DE60124628T2

DE60124628T2 - Kristallstruktur (3 Å-Auflösung) des 30S-Ribosoms und deren Verwendung

Info

Publication number: DE60124628T2
Application number: DE60124628T
Authority: DE
Inventors: Venkatraman Cambridge Ramakrishnan; Ditlev Egeskov Cambridge Brodersen; Andrew Philip Cambridge Carter; Brian Thomas Wimberly; William Melvon Clemons Jr.
Original assignee: Medical Research Council; University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: Medical Research Council; University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-07-14
Also published as: ATE346089T1; GB0029871D0; GB2368066B; US6925394B2; EP1172374A8; AU783778B2; DE60124628D1; EP1172374B1; US20020106660A1; GB0029870D0; CA2352399A1; GB2368066A; IL144083A0; EP1172374A1; JP2005194188A; GB0116858D0; AU7215701A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung einer hochaufgelösten Kristallstruktur der prokaryotischen 30S Ribosomuntereinheit und die Verwendung dieser Struktur zur Arzneimittelentwicklung.
Hintergrund der Erfindung
Die Informationsfülle, die durch Anstrengungen in der strukturellen Genomforschung erzielt wurden, und Vorteile in der Berechnung hat die Struktur-basierte Arzneimittelentwicklung zugelassen, um als ein wertvolles Werkzeug in der medizinischen Chemie aufzutreten. In der Vergangenheit zog die kombinatorische Chemie, gekoppelt mit Ansätzen mit hohem Durchsatz, die Aufmerksamkeit weg von den mehr Struktur-basierten Verfahren. Bestimmung von Proteinstrukturen im Hochmaßstab kehrt das Arzneimittelentwicklungsverfahren um, indem mit der Proteinstruktur begonnen wird und diese verwendet wird, um neue Liganden zu identifizieren und zu gestalten. Es ist die Integration von Struktur-basierten Verfahren, "virtual screening" und kombinatorischer Chemie, was die Basis für eine effizientere Arzneimittelentwicklung in der Zukunft bereitstellt, was wiederum signifikant die Zeitdauer des Entwicklungszyklus und die Kosten pro auf den Markt gebrachtem Arzneimittel vermindert. Signifikante Vorteile sind bereits bei AIDs, Arthritis und Krebs und in der Behandlung von Bluthochdruck z.B. Captopril erreicht worden.
Die Translation des genetischen Codes tritt auf dem Ribosom auf, einem großen Nukleoproteinkomplex, der aus zwei Untereinheiten besteht. In Bakterien werden diese zwei Untereinheiten als 30S und 50S bezeichnet. Die 50S Untereinheit enthält die katalytische Stelle der Peptidyltransferaseaktivität, während die 30S Untereinheit eine ausschlaggebende Rolle im Decodieren der Messenger RNA spielt. Die Proteinsynthese ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, welches verschiedene extrinsische GTP-hydrolysierende Proteinfaktoren während jeder der Hauptstufen der Initiierung, Verlängerung und Terminierung erfordert. Trotz mehrerer Jahrzehnte an Arbeit sind die molekularen Details des Verfahrens schlecht verstanden und die Erläuterung des Mechanismus der Translation ist zur Zeit eines der fundamentalen Probleme in der Molekularbiologie. Eine derzeitige Zusammenstellung an Artikeln faßt den Stand des Verständnisses auf diesem Gebiet zusammen [1].
Ein Beitrag zu diesem Problem wurde von Yonath und dessen Mitarbeiter gemacht, der nach nahezu einem Jahrzehnt an Arbeit zeigte, daß Strukturen so groß wie die 50S ribosomale Untereinheit Kristalle formen würden, die über 3 Å Auflösung beugen [2]. Ursprünglich war nicht klar, daß Phaseninformation von einer solch großen asymmetrischen Einheit in hoher Auflösung erhalten werden könnte, aber die Entwicklung von hellen bzw. klaren, abstimmbaren Synchrotonstrahlungsquellen, großen und genauen Bereichsdetektoren, äußerst verbesserter kristallographischer Berechnung und die Einführung von Cryo-Kristallographie haben sämtlich dazu beigetragen, Strukturstudien von dem Ribosom lenkbarer zu gestalten. In unserer Arbeit hat auch die Verwendung von anomalem Streuen von den LIII Kanten von Lanthaniden und Osmium eine kritische Rolle im Erhalten der Phasen gespielt.
Die 30S ribosomale Untereinheit (im folgenden als 30S bezeichnet) von Thermus thermophilus wurde ursprünglich von Trakhanov et al. in 2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD) [3] und bald danach von Yonath und Mitarbeitern in einem Gemisch von Ethylbutanol und Ethanol [4] kristallisiert. Nachfolgende Arbeit durch beide Gruppen zeigte, daß die MPD Kristallform bis etwa 9-12 Å Auflösung beugte [5,6]. Die Beugungsgrenze dieser Kristalle verbesserte sich nicht über 7 Å Auflösung für nahezu ein Jahrzehnt, aber kürzlich erhielten sowohl Yonath und Mitarbeiter [7,8] als auch wir [9] Kristalle der MPD Form, die deutlich verbesserte Beugung bzw. Diffraktion zeigte. Jedoch ungleich den Kristallen, erhalten durch die Yonath Gruppe [6], erforderten unsere Kristalle nicht das Eintauchen in Wolframcluster oder Wärmebehandlung, um hohe Beugungsauflösung zu erhalten.
Wir haben zuvor die Struktur der 30S bei 5,5 Å Auflösung beschrieben [9]. Wir waren in der Lage, alle sieben Proteine, deren Strukturen zu der Zeit bekannt waren, unterzubringen bzw. zu platzieren, die Struktur des Proteins S20 als ein Drei-Helixbündel abzuleiten, die Faltung einer gesamten Domäne von 16S RNA aufzuspüren und eine lange RNA Helix an der Grenzfläche zu identifizieren, welche die dekodierende Stelle der 30S enthält. Die Proteine S5 und S7 wurden ebenso in Elektronendichtemappen der 30S, erhalten von Yonath und Mitarbeiter, platziert.
Die ribosomale 30S Untereinheit ist ein Hauptziel für Antibiotika. Das Ribosom ist ein nützliches Target für Antibiotika, da die Struktur der 30S zwischen Prokaryoten weithin bewahrt wird, was Breitbandantibiotika zuläßt. Jedoch ist die Beständigkeit gegen gegenwärtige Antibiotika ein derzeitiges Hauptproblem in der Medizin. Es sind derzeit sehr wenige neue Antibiotika erhältlich, welche verwendet werden können, um hochbeständige Bakterienstämme wie MRSA (Methicilin beständiges Staphylococcus aureus) zu behandeln, welche ansteigend verbreitet werden.
Das Verständnis der Wechselwirkung von Antibiotika mit dem Ribosom auf der molekularen Ebene ist für zwei Gründe wichtig. Zunächst wirken Antibiotika durch Eingreifen mit verschiedenen Aspekten der Ribosomfunktion. Daher wird das Verständnis dieser Wechselwirkung helfen, Licht auf die Mechanismen, die in der Translation involviert sind, zu werfen. Zweitens kann ein detailliertes Wissen von antibiotischen Wechselwirkungen mit dem Ribosom die Entwicklung von neuen Arzneimitteln gegen hochbeständige Bakterienstämme unterstützen. Obwohl Antibiotika mehrere Jahrzehnte zuvor charakterisiert wurden, wird ein detailliertes Wissen von deren Mechanismus im allgemeinen eine dreidimensionale Struktur von deren Komplex mit dem Ribosom erfordern.
Die niederen (größer als 3 Å Auflösung) Kristallstrukturen, wie vorstehend beschrieben, stellen keine ausreichend detaillierte Auflösung zur verwendbaren Modellierung der Kristallstruktur der 30S bereit und daher gibt es einen Bedarf für eine hochaufgelöste Struktur, welche in der Entwicklung von neuen Therapeutika nützlich verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben nun die Struktur von der 30S bei 3 Å Auflösung gelöst und verfeinert. Die Struktur enthält sämtliche der geordneten Regionen bzw. Bereiche von 16S RNA und 20 verknüpfter Proteine, und enthält über 99% der RNA Sequenz und 95% der Proteinsequenzen, wobei die fehlenden Teile ausschließlich an den Enden der RNA oder Polypeptidketten sind. Wir beschreiben hier die Gesamtarchitektur und die Hauptstrukturmerkmale der 30S Untereinheit.
Das verfeinerte Atomauflösungsmodell der 30S, wie hier dargestellt, erlaubt die Interpretation einer überaus großen Menge biochemischer Daten bezüglich dessen Funktion in präzisen Strukturtermen. Die Struktur dient auch als eine Basis zur Interpretation in molekularer Hinsicht bezüglich Modellen niedrigerer Auflösung von verschiedenen funktionellen Zuständen durch Elektronenmikroskopie oder Röntgenkristallographie. Die 30S Struktur wird helfen, testbare Modelle für verschiedene Aspekte der Ribosomfunktion zu erzeugen.
In einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen Kristall der 30S Untereinheit von Thermus thermophilus mit einer tetragonalen Raumgruppe P4₁2₁2 mit Elementarzellendimensionen von a = 401,375 Å, b = 401,375 Å, c = 175,887 oder allgemeiner a = 401,4 Å, b = 401,4 Å, C = 175,9 Å, aber mehr bevorzugt a = 401,4 + 4,0 Å, b = 401,4 ± 4.0 Å, c = 175,9 ± 5,0 Å. Ein vorteilhaftes Merkmal der Struktur liegt darin, daß sie über 3 Å Auflösung beugt. Ein weiteres Merkmal dieser Struktur liegt darin, daß sie in einem Verfahren erhalten wurde, welches nicht das Eintauchen von Kristallen in Schweratom (z.B. Wolfram oder Tantal)-Cluster oder Wärmebehandlung involviert. Ferner ist sie bezüglich der 885-888/910-912 Basenpaarkonformation von 16S RNA spezifisch. Diese Merkmale, sowohl allein und in Kombination, tragen sämtlich zu Merkmalen der Erfindung, welche vorteilhaft sind, bei.
In einem zweiten Aspekt liefert die Erfindung ebenso einen Kristall von 30S mit den dreidimensionalen Atomkoordinaten des 30S Ribosoms. Tabelle 1A liefert ein Atomkoordinatenset des 30S Ribosoms. Tabelle 1B liefert ein Set, basierend auf den Koordinaten der Tabelle 1A, welche aber aus unseren Daten weiter verfeinert worden sind. Bezugnahme auf "Tabelle 1" ist eine Referenz zu entweder Tabelle 1A oder 1B (oder wo der Kontext erlaubt, beiden). Wenn daher beispielsweise angeführt wird, daß die Erfindung sich auf computerlesbare Medien mit "Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1, wie hier aufgezeichnet" bezieht, meint dies, daß das Medium entweder die Daten von Tabelle 1a oder die Daten von Tabelle 1B oder beiden, wie darin angegeben, aufweist.
Wir haben ebenso festgestellt, daß 30S Kristalle nicht das S1-Untereinheitsprotein enthalten. In unseren Studien haben wir festgestellt, daß wir durch selektives Entfernen dieses Proteins vor der Kristallisation in der Lage gewesen sind, die verbesserte Auflösung, wie hier beschrieben, zu erhalten. Obwohl die in der nachstehenden Tabelle 1 angegebenen Atomkoordinaten zulassen, daß ein Fachmann die Notwendigkeit umgeht, die Kristallisation der 30S durchzuführen, bildet dieses Kristallisationsverfahren nichtsdestotrotz einen weiteren Aspekt der Erfindung. Demgemäß wird ein Verfahren zur Kristallisation einer 30S Untereinheit unter Erhalten einer Struktur einer 30S Untereinheit mit hoher Auflösung bereitgestellt, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer 30S Untereinheit, das selektive Entfernen der S1 Untereinheit davon und Kristallisieren der 30S umfaßt.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Computer-basiertes Verfahren zur Identifizierung einer potentiellen Inhibitors der 30S, umfassend die Schritte:

a. das Anwenden einer dreidimensionalen Struktur von 30S oder mindestens einer Unterdomain davon, um mindestens eine aktive Stelle zu charakterisieren, wobei die dreidimensionale Struktur durch Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1 definiert wird, und
b. das Identifizieren des potentiellen Inhibitors durch Gestalten oder Auswählen einer Verbindung zur Wechselwirkung mit der aktiven Stelle.

In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung von Computer-lesbaren Medien mit entweder (a) Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1, wie darauf aufgezeichnet, wobei die Daten die dreidimensionale Struktur von 30S oder mindestens einer Unterdomain davon definieren, oder (b) Strukturfaktordaten für 30S, wie darauf aufgezeichnet, wobei die Strukturfaktordaten von den Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1 ableitbar sind.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die sekundäre Struktur des 30S Ribosoms.
2 ist Tabelle 1A und Tabelle 1B.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen.
Der Ausdruck "Unterdomain" schließt die folgenden ein:

(a) ein Element, ausgewählt aus den folgenden: mindestens einem vollständigen Element der sekundären Struktur, d.h. einer Alpha-Helix oder ein Beta-Blatt, oder RNA-Helix, wie in der detaillierten Beschreibung nachstehend beschrieben; einer Gruppe von zwei oder mehreren solcher Elemente, welche miteinander wechselwirken; mindestens einem Untereinheitsprotein; einer Untergruppe von Untereinheitsproteinen, beispielsweise eine Gruppe, welche zwei oder mehrere Proteine einschließt, von denen gefunden wurde, daß sie miteinander wechselwirken; jedwedem der vorstehenden, wenn es ein Protein oder Element davon ist, welches in Verbindung mit sämtlichen oder einem Teil der 16S RNA-Struktur, verknüpft mit den Elementen oder Proteinen, verwendet wird;
(b) ein Volumenraum, der einen Bereich um irgendein bestimmtes Atom von Interesse definiert (z.B. ein Atom, welches in dem Binden an ein Antibiotikum involviert ist), wobei das Volumen weniger als das Gesamtvolumen des tetragonalen Raums des vollständigen Kristalls ist. Beispielsweise können die Atomkoordinaten in einem Volumen von etwa 500 bis etwa 15000 Å³ ausgewählt werden und für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Solch ein Raum kann eine Sphäre mit einem Durchmesser von etwa 10 Å bis etwa 30 Å, zentriert um einen Punkt von Interesse sein; und
(c) eine Sammlung von mindestens 10, beispielsweise mindestens 25 wie mindestens 50, mehr bevorzugt mindestens 100, noch mehr bevorzugt mindestens 500 Atomen und am meisten bevorzugt, mindestens 1000 Atomen, definiert durch die Koordinaten von Tabelle 1, wobei mindestens zwei der Atome und vorzugsweise mindestens 50% der Atome der Sammlung innerhalb 50 Å voneinander angeordnet sind.

