebrachten UCB-Marker in den Studien- und Kontrollgruppen.
Von den ausgewerteten Urinproben von TCC-Patienten waren 46,7% (14/30) positiv für UBC-1, 53,3% (16/30) für UBC-2, 70% (21/30) für UBC-3, 43,3% (13/30) für UBC-4 und 63,3% (19/30) für UBC-5 (Tabelle 3).

Die Expression der Marker in Bezug auf Stadium und Stufe von TCC ist in Tabelle 4 unten gezeigt. TABELLE 4 Anzahl Positive/Gesamtzahl der Untersuchten (%)

Marker	Stufe I-II	Stufe III	Stadium Ta	Stadium T1	Stadium T2-T3	CIS
UBC1	4/9 (44,4)	10/21 (47,6)	5/14 (35,7)	6/8 (75)	3/6 (50)	4/8 (50
UBC2	4/9 (44,4)	12/21 (57,1)	6/14 (42,8)	4/8 (50)	5/6 (83,3)	4/8 (50)
UBC3	4/9 (44,4)	16/21 (80,9)	7/14 (50)	7/8 (87,5)	5/6 (83,3)	4/8 (50)
UBC4	2/9 (22,2)	11/21 (52,4)	6/14 (42,8)	3/8 (37,5)	3/6 (50)	3/8 (37,5)
UBC5	2/9 (22,2)	15/21 (71,4)	8/14 (57)	7/8 (87,5)	3/6 (50)	4/8 (50)

Obwohl die Grundgesamtheit der TCC-Patienten nicht in Bezug auf Stadium und Stufe ausgewählt war, ist es bemerkenswert, daß die Mehrheit der bösartigen Tumoren oberflächliche Krebsgeschwüre waren (Stadien Ta/T1, Stufe III) (Tabelle 2). Es wurde beobachtet, daß die Häufigkeit aller Marker mit Fortschreiten der Karzinome von einer niedrigen Stufe (I-II) zu hoher Stufe (III) und niedrigem Stadium (Ta) zu höherem Stadium (T1-3) anstieg.
Der Prozentsatz an positiven Proben der fünf Biomarker in der normalen Grundgesamtheit war 14,7 (5/34) für UBC-1, 8,9 (3/34) für UBC-2, 11,8 (4/34) für UBC-3, 14,7 (5/34) für UBC-4 und 20,6 (7/34) für UBC-5, was jeweils einer Spezifität von 85,3%, 91,1%, 88,2%, 85,3% und 79,4% entspricht (Tabelle 3). Die Häufigkeit der Marker in dieser Kontrollgruppe ist signifikant unterschiedlich von deren Häufigkeit in den TCC-Urinproben (Tabelle 3).
Die Biomarker UBC-1 und UBC-4 wurden in Urintestmaterialien von Patienten mit anderen urogenitalen Erkrankungen mit einer Häufigkeit, die annähernd der normalen Gruppe entspricht gefunden (4/30 oder 13,3%). Die Marker UBC-2, -4 und -5 wurden jedoch mit relativ höherer Häufigkeit gefunden: 30% (9/30) für UBC-2 und UBC-4 und 40% (12/30) für UBC-5. Der Unterschied in der Häufigkeit dieser Marker zwischen dieser Kontrolle (d.h. anderen Erkrankungen) und der Gruppe mit TCC-Krebs bleibt statistisch signifikant für die Marker UBC-1, -3 und -4, war aber nicht für die Marker UBC-2 und UBC-5 signifikant (Tabelle 3).
Basierend auf diesen Ergebnissen reichen die Gesamtspezifitäten der einzelnen Marker zum Nachweis von TCC von 70,3-85,9% (Tabelle 3). Ähnlich schwankten die negativen Vorhersagewerte (NPV) von 76,4-85% und die positiven Vorhersagewerte (PPV) von 50-61,8% (Tabelle 3).
C. Gruppe 2 der Marker: PC-1 bis PC-7

