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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf medizinische Vorrichtungen
(zum Beispiel implantierbare Pulsgeneratoren), die ein Polymer oder
Polynukleotid umfassen. Insbesondere kann die medizinische Vorrichtung
zum Vorbeugen und Behandeln von medizinisch vorrichtungs-assoziierten
Infektionen verwendet werden. In einigen Aspekten der vorliegenden
Erfindung tragen die medizinischen Vorrichtungen ein Polynukleotid,
das ein antimikrobisches Peptid codiert und das Wachstum von Krankheitserregern
bzw. pathogenen Keimen inhibiert. In anderen Aspekten der vorliegenden
Erfindung tragen die medizinischen Vorrichtungen eukaryotische Zellen
(zum Beispiel Endothelzellen), die ein antimikrobisches Peptid exprimieren
und das Wachstum von Krankheitserregern inhibieren.
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HINTERGRUND
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Das
Einfügen
bzw. Einsetzen von Implantaten ist ein breit akzeptiertes und oftmals
lebensrettendes Verfahren geworden. Die letzten paar Jahre haben
eine dramatische Steigerung in der Vielfalt und Anzahl von medizinischen
Vorrichtungen gebracht. Es wird geschätzt, dass es zurzeit weltweit
etwa 6.000 verschiedenartige oder generische Gruppen von medizinischen
Vorrichtungen und etwa 750.000 oder mehr Marken und Modelle bzw.
Ausführungen gibt,
die sich von sehr einfachen Vorrichtungen zu sehr komplexen Systemen
erstrecken. In einer Studie im Jahre 1989 wurde geschätzt, dass
weltweit ungefähr
1.000.000 Implantationen jährlich
durchgeführt
werden; die Anzahl von zusätzlich
verwendeten Kathetern für
diagnostische und therapeutische Mittel übersteigt diese Anzahl wesentlich.
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Infektion
ist die meist gefürchtete,
wenn nicht die schwerwiegendste Komplikation bei den zahlreichen
Vorrichtungen und Materialien, die eingesetzt werden. Behandlung
von solchen Infektionen ist schwierig, und sehr oft ist die Infektion
irreversibel, so dass in vielen Fällen eine komplette Entfernung
des Katheters oder Implantats erforderlich ist. Technologische Material-
und Konstruktionsverbesserungen bzw. -verfeinerungen und zunehmende
chirurgische Erfahrung erniedrigt im Allgemeinen die Häufigkeit von
infektiösen
Komplikationen; jedoch bleibt Infektion eine konstante Ursache für Morbidität und Mortalität.
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Die
Auswirkung und die klinische Bedeutung von implantationsbedingten
Infektionen können
mit Rücksicht
auf verschiedene Faktoren besser eingeschätzt werden. Ein wichtiger Faktor
sind die Millionen von Patienten, in denen Prothesen von einer Art oder
einer anderen vorhanden sind. Ein anderer wichtiger Faktor ist die
Schwere der Erkrankung, die sich aus vorrichtungsbedingten Infektionen
ergibt. In den meisten Fällen
resultiert die Infektion, die eine vollständige implantierbare Vorrichtung
umfasst, in Funktionsverlust und der Notwendigkeit der chirurgischen
Entfernung, um eine Heilung zu erzielen. Abhängig von dem Vorrichtungstyp,
zum Beispiel bei künstlichen
Herzklappen bzw. Klappenprothesen oder Vaskular-Transplantaten, ist die einer Infektion folgende
Mortalität
hoch. Ein dritter Faktor sind die wirtschaftlichen Folgen, die in
den Kosten der Erstellung der Diagnose und in der Behandlung einer
vorrichtungsbedingten Infektion gemessen werden. Es wird geschätzt, dass
die Kosten der Behandlung einer infizierten Gelenkprothese das vier-
bis sechsfache der Kosten von originalem prothetischen Gelenkersatz übersteigen.
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Methoden
bzw. Ansätze,
um die vorrichtungsbedingten Infektionen zu reduzieren, wurden anfangs
auf Verbesserungen der chirurgischen Techniken konzentriert, die
Modifikation des Bereichs des Operationssaals und die Verwendung
von prophylaktischen Antibiotika beim chirurgischen Eingriff umfassend.
Trotz der Anweisungen von diesen äußerst genauen bzw. pedantischen
aseptischen Maßnahmen konnte
das Auftreten von vorrichtungsbedingten Infektionen nicht komplett
beseitigt werden.
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Eine
alternative Methode ist, sich auf das Implantat selbst zu konzentrieren
und folglich auf die Modifikation der Vorrichtung, um Infektionsresistenz mittels
Bereitstellung von Flächen
an der Vorrichtung, die entsprechende Integration von Umgebungsgewebe
mit der Vorrichtungsfläche
fördert,
zu verbessern. Das zu Grunde liegende Konzept ist, dass die viel
versprechende, schnelle Kolonisierung und Integration der Vorrichtungsfläche mit
Gewebezellen die Implantatfläche
vor Bakterienkolonisierung schützt.
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Eine
beträchtliche
Menge an Aufmerksamkeit und Studien wurden auf die Verhinderung
der Kolonisierung von Bakterien- und Pilzorganismen an den Flächen von
orthopädischen
Implantaten gerichtet, mittels der Verwendung von antimikrobischen Mitteln,
wie Antibiotika, die an die Fläche
von den in solchen Vorrichtungen verwendeten Materialien gebunden
sind. Die Aufgabe von solchen Versuchen war es, eine ausreichende
bakteriostatische oder bakterizide Wirkung zu erzeugen, um Kolonisierung zu
verhindern. Die Praxis von Beschichtungsverfahren des Standes der
Technik resultiert in einen orthopädischen Implantat oder einer
medizinischen Vorrichtung, wobei die Effektivität der Beschichtung über die
Zeit abnehmen kann. Nach dem Einfügen der medizinischen Vorrichtung
oder des orthopädischen
Implantats können
die Antibiotika sich aus der Fläche der
Vorrichtung in die umliegende Umgebung herauslösen bzw. extrahieren. Außerdem sind
bakterielle Krankheitserreger zunehmend resistent gegen allgemein
verwendete Antibiotika geworden. In einigen Fällen bleiben keine Alternativen
erster Wahl für
Therapie übrig.