Eine "aktive Stelle" der 30S ist jedweder Teil dieser Struktur, involviert in tRNA oder mRNA-Binden, Faktorbinden oder Translokation. Dieses schließt Bereiche, verantwortlich für das Binden von Initiierungsfaktoren, Verlängerungsfaktor G oder Freisetzungsfaktoren, Bereiche, welche Zielstellen zur Regulierung durch Co-Faktoren, Phosphorylierung oder Acetylierung sind, und Bereiche, verantwortlich für die Wechselwirkung mit dem 50S Ribosom, ein. Dieses schließt ebenso Bereiche ein, welche die Konformation während Translokation oder Proteinsynthese ändern, insbesondere ein oder mehrere der 16SRNA Helices 18, 27, 34 und 44.
Besondere Bereiche der 30S schließen antibiotische Bindungsbereiche ein. Andere Bereiche schließen die drei tRNA Bindungsstellen, d.h. die Aminoacyl (A), Peptidyl (P) und (Exit) E-Stellen ein.
Andere aktive Stellen sind solche, welche eine Bewegung während der Translokation von tRNAs von den A- zu P-Stellen und den P- zu E-Stellen eingehen. Bereiche schließen ferner jedwede der Proteinuntereinheiten S2 bis S20 und THX ein, einschließlich jedweder individuell identifizierter Proteinuntereinheiten in den beigefügten Beispielen.
Durch "Anpassen" ist das Bestimmen durch automatische oder semiautomatische Mittel von Wechselwirkungen zwischen einem oder mehreren Atomen eines potentiellen Inhibitormoleküls und einem oder mehreren Atomen oder Bindungsstellen der 30S und Berechnen des Ausmaßes, zu welchem solche Wechselwirkungen stabil sind, gemeint. Verschiedene Computer-basierte Verfahren zum Anpassen werden hier weiter beschrieben.
Mit "mittlere Quadratwurzel-Abweichung" meinen wir die Quadratwurzel des arithmetischen Mittels der Quadrate der Abweichungen von dem Mittel. "Computerlesbare Medien" bezeichnet jedwedes Medium, welches durch einen Computer gelesen werden kann und direkt an einen Computer angeschlossen werden kann.
Solche Medien schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein: Magnetische Speichermedien wie Floppy-Disks, Harddiskspeichermedien und Magnetbänder; optische Speichermedien wie optische Disks oder CD-ROM, elektrische Speichermedien wie RAM und ROM, und Hybride dieser Kategorien wie magnetische/optische Speichermedien.
Ein "Computersystem" bezeichnet Hardware-Mittel, Software-Mittel und Datenspeichermittel, die zur Analyse der Atomkoordinatendaten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Minimumhardwaremittel der Computer-basierten Systeme der vorliegenden Erfindung umfassen eine Zentralverarbeitungseinheit (CPU), Eingabemittel, Ausgabemittel und Datenspeichermittel. Wünschenswerterweise ist ein Monitor bereitgestellt, um die Strukturdaten zu visualisieren. Die Datenspeichermittel können RAM oder Mittel zum Anschluß an Computer-lesbare Medien der Erfindung sein. Beispiele solcher Systeme sind Mikrocomputer, Workstations, erhältlich von Silicon Graphics Incorporated and Sun Microsystems, die auf Unix-Basis laufen, Windows NT oder IBM OS/2 Betriebssysteme.
Tabelle 1.
Die Koordinaten der Tabelle 1 liefern ein Maß der Atomlage in Angström zu einer dritten Dezimalstelle. Um diese Information in diesen Tabellen zu den hier beschriebenen Zwecken als Aspekte der vorliegenden Erfindung zu verwenden, können diese Koordinaten bis zu ± 1,0 variieren, wie bis zu ± 0,7, vorzugsweise nicht mehr als bis zu ± 0,5 Angström, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Des weiteren wird das Variieren der relativen Atompositionen der Atome der Struktur, so daß die mittlere Quadratwurzel-Abweichung der 16S RNA- oder S2-S20 Protein Rückgratatome weniger als 1,5 Å (vorzugsweise weniger als 1,0 Å und mehr bevorzugt weniger als 0,5 Å) beträgt, wenn auf die Koordinaten, geliefert in Tabelle 1, für diese Strukturen überlagert, in einer Struktur resultieren, welche im wesentlichen die gleiche wie die Struktur der Tabelle 1 sowohl bezüglich deren strukturellen Eigenschaften als auch bezüglich der Wirksamkeit zur Struktur-basierten Arzneimittelentwicklung von 30S Liganden ist.
Für die hier beschriebenen Zwecke als Aspekte der vorliegenden Erfindung ist es daher innerhalb des Umfangs der Erfindung, wenn: Die Koordinaten gemäß Tabelle 1 zu einem unterschiedlichen Ursprung und/oder Achsen transponiert werden; die relativen Atompositionen der Atome der Struktur derart variiert sind, daß die mittlere Quadratwurzel-Abweichung der bewahrten Restrückgratatome weniger als 1,5 Å (vorzugsweise weniger als 1,0 Å und mehr bevorzugt weniger als 0,5 Å), wenn auf die in Tabelle 1 bereitgestellten Koordinaten für die bewahrten Restrückgratatome überlagert, beträgt; und/oder die Zahl und/oder Positionen der Wassermoleküle variiert. Bezugnahme auf die Verwendung der Koordinaten von Tabelle 1 schließt daher die Verwendung der Koordinaten ein, in welchen ein oder mehrere individuelle Werte der Tabelle in dieser Weise variieren.
Tabelle 1 schließt die Koordinaten von zwei Zinkionen, zusammen mit 202 anderen Ionen, welche nicht identifiziert sind, ein, obwohl, ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, es angenommen wird, daß diese aus Kobalt und Magnesium ausgewählt sind. Einige oder sämtliche dieser Ionen können gegebenenfalls von Tabelle 1 gestrichen werden, wenn die Daten verwendet werden. Die Tabelle listet ebenso die Koordinaten eines 26 Aminosäurepeptids, Thx, sowie eines 6 Nukleotidfragments von mRNA, NNNUCU, bezeichnet als Molekül X, auf. Beide Koordinaten von diesen beiden Molekülen können ebenso gegebenenfalls gestrichen werden, d.h. so daß die Koordinaten der 16S RNA und die Proteine S2 bis S20 allein modelliert und in Anwendungen dieser der Erfindung verwendet werden.
Es gibt einige wenige N- oder C-terminale Sequenzen der S2 bis S20 Proteine, welche nicht in der Struktur gemäß Tabelle 1 aufgelöst wurden, zusammen mit einigen der 5' oder 3' Reste der 16S RNA. Diese sind nicht für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wesentlich, aber in Tabelle 2 zur Vervollständigung aufgeführt. Wenn gewünscht, kann ein Fachmann wollen, daß diese Strukturen, welche durch die Koordinate gemäß Tabelle 1 angegeben sind, durch Modellieren in ein oder mehrere der Aminosäuren oder Nukleotide der Tabelle 2 adaptiert werden.
Diese Methodik liefert einem Fachmann ein Mittel zur Bereitstellung von 30S Kristallen von T. thermophilus. Die Bewahrung der Ribosomstruktur, insbesondere von Strukturbereichen, die zur Funkton wesentlich sind, zwischen Prokaryoten beispielsweise Prokaryoten, welche humane Pathogene sind, wie Staphylococcus spp und dergleichen, erlauben, daß die Struktur in der Bereitstellung von antibakteriellen Mitteln im allgemeinen verwendbar ist. Daher kann die Struktur verwendet werden, um 30S Untereinheiten durch die Technik molekularen Ersatzes bzw. Austausches zu lösen. In einem solchen Verfahren werden Röntgenbeugungsdaten aus Kristallen einer 30S Untereinheit von anderen Spezies, beispielsweise eine Spezies eines Bakteriums, das gegenüber Menschen pathogen ist, erhalten. Die Koordinaten gemäß Tabelle 1 können verwendet werden, um die Orientierung des unbekannten Moleküls in dem Kristall und berechneten Elektronendichtemappen zu finden. Diese Mappen können anschließend mit der Sequenz der in Rede stehenden Spezies interpretiert werden, und die Koordinaten unserer 30S Struktur können verwendet werden, um diese Interpretation zu unterstützen oder diese Interpretation zu beschleunigen. Auf diese Weise erleichtert die Struktur unserer 30S die Bestimmung von Strukturen von 30S Untereinheiten und gesamten Ribosomen von anderen Organismen.
Demgemäß liefert die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer bakteriellen 30S von einer Speziez verschieden von T. thermophilus, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) das Kristallisieren der 30S der Spezies unter Erhalten eines Kristalls;
(b) das Durchführen von Röntgenstrahlkristallographie an dem Kristall unter Erhalten von Röntgenbeugungsdaten;
(c) das Bereitstellen der Strukturdaten von Tabelle 1 und
(d) das Verwenden von molekularem Austausch, um eine Elektronendichtemappe der 30S zu berechnen.

In einem solchen Verfahren kann die 30S durch Entfernen der S1 Untereinheit, wie hier beschrieben, hergestellt werden.
Die erhaltene Elektronendichtemappe kann anschließend verwendet werden, um die Atomkoordinatendaten der 30S zu berechnen. Die derart erhaltenen Atomkoordinatendaten können für die Gestaltung und Analyse neuer und spezifischer Liganden für 30S, wie hier beschrieben, verwendet werden.
Die 30S Kristallstruktur
Die hier bereitgestellte hochaufgelöste Struktur liefert einen Kristall mit Elementarzellendimensionen, welche in der beigefügten Tabelle zu drei Dezimalstellen angegeben sind, d.h. a = b = 401,375, c = 175,887 Å. Ein Fachmann, der wünscht, die hier beschriebene Kristallisation zu reproduzieren und solche Kristalle zu erhalten, wird jedoch erkennen, das ein Grad der experimentellen Variabilität und Fehler bedeuten wird, daß Kristalle der Erfindung mit einer Elementarzellendimension erhalten werden, innerhalb, aber nicht exakt korrespondierend zu dieser Größe, sein werden. Solche Kristalle der Erfindung können im allgemeinen definiert werden als Elementarzellendimensionen aufzuweisend von a = 401,4 ± 4,0 Å, b = 401,4 ± 4,0 Å, c = 175,9 ± 5,0 Å, vorzugsweise a = 401,4 ± 1,0 Å, b = 401,4 ± 1,0 Å, c = 175,9 ± 2,0 Å, vozugsweise a = 401,4 ± 0,7 Å, b = 401,4 ± 0,7 Å, c = 175,9 ± 1,4 Å und mehr bevorzugt a = 401,4 ± 0,2 Å, b = 401,4 ± 0,2 Å, c = 175,9 ± 0,4 Å. Es wird angenommen, daß diese Elementarzellengrößen eine neue und höher aufgelöste Elementarzellengröße definiert als es zuvor im Stand der Technik möglich gewesen ist.
Herstellung von Kristallen
Um Kristalle gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten, haben wir festgestellt, daß ein selektives Entfernen des S1 Untereinheitsproteins vorteilhaft ist. Ein geeignetes Verfahren zur selektiven Entfernung des S1 Untereinheitsproteins besteht in der Verwendung einer Chromatographiesäule mit hydrophober Wechselwirkung (poros-ET). Ribosomale 30S Untereinheiten, welchen die S1 Untereinheit fehlt, können vorteilhaft von solchen, welche die S1 Untereinheit enthalten, durch Betreiben einer Säule unter Verwendung eines Amoniumsulfat-Umkehrgradienten von 1,5M bis 0,5M, mit 20mM Hepes, pH 7,5 und 10mM Acetat abgetrennt werden. Die 30S Untereinheiten, welchen S1 fehlt, werden zunächst eluiert, was den ersten Hauptpeak ergibt. Während der Eluierung des 30S Peaks wird die Ammoniumsulfatkonzentration bei einem konstanten Grad beibehalten.
Wenn der 30S Peak eluiert worden ist, wird die Ammoniumsulfatkonzentration anschließend weiter vermindert, um die 30S + S1 Fraktion zu eluieren.
Ein alternatives Verfahren zur selektiven Entfernung des S1-Untereinheitsproteins ist mittels präparativer Gelelektrophorese. Gelelektrophorese kann geeigneterweise durch zunächst Herstellen und Mischen eines 3% Acrylamids, 0,5% Agarosezylindrischen Gels und Schütten dieses Gel in eine BioRad Prep-Zelle durchgeführt werden. Ribosomale 30S Untereinheiten werden anschließend auf das Gel geladen und kontinuierlich eluiert, wenn sie an dem anderen Ende des Gels auftauchen. Die 30S Fraktion, welcher die S1 Untereinheit fehlt, kommt zunächst, was den ersten Hauptpeak ergibt. Die 30S + S1 Fraktion gibt den zurückhängenden Peak (oder Schulter) und kann verworfen werden.
Wenn die S1 entfernt ist, können die Kristalle unter Verwendung geeigneter Bedingungen gebildet werden. Diese schließen die Verwendung von 13-17% vol/vol Methyl-2,4-pentandiol in der Gegenwart von 200-300 (z.B. etwa 250) mM KCl, 50-100 (z.B. etwa 75) mM Ammoniumchlorid, 15-30 (z.B. etwa 15 oder etwa 25) mM MgCl₂ bei einem pH von 6,3-7,5 (z.B. etwa pH 6,3-6,7 wie pH 6,5) in 50-150 (z.B. etwa 100) mM Natrium- oder Kaliumcacodylat oder MES (2-(N-morpholino)ethansulfonsäure) ein.