Zusätzlich zu dem Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit von einzelnen Proteinpeaksignalen zwischen der TCC-Gruppe und den Kontrollgruppen wurden auch Unterschiede in Bereichen der Massenspektren beobachtet. Eine statistische Analyse des Nachweises von Proteinclustern mit verschiedener Expression in der Studiengruppe und Kontrollgruppen ist in Tabelle 5 unten gezeigt. TABELLE 5 Anzahl der Positiven/Gesamtanzahl (%)

Marker	Massenbereich (AD)	TCC	Normal	Andere	P*	P**
PC-1	4,950-5150	17/30 (56,7)	9/34 (26,5)	2/30 (6,7)	0,025<P<0,05	P<0,001
PC-2	5,710-6,000	15/30 (50)	4/34 (11,8)	6/30 (20)	0,001<P<0,005	0,025<P<0,05
PC-3	6,758-7,750	20/30 (66,7)	4/34 (11,8)	11/30 (23,3)	P<0,001	0,025<P<0,05
PC-4	15,000-16,000	19/30 (63,3)	8/34 (23,5)	7/30 (23,3)	0,001<P<0,005	0,001<P<0,005
PC-5	37,500-40,000	20/30 (66,7)	7/34 (20,6)	16/30 (53,3)	P<0,001	0,75<P<0,9
PC-6	79,500-82,000	10/30 (33,3)	22/34 (64,7)	24/30 (80)	0,001<P<0,005	P<0,001
PC-7	85,000-92,000	15/30 (50)	5/34 (14,7)	5/30 (16,7)	0,005<P<0,001	0,01<P<0,025

Tabelle 5 zeigt die Anzahl und den Prozensatz an Positiven und p-Werte für die 7 Proteincluster Bereiche, die Unterschiede zwischen der TCC-Gruppe und den Kontrollgruppen aufzeigten. Das von 5 dieser Cluster, einschließlich 4.950-5.150 Da, 5.710-6.000 Da, 6.758-7.750 Da, 15.000-16.000 Da und 85.000-92.000 Da, gezeigte Proteinmuster erwies sich als signifikant unterschiedlich in Urinproben von TCC-Patienten als die in den Gesunden und Kontrollen mit anderen Erkrankungen gefundenen Muster. Die einzige Ausnahme war der Bereich 37.500-40.500, der sich als nicht statistisch verschieden (0,75<p<0,9) zwischen der TCC- und der Gruppe mit anderen Erkrankungen erwiesen hat. Interessanterweise wurde ein Proteincluster mit Massen im Bereich von 79,5-82,0 kDa in 64,7% der gesunden Kontrollgruppe und in 80% an Urinproben der nicht an TCC erkrankten Gruppe gefunden aber nur in 33% der TCC-Gruppe. Der Unterschied in der Häufigkeit dieses Clusters zwischen der Kontrolle und der TCC-Gruppe war statistisch signifikant.

Tabelle 6 unten zeigt die Verteilung der Proteincluster mit TCC-Stadium und -Stufe. TABELLE 6 Anzahl der Positiven/Gesamtanzahl (%)

Marker	Massenbereich (kD)	Stufe I-II		Stufe III		Stadium Ta		Stadium T1		Stadium T2-T3		CIS (%)
PC-1	4,950-5,150	2/9	(22.21	15/21	(71,4)	5/14	(35,7)	6/8	(75)	5/6	(83,3)	4/8	(50)
PC-2	5,710-6,000	3/9	(33,3)	12/21	(57,1)	6/14	(42,9)	4/8	(50)	4/6	(66,7)	2/8	(25)
PC-3	6,758-7,750	5/9	(55,5)	15/21	(71,4)	9/14	(64,3)	5/8	(62,5)	5/6	(83,3)	5/8	(62,5)
PC-4	15,000-16,000	5/9	(55,5)	14/21	(66,7)	8/14	(57,1)	7/8	(87,5)	3/6	(50)	5/8	(62,5)
PC-5	37,500-40,000	6/9	(66,7)	14/21	(66,7)	9/14	(64,3)	5/8	(62,5)	4/6	(66,7)	5/8	(62,5)
PC-6	79,500-82,000	3/9	(33,3)	7/21	(33,3)	3/14	(21,4)	4/8	(50)	3/6	(50)	2/8	(25)
PC-7	85,000-92,000	3/9	(33,3)	12/21	(57,1)	7/14	(50)	4/8	(50)	3/6	(50)	2/8	(25)