Eine kürzlich
veröffentlichte
Trendanalyse über
bakterielle Krankheitserreger, die in England und Wales von 1990
bis 1998 aus Blut isoliert wurden, zeigte einen Aufwärtstrend
in der Gesamt-Anzahl von Berichten über Bakteriämie. Die fünf meist zitierten Organismen
begründeten über 60%
der Berichte jedes Jahr. Es gab eine erhebliche Steigerung in dem
Anteil von Berichten über
Staphylococcus aureus, der resistent gegen Methicillin ist, Streptococcus
pneumoniae, der resistent gegen Penizillin und Erythromyzin ist,
und Enterococcus faecium, und Enterococcns faecalis die resistent
gegen Vancomycin sind.
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Antimikrobische
Peptide sind eine Art von Antibiotikum. Die ersten antimikrobischen
Peptide wurden im Jahre 1939 durch Dubos identifiziert, der bewies,
dass „ein
unidentifizierter Boden-Bazillus" antibakterielle
Verbindungen produzierte, die Pneumokokkeninfektionen in Mäusen verhindern
können (Boman
et al., „Antimicrobial
Peptids", Ciba Foundation
Symposium, John Wiley und Söhne,
Chicester (1994)). In den 1960igern wurde behauptet, dass ein Bienengift-Toxin
und ein Peptid in Froschhaut antibakteriell seien. Seitdem sind
antimikrobische Peptide aus Insekten (Cecropine von der Motte Hyalophora
cecropia und Drosophila melanogaster, Insektdefensine von den Fleischfliegen
Phormia terranovae und Sacrophaga peregrina), aus der Haut des afrikanischen
Krallenfrosches Xenopus laevis (Magainine), aus der Hufeisen-Krabbe
(Tachyplesine) aus Säugetier-Granulozyten
(Defensine), aus Makrophagen (murine mikrobizide Proteine) und aus
Blutplättchen (Thrombozyten)
isoliert worden. Ihre weite Verbreitung ist beachtenswert und macht
es höchstwahrscheinlich,
dass diese Komponenten eine wichtige schützende Rolle als eine Abwehr
erster Wahl gegen Infektionen spielen. Obwohl antimikrobische Peptide sich
in der Länge
wesentlich unterscheiden, sind beinahe alle von ihnen von kationischer
Natur.
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Beim
Menschen sind zahlreiche antimikrobische Peptide isoliert und gekennzeichnet
worden aus multiplen Quellen, die Neutrophile (auch im Stand der Technik
als polymorphonukleare Leukozyten bezeichnet), T-Zellen, bronchoalveolare
Lavage, Thrombozyten, Plasma, Wundflüssigkeit und verschiedene Organe
umfassen. Ferner ist in den letzten Jahren ein Bereich von antimikrobischen
Peptiden im Epithelgewebe von Atemwegen, im Urogenitalgewebe, in
der Haut und im Intestinum gefunden worden. Diese Ergebnisse bzw.
Funde schlagen vor, dass Wirtabwehr mittels antimikrobischer Peptide
gewöhnlicher
sein dürfte,
als bisher angenommen wurde.
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Antimikrobische
Peptide sind fähig,
eine breite Vielfalt von gram-positiven und gram- negativen Bakterien
zu töten.
Zumindest drei sequentielle Ereignisse sind erforderlich für Targetzellenlysis: Membranbindung,
Permeabilisierung und schließlich Schädigung der
DNA. Es wird angenommen, dass nach der Bindung an die Zellmembran
die antimikrobischen Peptide spannungsabhängige Kanäle in den Lipid-Doppelschichten
der Zellmembran bilden. Die amphipathischen Eigenschaften von antimikrobischen
Peptiden machen sie löslich
in wässrigen
Medien und fördern
ihre Fähigkeit
des Eindringens in Membranen. Die positive Netto-Ladung antimikrobischer Peptide begünstigt Interaktionen
mit negativ geladenen Lipidkopfgruppen und stellt eine anfängliche
Antriebskraft für
das Eindringen eines antimikrobischen Peptids in eine Membran zur
Verfügung.
Außerdem
ist dieser Wirkungsmechanismus. einer, bei dem die Bakterien Schwierigkeiten
haben, ihm mittels entwicklungs Resistenz auszuweichen.
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Die
WO 95/24929 offenbart ein polymeres Genabgabesystem, bei welchem
Gene in einer Polymermatrix zur Expression in einer Zelle eines
Patienten dispergiert werden.
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Die
WO 99/59649 und die WO 00/62830 beschreiben eine medizinische Vorrichtung,
die eine Polymerbeschichtung an der Fläche, die Arzneimittel enthält, aufweist,
die therapeutische Polypeptide codieren können.
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Die
US-A-5,698,531 beschreibt ein Verfahren zur Abgabe von Proteinen
durch Katheterisierung bzw. Kathetereinführung in Blutgefäße, die
Zellen verwenden, die therapeutische Proteine exprimieren.
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Die
WO 99/00071 beschreibt einen Stent, der mit einer polymerisierbaren
Matrix und DNA beschichtet ist, ein therapeutisches Protein codierend: ein
antithrombozytäres
Mittel, ein antikoagulierendes Mittel, ein antimitotisches Mittel,
Antioxidationsmittel, Antimetabolitmittel, antientzündliche
bzw. entzündungshemmende
Mittel und antimikrobische Mittel.
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Die
WO 00/32255 stellt implantierbare medizinische Vorrichtungen für die gesteuerte,
lokalisierte Abgabe von bioaktiven Mitteln zu Zielorten bzw. -stellen
im Innern des Körpers
bereit.