In einem besonderen Aspekt können die Bedingungen die Verwendung von 250 mM KCl, 75 mM NH₄Cl, 25 mM MgCl₂, 6 mM 2-Mercaptoethanol in 0,5 M Kaliumcacodylat oder 0,1 M MES (2-N-Morpholinoethansulfonsäure) bei pH 6,5 mit 13-17% MPD als das Fällungsmittel umfassen.
Die Kristalle können durch jedwedes bekannte Verfahren, das einem Fachmann bekannt ist, wachsen gelassen werden. Geeigneterweise können die Kristalle über einen Zeitraum von 4 bis 8 Wochen bei etwa 4°C wachsen gelassen werden. Die Struktur der derart erhaltenen Kristalle kann aufgelöst werden, und Kristalle, welche zu einer Auflösung von mindestens 3 Å auflösen, werden ausgewählt. Kristalle, welche zu einer Auflösung von etwa 3 Å auflösen, wie durch ein solches Verfahren erhältlich, sind ein weiterer Aspekt der Erfindung.
Verwendung der Struktur von Tabelle 1.
Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von 30S liefert eine Basis für die Gestaltung neuer und spezifischer Liganden für 30S. Mit Wissen der dreidimensionalen Struktur von 30S können Computermodellierungsprogramme verwendet werden, um verschiedene Moleküle zu gestalten, von denen erwartet wird, daß sie mit möglichen oder bestätigten aktiven Stellen wechselwirken, wie Bindungsstellen oder andere Struktur- oder funktionale Merkmale von 30S. Das hochaufgelöste Modell der 30S, wie durch Tabelle 1 bereitgestellt, kann verwendet werden, um das Binden von Antibiotika, von denen bekannt ist, daß sie auf diese Ribosomuntereinheit abzielen, zu überprüfen und zu bestimmen. Solche Antibiotika schließen Paromomycin, Streptomycin, Spectinomycin, Tetracyclin, Pactamycin und Hygromycin B ein.
Ein Kandidatenligand, insbesondere einer, welcher als ein Inhibitormolekül wirkt, kann jedwede erhältliche Verbindung sein. Eine Anzahl von kommerziellen Quellen von Bibliotheken von Verbindungsstrukturen sind beispielsweise die Cambridge Structural Data Base.
Solche Bibliotheken können verwendet werden, um ein computerbasiertes Screening mit hohem Durchsatz von vielen Verbindungen zuzulassen, um solche mit Potential zur Wechselwirkung mit der aktiven Stelle eines Ribosoms zu identifizieren. Insbesondere kann ein potentieller Ligand, der befähigt ist, die 30S Aktivität zu modulieren, durch die Verwendung einer Computermodellierung unter Verwendung eines "docking Programms" wie GRAM, DOCK oder AUTODOCK (siehe Walters et al., Drug Discovery Today, Vol. 3, Nr. 4, (1998), 160-178 und Dunbrack et al., Folding and Design, 2 (1997), 27-42) zur Identifizierung von potentiellen Liganden von 30S überprüft werden. Dieses Verfahren schließt das Computeranpassen von potentiellen Liganden an 30S oder einer Unterdomain davon ein, um zu bestimmen, wie gut die Form und die chemische Struktur des potentiellen Liganden an das Enzym binden wird.
Ebenso kann eine Computer-unterstützte manuelle Überprüfung der Struktur der aktiven Stelle von 30S durchgeführt werden. Es kann ebenso Verwendung von einem Programm wie GRID (Goodford, J.Med.Chem., 28, (1985), 849-857) – ein Programm, das mögliche Wechselwirkungsstellen zwischen Molekülen mit verschiedenen funktionalen Gruppen und der Enzymoberfläche bestimmt – gemacht werden, um die aktive Stelle zu analysieren, um Teilstrukturen von Liganden für die Stelle vorherzusagen.
Es können Computerprogramme verwendet werden, um die Anziehung, Abstoßung und sterische Hinderung der zwei Bindungspartner (z.B. die 30S und ein potentieller Ligand) abzuschätzen. Je enger die Anpassung, im allgemeinen desto geringer die sterische Hinderung, und je größer die Anziehungskräfte, desto stärker der potentielle Ligand, da diese Eigenschaften mit einer engeren Bindungskonstante konsistent sind. Je mehr Spezifität in der Gestaltung bzw. Design eines potentiellen Liganden, desto eher ist es, daß der Ligand nicht auch mit anderen Proteinen wechselwirkt. Dies tendiert dazu, potentielle Nebeneffekte aufgrund ungewollter Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu minimieren.
Nach Gestaltung oder Auswahl möglicher Bindungsliganden können diese anschließend bezüglich Aktivität überprüft bzw. gescreent werden. Infolgedessen umfaßt das Verfahren vorzugsweise die weiteren Schritte:
des Erhaltens oder Synthetisierens des potentiellen Ligandens und
des Inkontaktbringens des potentiellen Ligandens mit 30S, um die Befähigung des potentiellen Liganden zur Wechselwirkung mit 30S zu bestimmen.
Mehr bevorzugt wird in einem späteren Schritt der potentielle Ligand mit 30S unter Bedingungen in Kontakt gebracht, um dessen Funktion, beispielsweise in einem zellfreien Translationssystem zu bestimmen.
Statt oder zusätzlich zu dem Durchführen eines solchen Assays kann das Verfahren die weiteren Schritte umfassen:
des Erhaltens oder Synthetisierens des potentiellen Ligandens,
des Bildens eines Komplexes von 30S und dem potentiellen Liganden und
des Analysierens des Komplexes durch Röntgenstrahlkristallographie, um die Befähigung des potentiellen Ligandens zur Wechselwirkung mit 30S zu bestimmen.
Detaillierte Strukturinformation kann anschließend über das Binden des potentiellen Liganden an 30S erhalten werden, und im Lichte dieser Information könnten Einstellungen bezüglich der Struktur der Funktionalität des potentiellen Liganden gemacht werden, um beispielsweise das Binden an die aktive Stelle zu verbessern. Die Schritte c. bis e. können wiederholt und wiederum wiederholt werden, wenn erforderlich.
Die vorliegende hochaufgelöste Struktur von 30S liefert ein Mittel zum Bestimmen der Stelle der Bindung an Antibiotika sowie der Wechselwirkungen an die Stelle zwischen 30S und dem Antibiotikum. Solche Antibiotika schließen Paromomycin, Streptomycin, Spectinomycin, Tetracyclin, Pactamycin und Hygromycin B ein. Die hochaufgelöste Struktur von Tabelle 1 kann verwendet werden, um das Binden an 30S von diesen, anderen Antibiotika und anderen Liganden zu modellieren. Daher wird in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Analysieren eines 30S-Ligand (worin "Ligand" ein Antibiotikum einschließt)-Komplexes ein, umfassend die Schritte des (i) Co-kristallisierens der 30S mit dem Liganden oder Eintauchen des Liganden in Kristalle der 30S, (ii) des Sammelns von Röntgenstrahl-Kristallographiebeugungsdaten von den Kristallen des 30S-Ligand-Komplexes und (iii) des Verwendens der dreidimensionalen Struktur von 30S von Tabelle 1, oder mindestens einer Untereinheit davon, um eine Differenzfourier-Elektronendichtemappe des 30S-Ligand zu erzeugen, und (iv) des Modellierens des Liganden in der Differenzfourier-Elektronendichte.
Daher können 30S-Ligand-Komplexe kristallisiert und unter Verwendung von Röntgenstrahlbeugungsverfahren analysiert werden, beispielsweise gemäß dem Ansatz, beschrieben von Greer et al., J. of Medical Chemistry, Vol 37, (1994), 1035-1054, und Differenzfourier-Elektronendichtemappen können auf der Basis von Röntgenstrahlbeugungsmustern von eingetauchten oder co-kristallisiertem 30S und der gelösten Struktur von nicht-komplexierter 30S berechnet werden. Diese Mappen können anschließend verwendet werden, um die Struktur des Liganden, gebunden an die 30S, und/oder Änderungen der Konformation von 30S zu bestimmen.
Daten, erhalten von einem an 30S gebundenen Liganden können verwendet werden, um den Ligand zu verbessern, beispielsweise durch Zugeben oder Entfernen funktionaler Gruppen, Substituieren von Gruppen oder Ändern von dessen Form, um verbesserte Kandidaten zu erhalten, welche anschließend, gelöst im Komplex, wie zuvor hier beschrieben, in einem iterativen Prozess gescreent werden können.
Elektronendichtemappen können unter Verwendung von Programmen wie solche von der CCP4 Computing Package (Collaborative Computational Project 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, Acta Crystallographica, D50, (1994), 760-763) berechnet werden. Zur Mappenvisualisierung und Modellaufbau können Programme wie "O" (Jones et al., Acta Crystallography, A47, (1991), 110-119) verwendet werden.
Durch Bereitstellen solcher Computer-lesbarer Medien können die Atomkoordinatendaten routinemäßig abgerufen werden, um 30S oder eine Unterdomain davon zu modellieren. Beispielsweise ist RASMOL ein öffentlich erhältliches Computersoftwarepacket, welche Zugang und Analyse von Atomkoordinatendaten zur Strukturbestimmung und/oder rationalem Arzneimitteldesign erlaubt. Auf der anderen Seite sind Strukturfaktordaten, welche von Atomkoordinatendaten (siehe beispielsweise Blundell et al. in Protein Crystallography, Academic Press, New York, London und San Francisco, (1976)) ableitbar sind, zur Berechnung von beispielsweise Differenzfourier-Elektronendichtemappen besonders verwendbar.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung von Systemen, insbesondere von Computersystemen, die zur Erzeugung von Strukturen und/oder Durchführung von rationaler Arzneimittelentwicklung für 30S oder 30S-Ligand-Komplexe intendiert sind, wobei die Systeme entweder (a) Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1, wobei die Daten die dreidimensionale Struktur von 30S oder mindestens einer Unterdomain davon definieren, oder (b) Strukturfaktordaten für 30S, wobei die Strukturfaktordaten von den Atomkoordinatendaten von Tabelle 1 ableitbar sind, enthalten.
Mutantenstämme, die gegenüber der Wirkung dieser Antibiotika beständig sind, können durch Mutation einer Proteinuntereinheit der 30S oder durch Mutation oder Modifizierung in der 16S RNA (z.B. 2'O-Methylierung) oder Modifikation (z.B. Acetylierung) des Antibiotikums auftreten. Die Mutationsstellen sind in einigen Fällen bekannt oder können identifiziert werden. Wenn solche Stellen beispielsweise durch primäre Sequenzdaten identifiziert werden, liefert die vorliegende Erfindung ein Mittel, die Struktur der Mutanten zu modellieren.
Es wird somit ein Verfahren offenbart, welches das Bereitstellen der Struktur des 30S Ribosoms von Tabelle 1, das Ändern einer Aminosäure oder Nukleotidsäure der Struktur unter Bereitstellung einer mutanten 30S und des Modellierens der Struktur der mutanten 30S unter Bereitstellung einer Struktur des Mutanten umfaßt. Der Mutant kann in der vorstehenden Weise für den Wild-Typ verwendet werden, z.B. gespeichert in Computer-lesbarer Form, modelliert zur Bereitstellung von Liganden und dergleichen. Das Modellieren kann auf das vorhergesagte Verhalten der Atome der geänderten Aminosäure, basierend auf dessen Wechselwirkung mit den umgebenden Atomen, in dem hier bereitgestellten Modell basiert werden.
Dieser Prozeß kann iterativ sein, beispielsweise um nacheinanderfolgende Mutationen in der 30S Struktur, beispielsweise 2, 3, 4 oder 5 bis 10 Mutationen, zu erzeugen.
Regionen bzw. Bereiche der 30S, welche Gegenstand dieses Aspekts der Erfindung sind, schließen solche Bereiche ein, die in den beigefügten Beispielen als Bereiche der 30S, involviert in der Ribosomfunktion, identifiziert sind.
In einem weiteren Aspekt wird ein Mittel offenbart, um Elektronendichtemappen des gesamten 70S Ribosoms mit niedriger oder hoher Auflösung zu lösen oder zu interpretieren und somit die Struktur des gesamten 70S Ribosoms zu lösen.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur eines bakteriellen 70S Ribosoms offenbart, wobei das Verfahren umfaßt

(a) das Kristallisieren der 70S der Spezies unter Erhalten eines Kristalls;
(b) das Durchführen der Röntgenstrahlkristallographie an dem Kristall und Erhalten von Röntgenstrahlbeugungsdaten;
(c) das Bereitstellen der Strukturdaten von Tabelle 1; und
(d) das Verwenden von molekularem Austausch unter Berechnung einer Elektronendichtemappe der 70S.

Die Erfindung wird nachfolgend durch die folgenden Beispiele, deren beigefügten Figuren und Tabellen erläutert. In Tabelle 1 ist jede Atomreihenzahl gezeigt, jeder Elementtyp, Rest (Aminosäure; Nukleotid, etc.), Zahl im Molekül (für Proteine N bis C terminale Richtung, für Nukleinsäure 5' bis 3' Richtung), X, Y und Z Koordinaten, Belegung, B Faktor (Å²) und ein Identifikator für die Glieder der 30S (beispielsweise für die Untereinheiten in dem Format "ASn", worin A ein zufälliger Buchstabe ist, unterschiedlich für jedes Glied, S die Untereinheit ist und s die Untereinheitszahl ist; und für die 16S als "A16S").
Durch das beigefügte Beispiel hindurch verwenden wir das Zählsystem für E. coli 16S RNA sowie die Standardhelixnummerierung, bezeichnet H1-H45, für die Sekundärstrukturelemente [19] mit einigen Modifikationen, wie in 1 gezeigt. Die meisten signifikanten Unterschiede zwischen den E. coli und T. thermophilus Sequenzen sind eine kürzere H6 und H10 und Insertion in H9 und H33a. Jedwede Insertionen in T. thermophilus relativ zu E. coli sind in den Koordinaten mit einem Insertionsbuchstabe nach der Nukleotidnummer, folgend der Praxis für tRNA, angegeben.