Ähnlich zu den UBC1-5 Markern wurde beobachtet, daß die Häufigkeit der meisten der Cluster mit Fortschreiten der Karzinome von Stufen I-II zu Stufe III und Stadium Ta zu Stadien T1-3 zunahm.
Ohne an eine Theorie gebunden werden zu wollen, könnten diese Cluster, da sie mit Ausnahme des einen zwischen 79,5-82,0 kDa hauptsächlich in der TCC-Gruppe beobachtet wurden, als eine Wiederspiegelung der gesteigerten Proteinausschüttung im Urin von Blasenkrebspatienten, die hier nachgewiesen und vorher beschrieben wurde, angesehen werden (Protheroe et al., British J. Cancer, 80(1/2):273-8 (1999); Hemmingsen et al., J. Urol., 152:1923 (1994)) und entweder einem Verlust an Serumproteinen aus der neuen Gefäßanordnung des Tumors oder einem gesteigerten Umsatz an Blasenkrebszellen zugeordnet werden (Protheroe et al., British J. Cancer, 80(1/2):273-8 (1999)).
V. Protein-Biochip-SELDI-Analyse von Blasenbarbotage
A. Probenvorbereitung aus Blasenbarbotage und SELDI-Analyse
Blasenwaschungen wurden bei 1.500 rpm für 5 Min. zur Bindung von zellulärem Material zentrifugiert. Die Überstände wurden mit der Ausnahme von 1-2 ml, die zum Resuspendieren des Zellniederschlags verwendet wurden, verworfen. Es wurden dann Cytospin-Präparate von 50-100 μl des resuspendierten Zellniederschlags gemacht, die Objektträger unmittelbar in 100% EtOH verbracht und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. Die gefärbten Objektträger wurden zur Identifizierung von Krebszellen durch einen Pathologen (S.N.) untersucht und einzelne Krebszellen oder Anhäufungen wurden unter Verwendung des Pixcell 100 Laser Capture Microdissection Mikroskops (Arcturus Engineering, Mountain View, CA) wie vorher beschrieben bereitgestellt (Wright et al. (1999), supra; Emmert-Buck et el., J. Immun. Meth., 141:149-155 (1991)).
Proteinextrakte wurden von 500-1000 der durch Mikrosektion gewonnenen Zellen durch Resuspendieren der Zellen in 3-5 μl von 20 mM HEPES, das 0,1% NP-40 enthält, Vortexen für 5 min. und dann Zentrifugieren bei 14.000 rpm für 1 min. hergestellt. Das gesamte Lysat wurde auf eine Nickel-IMAC3 (immobilisierter Metallaffinitäts-) ProteinChip^® aufgebracht und für 1 h inkubiert. Die Chips wurden mit 20 mM Tris pH 7,5, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl (5 Mal) und HPLC-H₂O (5 Mal) gewaschen. Eine Massenanalyse wurde wie für Urin beschrieben durchgeführt, wobei entweder CHCA oder Sinapinsäure (SPA) als energieabsorbierende Moleküle verwendet wurden.
B. Nachweis von Marker UBC-1
Eine Gesamtzahl von 6 zusammenpassenden (d. h. von demselben TCC-Patienten stammenden) Blasenwaschungen und Gruppen an Urintestmaterialien wurden analysiert. Blasenkrebszellen von allen 6 Patienten exprimierten das 3,3/3,4 kDa Protein (den UBC-1 Marker) der auch in 4/6 zusammenpassenden Urinproben vorhanden war.
4 zeigt 3 der zusammenpassenden Gruppen, die positiv für den Marker in sowohl Zelllysat als auch Urin waren. Es ist bemerkenswert, daß das in Urin gefundene Muster des Doppelpeaksignals für dieses Protein in den Spektren der Zelllysate erhalten bleibt. Es wurde gefunden, daß in Blasenepithelzellen von zwei unterschiedlichen Blasenbarbotage-Testmaterialien, die von dem Pathologen als gutartig beschrieben wurden, auch das 3,3/3,4 kDa Protein enthalten war (Daten nicht gezeigt).