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Die
WO 01/74413 stellt eine medizinische Vorrichtung zur Verfügung, die
eine Polymerbeschichtung aufweist, die ein genetisches Material trägt, umfassend
Polynukleotide, transfizierte Zellen.
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Die
WO 00/12028 und die WO 99/55360 stellen ein implantierbares System
zur Verfügung,
umfassend einen Träger
und Zellen, die ein therapeutisches Mittel und ein Stimulierungselement
produzieren und freisetzen, um die Freisetzung des therapeutischen
Mittels zu stimulieren.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung eine medizinische Vorrichtung
zur Verfügung,
umfassend:
einen Träger,
der eine Fläche
aufweist, die ein Polymer umfasst; und
ein Polynukleotid, welches
zumindest mit einem Abschnitt des Polymers assoziiert ist, wobei
das Polynukleotid nicht in einer Zelle vorhanden ist; und wobei das
Polynukleotid eine Sequenz umfasst, welche ein antimikrobisches
Peptid codiert.
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In
einem anderen Aspekt wird eine medizinische Vorrichtung bereitgestellt,
umfassend:
einen Träger,
der eine Fläche
umfasst, die ein Polymer umfasst; und
eine Zelle, die zumindest
mit einem Abschnitt des Polymers assoziiert ist, wobei die Zelle
ein antimikrobisches Peptid exprimiert.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen
und die Vorrichtung in Form.
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Die
vorliegende Erfindung hat bestimmte Aufgaben. Das heißt, verschiedene
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung stellen Lösungen für ein oder mehrere Probleme
zur Verfügung,
die aus dem Stand der Technik mit Bezug auf vorbeugende Infektionen,
die mit implantierbaren medizinischen Vorrichtungen assoziiert sind,
existieren. Diese Probleme umfassen fortgesetzte Prävalenz von
Infektionen, die mit medizinischen Vorrichtungen assoziiert sind,
und die Ineffektivität
von traditionellen Antibiotika, um Infektion durch resistente Stämme von
Mikroorganismen zu verhindern. Verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung haben die Aufgabe des Lösens zumindest eines der vorhergehenden
Probleme.
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Im
Vergleich mit bekannten medizinischen Vorrichtungen stellen verschiedene
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Vorteile
zur Verfügung:
(a) Inhibieren des Wachstums von pathogenen Mikroorganismen, indem
die Mikroorganismen den antimikrobischen Peptiden ausgesetzt werden;
(b) Bereitstellen eines Polynukleotids, das ein antimikrobisches
Peptid an eine in einem Patienten vorhandene Zelle derart codiert,
dass die Zelle das antimikrobische Peptid exprimiert; (c) Bereitstellen
einer Zelle, die ein antimikrobisches Peptid exprimiert; und (d)
Herstellen eines antimikrobischen Peptids, verfügbar an der Stelle der Implantation
von einer medizinischen Vorrichtung und dabei die Wahrscheinlichkeit
von einer medizinischen vorrichtungs-assoziierten Infektion verringernd.
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Einige
Ausführungsformen
der Erfindung umfassen ein oder mehrere der folgenden Merkmale: (a)
einen Träger,
der eine Fläche
aufweist, die ein Polymer und ein Polynukleotid umfasst, welches
zumindest mit einem Abschnitt des Polymers, wem das Polynukleotid
nicht in einer Zelle vorhanden ist, assoziiert ist; und (b) einen
Träger,
der eine Fläche
aufweist, die ein Polymer und eine Zelle umfasst, die mit zumindest
einem Abschnitt des Polymers, wem die Zelle ein antimikrobisches
Peptid exprimiert, assoziiert ist.
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Definitionen
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Die
Begriffe „medizinische
Vorrichtung", „Träger" und „implantierbarer
Pulsgenerator" werden hier
detaillierter beschrieben.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „poröses Polymer" auf ein Polymer, das Poren aufweist,
die durchgehend verteilt sind, und das fähig ist, Flüssigkeiten zu absorbieren.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Polynukleotid" auf eine Polymerform
von Nukleotiden von beliebiger Länge,
entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide, und umfasst sowohl
doppelt- als auch einzel-strängige
DNA und RNA. Ein Polynukleotid kann Nukleotidsequenzen umfassen,
die verschiedene Funktionen aufweisen, umfassend zum Beispiel Codierungssequenzen
und Nicht-Codierungssequenzen wie Regulatorsequenzen. Ein Polynukleotid
kann direkt aus einer natürlichen
Quelle erlangt werden, oder kann mit der Hilfe von rekombinanten,
enzymantischen oder chemischen Techniken bereitgestellt bzw. hergestellt
werden. Ein Polynukleotid kann in der Struktur linear oder kreisförmig sein. Ein „eingedrungenes
bzw. eingesetztes Polynukleotid" ist
ein Polynukleotid, welches in eine Zelle eingedrungen ist, zum Beispiel
durch ex vivo Gentransfer. Ein Polynukleotid kann zum Beispiel ein
Abschnitt eines Vektors wie eines Expressionsvektors oder ein Fragment
sein.