MATERIALEN UND METHODEN
Kristallisation der 30S
Da wir beobachteten, daß den 30S-Kristallen das ribosomale Protein S1 vollständig fehlte, wurde darauf geachtet, S1 selektiv von der 30S vor der Kristallisation zu entfernen. Kristalle wurden in 13-17% MPD über einen pH-Bereich unter den durch Trakhanov et al [3] beschriebenen Salz- und Magnesiumbedingungen erhalten. Die Kristalle wurden am größten und am meisten reproduzierbar bei einem pH von 6,5 in 0,1 M Cacodylat oder MES-Puffer erhalten. Die Kristalle brauchten annähernd 6 Wochen bei 4°C, um auf ihre maximale Größe zu wachsen. Die größten Kristalle, welche für die hochaufgelöste Datensammlung benötigt wurden, wuchsen auf eine Größe von 80-100 × 80-100 × 200-300 Mikrometer. Die Aktivität von wiederaufgelösten Kristallen in Poly(U)-dirigierter Proteinsynthese war mit der von frisch isolierten 30S-Untereinheiten vergleichbar.
Datensammlung
Kristalle wurden durch Dampfdiffusion in zwei Schritten über eine Dauer von 6 Tagen zu 26% MPD transferiert. Alle Kristalle (außer solchen, welche mit Osmiumhexamin oder Osmiumpentamin durchtränkt waren) enthielten auch 1 mM Kobalthexamin im Kälteschutzmittel. Kristalle wurden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff blitzgekühlt und die Datensammlung wurde in einem Kältestrom bei 90-100 K durchgeführt.
Ein großer Teil von Kristallen wurde an den Strahllinien 9,6 oder 14,1 bei dem SRS bei den Daresbury Laboratories unter Verwendung zweier kurzer, mindestens 40°C auseinanderliegender Expositionen gescreent. Diese Kristalle wurden dann auf Beugungsgrenzen, Zelldimensionen und Mosaikverteilung analysiert. Nur Kristalle von ähnlichen Zelldimensionen und mit sinnvoller Mosaikverteilung wurden zur Datensammlung verwendet.
Potentielle Derivate wurden an den Strahllinien X25 bei dem NSLS im Brookhaven National Laboratories und BM-14 bei ESRF (Grenoble) gescreent. Daten bis etwa 4,5 Å wurden von X25 erhalten. Hochaufgelöste Daten wurden am SBC ID-19 am APS im Argonne National Laboratory und ID14-4 am ESRF gesammelt. In allen Fällen wurden Derivativdaten am Peak der Fluoreszenz an der LIII-Kante gesammelt, um anomale Differenzen zu maximieren. Am X25 und SBC ID-19 wurde der Kappa Goniostat verwendet, um präzise um eine Spiegelebene zu rotieren, so daß kleine anomale Differenzen akkurat gemessen werden konnten. Jeder Kristall lieferte typischerweise 3-10 Grad an Daten. Daten wurden unter Verwendung von HKL-2000 [10] integriert und skaliert.
Strukturbestimmung
Vorher bestimmte Phasen bei 5,5 Å [9] wurden verändert, um schwere Atomstellen unter Verwendung anomaler Differenzfourier-Mappen zu lokalisieren. Anfänglich wurden diese Stellen zum Inphasebringen auf 3,35 Å unter Verwendung des Programms SOLVE [11] verwendet, gefolgt von einer Dichtemodifikation mit SOLOMON [12] unter Verwendung der in SHARP [13] implementierten Prozedur. Es war eine Optimierung der verschiedenen Parameter in der Prozedur erforderlich, um interpretierbare Karten bzw. Mappen zu erhalten. Die RNA und einige der Proteine wurden unter Verwendung der SOLVE-Mappen aufgebaut. Es wurde die Sequenz von Thermus Thermophilus 16S RNA [14] für die Struktur verwendet. Für Proteine wurden eine Kombination von vorher veröffentlichten Sequenzen und neuen von dem Göttingen Thermusgenom Sequenzierungsprojekt verwendet. Verbesserte Karten bzw. Mappen wurden durch Berechnen experimenteller Phasen auf 3,2 Å unter Verwendung von SHARP, gefolgt von Dichtemodifikation und Phasenerweiterung auf 3,05 Å, mit DM [15] erhalten. Die verbesserten Karten erlauben uns sämtliche geordneten Teile der Struktur aufzubauen. Das Modell wurde unter Verwendung von O [16] aufgebaut und unter Verwendung des Programms CNS [17] verfeinert. Maximum-likelihood-Verfeinerung wurde verwendet, anfänglich mit beiden Amplituden und experimentellen Phasen der Wahrscheinlichkeitsverteilung auf 3,35 Å und nachfolgend mit Amplituden auf 3,05 Å.
ERGEBNISSE
Die 30S-Untereinheit von Thermus Thermophilus besteht aus einer 1522 Nukleotide 16S ribosomalen RNA [14] und 21 verbundenen Proteinen, von denen 20 bekannte Gegenstücke in E.coli aufweisen. Protein S21 liegt in Thermus nicht vor und Protein S1 wurde von der 30S vor unserer Kristallisation entfernt. Zusätzlich liegt in Thermus 30S-Untereinheiten ein 26-Reste-Peptid (Thx) vor [18].
Experimentelle in Phase gebrachte Mappen zeigten deutlich Hauptkettendichte für RNA und Protein, einzelne Basen (welche oft von ausreichender Qualität waren, um Purine von Pyrimidinen zu unterscheiden), und große wohlgeordnete Seitenketten von Proteinen. Diese Karten wurden verwendet, um 16S-RNA und die vorher unbekannten Proteine S2, S3, S9, S10, S11, S12, S13, S14 und Thx aufzubauen. Zusätzlich wurden ebenso Bereiche aufgebaut, welche in isolierten Strukturen ungeordnet waren oder sich signifikant verändert haben. Dies bestand häufig aus signifikanten Teilen der N- und C-terminalen Schwänze des Proteins, manchmal einschließlich gesamter Domänen, welche in Isolation entfaltet waren. Proteine mit kleinen Kernen und langen Schleifen, wie S16 und S17, mußten im Wesentlichen wieder aufgebaut werden, da diese Schleifen im Allgemeinen in den Lösungs-NMR-Strukturen ungeordnet vorlagen. Die gesamte Struktur wurde nach einem anfänglichen Durchlauf des Verfeinerns schließlich aufgebaut. Unser gegenwärtiges Modell besteht aus den Nukleotiden 5-1511 von Thermus Thermophilus 16S RNA (welches 5-1534 von E.coli 16S rRNA entspricht) und all den geordneten Bereichen der gebundenen 20 Proteine. Das gegenwärtige Modell wurde gegen 3,05 Å verfeinert mit einem konventionellen R-Faktor von 0,213, einem freien R-Faktor von 0,256 und guter Geometrie. Für die Proteine waren 94% der Reste im Kern oder erlaubten Bereichen des Ramachandran Plots, 3,9% im großzügig erlaubten Bereich und 1,8% im verbotenen Bereich.
16S RNA
Die Sekundärstruktur von 16S ribosomaler RNA enthält 45 Doppelhelices, welche durch kurze einsträngige Segmente verbunden sind. In der Kristallstruktur sind viele dieser Helices koaxial mit einer benachbarten Helix in der Sequenz gestapelt. Es gibt 13 Gruppen von koaxial gestapelten Helices und 23 ungestapelten Helices in 16S rRNA, mit einer Gesamtzahl von 36 helicalen Elementen. Es gibt 3 unterschiedliche Typen von Helix-Helixpackung. Die meisten der helicalen Elemente sind in einer kleine-Furche-an-kleine-Furche-Art gepackt, welches häufig Verzerrungen von der kanonischen A-Form helicaler Geometrie in einer der beiden Helices erfordert. Adenosine von internen Schleifen oder Haarnadelschleifen vermitteln häufig das Andocken gegen eine Doppelhelix einer A-Form, wobei ein dichtes Netzwerk von Base-2'OH und 2'OH-2'OH-Wasserstoffbindungen die Packung stabilisiert. Weniger häufig tritt die Helix-Helix-Packung in einem anderen Modus auf, durch Einführung eines Phosphatrückens in eine komplementäre kleine Furche einer anderen Helix. Dieser Packungsmodus wird durch Wasserstoffbindungen zwischen dem Rücken von Phosphatsauerstoffen und einer Ebene von 2'OH und Guaninbasen NH₂-Gruppen stabilisiert. Diese Guanin N2-Gruppen werden häufig durch die Geometrie von G-U Paaren zugänglicher gemacht, was diese Gruppe weiter in die kleine Furche platziert als Watson-Crick-Paare dies tun. Schließlich verwendet der seltene End-on-Modus von interhelicaler Packung eine Purinbase, um das senkrechte Packen einer Helix gegen die kleine Furche einer weiteren Helix zu vermitteln. Alle drei Modi der Helix-Helix-Packung werden weiter durch idiosynkratische Wechselwirkungen zwischen doppel-helicaler RNA und kurzen nicht-helicalen RNA-Segmenten stabilisiert. Häufig wurde gefunden, daß kleine Ausbauchungen von einer bis drei Nukleotiden entweder zwischen Helices oder in die große Furche einer Helix packten.
Die 5'-Domäne (fpd)
Die fpd von 16S RNA enthält 19 Doppelhelices, angeordnet als 7 Gruppen von koaxial gestapelten Helices und 5 ungestapelten Helices, mit einer Gesamtzahl von 12 doppelhelicalen Elementen, welche eng zusammengepackt sind. Das Ergebnis ist eine keilförmige Masse von RNA, welche sich zu einer Einzelschicht von Doppelhelices nahe des oberen Teils der Domäne verjüngt. Wie die anderen Domänen ist die fpd eher länger entlang der Untereinheitsgrenzfläche als in der senkrechten Richtung.
Die fpd kann in drei Unterdomänen aufgeteilt werden, welche grob im oberen, unteren und mittleren Drittel der Sekundärstruktur der fpd entsprechen. Diese Untereinheiten bilden die obere und linke, die mittlere, bzw. die untere rechte Seite des Körpers aus der Sicht von 50S. Die obere Unterdomäne ist eine nahezu Planare Anordnung von 4 helicalen Elementen (H16/H17, H4/H5, H1/H3 und H18). Der H16/H17-Stapel bildet die linke Grenze des Körpers, aus Sicht von 50S. Dieser Stapel ist beinahe 120 Å lang, wobei H16 Kontakt mit dem Kopf aufnimmt und H17 den unteren Teil der Untereinheit erreicht. Interne Schleifen in beiden Helices enthalten S-Windungen, welche im Falle von H17 verwendet werden, um die Position des Phosphat-Rückgrats zu modulieren, oder im Falle von H16 eine erweiterte kleine Furchenoberfläche für eine Helix-Helix-Andockung zu erzeugen. Der H4/H15-Stapel zeigt auch den unteren Teil der Untereinheit, wobei H15 gegen H17 gut gepackt ist. Der H1/H3-Stapel ist durch die konservierte Ausbauchung an Position 30 gebogen, was darin resultiert, daß das proximale Ende horizontal ist und das terminale Ende nach oben zum Kopf zeigt. Das vierte helicale Element H18, welches scharf gebogen ist, um den 530-Pseudoknoten zu beherbergen, welcher durch die ungestapelten Helices 505-507/524-526 (H18,2) und 521-522/527-528 (H18,1) definiert ist. H18 ist gut gepackt zwischen die anderen zwei nach oben zeigenden Elemente der oberen Untereinheit H1/H3 und H16. Der 530-Pseudoknoten ist gegen den zentralen Pseudoknoten an der H18,1-H1 Grenzfläche gepackt.
Die mittlere Untereinheit enthält vier helicale Elemente (H5, H6, H12/H6A und H13/H14), welche eine Ebene zwischen der oberen und unteren Unterdomäne im Zentrum des Körpers bilden. Es gibt relativ wenige Packungswechselwirkungen innerhalb der Untereinheit und mehrere seiner Helices packen gegen die obere Untereinheit auf einer Seite und der unteren Untereinheit auf der anderen. Daher packt am unteren Teil der Untereinheit die konservierte Wurzel von H6 gegen H8 (untere Unterdomäne) auf einer Seite und H15 (obere Unterdomäne) auf der anderen Seite. Auf ähnliche Weise packt H12/H6A gegen H4 (obere Unterdomäne) und H7 (untere Unterdomäne). H12/H6A packt auch gegen H5 und die 117-Schleife, welche gegen Elemente der oberen bzw. unteren Unterdomäne packt. H5 ist gut gepackt gegen H15 und die 117-Schleife stapelt mit der Wurzel von H11. H5 packt auch gegen den H13/H14 Stapel in der Phosphatrücken-kleine-Furche-Art. H13/H14 wechselwirkt mit zwei unterschiedlichen Bereichen der unteren Unterdomäne. Die konservierte UACG Haarnadelschleife am Ende von H14 packt gegen die 160 GAAA Haarnadel von H8, während die große konservierte Haarnadel am Ende von H13 mit H7 wechselwirkt. Diese Haarnadelschleife weist auch viele Wechselwirkungen mit Elementen der mittleren Subdomäne auf.
Die untere Subdomäne ist eine Sammlung aus drei helicalen Elementen, welche eine offene sattelförmige Struktur in der unteren rechten Ecke des Körpers bilden. Der H8/H9-Stapel erstreckt sich von dem hinteren Teil der Untereinheit zum vorderen Teil, wobei die konservierte 160 GAAA Haarnadel zur 50S Untereinheit zeigt. Sie packt leicht gegen den H7/H10-Stapel an der 4-Wege-Kreuzung, welche sich mit ihnen verbindet, und wieder bei einer Thermus-spezifischen Wechselwirkung zwischen Einfügungen bei den Nukleotiden 190 und 129. Der H7/H10-Stapel weist ebenso schwache Wechselwirkungen mit H15 und H17 der oberen Unterdomäne im unteren Teil der Untereinheit auf. H11 enthält zwei scharfe Biegungen, welche seiner konservierten terminalen Haarnadelschleife erlauben, gegen H7 zu packen. Beide Biegungen werden durch kleine-Furche-an-kleine-Furche Packungskontakte kurzer Reichweite stabilisiert.