Im Gegensatz zu dem UBC-1 Proteinmarker wurden die 9,5 (UBC-2), 44 (UBC-3), 100 (UBC-4) und 133 (UBC-5) kDa Proteine aus Urin nicht in den Blasenzelllysaten nachgewiesen. Ohne eine Bindung an eine Theorie zu wollen, können die Marker UBC-2 bis UBC-5 extrazelluläre Proteine sein oder alternativ proteolytische Fragmente von intrazellulären Proteinen, da sie nicht in aus zytologischen Testmaterialien bereitgestellten Krebszellen nachgewiesen wurden. Sofern es gewünscht ist, kann die Identifizierung dieser Proteine z. B. durch Peptidkartierung mit Trypsin (Patterson, Anal. Biochem., 221:1 (1994)) und Aminosäuresequenzierung (Patterson, SD, "Protein Identification und Characterization by Mass Spectrometry. Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., Abschnitt 10.22, S. 10.22.1-10.22.24 (1998)) erreicht werden.
C. Identifizierung von Marker UBC-1 als Defensinfamilie
Ein Durchsuchen von Proteindatenbanken (SWISS-PRO, www.expasy.ch/tools/tagident. html) nach Proteinen mit ähnlichem Molekulargewicht zu den 5 mit TCC in Zusammenhang stehenden Markern, deutete an, daß der Doublet eines Markers bei 3,3/3,4 kDa humanem Defensin α2 und 1 entspricht (Celis et al., Electrophoresis, 20(2):300-9 (1999)), von denen jeweils molekulare Massen von 3,38 und 3,45 kDa berichtet wurden. Zur Untersuchung dieser Hypothese, wurde ein auf SELDI basierender Immunotest unter Verwendung von handelsüblich erhältlichen Antikörpern gegen humane Defensine 1, 2 und 3 durchgeführt.
Die SELDI-Immunotests wurden ähnlich zu den in einem vorhergehenden Bericht beschriebenen durchgeführt (Wright et al. (1999), supra). In Kürze, die Anordnung eines voraktivierten Chips (PSI ProteinChip^®, Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA) wurden mit 4 μl Protein G (0,5 mg/ml in 50 mM Natriumbicarbonat pH 8, Sigma) für 2-4 h bei Raumtemperatur unter Schütteln beschichtet. Verbleibende aktive Stellen wurden anschließend mit 1 M Ethanolamin blockiert (30 min, R.T), gefolgt von aufeinanderfolgenden Waschungen in konischen 15 ml Röhrchen mit PBS – 0,5% Triton X (x3) und PBS (x4). 2 μl monoklonaler Antikörper (Ab) gegen Defensine 1-3 (HNP1, 2 und 3) (IgG1, 0,2 mg/ml, Serotec), PSMA 7E11C5.3 Ab (IgG1, 0,2 mg/ml, freundlicherweise von Cytogen Corporation, Princeton, NJ zur Verfügung gestellt) oder mouse IgG1 (30 μg/ml) wurden auf den Chip gegeben und ein Binden bei 4 °C über Nacht (o/n) unter Schütteln ermöglicht. Ungebundene Antikörper wurden durch aufeinanderfolgende Waschungen in konischen 15 ml Röhrchen mit PBS – 0,5% Triton X (x1), PBS – 0,1% Triton X (x3) und PBS (x4) entfernt. Urinproben wurden mit 100 μl PBS – 0,1% CETAB (Sigma, 29) auf eine Gesamtproteinkonzentration von 0,055 mg/ml verdünnt und im Anschluß an eine 20 minütige. Inkubation auf Eis unter Verwendung eines Bioprozessors (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA) auf die Anordnungen gegeben. Nach einer 3 ständigen. Inkubation bei 4 °C wurden die ungebundenen Proteine aus Urin durch 5 Waschungen mit PBS – 0,1% CETAB (jeweils 5 Min. R.T.) gefolgt von 5 Waschungen mit HPLC-H₂O weggewaschen, CHCA zugegeben und der Chip einer Massenanalyse unterzogen. Die Spektren wurden durch Mittelung des Signals von 90 Laserschüssen erzeugt.