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Der
Ausdruck „nicht
in einer Zelle vorhanden" bedeutet,
dass das Polynukleotid nicht in einer eukaryotischen oder einer
prokaryotischen Zelle vorhanden ist und nicht in einem Viruspartikel
vorhanden ist.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „assoziiert mit" in dem Zusammenhang
von Polynukleotiden oder Zellen darauf, wie sie mit einem Trägerpolymer
kombiniert werden. Die Polynukleotide oder Zellen können zum
Beispiel in einer Polymerbeschichtung oder -film auf dem Trägern inkorporiert bzw.
integriert sein, oben auf einer Polymerbeschichtung oder -film auf
dem Träger
beschichtet oder unter einer Polymerbeschichtung oder -film auf
dem Träger vorhanden
sein. Die Polynukleotide oder Zellen können auch in mikroskopischen
Container-Vehikeln
inkorporiert bzw. integriert sein, die in einer Polymerbeschichtung
oder -film auf dem Träger
inkorporiert bzw. integriert sind, oben auf einer Polymerbeschichtung
oder -film auf dem Träger
beschichtet sind oder die unter einer Polymerbeschichtung oder -film
auf dem Träger
vorhanden sind.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Film" auf ein flächiges Material bzw. Schichtmaterial.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „natürliches poröses Polymer" auf ein Polymer, welches in der Natur
vorhanden ist oder durch die Natur produziert wird, dass heißt, es ist
nicht künstlich
oder synthetisch.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „synthetisches poröses Polymer" auf ein Polymer,
welches künstlich
oder synthetisch ist, dass heißt,
es ist nicht in der Natur vorhanden oder wird nicht durch die Natur
produziert.
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„Codierungsbereich" und „Codierungssequenz" werden synonym verwendet
und beziehen sich auf einen Nukleotidbereich, der ein Polypeptid codiert
und, wenn unter der Kontrolle von entsprechenden bzw. geeigneten
Regulatorsequenzen platziert, das codierte Polypeptid exprimiert.
Die Grenzen bzw. Ränder
von einem Codierungsbereich werden allgemein durch ein Translations-Startkodon
an seinem 5' Ende
und ein Translations-Stoppkodon an seinem 3' Ende bestimmt. Eine Regulatorsequenz
ist eine Nukleotidsequenz, die Expression eines Codierungsbereichs,
an welche sie operabel verbunden ist, reguliert. Nicht einschränkende Beispiele
von Regulatorsequenzen umfassen Promoter, Transkriptionsinitiationsstellen,
Translationsstartstellen, Translationsstoppstellen und Terminatoren. „Operabel
verbunden" bezieht
sich auf eine Juxtaposition, wobei die Komponenten in einer Beziehung,
die es ihnen erlaubt, in ihrer beabsichtigten Art und Weise zu funktionieren,
so beschrieben werden. Eine Regulatorsequenz ist an einen Codierungsbereich „operabel
verbunden", wenn
sie auf solche Weise verbunden ist, dass Expression des Codierungsbereichs
erreicht wird unter Konditionen, die mit der Regulatorsequenz kompatibel
sind.
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„Peptid" und „Polypeptid" werden hier synonym
verwendet, um sich auf ein Polymer von Aminosäuren zu beziehen und bezieht
sich nicht auf eine spezifische Länge von einem Polymer von Aminosäuren. Deshalb
sind zum Beispiel die Begriffe Oligopeptid, Protein und Enzym innerhalb
der Definition von Peptid enthalten. Dieser Begriff umfasst auch Post- Expressions-Modifikationen
von dem Peptid, zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen
und dergleichen: Der Begriff „antimikrobisches
Peptid" wird hier
im Detail beschrieben.
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Der
Begriff „kondensiert", wie hier verwendet,
beschreibt ein Polynukleotid, welches zu isolierten Sphären oder
Toroiden verdichtet bzw. zusammengedrängt worden ist, so dass die
Interaktion von der DNA mit dem Lösungsmittel minimal ist.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „gebunden an einen Rezeptor-Liganden" auf eine Bindung
bzw. Anheftung eines Rezeptor-Liganden an die Fläche eines ein-gekapselten oder
kondensierten Polynukleotids. Die Bindung bzw. Anheftung kann durch
eine kovalente Bindung, Wasserstoffbindung oder Van-der-Waals-Kräfte bzw.
Dispersionskräfte
geschehen. Sofern nicht anderweitig spezifiziert, werden „ein", „der", „die", „das" und „zumindest
ein" überall in
der Beschreibung synonym verwendet und bedeuten ein oder mehrere
als ein.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt
einen implantierbaren Pulsgenerator (IPG) 12, der in einem
Patienten 10 implantiert ist.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG VON DEN BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Medizinische
Vorrichtungen
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Die
vorliegende Erfindung stellt medizinische Vorrichtungen zur Verfügung, die
ein Polymer und ein Polynukleotid, welches mit dem Polymer assoziiert ist,
umfassen. Das Polynukleotid ist nicht in einer Zelle vorhanden.
Bevorzugter Weise sind medizinische Vorrichtungen für die Vorbeugung
bzw. Prophylaxe oder Behandlung von medizinisch vorrichtungs-assoziierten
Infektionen nützlich.
In einigen Aspekten der Erfindung umfassen die medizinischen Vorrichtungen
einen Träger
und ein Polynukleotid. Bevorzugter Weise umfasst das Polynukleotid
einen Codierungsbereich, der ein antimikrobisches Peptid codiert.
In anderen Aspekten um fasst die medizinische Vorrichtung einen Träger und
eine Zelle, die ein antimikrobisch es Peptid exprimiert.
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Eine
Vielfalt von Trägern
kann in den medizinischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, zum Beispiel umfassend Stents, Gefäßtransplantate, Stenttransplantate,
synthetische Patchs, Infusionsmanschetten bzw. -hülsen, medizinisch
elektrische Leitungen und Elektroden, Dauerkatheter, Herzklappen,
Anuloplastikringe, Ohrsonden, Zerebrospinalflüssigkeitsshunts, implantierbare Arzneimittelpumpen
und implantierbare Pulsgeneratoren (IPGs) und die elektrischen Leitungen,
die mit den IPGs assoziiert sind. Beispiele von IPGs umfassen Schrittmacher,
implantierbare Kardioverter-Defibrillatoren, implantierbare Defibrillatoren
und Neurostimulatoren. Jede von diesen Vorrichtungen kann als Träger von
Polynukleotiden oder Zellen der Erfindung verwendet werden. Die
folgende Beschreibung konzentriert sich auf IPGs, obwohl sie genauso
auf andere medizinische Vorrichtungen zutrifft.