Die Zentraldomäne (cd)
Die cd ist die RNA-Komponente der Plattform. Seine auf unserer vorherigen 5,5 Å Struktur [9] basierenden Faltung ist in exzellenter Übereinstimmung mit unserer gegenwärtigen Struktur. Sie enthält 9 helicale Elemente, welche in eine W-Form aus Sicht der 50S gefaltet sind. Zwei lange einzelsträngige Segmente von RNA, die 570 und 820 Schleifen, sind auch wichtige Strukturelemente. Die Domäne wird durch die langen Stapel von H21/H22/H23 dominiert, welche den U-förmigen Umkreis der Domäne bildet. H21 ist die einzige Komponente des linken Arms des Ws, während H22 und H23 die Basis der rechten Seiten bilden. Der rechte Arm des Ws besteht aus H23B und H24A, deren konservierte Haarnadelschleifen eng gepackt sind. Diese Anordnung erfordert scharfe Biegungen zwischen H23 und H23B und zwischen H24 und H24A. Die H23/H23B Biegung wird durch kleine Furche-kleine Furche Packungswechselwirkungen kurzer Reichweite stabilisiert. Die H24/H24A Biegung ist ungewöhnlicher darin, dass die Biegung gegen die große Furche verläuft, welche einen Rücken von H24A-Phosphaten in die große Furche von H24 platziert. Diese große-Furche Biegung wird teilweise durch Base-Base und Base-Rückgratwechselwirkungen kurzer Reichweite in der großen Furche der Biegung, und teilweise durch Wechselwirkungen großer Reichweite zwischen der gebogenen H24/H24A kleinen Furche und der kleinen Furche von H23 stabilisiert. Das Herz der zentralen Domäne ist der dickere Mittelarm des Ws, welcher sechs helikale Elemente (H20, H19/H25, H24, H26/H26A, H27, und H23B) und die 570 und 820 Schleife enthält. Auf der linken Seite des Arms packt der H26/H26A Stapel eng gegen H22, die Basis von H25, und die 570 Schleife. Der H25/H19 Stapel packt gut mit H20 und mit der 570 Schleife. Auf der rechten Seite des mittleren Arms des Ws packt H23A gut mit H22, die 820 Schleife stapelt auf H24 und H24 packt gut mit der konservierten GCAA Haarnadelschleife von H27. Im Zentrum des Arms packt H23A mit H26 in der Art Phosphatrückgrat-kleine Furche, und die konservierte H23A GAAG Haarnadelschleife packt gegen H20. Die 820 Schleife wechselwirkt auch mit H20, H25 und der 570 Schleife.
Die 3' Hauptdomäne (tmd).
Die 3' Hauptdomäne (tpd) ist die RNA Komponente des Kopfes der 30S Untereinheit. Aus Sicht der 50S verjüngt sich die linke Seite des Kopfes in einen Schnabel, welcher auf der 50S Seite aus RNA und auf der Lösungsmittelseite aus Protein besteht. Wie die anderen Domänen ist die tpd in der zu der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten senkrechten Richtung relativ dünn. Die tpd besteht aus 15 helikalen Elementen, von denen die meisten nicht auf eine benachbarte Helix stapeln, im Gegensatz zu dem ausgedehnten Stapeln von benachbarten Helices wie in fdp und der Zentraldomäne gesehen. Die tpd kann in drei Unterdomänen aufgeteilt werden, welche dem oberen, mittleren und unteren Teil der tpd Sekundärstruktur entsprechen. Die obere Unterdomäne ist eine im von der 50S Untereinheit am weitesten entfernten Teil des Kopfes ausgedehnte Struktur, und weist relativ wenige Packungskontakte mit RNA von den anderen Kopfunterdomänen auf. Die untere und mittlere Unterdomäne sind kugelförmiger und inniger zusammengepackt und bilden den vorderen rechten bzw. vorderen linken Teil des Kopfes. Die mittlere Unterdomäne schließt den RNA Teil des Schnabels ein.
Die obere Unterdomäne enthält drei helikale Elemente, welche eine gut getrennte Struktur der Lösungsmittelseite des Kopfes bilden. Die Unterdomäne wird durch den H35-H36-H38-H39 Stapel dominiert, welcher sich vom oberen zum unteren Teil des Kopfes erstreckt. Die anderen zwei helikalen Elemente der Unterdomäne sind H37 und H38, welche gut miteinander und lose mit dem H35-H36-H38-H39 Stapel packen. Der H37-H40 Stapel wird durch eine semikonservierte GAAA hp in H40 mit benachbarten G-C Paaren in H37 vermittelt.
Die kleinere mittlere Unterdomäne ist ausgedehnt und enthält nur vier helikale Elemente, H32, H33/H33A, H33B und H34. Zwei von diesen (H33/H33A und H33B) bilden Y-förmige RNA Komponente des Schnabels. Der H33/H33A Stapel zeigt aus Sicht der 50S nach links, während H33B nach rechts zeigt, wobei seine terminal konservierte GNRA Haarnadelschleife gegen H32 gepackt ist, die kovalente Verbindung zwischen dem Schnabel und der unteren Unterdomäne. H32 packt im Gegenzug gegen die H33-H34 Kreuzung als auch die 980 Schleife in der unteren Unterdomäne. Mit Ausnahme einer kleinen Packungswechselwirkung mit H32 weist die unregelmäßige H34 nur langweitreichende und etwas lose Packungswechselwirkungen auf. Die erste ist mit H31 der unteren Unterdomäne, eine ungewöhnlich schwache kleine Furche-an-kleine Furche Packung. Die zweite Wechselwirkung ist eine ungewöhnliche end-on Packungswechselwirkung mit der kleinen Furche der H34/H35/H38 Kreuzung in der oberen Unterdomäne.
Die untere Unterdomäne enthält beinahe die Hälfte der tpd RNA und enthält sieben helikale Elemente (H28/H29, H30, H31/980 Schleife, H41, H41A, H42 und H43) welche innig in eine kugelförmige Masse gepackt sind. Helices 42 und 43 sind in einer annähernd parallelen Art im Zentrum der Faltung angeordnet, und jedes wechselwirkt mit mindestens drei der anderen helikalen Elemente. Helices 42 und 43 docken mittels einer kleinen Furche-an-kleine-Furche Packung ihrer konservierter Haarnadelschleifen zusammen. Auf der Lösungsmittelseite des H42/H43 Paars packt H41 mit jeweils H42 und H43, während die terminale GCAA Haarnadelschleife von H41A gegen H42 packt. Diese Anordnung erfordert eine scharfe Biegung zwischen H41 und H41A, deren kleine Furchen in der Biegung gegeneinander packen. Die H43-H41 Packung wird durch eine unterwundene A-reiche innere Schleife in H41 ausgedehnter gemacht. Auf der 50S Seite des zentralen H42/H43 Paars sind H29, H30, H31 und die 980 Schleife. H43 ist gut gepackt mit H29 und weist schwächere Wechselwirkungen mit H30 und der 980 Schleife auf, während H42 mit H30 und der 980 Schleife gut gepackt ist. Die H42-H30 Packung wird durch aufeinanderfolgende konservierte G-A Paare an der Basis H42 vermittelt. H43-H29 Packung wird durch eine konservierte S-Windung an der Basis von H43 vermittelt. Eine S-Windung vermittelt auch die Packung von H42 mit H41. H31 ist ein peripheres Element der Unterdomäne, welches nur mit H30 gut packt, aber auch mit H34 von der mittleren Unterdomäne packt.
Die 3' kleinere Domäne.
Die 3' kleinere Domäne besteht aus nur zwei Helices an der Untereinheitsgrenzfläche. H44 ist die längste einzelne Helix in der Untereinheit und erstreckt sich von dem unteren Teil des Kopfes zum unteren Teil des Körpers. Es ragt vorstehend zur Wechselwirkung mit der 50S Untereinheit aus dem Körper. H45 ist annähernd senkrecht zu H44, mit seiner konservierten GGAA Haarnadelschleife gegen H44 gepackt und verfügbar zur Wechselwirkung mit der großen Untereinheit.
PROTEINE IN DER 30S UND IHRE WECHSELWIRKUNG MIT DER 16S RNA
Die gegenwärtige Struktur schließt alle der 30S Proteine außer S1 ein. Proteine bestehen im Allgemeinen aus einer oder mehreren gefaltenen Domänen, von denen etwa die Hälfte von vorherigen Arbeiten an isolierten Proteinen bekannt waren. Nahezu alle der Proteine enthalten jedoch ausgestreckte Termini oder Schleifen, welche innig mit RNA wechselwirken und ungeordnet in den isolierten Strukturen waren. Obwohl die meisten der Proteine innigen Kontakt mit ribosomaler RNA bilden, gibt es auch Protein-Protein Wechselwirkungen wie die in den S4-S5-S8 und S3-S10-S14 Clustern gesehenen.
Proteine in der zentralen Domäne (S18, S11, S8, S15).
S18: S18 besteht in der 30S aus den Resten 19-88. Es besteht aus zwei Helices und einem dritten helikalen Element, welches durch zwei kurze Windungen von unterschiedlichen Teilen der Struktur gebildet wird, welche Ende an Ende stapeln. Diese Helices bilden zusammen einen hydrophoben Kern. Der C-Terminus wechselwirkt mit S11.
S11: S11 ist eine Struktur und besteht aus zwei Helices, welche gegen ein Blatt packen, ein Typ von Faltung, welcher in vielen ribosomalen Proteinen gesehen wird. Das Blatt packt gegen die kleine Furche der 690 Schleife (H23) und weist eine C-terminale Ausdehnung auf, welche mit dem C-terminalen Ausdehnung von S18 und mit der 790 Schleife (H24) wechselwirkt. Daher stabilisiert S11 durch Binden an jeweils H23 und H24 nahe der Spitze der Plattform das Falten der Plattform.
S8: S8 bindet nahe der H20/H21/H22 Dreiwege-Kreuzung und geht ausgedehnte Wechselwirkungen mit H21 und H25 ein. Wir haben nun molekulare Details dieser Wechselwirkungen. Insbesondere wickeln sich zwei Schleifen von S8 (87-92 und 112-118) um die ausgebauchten Basen 641-642, von denen bekannt war, dass sie für das Binden mit S8 mit hoher Affinität erforderlich sind [20, 21]. Der Endterminus des Proteins packt auch gegen die kleine Furche des 825 Stamms (H25), wodurch er dem Falten der zentralen Domäne hilft. Die Reste K55 auf S8 und 653 auf RNA befinden sich nebeneinander, wie von quervernetzten zu erwarten wäre [22]. Die Erweiterung in Thermus S8 der Schleife 69-76 packt gegen S2 von einem symmetrieverwandten Molekül.
S15: S15 bindet zwischen H20 und H22 nahe der Dreiwege-Kreuzung.
Die 5' Domäne bindende Proteine S17, S16 und S20.
S17: Obwohl zunächst angenommen wurde, dass es ausschließlich 5' Domäne bindendes Protein sei, bindet S17 auch nahe der H20/H21/H22 Dreiwege-Kreuzung. Vom Kern von S17 ist durch NMR bekannt, dass er ein β Fass mit einer OB-Faltung mit lang ausgestreckten Schleifen ist [23]. Diese Schleifen sind in Lösung ungeordnet, aber binden in 30S RNA. In Thermus liegt eine lange C-terminale Ausdehnung zu S17 vor, welche als eine RNA-bindende Helix organisiert ist. Der Kern des Proteins und die C-terminale Helix weisen ausgedehnte Kontakte mit H11 auf und kontaktieren auch H7. Die C-terminale Helix kontaktiert auch H21 in der zentralen Domäne. Zwei lange Schleifen, Schleife 1 (26-36) und Schleife 2 (60-71), sind geordnet und wechselwirken mit ungleichen Domänen von RNA exakt wie vorhergesagt. Schleife 1, welche die Stelle von Neaminresistenz, ist zwischen H21 und einer höchst unregelmäßigen Struktur an der Basis von H11 eingefügt. Die äußerste Spitze von Schleife 1 berührt auch die 560 Schleife von 16S RNA. Schleife 2, welche die Stelle eines mutierten Defekts in der Zusammenlagerung enthält, ist in das Zusammennähen von H7 und H11 verwickelt. Daher wechselwirkt S17 mit H7, H11 und der 560 Schleife in der 5' Domäne und H21 in der zentralen Domäne.
S16: Für ein kleines Protein weist S16 einen ausgedehnten Fussabdruck durch die 5' Domäne hinweg auf. Alle Reste (1-80) sind in der Elekrodendichte sichtbar und wurden unter Verwendung einer NMR Struktur [24] als ein Anhaltspunkt wieder aufgebaut. Das Protein besteht aus einem N-terminalen Blatt mit zwei ausgedehnten Schleifen und zwei kurzen Helices im C-terminalen Ende. Alle der ausgedehnten Kontakte mit 16S RNA sind nun klar. Das β-Faltblatt ist zwischen der internen 608/620 Schleife von H21 auf der einen Seite und einer kleinen Furche von H4 auf der anderen gepackt. Die zwei Schleifen, welche sich von diesem Blatt ausstrecken, wechselwirken beide mit RNA. Schleife 1 wechselwirkt mit Phosphaten in der großen Furche von H4, während Reste 39-43 in Schleife 2 Kontakt mit dem Phosphatrückgrat um die interne Schleife nahe 453 in H17 aufnehmen. Die erste Helix (53-61) erstreckt sich auch über die große Furche dieser internen Schleife, während das C-terminale Ende der zweiten Helix zusammen mit der Windung, welche aus ihr herausführt, in eine kleine Furche von H17 weisen. Es gibt auch Wechselwirkung mit der 110 Schleife der 5' Domäne. Schließlich liegt der ausgedehnte C-Terminus über der kleinen Furche der Spitze von H17.