Insgesamt 3 positive und 3 negative Urintestmaterialien für diesen Marker wurden analysiert. Wie in 5A gezeigt, wurde Marker UBC-1 leicht abgefangen, wenn der Defensin-α Ab vorgebunden an den Chip war. Im Gegensatz dazu wurde in der Abwesenheit des Defensin Ab (5B) oder bei Vorhandensein eines nichtverwandten Ab keine spezifische Bindung über dem Hintergrundniveau nachgewiesen (5C, 5D). Urintestmaterialien, die negativ für UBC-1 bei der direkten Bildung in SELDI waren, blieben für UBC-1 negativ bei dem SELDI-Immunotest ( 5E).
Defensine bilden eine Familie kleiner Peptide mit antimicroben, cytotoxischen und Anti-tumor-Aktivitäten (Zhao et al., FEBS Lett., 396:319-22 (1996)). Basierend auf ihrer primären Struktur wurden im Menschen zwei Familien, die α und β-Defensine charakterisiert (Celis et al., Electrophoresis, 20(2):300-9 (1999)). Von β-Defensinen wurde herausgefunden, daß sie hauptsächlich in Epithelzellen der Niere, Haut und des Atmungssystems exprimiert werden (Yang et al., Science, 286: 525-528 (1999); Selsted et al., J Cell Biol., 118:929-936 (1992)), wohingegen α-Defensine in neutrophilen und intestinalen Panethzellen exprimiert werden (Mizukawa et al., Anticancer Res., 19:2969-72 (1999)). Jüngere Daten zeigen weiter die Immunlokalisierung von α-Defensinen in Langerhanszellen und Zellen der Gänge von submandibularen Drüsen von Patienten mit Mundkarzinom (Mizukawa et al., Anticancer Res., 20(2B):1125-7 (2000); Barnathan et al., Amer. J. Pathol., 150 (3):1009-1019 (1997)) sowie Endothel- und glatten Muskelzellen von Herzgefäßen (Porter et al., FEBS Lett., 434:272-276 (1998)). Das Vorhandensein von Defensin-Peptiden in Blasenkrebszellen wurde vorher nicht beschrieben. Ohne an eine Theorie gebunden werden zu wollen kann diese Entdeckung der Freisetzung dieser Peptide aus durch einen Tumor aktivierten Neutrophilen untergeordnet sein, alternativ können diese Peptide durch die Blasenzellen exprimiert werden, was durch Untersuchen der mRNA-Spiegel in den Blasenzellen bestätigt werden kann.
Das Vorhandensein des für Panethzellen spezifischen Defensins in Urin aus einer Ileum-Neoblase wurde gezeigt (Hemmingsen et al., J. Urol., 152:1923 (1994)), dennoch konnte das Vorhandensein dieser Art von Defensinen in Urinproben desselben Patienten vor der Zystektomie nicht gezeigt werden. Die in diesem Beispiel verwendeten Antikörper erkennen die für Neutrophile spezifischen Defensine HNP1, 2 und 3, wobei sie eine Erklärung für die unterschiedlichen in den beiden Studien erhaltenen Ergebnisse zur Verfügung stellen.
Das Vorhandensein der Defensinen-Polypeptide in gutartigen Blasenzellen legt nahe, daß im Gegensatz zu Urin das Vorhandensein dieses Markers auf zellulärer Ebene nicht tumorspezifisch ist. Jedoch ohne an eine Theorie gebunden werden zu wollen wird erwartet, daß Veränderungen in seiner Menge während der Tumorentwicklung auftreten, was zu dem Nachweis von größeren Mengen in den Urinproben von TCC-Patienten führt. Alternativ kann das Vorhandensein dieser Polypeptide auch ein Hinweis auf die Anfangsphasen der Tumorentwicklung sein, die durch den Pathologen noch nicht erkannt werden. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, daß bei einem Patienten 3 Monate nach der Probennahme der Blasenbarbotage TCC Stadium T1, Stufe II gefunden wurde. Auf jeden Fall können Immunotests zur Überwachung quantitativer Veränderungen dieses Peptids zusätzliche nützliche Informationen in Bezug auf Tumorentwicklung und -fortschreiten zur Verfügung stellen.
VI. Analyse einer Kombination an Markern