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1 zeigt
einen bevorzugten Aspekt der Erfindung, wo der IPG 12 in
eine Tasche, die im Patienten 10 ausgebildet ist, zum Beispiel
in den linken pectoralis major- bzw. großen Brustmuskelbereich, eine
traditionelle Schrittmacherimplantatstelle, eingesetzt bzw. implantiert
ist. Der IPG weist eine Fläche auf,
die das Gewebe kontaktiert, das die Wand der Tasche, in welche der
IPG implantiert worden ist, aufbaut. Der IPG kann mit einer natürlichen
oder synthetischen Polymerbeschichtung oder -film zum Halten der
Polynukleotide oder Zellen an der Stelle beschichtet sein. Polymerbeschichtungen
oder -filme werden hier detaillierter beschrieben.
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Ob
der Träger
ein IPG ist oder eine andere medizinische Vorrichtung, sind die
Polynukleotide oder Zellen mit dem Trägerpolymer assoziiert. Die medizinischen
Vorrichtungen dieser Erfindung umfassen bevorzugter Weise eine erste
Polymerzusammensetzung, in welcher die Polynukleotide oder Zellen
vorhanden sind. Die erste Polymerzusammensetzung dieser Erfindung
kann zum Beispiel aus einem Homopolymer, einem Copolymer (das heißt einem Polymer
von zwei oder mehreren verschiedenen Monomeren) oder einer Zusammensetzung
(zum Beispiel ein Blend) mit einem oder mehreren Polymeren oder
Copolymeren bereitgestellt bzw. hergestellt sein. Die Zusammensetzung
bildet bevorzugter Weise ein viskoelastisches, ein- bzw. zerreißfestes,
biokompatibles Polymer. Der Begriff „viskoelastisch" bezieht sich auf
die vorgeschriebenen „Speicher"-Charakteristika
von einem Molekül,
das dem Molekül
ges tattet, auf Spannung bzw. Belastung zu reagieren, als ob das
Molekül
eine Kombination bzw. Verbindung von elastischen Feststoffen und
viskosen Flüssigkeiten
wäre. Der
Begriff „ein- bzw. zerreißen" bedeutet, dass,
wenn das Polymer Expansionsbelastung bzw. -spannung ausgesetzt ist,
das Material im Wesentlichen nicht ein- bzw. zerreißt. Das
Ein- bzw. Zerreißen
bezieht sich auf die Propagation einer Kerbe oder eines Schnittes
im Material unter Spannung bzw. Belastung. Der Begriff „biokompatibel" wird hier verwendet,
um sich auf ein Material zu beziehen, das keine toxischen oder schädlichen
Wirkungen auf biologische Systeme hat.
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Bevorzugter
Weise verringert oder exazerbiert die erste Polymerzusammensetzung
nicht bzw. verschlimmert nicht Irritation an dem Gewebe, das die
Tasche, in welche der IPG eingesetzt bzw. implantiert ist, umgibt.
Die erste Polymerzusammensetzung ist bevorzugter Weise nicht inflammatorisch
und nicht thrombogen, wenn allein angewandt, oder alternativ, wenn
mit anti-thrombogenen Wirkstoffen bzw. Mitteln wie Heparin und dergleichen
oder mit anti-inflammatorischen
Wirkstoffen bzw. Mitteln wie Cyclosporine und dergleichen verwendet.
Die erste Polymerzusammensetzung ist bevorzugter Weise auch ein
biostabiles oder ein bioabsorptionsfähiges Polymer, abhängig von
der gewünschten
Freisetzungsrate bzw. Abgaberate oder dem gewünschten Grad von Polymerstabilität.
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Die
ersten Polymerzusammensetzungen dieser Erfindung können ein
oder mehrere synthetische oder natürliche Polymere umfassen. Geeignete Polymere
umfassen jene, die kompatibel mit den Polynukleotiden oder den Zellen
sind. Bevorzugter Weise ist das erste Polymer ein poröses Polymer.
In einem Aspekt der Erfindung ist das poröse Polymer ein Film an zumindest
einem Abschnitt der Struktur. In einem anderen Aspekt ist das poröse Polymer
ein integraler Abschnitt der Struktur. Bevorzugter Weise ist das
poröse
Polymer biokompatibel und ausreichend reißfest, nicht inflammatorisch
entzündungshemmend
und nicht thrombogen. Bevorzugter Weise ist das poröse Polymer
biologisch abbaubar.
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Bevorzugter
Weise ist das poröse
Polymer ein natürliches
poröses
Polymer oder ein synthetisches poröses Polymer. Beispiele für natürliche poröse Polymere
umfassen Gelatine, Fibrin, Kollagen, Elastin, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat,
Dermatansulfat, Heparinsulfat, Heparin, Zellulose, Chitin, Chitosan,
Mixturen oder Copolymere davon, oder eine breite Vielfalt von anderen
typischer Weise in implantierbaren medizinischen Vorrichtungen als
nützlich offenbarten.
Beispiele von synthetischen porösen Polymeren
umfassen Silikon, Polyurethan, Poly sulfon, Polyethylen, Polypropylen,
Polyamid, Polyester, Polycarbonsäuren,
Polyvinylpyrrolidon (PVP), Maleinsäureanhydrid-Polymere, Polyamide,
Polyvinylalkohole (PVA), Polyethylenoxide, Polyacrylsäure-Polymere,
Polytetrafluorethylen, Polyhydroxyethylmethacrylatsäure (pHEMA),
Polyaminopropylmethacrylamid (pAPMA), Polyacrylamido-2-methylpropansulfonsäure (pAMPS),
Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Mixturen
oder Copolymere davon, oder eine breite Vielfalt von anderen typischer
Weise in implantierbaren medizinischen Vorrichtungen als nützlich offenbarten.