S20: Die gegenwärtige hochaufgelöste Struktur von S20 zeigt, dass die lange N-terminale Helix die Basis von H6 und die Spitze von Helix 44 kontaktiert, und viele konservierte basische Reste Salzbrücken mit Phosphaten eingehen. Helices 2 und 3 von S20 wechselwirken mit der kleinen Furche von H9, und Helix 3 wechselwirkt auch mit der Spitze von H11 (263). Schließlich ist der äußerste C-Terminus des Proteins ausgestreckt und liegt entlang der kleinen Furche von H9, welche in Thermus um 11 Nukleotide länger ist. Daher bringt S20 mehrere Helices nahe dem unteren Teil der Untereinheit zusammen.
Proteine nahe des funktionellen Zentrums
S4, S5 und S12 bilden eine Gruppe bzw. einen Cluster nahe des "funktionellen Zentrums" des Ribosoms und enthalten die Stellen verschiedener wichtiger Mutationen.
S4: In der Struktur von isoliertem S4 [25, 26] wurde die N-terminale Domäne vor der Kristallisation abgespalten. Dieser N-terminale Bereich ist als eine eng gefaltete Domäne mit einem Metallion (vermutlich Zink), welches durch vier Cysteine koordiniert ist, organisiert. Die Domäne ist gegen Körper des Protein gepackt. Während der N-Terminus von S4 hochkonserviert ist, sind die Cysteine ihrerseits dies nicht. Es ist daher wahrscheinlich, daß die Zugabe eines „Zink"-Fingers vielmehr zur zusätzlichen Stabilität als für die Faltung wesentlich ist. Die Linker-Reste 46-52 verbinden die N-terminale Domäne mit dem Rest des Protein. Sämtliche Domänen von S4 gehen innige Kontakte mit RNA ein. Insbesondere geht S4 ausgedehnte Kontakte mit einer Fünfwege-Kreuzung ein, wobei H3, H4, H16, H17 und H18 in der 5' Domäne zusammenkommen.
Die N-terminale Domäne ist gegen die 420 Stammschleife (H16) gepackt. Die zum größten Teil helikale Domäne I ist gegen einen komplizierten Bereich von RNA gepackt, wobei H3 und die 507 Ausbauchung an der Basis von H18 zusammenkommen. Die verbleibende Domäne von S4 stellt ausgedehnten Kontakt mit der kleinen Furche der Basis von H16 her. Zusätzlich stellt sie auch Kontakt mit der Spitze von H21 her, welche selbst gegen H4 gepackt ist. Diese Position ist konsistent mit der großen Menge biochemischer Daten über an 16S RNA bindendes S4.
Der C-Terminus von S4 bildet eine ausgedehnte Grenzfläche mit S5. Die meisten der bekannten Mutationen von S4 und S5, welche an den ram Phänotyp erinnern, sind in dieser Region bzw. diesem Bereich lokalisiert [27, 28]. Die Grenzfläche besteht aus verschiedenen höchst konservierten Salzbrücken und einige der Mutationen brechen eine oder mehrere dieser Wechselwirkungen.
S5: Die Struktur von S5 zeigt, dass die Schleife von den Resten 14-28 auf den Körper des Proteins in der isolierten Struktur zurückgefaltet ist, aber eine voll ausgestreckte β-Haarnadel in der 30S ist. Ebenso ist der C-Terminus von S5, welcher in der isolierten Struktur ungeordnet ist, hauptsächlich helikal und packt gegen eine komplizierte Oberfläche von S8, welche durch viele verschiedene Stränge gebildet wird.
S5 wechseltwirkt eng mit einem Bereich des Ribosoms, an dem der Kopf und der Körper zusammenkommen. Im Kopf packt die ausgedehnte H35/H36 Helix gegen H28, welche den Hals der den Körper mit dem Kopf verbindenden 30S bildet. Die Spitze von H36 stellt Kontakt mit H26a, H2 und den zentralen Pseudoknoten in dem Körper her. Protein S5 weist Kontakte überall in diesem Bereich auf und stabilisiert dadurch die Konformation des Kopfes mit bezug auf den Körper.
Das C-terminale Blatt von S5 stellt ausgedehnte Wechselwirkungen mit der großen Furche bzw. Höhle von H1 und dem zentralen Pseudoknoten her. Die N-terminale Domäne bindet an die große Furche von H36, wie dies auch die Basis der β-Haarnadel tut. Die Spitze der Haarnadel wechselwirkt mit dem Phosphatrückgrat in H28 und ist auch sehr nah an H34. Nukleotid 560 ist sehr nah an K121 in Übereinstimmung mit Vernetzungsdaten.
Die meisten der ausgedehnten Wechselwirkungen mit RNA ereignen sich über große Furchen oder das Phosphatrückgrat.
S12: S12 ist jeweils für seine Struktur und seinen Ort ungewöhnlich. Es ist darin einzigartig unter den 30S Proteinen, dass es sich auf der Grenzflächenseite der Untereinheit befindet. Sein zentraler Kern besteht aus einem b-Fass mit einer OB-Faltung, einem Merkmal, welches in anderen Proteinen wie S17 gefunden wird. Dieser Kern bindet H18, die 530 Stammschleife (an der Spitze von H18), H3 und einen Teil von H44 nahe der Entschlüsselungsstelle zusammen. Ein ungewöhnliches Merkmal ist eine lange Ausdehnung, welche diesen Kern mit einer kurzen Helix am N-Terminus des Proteins verbindet. Diese Verbindung windet sich zwischen der 560 Schleife und H12 auf der einen Seite und H11 auf der anderen hindurch, um Kontakt mit jeweils S8 und S17 auf der anderen Seite der 30S herzustellen.
S12 ist außerdem das einzige Protein in der Nähe der Dekodierungsstelle nahe 1492-1493 der RNA. Es ist die Stelle einer Zahl von funktionell interessanten Mutationen.
Die Kopfproteine S7 und S9.
S7: Von Protein S7, dessen Struktur in Isolation vorher bekannt war, ist bekannt, dass es entscheidend für das Zusammenlagern des Kopfes ist [29]. In unserer 30S Struktur ist die gesamte Sequenz sichtbar, einschließlich dem sehr basischen Endterminus. S7 bindet an einen kleinen, aber komplexen Bereich des tpd, welcher zwei Mehrfachstammkreuzungen an einer Ecke des Kopfes umfaßt. Die Mehrheit der Wechselwirkungsoberfläche besteht aus H29, welches eng an die S-Windung an der Basis von H43 angedockt ist. Dieses Andocken erfordert eine enge Windung bei 1346, wahrscheinlich durch S7-Bindung stabilisiert. Da S7 auch Wechselwirkungen mit H28 eingeht, umfaßt seine primäre Wechselwirkungsoberfläche alle drei Helices um die H28/H29/H43 Dreiwege-Kreuzung. Das sehr enge Andocken von H29 an H43 bewirkt einen kleinen Bereich sehr hoher negativer Ladungsdichte, welcher durch eine Oberfläche von S7 mit sehr hoher Konzentration von positiver Ladung (hauptsächlich S7 Helices 1 und 4) gebunden ist.
Die zweite wichtige Wechselwirkungsoberfläche ist zentriert auf der zweiten Mehrfachstammkreuzung, welche S7 bindet, der H29/H30/H41/H42 Kreuzung. In dieser Kreuzung sind H30 und die Basis von H42 eng zusammengepackt, mit einer engen Windung zwischen ihnen. Eine S-Windung zwischen den Helices 41 und 42 vermittelt das Packen von H41 und H42, welche auch eine enge Windung zwischen sich aufweisen. H41 packt auch sehr eng gegen H43. S7 stellt Kontakt mit dem Phosphatrückgrat von H41 her, stabilisiert seine Packung mit H43 und an die Reste um 1240 und 1298, wobei die engen Biegungen in der H29/H30/H41/H42 Kreuzung auftreten. Kontakte mit U1240 sind insbesondere innig: die universell konservierte Ausbauchung U1240 ist tief in einer konservierten hydrophoben Tasche zwischen den 35 und 115 Schleifen von S7 eingegraben.
Die β-Haarnadel ist nicht eng mit 16S RNA verbunden, aber paßt wahrscheinlich eng in die kleine Furche der E-Stelle tRNA. Die Struktur ist in grober Übereinstimmung mit einem Modell von S7, welches an ribosomale RNA bindet [30], aber es gibt auch signifikante Unterschiede, einschließlich des Ortes von H43.
S9: S9 besteht aus einer kompakten RNA-bindenden Domäne, bestehend aus zwei Helices, die gegen ein fünfsträngiges Blatt gepackt sind, mit einer dritten kurzen Helix am C-terminalen Ende der Domäne. Von dieser Domäne geht ein langer, 25-Reste C-terminaler Schwanz aus, welcher sich in Elemente der Kopf RNA schlängelt. S9 wechselwirkt auch mit S7 über einen kleinen hydrophoben Fleck.
Das Blatt von S9 geht ausgedehnte Wechselwirkungen mit H38 und H39 ein. Es weist auch zwei Schleifen auf, welche mit der internen 1250 Schleife von H41 wechselwirken. Die kurze C-terminale Helix wechselwirkt mit 1177-1180 in H40.
Die lange C-terminale Ausdehnung schlängelt sich zwischen der H29-H43 Kreuzung auf der einen Seite und der H38-H34 Kreuzung auf der anderen, um einen Teil von H31 zu berühren.
Der S3 S10 S14 Cluster
Diese drei Proteine bilden eine Gruppe bzw. einen Cluster auf der hinteren linken Seite des Kopfes, als der Proteinteil des Schnabels. S3 ist klar oben auf die anderen zwei Proteine gestapelt, was konsistent mit der Reihenfolge der Zusammenlagerung ist.
S14: S14 ist in einen Spalt in der RNA angebunden und ist größtenteils durch S3 und S10 bedeckt. Fast das gesamte Molekül ist mit RNA in Kontakt, einschließlich Helices H31, H32, H34, H38 und H43. Ein quervernetzter Rest ist in Nahbereich der RNA 28. S14 enthält ein Zinkion, welches durch vier Cysteine eines CXXC-X12-CXXC-Motives koordiniert ist. Diese Motiv ist strukturell ähnlich dem, welches im Zinkfinger des glucocorticoiden Rezeptors gebunden ist. Dieses Zink-bindende Motiv ist nicht unter allen Bakterien konserviert, obwohl viele der Reste, welche dies umringen, es sind, was vielleicht nahelegt, dass in anderen Organismen das Protein über einen hydrophoben Kern faltet.
S10: S10 ist strukturell sehr ähnlich der S6-Faltung, wobei zwei Helices gegen ein viersträngiges Blatt gepackt sind. Zwei der Stränge in dem Blatt sind über eine lange β-Haarnadel verbunden, welche sich von dem Blatt ausstreckt und direkt in das Zentrum der Kopf RNA Faltung eingefügt ist. Die β-Haarnadel stellt die meisten der Kontakte mit RNA her, einschließlich Helices H31, H34 und H41. Die zwei Stränge des Blattes packen in die flache kleine Furche von H39, wobei sie Kontakt mit den Rückgratresten auf beiden Seiten der Furche herstellen.
S3: S3 enthält zwei Domänen, wobei beide aus zwei Helices, welche gegen ein viersträngiges Blatt gepackt sind, bestehen, was ähnlich mehreren anderen ribosomalen Proteinen ist. Zusätzlich zu den Domänen gibt es einen N-terminalen Schwanz (von dem alles sichtbar ist). Die C-terminalen 30 Reste sind kaum konserviert und ungeordnet in der Struktur.
RNA Kontakt wird durch den N-terminalen Schwanz und die C-terminale Domäne hergestellt. Der N-terminale Schwanz paßt in eine große Furche von H34. Das Blatt in der C-terminalen Domäne packt auch gegen H34.
Die N-terminale Domäne stellt, wenn überhaupt, wenige Kontakte mit der RNA her, aber ist hauptsächlich in das Herstellen von Proteinkontakten mit S10 und S12 verwickelt.
S13 und S19
S13 und S19 bilden ein loses Dimer an der ganz „obersten Stelle" der Grenzflächenseite des Kopfes, wobei sich beide nach oben und näher an die 50S als jede der Kopf RNA erstrecken. Trotz ihres Ortes in diesem flexiblen Bereich sind beide relativ in der Elektronendichte gut definiert. Außer dem C-terminalen Schwanz von S13, welcher in den Kopf reicht und beinahe den Schwanz von S9 berührt, sind keine dieser Proteine in Kontakt mit einem anderen der Proteine in der kleinen Untereinheit. Zusammen mit S12, S11 und S15 sind diese unter den wenigen Proteinen, die den Bereich von Kontakt zwischen Untereinheiten umringen.
S13: Alle 125 Reste von S13 sind in der Struktur sichtbar. Der N-Terminus (etwa 60 Reste) bildet eine kompakte Domäne, bestehend aus drei kleinen Helices. Von dieser Domäne ist nur eine kleine Schleife in Kontakt mit der RNA, und die Domäne erscheint aufgrund ihres äußerst ausgestreckten C-terminalen Bereichs an der Untereinheit zu haften. Dieser Bereich beginnt mit einer langen, geraden Alpha-Helix, welche entlang des oberen Teils des 30S Kopfes zu S19 kriecht. Er wechselwirkt hauptsächlich mit der 1300 Schleife und H42. An diesem Punkt biegt sich die Polypeptidkette um etwa 90 Grad, und dem Rest des Proteins fehlt größtenteils jede Sekundärstruktur. Dieser ausgedehnte Bereich kurvt um H41 in den Kopf, wo er in die RNA etwa 50-60 Å von der kugelförmigen N-terminalen Domäne eingegraben ist. Es bzw. sie kontaktiert H30 im Kopf.