Die SELDI-Technik bietet den Vorteil der gleichzeitigen Analyse mehrerer Marker. Daher wurden zur Maximierung der diagnostischen Nützlichkeit der mit TCC in Zusammenhang stehenden Biomarker die individuellen Proteine UBC1-UBC5 und 7 Protein Cluster in zahlreichen Kombinationen zur Bildung eines Biomarkerfeldes platziert, und die Urinspektren für alle Gruppen nochmal analysiert. Eine Biomarkerkombination wurde als positiv eingestuft, wenn irgendein Marker der Gruppe der Kombination in einer Probe vorhanden war, und negativ, wenn keiner der Marker in dem Testmaterial nachgewiesen wurde. Empfindlichkeit und Spezifität der mehrfachen Biomarkerfelder sind in Tabelle 7 unten gezeigt. Tabelle 7

Marker (kD)	Empfindlichkeit %	Spezifität-N%	Spezifität-O%	Spezifität-All%	PPV%	NPV%
3,9/9,5/100 3,3/44/85-92	83,3 83,3	70,6 70,6	63,3 63,3	67,2 67,2	54,3 54,3	89,6 89,6
3,3/9,5/85-92	86,7	70,6	60,0	65,6	54,2	91,3

Unter Verwendung dieser Biomarkerfelder stieg die Empfindlichkeit zum Nachweis von TCC von 43,3-63,3% bei Verwendung einzelner Biomarker (Tabelle 3) auf 83,3%-86,7% (Tabelle 7). Es gab jedoch wie zu erwarten ein Kompromiß bei der Gesamtspezifität der Untersuchung von einem Durchschnitt von 81% für einzelne Marker auf 67,2% bei Verwendung einer Kombination an Biomarkern (Tabelle 7). Es gab eine bemerkenswerte Steigerung des NPV des Tests auf 89,6% gegenüber einem Durchschnitt von 79% für einen einzelnen Marker und des PPV von 54,3% (Tabelle 7) war ähnlich dem Durchschnitt des PPV von 58% für eine einzelne Untersuchung (Tabelle 3).
Die Kombination des 3,3/3,4 kDa (UBC-1), 9,5 kDa (UBC-2) Markers und des 85-92 kDa Clusters (PC-7) wurde als die beste der Biomarkerkombinationen in Bezug auf Testempfindlichkeit identifiziert. Unter Verwendung dieser Gruppe wurde eine Empfindlichkeit von 86,7% erreicht mit einem PPV von 91,3% und einer Spezifität und einem NPV von jeweils 65,6% und 54,2% (Tabelle 7).
Alle drei der in Tabelle 7 gezeigten Kombinationsgruppen waren in der Lage Karzinome mit einer niedrigen Einstufung und Stadium mit relativ hoher Empfindlichkeit nachzuweisen.
Empfindlichkeit der Biomarkerfelder im Vergleich zu den Stadien und Stufen von Tumoren sind in Tabelle 8 unten gezeigt. Tabelle 8