Zusätzliche
Beispiele von synthetischen porösen
Polymeren umfassen biologisch abbaubare synthetische poröse Polymere
wie Polyglykolsäure, Polymilchsäure, Polydioxanon,
Poly(-caprolacton), Polyanhydride, Poly(-hydroxybutyrat), Poly(orthoester), Poly(aminosäuren), Polyiminocarbonaten
und Mixturen oder Copolymere davon. In Materialien, welche keine
Poren in ihren gewöhnlichen
Strukturkonfigurationen umfassen, können Poren zwischen einem Mikrometer
im Durchmesser bis zu 1000 Mikrometer im Durchmesser, durch konventionelle
Mittel eingebracht werden, wie durch Einbringung bzw. Einführung eines
flüssigen,
löslichen
Partikelmaterials in die gewünschte
Struktur und Lösen
des Partikelmaterials mit einem Lösemittel. Jedoch ist keine einzelne
Porengröße für diese
Erfindung kritisch. Fachleute werden erkennen, dass die Verfahren
zur Bildung der ersten Polymerzusammensetzung modifiziert werden
können,
um andere Polymere zu umfassen, wie in dieser Erfindung vorgesehen,
ohne übermäßig zu experimentieren.
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In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das poröse Polymer
aus einem Polymer, der nicht Fibrin ist, hergestellt und hat Fibrin
in den Poren inkorporiert. Typisch und bevorzugter Weise ist ein
derart poröses
Polymer in der Form eines flächigen
Materials bzw. Schichtmaterials eines synthetischen Polymers, das
biostabil ist. Derartige synthetische biostabile Polymere umfassen
Silikon, Polyurethan, Polysulfon, Zellulose, Polyethylen, Polypropylen,
Polyamid, Polyester, Polytetrafluorethylen und Kombinationen davon.
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Wenn
das poröse
Polymer in der Form einer porösen
Schicht oder Films ist, kann es durch eine Vielfalt von Verfahren
hergestellt werden. Diese Verfahren können zum Beispiel das Bilden
des Films umfassen, der ein festes Partikelmaterial bzw. Feststoff
verwendet, das im Wesentlichen entfernt werden kann, nachdem der
Film gebildet ist, dadurch Poren ausbildend. Durch Verwenden eines
festen Partikelmaterials während
der Filmbildung kann die Größe der Poren
teilweise gesteuert werden durch die Größe des festen Partikelmaterials,
das verwendet wird. Das Partikelmaterial kann von weniger als ungefähr 1 Mikrometer
im Durchmesser bis ungefähr 1000
Mikrometer, bevorzugter Weise ungefähr 1 Mikrometer bis ungefähr 100 Mikrometer,
insbesondere bevorzugt ungefähr
25 Mikrometer bis ungefähr
60 Mikrometer, reichen. Für
die Einheitlichkeit der Poren kann das Partikelmaterial durch aufeinander
folgende, feiner maschige Siebe gesiebt werden, zum Beispiel durch
100, 170, 270, 325, 400 und 500 analytische Maschenweite von Sieben
mit rostfreien Stahlmaschen, um einen gewünschten Bereich von Partikelgröße zu produzieren.
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In
einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
kann ein poröses
Polyurethan-Schichtmaterial
hergestellt sein durch Lösen
eines Polyetherurethans in einem organischen Lösungsmittel wie N-methyl-2-pyrrolidon;
Mischen in die resultierende Polyurethanlösung eines Kristallins, Partikelmaterials wie
ein Salz oder Zucker, welches nicht in dem Lösungsmittel löslich ist;
Gießen
der Lösung
mit Partikelmaterial in einen dünnen
Film; und dann Anwenden eines zweiten Lösungsmittels wie Wasser, um das
Partikelmaterial zu lösen
und zu entfernen, dadurch eine poröse Schicht hinterlassend. Ein
Teil des Partikelmaterials kann innerhalb des Films bleiben. Demzufolge
ist es bevorzugt, dass das feste Partikelmaterial biokompatibel
ist. Arzneimittel, zum Beispiel, aber nicht begrenzt auf Antikoagulationsmittel
wie Heparin, Warfarin, Aspirin, Hirudin und Gewebe-Plasminogen-Aktivator,
oder nicht inflammatorische Mittel wie Dexamethason, Beclometason,
Cyclosporin und Superoxiddismutase, können vor der Implantation in
den IPG in einem Umfang, der effektiv ist, um Thrombose oder Inflammation
zu verhindern oder zu begrenzen, inkorporiert werden. Ein Arzneimittel-Immersionsverfahren
kann verwendet werden, um das Arzneimittel zu inkorporieren. Eine
Lösung des
Arzneimittels kann alternativ zu der Zeit zugefügt werden, wenn die Polynukleotide
oder die Zellen zu dem IPG zugefügt
werden. Das Arzneimittel kann auch in die Polymermatrix inkorporiert
werden, bevor es vollständig
polymerisiert ist. Zum Beispiel kann pulverisiertes Arzneimittel
auf den IPG während
des Polymerisationsprozesses gestäubt werden.
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Die
Form des Polymerfilms oder -beschichtung kann modifiziert werden,
basierend auf den Verfahren, die verwendet werden, um den IPG zu
bedecken. Es kann auf dem IPG sprühbeschichtet werden, oder ein
Film kann über
den IPG gegossen bzw. geformt werden. Die erste Polymerzusammensetzung
dieser Erfindung kann zumindest einen Abschnitt des IPGs bedecken.
Der IPG kann auch innerhalb einer Form positioniert sein, und die
Verbindungen bzw.
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Mischungen
bilden die erste Polymerzusammensetzung aus, die in die Form inkorporiert
ist. Die erste Polymerzusammensetzung, die eine Schicht oder Hülse bildet,
kann in einer verlängerten
Form präpariert
werden und dann in eine Endform gepresst oder dehydriert werden,
um über
den IPG zu passen.