S19: S19 besteht aus 92 Resten. Eine NMR Struktur von isoliertem S19 [31] zeigte eine einzige kugelförmige Domäne, bestehend aus einer Helix, welche gegen ein dreisträngiges Blatt gepackt ist, in welchem die Reste 9-78 geordnet waren. In der 30S Struktur sind die Reste 2-81 in der Elektronendichte sichtbar. Der C-Terminus des Proteins zeigt zu der Grenzflächenseite und kann im 70S Komplex geordnet sein. Wie in S13 ist das meiste der kugelförmigen Domäne von S19 gut getrennt von der RNA, aber hier stellen jeweils die N- und C-terminalen Ausdehnungen der kugelförmigen Domäne als auch die Schleifen 68-73 und 34-39 Kontakt mit H42 her. Die C-terminale Ausdehnung, wie S13, biegt um die RNA, um H31 zu kontaktieren, während der N-Terminus H42 in beträchtlicher Entfernung erreicht. Daher umspreizt S19 einen Teil des Kopfes von S30. Die Reste in S13 und S19, welche quervernetzt 48 waren, sind in der Struktur benachbart.
S2.
Thermus S2 besteht aus 256 Resten, von denen 7-235 in unserer Struktur sichtbar sind. Das Protein besteht aus einer großen zentralen Domäne von etwa 200 Resten, welche aus einem fünfsträngigen parallelen Blatt und vier Helices, welche diese verbinden, besteht. Zwei Helices, die ein kleines Superhelixmotiv bilden, ragen aus dieser Domäne hervor. Das Protein befindet sich auf der Rückseite der 30S an der Grenzfläche zwischen dem Kopf und dem Rest des Teilchens. Während es primär als ein „Kopfprotein" betrachtet wird, stellt es in unserer Struktur auch Kontakt mit der zentralen Domäne her.
Thx.
Dieses kleine Peptid mit 26 Resten wurde aus Thermusribosomen isoliert und charakterisiert [18]. Thx füllt eine Aushöhlung, welche durch eine Zahl von verschiedenen Elementen am ganz oberen Teil des Kopfes gebildet wird. Die Reste 1-24 sind in der Elektronendichte sichtbar, von denen 8-14 eine kurze Helix bilden, welche durch ausgedehnte Enden flankiert ist. Es wird umringt von H42, der Spitze von H41 und der Basis von H41, während der untere Teil der Aushöhlung durch die große Furche von H42 gebildet ist. Das Protein ist höchst basisch, und es gibt ausgedehnte Salzbrücken zwischen diesen Resten und Phosphaten von RNA in der Nähe. Daher stabilisiert Thx eine Zahl von verschiedenen RNA Elementen, welche am oberen Teil des Kopfes nahe zusammenkommen.
FUNKTIONELLE KENNTNISSE AUS DER STRUKTUR DER RIBOSOMALEN 30S-UNTEREINHEIT
Während der Übersetzung des genetischen Codes stellt die ribosomale 30S-Untereinheit das Gerüst für die Basenpaarung zwischen dem Anticodon der tRNA und dem Codon der mRNA bereit und unterscheidet zur Sicherstellung der Übersetzungsgenauigkeit zwischen verwandten und nicht-verwandten tRNAs in einem als Dekodierung bezeichneten Verfahren. Während der Übersetzung muß sich das Ribosom genau ein Codon bezogen auf die mRNA und die gebundenen tRNAs fortbewegen. Sowohl die Dekodierung als auch die Translokation führen "Schalter" ein, in welchen genaue Konformationsänderungen in dem Ribosom auftreten. Die aufgelöste Atomstruktur der 30S-Untereinheit ermöglicht uns die Umgebung der mRNA und tRNA-Bindungsstellen molekular zu interpretieren. In einem gut charakterisierten Beispiel eines funktionalen Schalters, der zur Genauigkeit eingeführt ist, sind wir auch fähig, die räumliche Anordnung seiner Segmente zu bestimmen, und somit seine Architektur aufzuklären. Die Struktur legt auch andere mögliche Schalterelemente in 30S nahe und strahlt Licht auf die Bewegungsarten, welche auftreten können.
Das Ribosom enthält drei tRNA-Bindungsstellen, bezeichnet als A (Aminoacyl), P (Peptyl) und E (Exit), nach ihren entsprechenden tRNA-Substraten. Jede Stelle ist zweiteilig, teilweise auf der ribosomalen 30S-Untereinheit und teilweise auf der 50S-Untereinheit lokalisiert. Die tRNAs der A- und P-Stellen binden mit ihren Aminoacyl-Akzeptorenden an die 50S-Untereinheit und mit ihren Anticodon-Enden, welche zu benachbarten mRNA-Codons basengepaart sind, an die 30S-Untereinheit. Die tRNA der E-Stelle ist in einer ähnlichen Orientierung gebunden, aber es ist nicht bekannt, ob die tRNA der T-Stelle basengepaart zu dem mRNA-Codon der E-Stelle vorliegt. Die 30S-Untereinheit bindet auch mRNA stromaufwärts und stromabwärts der A-, B-, und E-Codons. Während der Übersetzung wird eine ankommende Aminoacyl-tRNA zu der A-Stelle als ein ternärer Komplex mit EF-Tu und GTP geliefert. Die Unterscheidung von verwandten und nicht-verwandten tRNAs tritt in der A-Stelle auf. Man glaubt, daß es auch einen zweiten "Kontroll-Lesungs"-Unterscheidungsschritt in der A-Stelle nach GTP-Hydrolyse durch EF-Tu gibt, was zur Unterscheidung verwandter von nahe-verwandter tRNAs benötigt wird. Die 30S P-Stelle hat eine viel höhere Affinität für tRNA, um das Leseraster aufrecht zu erhalten.
Es gibt einen gut charakterisierten Konformationsschalter in der 30S-Untereinheit, der Helix 27-Genauigkeitsschalter [32]. Genetische und biochemische Daten unterstützen ein Model, in welchem dieser Schalter Teil einer Konformationsänderung in großem Umfang sein kann, welche zwischen anfänglicher Auswahl und Kontroll-Lesen der A-Stellen tRNA auftritt, oder der Schalter kann eine Rolle in der Translokation spielen.
Bis vor kurzem gab es einen großen Unterschied zwischen der hohen Auflösung der genetischen und biochemischen Daten, welche die RNA-Komponenten der aktiven Stellen der 30S-Untereinheit definieren, und der relativ niedrigen Auflösung der erhältlichen dreidimensionalen Strukturen von Ribosomen. Die vorliegende Erfindung richtet sich an diesen Unterschied. In Kombination mit bisherigen biochemischen und anderen Daten ist es nun möglich, die detaillierte Struktur der aktiven 30S-Stellen zu identifizieren. Zusätzlich ist es durch Übereinanderlegen der tRNA- und mRNA-Koordinaten von der bekannten 7,8 Å 70S-Struktur nur möglich, auf viele der Wechselwirkungen zwischen den aktiven 30S-Stellen und den tRNA/mRNA-Liganden zu schließen.
Mit unserer vollständigen und hochaufgelösten Struktur der 30S-Untereinheit ist es nun möglich, bei dem verbleibenden Niveau die Elemente der 30S-Untereinheit zu identifizieren, welche mit der Anticodon-Stamm-Schleife (ASL) der A-, P- und E-Stellen tRNA, und assoziierter mRNA wechselwirken.
Die Identifikation der genauen Grenzen der A-, P- und E-Stellen in einem ungezwungenen Zustand in einer Struktur, bestimmt in Abwesenheit von verwandten tRNA-Liganden, würde normalerweise problematisch sein. Wie gewöhnlich ist die P-Stelle in der 30S-Struktur mit Stamm-Schleife der RNA gefüllt, welche den Resten 50-95 (in dem E.coli Numerierungssystem) vom Ende des "Sporns" (H6) eines benachbarten Moleküls entspricht (nachstehend bezieht sich der Begriff "Sporn" auf den Symmetrie-bezogenen Sporn, angedockt an der P-Stelle, eher als der Sporn am unteren Ende der gleichen Untereinheit). Der Sporn scheint die P-Stellen tRNA durch eine Vielzahl von Kriterien nachzuahmen. Das Ausmaß der 30S-Wechselwirkung mit der Anticodon-Stamm-Schleife (ASL) ist in sehr guter Übereinstimmung mit der, bestimmt durch Affinitätsmessungen [33] und durch Hydroxyradikal-Footprinting [34]. Zweitens ist die Konformation der Sporn-Stamm-Schleife verdreht, um der kanonischen tRNA-ASL-Konformation besser zu gleichen [35, 36]: Ein U-A-Basenpaar ist gebrochen, so daß sich die Sporn-Haarnadel-Schleife der Konformation einer tRNA-ASL annähern kann, vervollständigt mit einer U-Drehung und gestapelten Anticodon. Ein weiteres Anzeichen, daß der Sporn eine Nachahmung einer gebundenen P-Stelle-tRNA-ASL ist, ist darin zu sehen, daß von den 12 Wasserstoffbindungen zwischen 30S und dem Sporn nur eine Sequenz spezifisch zu sein scheint, in Übereinstimmung mit dem Fehlen der Sequenzkonservierung in tRNA-Anticodon-Stämmen. Schließlich sind enge Kontakte des Sporns mit 16S-RNA insgesamt konsistent mit den chemischen Schutzdaten für P-Stelle tRNA [37] und mit der 34-C1400 UV-induzierten Vernetzung zwischen tRNA und 16S-RNA [38] (die analogen Reste sind in der 30S-Kristallstruktur gestapelt).
Noch ein weitere Hinweis, daß der Sporn eine P-Stelle tRNA-ASL nachahmt, ist, daß sein "Pseudo-Anticodon" mit einem Nukleotidtriplet basengepaart ist, eine Nachahmung von mRNA. Ein viertes Nukleotid ist auch 5' zu dem Pseudo-Anticodon in der E-Stelle sichtbar. Diese Pseudo-Codon-Basen sind deutlich Pyrimidine und scheinen UCU hinsichtlich der Basenpaarungsgeometrien zu sein, welche U-U, U-C, und U-U sind, da das Pseudo-Anticodon UUU ist. Der Ursprung dieser "Pseudo-Nachricht" ist unklar, aber er kommt wahrscheinlich von dem 3'-Ende der 16S-RNA, die mit 5'-U1542C1543U1544 3' endet. Das letzte Nukleotid unseres 16S-Models ist C1533, so daß sieben gestörte bzw. ungeordnete Nukleotide die 25 Å Lücke zwischen C1533 und U1541 umspannen würden, was stereochemisch deutlich möglich ist. In einer anderen Ausführungsform ist es möglich, daß das 3'-Ende der 16S-RNA irgendwo zwischen C1533 und U1541 vor oder während der Kristallisierung gespalten worden ist. Das Vorhandensein von funktionalen Nachahmungen von RNA und P-Stellen tRNA erklärt auch, warum diese Kristalle relative gut beugen: die P-Stellen tRNA stellt extensive Kontakte mit sowohl dem Kopf und dem Körper der 30S her und dadurch wird geholfen, den Partikel in eine einzelne Konformation zu sperren.
Zur Frage, wie gut die Pseudo-Nachricht und der Sporn mRNA und die tRNA-ASL nachahmt, haben wir die Struktur mit der 7,8 Å Auflösung des 70S Ribosoms mit gebundener mRNA und tRNAs verwendet [39]. In dieser Struktur wurden zwei Elemente von 16S-RNA identifiziert, H27 und H44. Zur Vermeidung irgendeiner möglichen Tendenz in unserer Interpretation des Sporns als Nachahmung wurde nur H27 und H44 für die Zuordnung verwendet, um die 70S-Strukturen auf unsere 30S-Struktur übereinander zu legen. Trotz der relativ niedrigen Auflösung der verwendeten 70S-Struktur weist eine Überlagerung nach der Methode der kleinsten Quadrate von diesen zwei Elementen ein Phosphat r.m.s.d. von nur 2.3 Å auf. Wenn die 70S-Elemente in dieser Weise auf unsere 30S-Struktur übereinander gelegt werden, fanden wir, daß sich tatsächlich, wie erwartet, die P-Stellen tRNA gut auf den 30S-Sporn übereinander legt und die 30S-Pseudonachricht dem P-Stellen-Codon entspricht. Insbesondere ist die Orientierung der Sporn-Stamm-Schleife sehr ähnlich zu der 70S-P-Stellen-ASL und es gibt keine signifikanten Zusammenstöße zwischen den 70S-A- und E-Stellen-tRNAs und unserer 30S-Untereinheit, wenn sie in dieser Art übereinander gelegt werden. Es ist klar, daß der Sporn und die Pseudonachricht nicht perfekte Nachahmungen sein können, da die Pseudo-Anticodon-Codon-Helix aus drei Pyrimidin-Pyrimidin-Basenpaaren besteht, die etwa 2 Å enger sind als die Watson-Crick-Paarungen. Somit scheint es wahrscheinlich zu sein, daß der Sporn und seine Pseudonachricht gut sind, aber nicht perfekt die P-Stelle-tRNA bzw. P-Stellen-Codon nachahmen, und daß das Sporn-Nachahmungsmodell viele, aber vielleicht nicht alle Merkmale der P-Stellen-tRNA-Bindung an die 30S erklären sollte. Darüber hinaus stellen die transformierten A- und P-Stellen-tRNAs und das A-Stellen-Codon einen nützlichen Meilenstein für die Modellierung des Ausmaßes der A- und E-Stellen der 30S bereit.
Die P-Stelle.