Marker (kD) Stufe I, II Stufe III Ta T1, T2, T3

3,3/9,5/100 77,7 85,7 78,6 78,6

3,3/44/85-92 66,7 90,5 71,4 92,8

3,3/9,5/85-92 77,7 90,5 78,6 92,8
Wie in Tabelle 8 gezeigt, weist die Kombination aus 3,3/3,4, 44 und 85-92 kDa 66% aller Karzinome mit Stufe I und II und 71,4% mit Stadium Ta nach. Die Kombinationsgruppen aus 3,3/3,4, 9,5, 100 kDa und 3,3/3,4, 9,5 und 85-92 kDa stellten eine leicht bessere Empfindlichkeit von 77,7% für Karzinome mit Stufe I und II und 78,6% für Ta Karzinome zur Verfügung. Am bemerkenswertesten war, daß die Nachweisrate des SELDI-Urintests merklich höher als die Rate von 33,3% war, die entweder durch entleerten Urin oder Zytologie von Blasenwaschungen derselben Patienten erhalten wurde. Alle Kombinationen an Biomarkerfeldern stellten höhere Empfindlichkeiten (85,7%-90,5%) beim Nachweisen von Karzinomen der Stufe III und, mit der Ausnahme der Gruppe aus 3,3/3,4, 9,5 und 100 kDa, von Tumoren mit Stadium T1-T3 (92,8%) zur Verfügung.
Wie oben beschrieben wurde herausgefunden, daß die Empfindlichkeit jedes einzelnen Markers (UBC1-UBC5) oder jedes der 7 Proteincluster-Markers PC-1 bis PC-7 zum Nachweis von TCC relativ gering war. Das Kombinieren der einzelnen Marker oder Proteincluster steigerte jedoch die Gesamtnachweisrate von TCC und die Rate für Karzinome mit niedriger Stufe und niedrigem Stadium. Basierend auf dem in diesem Beispielabschnitt beschriebenen Ergebnissen, stellte der kombinatorische Ansatz mit SELDI eine Nachweisrate von 77,7% für Karzinome mit Stufe I und II und eine Nachweisrate von 78,6% für Karzinome im Stadium Ta im Vergleich zu einer Nachweisrate von 20-30% durch Zytologie mit entleertem Urin zur Verfügung (siehe Grossman und Dinney, Urol. Oncology 5:3-10 (1999)). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Marker der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von frühem TCC verwendet werden können (z. B. unter Verwendung eines proteomischen Ansatzes mit SELDI).
Der Ansatz der kombinatorischen Analyse mit Biomarkern steigerte die Empfindlichkeit aber verringerte die Spezifität der Untersuchung. Dieser Ansatz basiert auf einfachen gewöhnlichen statistischen Verfahren. Zum Verarbeiten einer größeren Menge an Proben und SELDI-Daten kann es wünschenswert sein, ein Programm mit künstlicher Intelligenz, wie Fuzzylogic, Clusteranalyse oder ein neuronales Netzwerk (ANN) zur Analyse der Daten zu verwenden. Zuvor für die Vorhersage des Ausgangs bei Prostata- (Qureshi et al., J. Urol., 163: 630-633 (2000)) oder Blasenkrebs (Snow, et al., J. Urol., 152:1923 (1994)), basierend auf klinisch-pathologischen und molekularen Markern, entwickelte ANN können bei Ausführungsformen der Erfindung angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Materialien und Verfahren zur Unterstützung der Diagnose von Blasenkrebs unter Verwendung von Markern, die verschieden in Proben eines Blasenkrebspatienten und einer normalen Testperson, die keinen Blasenkrebs hat, vorhanden sind.