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Polynukleotide
oder Zellen können
zum IPG zugefügt
werden durch Mischen der Monomerlösung der ersten Polymerzusammensetzung
mit Polynukleotiden oder Zellen oder durch direktes Anwenden der Polynukleotide
oder Zellen an die polymerisierte Zusammensetzung. In einem Aspekt
werden Polynukleotide oder Zellen zu dem IPG zur Zeit der Bildung
der ersten Polymerzusammensetzung zugeführt.
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Alternativ
können
die Polynukleotide oder Zellen zum Polymer, das den IPG beschichtet,
entweder zur Zeit der Vorrichtungsherstellung oder durch den Arzt/Mediziner
vor der Vorrichtungsimplantation zugeführt werden. Wenn die erste
Polymerzusammensetzung imstande ist zur Dehydrierung und Rehydrierung,
kann der IPG in einer sterilen, dehydrierten Form bereitgestellt
werden, und Polynukleotide und Zellen können zum IPG durch Rehydrierung
der ersten Polymerzusammensetzung zugeführt werden, positioniert auf
dem IPG durch Eintauchen in, Dochten oder Besprühen mit einer Flüssigkeit,
die die Polynukleotide oder Zellen auf der IPG vor der IPG-Implantation
beinhalten. Ein Beispiel für solch
eine Flüssigkeit
zur Addition von Polynukleotiden ist zum Beispiel 10 mM Tris-HCl
und 1 mM EDTA, ungefähr
pH 7,4 bis ungefähr
pH 8,0 (TE Puffer) und dergleichen. Ein Beispiel von solch einer
Flüssigkeit
zur Addition von Zellen ist zum Beispiel eine neutrale Salzlösung, die
HBSS oder ein Gewebe-zellkulturmedium und dergleichen umfasst. Die
Flüssigkeit, die
verwendet wird, um Polynukleotide oder Zellen zu der ersten Polymerbeschichtung
abzugeben, sollte die Stabilität
der Polynukleotide und Zellen unterstützen und sollte pH-gepufferte
Lösungen
umfassen, in einer Form, die biokompatibel und vorzugsweise nicht
immunogen ist. Optional kann die Flüssigkeit Stabilisatioren wie
Albumin, Glyzerin oder dergleichen umfassen. Optional können die
Polynukleotide in Assoziation mit Zusammensetzungen, die Abgabe der
Polynukleotide an eine Zelle unterstützen, vorhanden sein. Solche
Zusammensetzungen umfassen Liposome und Kondensationsmittel und
werden hier im Detail beschrieben. Wenn die Polynukleotide oder
Zellen in eine Polymerlösung
für Sprühapplikationen
oder Luftpumpenapplikationen inkorporiert sind, sollte das Polymer
ausreichend dünnflüssig sein,
um die Applikation der Lösung
an den IPG zu ermöglichen.
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In
einem anderen Aspekt des IPGs dieser Erfindung kann eine zweite
Polymerzusammensetzung über
die erste Polymerzusammensetzung anschließend oder zur Zeit des Zufügens der
Polynukleotide oder Zellen zugefügt
werden. Bevorzugter Weise ist die zweite Polymerzusammensetzung
biologisch abbaubar, und die zweite Polymerzusammensetzung beschichtet
zumindest einen Abschnitt der ersten Polymerzusammensetzung und
Polynukleotide. Zum Beispiel, nachdem die Polynukleotide oder Zellen
zu einem IPG, der eine darauf beschichtete erste Polymerzusammensetzung
aufweist, zugeführt
sind, kann der IPG mit einer Lösung
besprüht
oder in eine Lösung
eingetaucht werden, um eine Beschichtung eines biologisch abbaubaren
Polymers zu bilden, wie Kollagen, Gelatine, Polymilchsäure oder
Methylzellulose, mit oder ohne einer koagulationshemmenden oder
anti-inflammatorischen Verbindung bzw. Mischung. Vorteilhafter Weise
stellt die zweite Polymerschicht sogar größere anhaltende Freisetzungsvermögen bzw.
-fähigkeiten
zur Verfügung.
Geeignete Polymere zum Verwenden in der zweiten Polymerzusammensetzung
umfassen diese für
die erste Polymerzusammensetzung oben aufgelisteten, sind aber darauf
nicht begrenzt, und Zusammensetzungen davon oder eine breite Vielfalt
von anderen typischer Weise als in IPGs als nützlich offenbarten.
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Die
Polynukleotide oder Zellen können
auch in ein mikroskopisches Container-Vehikel, das stimuliert werden
kann, um Polynukleotide oder die antimikrobischen Peptide, die durch
die Zellen exprimiert sind, eingefügt werden. Dieses mikroskopische
Container-Vehikel kann auf der Abgabevorrichtung direkt oder in
oder auf einer Polymerbeschichtung oder -film beschichtet werden.
Die Polynukleotide oder Zellen sind in solch einem Vehikel eingeschlossen bzw.
beigefügt.
Bei Stimulierung des Container-Vehikels werden die Polynukleotide
oder die antimikrobischen Peptide, die durch die Zellen exprimiert
sind, aus dem Container-Vehikel freigesetzt. Stimulierung der Container-Vehikel
kann ausgebildet werden, verwendend eine Vielfalt von Techniken,
die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
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Beispiele
für mikroskopische
Container-Vehikel umfassen jene, die in den Internationalen Patentanmeldungen
Nrn. WO 96/28841 (Ohman) und WO 96/34417 (Smela et al.) und Smela
et al., Science, 268, 1735-1738 (1995), welche mikrobearbeitete
Strukturen und Mikroaktuatoren offenbaren, sind aber darauf nicht
beschränkt.