Der P-Stellen-Sporn kontaktiert mehrere diskrete Bereiche der 16S-RNA, die meisten davon stehen im Zusammenhang mit der P-Stellenbindung durch biochemische Experimente. Zwei Proteine nehmen auch bei der Bindung der P-Stellen-ASL teil, ein möglicherweise überraschendes Ergebnis. Das meiste der Kontaktoberfläche liegt zwischen der kleinen Höhle des Sporn-Stamms und den 16S-RNA-Nukleotiden 1338-1341, 1229-1230 und dem C-terminalen Schwanz der Proteine S13 und S9. Es gibt viele Wasserstoffbindungen zwischen der kleinen Höhle (d.h. der 2'OH und Basengruppen) der Sporn-Reste C91, C92 und G78 und der kleinen Höhlenoberfläche von G1338-A1339. Nur eine dieser Wasserstoffbindungen scheint sequenzspezifisch zu sein (G78 N2 – A1339 N3). Ein Kontakt von Lys 126 von S9 scheint zu helfen, diese Wechselwirkung der kleinen Höhle bzw. Furche zur kleinen-Höhle-Beladung zu stabilisieren. Sowohl 1338 als auch 1339 stehen im Zusammenhang mit der P-Stellenbindung [37]. Ein zweiter Kontaktbereich, fast ununterbrochen mit dem ersten, liegt zwischen dem 16S 1229-1230 Zucker-Phosphat-Rückgrat und den Spornresten G77 und G78. Dieser Kontaktbereich wird ausgedehnt durch den C-terminalen Schwanz von S13, welcher zu helfen scheint, den Sporn und den 1229-1230 Bereich zusammenzubinden. Die anderen Kontaktbereiche sind viel schwächer. Eine Wechselwirkung ist das Stapeln von U82 auf C1400, was die ASL-34-C1400-UV-induzierte Vernetzung erklärt [38]. Die andere ist eine Beladungswechselwirkung zwischen A790 und den Spornresten 88-89 mit einer einzelnen vorhandenen Wasserstoffbindung. A790 ist die sogenannte Klasse III-Stelle, d.h. sie ist geschützt durch entweder tRNA oder 50S-Untereinheiten. Aufgrund der Spornwechselwirkung scheint es somit, daß das Binden von entweder der 50S-Untereinheit oder der P-Stelle-ASL einen Kontakt zwischen A790 N6 und dem Phosphat von 1498 stabilisiert, z.B. einen Kontakt zwischen der zentralen und 3'-kleinen Domänen. Wenn schließlich die Pseudo-Codon-Pseudo-Anticodon-Helix ein paar Å breiter wäre, so wie es für eine Watson-Crick-gepaarte Helix wäre, würde sie einen van-der-Waals-Kontakt mit der Base von G966 machen. G966 steht auch im Zusammenhang als Teil der P-Stelle durch chemische Modifizierungsexperimente und wurde auch als eine der wenigen Guanine identifiziert, die für die P-Stellenbindung entscheidend sind [40].
Das P-Stelle-Codon wird durch die große Höhle bzw. Furche des oberen Teils der Helix 44, in einem universell konservierten Bereich von 16S-RNA, durchgezogen. Dies scheint eine enge Drehung zwischen Nukleotiden –1 und +1 zu sein, d.h., zwischen den letzten E-Stelle- und den ersten P-Stelle-Codonnukleotiden. Diese enge Drehung wird durch eine Wasserstoffbindung zu den N1/N2-Gruppen des konservierten Restes G926, ein Rest, der als entscheidend für die P-Stellenbindung im Zusammenhang steht [40], stabilisiert. Zusätzliche Wasserstoffbindungen werden zwischen dem 2'OH von +1 bis zu dem Phosphat von C1498 und zwischen dem Phosphat von +2 und dem 2'-OH von C1498 gesehen. Dieses Phosphat von +2 liegt auch auf der Base von C1498. Das Phosphat von +3 ist innerhalb der Wasserstoff-Bindungsdistanz von zwei konservierten Cytidin N4-Gruppen, von C1402 und C1403. Die +3-Base liegt auch auf dem Zucker von C1400. Schließlich scheint es wahrscheinlich zu sein, daß es mehrere Magnesiumionen gibt, die zur Stabilisierung der Lokation des P-Stelle-Codons in der großen Höhle von H44 helfen können.
Die E-Stelle
Die E-Stelle wird durch die Umgebung definiert, welche die 70S-E-Stelle tRNA, darübergelegt auf unsere 30S-Struktur, wie vorstehend beschrieben, umgibt. Anders als die A- und P-Stellen besteht die E-Stelle am meisten aus Protein. Die Proteine S7 und S11 weisen eine kleine Grenzfläche auf, die die kleine Höhle der E-Stelle-ASL bindet. Die hochkonservierte Beta-Haarnadelstruktur von S7 erstreckt sich über diese Oberfläche fast bis zum unteren Ende des Anticodons und es ist möglich, daß die S7-Beta-Haarnadelstruktur hilft, das E-Stelle-Codon von dem E-Stelle-Anticodon zu dissoziieren. Der RNA-Teil der E-Stelle macht nur schwache Wechselwirkungen mit der E-Stelle-ASL. Die 16S-Nukleotide 1382 und 1383 können mit dem Rest 34 des Anticodons wechselwirken. Die Oberfläche der kleinen Höhle der konservierten 16S-Reste 693 und 694 können mit der Oberfläche der kleinen Höhle der Reste 37-39 der E-Stelle-ASL wechselwirken.
Die A-Stelle
Die A-Stelle ist eher breiter und flacher als die P- oder E-Stellen, vielleicht um eine Rotation der A-Stelle-Codon-Anticodon-Helix während oder nach der GTP-Hydrolyse durch EF-Tu zu ermöglichen. Die RNA-Komponenten der A-Stelle scheinen Teile der 530'-Schleife H34 im Kopf und die Reste 1492-1493 von der 3'-kleinen Domäne zu beinhalten, die alle im Zusammenhang mit der A-Stellen-Bindung stehen.
Der Helix 27-Schalter
Es ist klar, daß viele der Elemente, die einen Kontakt mit den unterschiedlichen tRNA machen, während der Translokation bewegt werden müssen. Tatsächlich ist von dem Ribosom bekannt, daß es ausgedehnte Konformationsänderungen während des Elongationszykluses durchmachen und diese müssen ein Aufbrechen und das Herstellen von genauen Kontakten einführen. Jedoch sind diese genauen Schaltelemente in diesen Konformationsänderungen im allgemeinen nicht bekannt, mit Ausnahme von einem Schalter in H27.
Von H27 wird angenommen, daß er zwei alternative Basenpaarungsschematas während der Translation aufweist, eine ist eine "RAM" oder tolerante Form, die 885-887 mit 910-912 paart, und eine alternative "restriktive" Form, die 888-890 mit 910-912 paart [32]. Diese RAM-Form scheint die stabilere Form im Ribosom zu sein und sie weist eine S-Drehung (oder Schleife E-Motiv) in H27 auf. Die S-Drehung H27 wird auch in der tRNA-gebundenen Struktur von 70S beobachtet [39]. Ein Schalter für die restriktive Form würde ein Gleiten der zwei Stränge von H27 bezogen auf den jeweils anderen zur Folge haben und die S-Drehung würde durch eine interne Schleife mit einer unterschiedlichen Struktur für H27 ersetzt werden. Tatsächlich ergibt die Analyse von zwei Formen durch Kryoelektronmikroskopie bemerkbare Konformationsänderungen im Ribosom, insbesondere um die A-Stelle [41]. Wir können nun genau die Struktur um H27 definieren und verwenden die vorhergehenden chemischen Identifizierungsdaten [32], um die Arten der involvierten Bewegung vorzuschlagen.
Die S-Drehung in H27 um 888 ist rechts nächst 1489 in H44 und H27 ballt sich gegen die kleine Höhle von H44 genau unter der Dekodierungsstelle. Die Spitze von H27 ist nahe an H11, während 885, die mit 910 unserer Konformation basengepaart ist, nahe von sowohl H1 als auch der 570-Schleife ist. Schließlich ist 914 nahe von sowohl H1 und 526 in der 530-Schleife. Somit ist H27 richtig in der Mitte von einem Bereich, welcher die Dekodierungsstelle und die 530-Schleife umfaßt. Somit ist es nicht überraschend, daß eine Änderung in der Konformation von H27 auch diese Elemente beeinflussen würden.
Eine Anzahl von Elementen, die im "restriktiven" Zustand mehr zugänglich sind, scheinen in der Struktur der vorliegenden Erfindung geschützt zu sein. Beispielsweise sind somit 524-526 üblicherweise mit 507-505 in dem 530-Pseudoknoten basengepaart. Dies legt nahe, daß der 530-Pseudoknoten in dem restriktiven Zustand gebrochen werden kann. Ähnlicherweise sind 1053 und 1197 in der üblichen Struktur basengepaart, aber sie sind Teil eines verdrehten Bereichs von H34, analog zu einer S-Drehung, und es ist nicht schwer sich vorzustellen, daß ein analoger Schalter in H34 in einem alternativen Zustand auftreten kann. Somit legen die Daten in Kombination mit unserer Struktur nahe, daß sich H34 im Kopf und in der 530-Schleife in der Schulter zwischen den zwei Zuständen bewegt, mit H34, welcher möglicherweise eine alternative Form annimmt, und wobei der 530-Pseudoknoten zerbrochen wird. In diesem Zusammenhang ist es interessant anzumerken, daß sowohl H34 als auch die 530-Schleife im Zusammenhang mit tRNA-Bindung steht. Andere Teile der chemischen Schutzdaten, insbesondere solche, von denen angenommen wird, daß sie eine erhöhte Zugänglichkeit im ram-Zustand anzeigen, sind nicht so leicht zu erklären, da sie geschützte Basen unserer Struktur umfassen.
Die 30S-Struktur hat es uns ermöglicht, Details der tRNA- und mRNA-Bindungsstellen zu identifizieren sowie einen ersten detaillierten Blick auf die Struktur um den H27-Schalter zu erhalten. Selbstverständlich ist H27 nur eine Komponente der Hauptkonformationsänderungen, die während der Translation auftreten. Die Analyse der hochaufgelösten 30S-Struktur sollte es uns ermöglichen, andere potentielle Schalterelemente, welche dann genetisch getestet werden können, zu identifizieren.
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TABELLE 2

Claims

Kristall einer 30S-Untereinheit von T. thermophilus mit einer tetragonalen Raumgruppe P4₁2₁2₁ mit Elementarzellendimensionen von a = 401,375 Å, b = 401,375 Å, c = 175,887 Å.
Kristall einer 30S-Untereinheit von T. thermophilus mit einer tetragonalen Raumgruppe P4₁2₁2₁ mit Elementarzellendimensionen von a = 401,4 Å, b = 401,4 Å, c = 175, 9 Å.
Kristall einer ribosomalen 30S-Untereinheit von T. thermophilus mit einer Auflösung von etwa 3 Å.
Kristall einer ribosomalen 30S-Untereinheit von T. thermophilus mit der durch die Koordinaten von Tabelle 1 definierten Struktur.
Computer-basiertes Verfahren zur rationalen Arzneimittelentwicklung, welches umfasst: das Bereitstellen der Struktur einer wie durch die Koordinaten von Tabelle 1 definierten ribosomalen 30S-Untereinheit, das Bereitstellen der Struktur eines Kandidaten-Modulatormoleküls, und das Anpassen der Struktur des Kandidaten an die Struktur der 30S von Tabelle 1.
Computer-basiertes Verfahren zum Identifizieren eines potentiellen Inhibitors des 30S-Ribosoms, welches die Schritte umfasst: a. das Anwenden einer dreidimensionalen Struktur von 30S oder mindestens einer Unterdomäne davon, um mindestens eine aktive Stelle zu charakterisieren, wobei die dreidimensionale Struktur durch die Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1 definiert ist, und b. das Identifizieren des potentiellen Inhibitors durch Entwerfen oder Auswählen einer Verbindung zur Wechselwirkung mit der aktiven Stelle.
Verfahren nach Anspruch 6, welches weiter umfasst: c. das Erhalten oder Synthetisieren des potentiellen Inhibitors, d. das Inkontaktbringen des potentiellen Inhibitors mit 30S, um die Fähigkeit des Inhibitors, mit der 30S wechselzuwirken, zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 6, welches weiter umfasst: c. das Erhalten oder Synthetisieren des potentiellen Liganden, d. das Bilden eines Komplexes von 30S und des potentiellen Liganden, und e. das Analysieren des Komplexes durch Röntgenkristallographie, um die Fähigkeit des potentiellen Liganden, mit 30S wechselzuwirken, zu bestimmen.
Verfahren für die Bestimmung der Struktur eines bakteriellen 30S aus einer von T. thermophilus verschiedenen Spezies, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Kristallisieren der 30S der Spezies, um einen Kristall zu erhalten, (b) das Durchführen von Röntgenkristallographie an dem Kristall, um Röntgendiffraktionsdaten zu erhalten, (c) das Bereitstellen der Strukturdaten von Tabelle 1, und (d) das Verwenden von molekularem Austausch, um eine Elektronendichtemappe der 30S zu berechnen.
Verwendung eines Computersystems, um für das 30S-Ribosom oder Komplexe des 30S-Ribosoms mit einem potentiellen Modulator Strukturen zu erzeugen und/oder rationale Arzneimittelentwicklung durchzuführen, wobei das System entweder (a) Atomkoordinatendaten gemäß Tabelle 1, wobei die Daten die dreidimensionale Struktur von 30S oder mindestens einer Unterdomäne davon definieren, oder (b) Strukturfaktordaten für 30S enthält, wobei die Strukturfaktordaten aus den Atomkoordinatendaten von Tabelle 1 ableitbar sind.
Verwendung eines Computer-lesbaren Mediums, um für das 30S-Ribosom oder Komplexe des 30S-Ribosoms mit einem potentiellen Modulator Strukturen zu erzeugen und/oder rationale Arzneimittelentwicklung durchzuführen, wobei das Medium entweder (a) darauf gemäß Tabelle 1 aufgezeichnete Atomkoordinatendaten, wobei die Daten die dreidimensionale Struktur des 30S-Ribosoms, mindestens eines Atoms oder mindestens einer Unterdomäne davon definieren, oder (b) darauf aufgezeichnete Strukturfaktordaten für das 30S-Ribosom umfasst, wobei die Strukturfaktordaten aus den Atomkoordinatendaten von Tabelle 1 ableitbar sind.
Verfahren zum Kristallisieren einer ribosomalen 30S-Untereinheit, um eine hochaufgelöste Struktur einer 30S-Untereinheit zu erhalten, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer ribosomalen 30S-Untereinheit, das selektive Entfernen der S1-Untereinheit davon und das Kristallisieren der 30S umfasst.
Kristall einer ribosomalen 30S-Untereinheit, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 12.