Claims

Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen wenigstens eines Proteinmarkers in einer Probe, wobei der Proteinmarker unter den folgenden ausgewählt ist: Marker UBC-1: humanes Defensin alpha2 und 1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker PC-1: 4,950-5,150 kDa, Marker PC-2: 5,710-6,000 kDa, Marker PC-3: 6,758-7,750 kDa, Marker PC-4: 15,000-16,000 kDa, Marker PC-5: 37,500-40,000 kDa, Marker PC-6: 79,500-82,000 kDa und Marker PC-7: 85,000-92,000 kDa, und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Korrelation das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des Markers oder der Marker in der Probe und die Häufigkeit des Nachweises desselben Markers oder derselben Marker in einer Kontrolle berücksichtigt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Korrelation weiterhin die Menge des Markers oder der Marker in der Probe im Vergleich zu einer Kontrollmenge des Markers oder der Marker berücksichtigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das Nachweisen von wenigstens dreien der Marker umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das Nachweisen von wenigstens vieren der Marker umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das Nachweisen von wenigstens fünfen der Marker umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Vorliegen der Marker UBC-1 und PC-7 nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe Urin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe ein Zelllysat von einer Blasenbarbotage ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Gasphasen-Ionenspektrometrie für das Nachweisen des Markers oder der Marker verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Gasphasen-Ionenspektrometrie Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie folgendes umfaßt: (a) Bereitstellen eines Substrats, welches ein daran angebrachtes Adsorptionsmittel umfaßt, (b) Inkontaktbringen der Probe mit dem Adsorptionsmittel und (c) Desorbieren und Ionisieren des Markers oder der Marker von dem Substrat und Nachweisen des desorbierten/ionisierten Markers oder der Marker mit dem Massenspektrometer.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Substrat eine Sonde ist, die für eine Verwendung mit dem Massenspektrometer ausgestaltet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Substrat dafür geeignet ist, auf einer Sonde plaziert zu werden, die für eine Verwendung mit dem Massenspektrometer ausgestaltet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Adsorptionsmittel ein Antikörper ist, der spezifisch an den Marker bindet.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Adsorptionsmittel ein kationisches Adsorptionsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Adsorptionsmittel ein Metall chelierendes Adsorptionsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, welches das Nachweisen des Markers UBC-1 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Immunotest verwendet wird, um den Marker oder die Marker nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Verfahren weiterhin folgendes umfaßt: (a) Erzeugen von Daten über die Probe mit dem Massenspektrometer, die die Intensität des Signals für Masse/Ladungs-Verhältnisse anzeigen, (b) Umwandeln der Daten in computerlesbare Form und (c) Betreiben eines Computers, um einen Algorithmus auszuführen, wobei der Algorithmus die Genauigkeit der Passung zwischen den computerlesbaren Daten und den Daten, die eine Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase oder eine negative Diagnose anzeigen, bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Algorithmus ein Programm künstlicher Intelligenz umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Programm künstlicher Intelligenz eine Fuzzylogik, eine Clusteranalyse oder ein neuronales Netz ist.
Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen wenigstens eines Proteinmarkers in einer Probe, wobei der Proteinmarker unter den folgenden ausgewählt ist: Marker PC-1: 4,950-5,150 kDa, Marker PC-2: 5,710-6,000 kDa, Marker PC-3: 6,758-7,750 kDa, Marker PC-4: 15,000-16,000 kDa, Marker PC-5: 37,500-40,000 kDa, Marker PC-6: 79,500-82,000 kDa und Marker PC-7: 85,000-92,000 kDa, und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.
Verfahren nach Anspruch 23, welches weiterhin folgendes umfaßt: (c) Nachweisen eines oder mehrerer weiterer Proteinmarker in der Probe, wobei die Marker unter folgenden ausgewählt sind: Marker UBC-1: humanes Defensin alpha2 und 1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker UBC-2: 9,495 kDa ± 233 Da, Marker UBC-3: 44,6 kDa ± 1,9 Da, Marker UBC-4: 100,120 kDa ± 4,3 Da und Marker UBC-5: 133,190 kDa ± 3,9 Da, und (d) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.
Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen wenigstens dreier Proteinmarker in einer Probe, wobei die Proteinmarker die folgenden sind: Marker UBC-1: humanes Defensin alpha2 und 1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker UBC-2: 9,495 kDa ± 233 Da, Marker PC-7: 85,000-92,000 kDa, und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.
Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen wenigstens dreier Proteinmarker in einer Probe, wobei die Proteinmarker die folgenden sind: Marker UBC-1: humanes Defensin alpha2 und 1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker UBC-3: 44,6 kDa ± 1,9 Da, Marker PC-7: 85,000-92,000 kDa, und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.
Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen wenigstens dreier Proteinmarker in einer Probe, wobei die Proteinmarker die folgenden sind: Marker UBC-1: humanes Defensin alpha2 und 1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker UBC-2: 9,495 kDa ± 233 Da, Marker UBC-4: 100,120 kDa ± 4,3 Da, und (b) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.
Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Nachweisen des Proteinmarkers PC-7: 85,000-92,000 kDa in einer Probe und (b) Nachweisen eines oder mehrerer weiterer Proteinmarker in der Probe, wobei die Marker unter den folgenden ausgewählt sind: Marker UBC-1: 3,353 kDa ± 105 Da, 3,432 kDa ± 122 Da, 3,470 kDa ± 32 Da, Marker UBC-2: 9,495 kDa ± 233 Da, Marker UBC-3: 44,6 kDa ± 1,9 Da, Marker UBC-4: 100,120 kDa ± 4,3 Da und Marker UBC-5: 133,190 kDa ± 3,9 Da, und (c) Korrelieren des Nachweises des Markers oder der Marker mit einer mutmaßlichen Diagnose von Übergangszellkarzinom der Blase.