In einem Beispiel umfassen solche mikrobearbeiteten Strukturen leitende Doppelschichten,
die aus einer Polymerschicht und einer Goldschicht ausgebildet sind,
die als Bindeglieder verwendet werden, um starre bzw. unbiegsame Platten
gegenseitig und mit einem Silikonsubstrat zu verbinden. Das Biegen
der Bindeglieder ist elektrisch gesteuert und reversibel, drei-dimensionale
Positionierung der Platten ermöglichend.
Das Verwenden von unterschiedlicher Adhäsion ermöglicht, dass die Strukturen
aus dem Silikonsubstrat freigesetzt werden. Deshalb können komplexe
Formen, wie Würfel, in
der Größenordnung
von Mikrometern gebildet werden, die verwendet werden können, um
Polynukleotide oder Zellen in Verbindung mit einer medizinischen
Vorrichtung wie einem IPG zu umfassen bzw. aufzunehmen, bis sie
für therapeutische
oder vorbeugende Behandlung benötigt
werden.
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Mikroskopische
Container-Vehikel können auch
Mikropumpen, Reservoire mit piezoelektrischen Ventilen enthalten.
Der Körper
der Pumpe oder des Reservoirs kann aus einem Polymermaterial ausgebildet
sein, während
die Ventile ein piezoelektrisches Material, welches das Öffnen und
Schließen
der Ventile und der Pumpbewegungen durch elektrische Stimulation
ermöglicht,
umfassen. Die Reservoirs umfassen die Polynukleotide oder Zellen.
Bei Stimulation des piezoelektrischen Materials wird das Ventil geöffnet; um
die Polynukleotide oder die antimikrobischen Peptide, die durch
die Zellen exprimiert sind, freizusetzen. Implantierbare piezoelektrische
Pumpen sind bekannt (siehe zum Beispiel US Pat. Nr. 4,944,659 (Labbe
et al.)) und können
durch einen Fachmann modifiziert werden, um Container-Vehikel für die vorliegende
Erfindung zu bilden.
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Die
vorliegende Erfindung kann in Verfahren verwendet werden zur lokalen
Abgabe eines Polynukleotids an einen Patienten oder zur lokalen
Abgabe einer Zelle, die ein antimikrobisches Peptid codiert, an
einen Patienten. Die Verfahren umfassen das Bereitstellen einer
medizinischen Vorrichtung, die einen Träger umfasst, der ein Polymer,
das mit ihm assoziiert ist, aufweist, und ein Polynukleotid, welches
zumindest mit einem Abschnitt des Polymers assoziiert ist. Alternativ
umfassen die Verfahren das Bereitstellen einer medizinischen Vorrichtung,
die einen Träger und
ein Polymer umfasst, und eine Zelle, die mit zumindest einem Abschnitt
des Polymers assoziiert ist. Die Zelle exprimiert ein antimikrobisches
Peptid.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung einer
medizinischen Vorrichtung zur lokalen Abgabe eines Polynukleotids
oder zur lokalen Abgabe einer Zelle, die ein antimikrobisches Peptid
codiert, zur Verfügung.
Die IPGs dieser Erfindung können
in einer sterilen, dehydrierten Form, in einer hydrierten Form mit
Polynukleotiden oder Zellen oder als ein erstes Polymer, das den
IPG, bereitgestellt mit den erforderlichen Materialien, bedeckt,
zur Verfügung
gestellt werden, um das Zufügen
der Polynukleotide oder Zellen und ferner die Beschichtung oder
Bedeckung des IPGs wie benötigt
zu ermöglichen.
Deshalb bezieht sich diese Erfindung auch auf ein Set, das einen
IPG mit einer ersten Polymerzusammensetzung umfasst, Puffer entsprechend
zum Rehydrieren des IPGs und Zufügen
der Polynukleotide oder Zellen und einen Container bzw. Behälter, um
sterile Addition der Polynukleotide an den IPG zu ermöglichen.
Optional kann das Set ferner auch Beschichtungen oder Bedeckungen
umfassen; um über
die erste Polymerzusammensetzung angewandt zu werden. In einem bevorzugten
Aspekt umfasst das Set folgendes: einen IPG, der eine Fläche umfasst,
die das Gewebe eines Patienten berührt, und eine erste Polymerzusammensetzung,
die zumindest einen Abschnitt der Fläche des IPGs bedeckt; eine
Polynukleotid-Additionszusammensetzung
oder Zellen-Additionszusammensetzung, um an dem IPG angewendet zu
werden; und einen Container, um den IPG und die Zusammensetzung
während
der Anwendung der Polynukleotid-Additionszusammensetzung oder Zellen-Additionszusammensetzung
aufzunehmen.
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Polynukleotide
-
Die
Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können mit den medizinischen
Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung assoziiert werden oder können in
eine Zelle inkorporiert werden, die mit den medizinischen Vorrichtungen
der vorliegenden Erfindung assoziiert ist. Solche Zellen werden
hier in dem Abschnitt mit dem Titel „Zellen, die ein antimikrobisches
Peptidexperiment" beschrieben.
Die Polynukleotide umfassen einen Codierungsbereich, der ein Peptid
codiert, vorzugsweise ein antimikrobisches Peptid. Auf antimikrobische
Peptide wird auch im Stand der Technik als Peptid-Antibiotika Bezug
genommen. Ein antimikrobisches Peptid ist ein Peptid, das das Wachstum
oder das Töten
von Pathogenen, das heißt,
Mikroorganismen, die Krankheiten verursachen, inhibiert. Typischer
Weise ist ein antimikrobisch es Peptid zwischen ungefähr 5 Aminosäuren bis
ungefähr
150 Aminosäuren
lang.
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Die
antimikrobischen Peptide, codiert durch die Polynukleotide, die
mit den medizinischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung assoziiert sind,
helfen bei der Prävention
oder Behandlung von medizinisch vorrichtungs-assoziierten Infektionen. Die
Polynukleotide werden aus dem Träger
freigesetzt und durch die Zellen, die benachbart zum Träger in dem
Patienten sind, aufgenommen, zum Beispiel Zellen, die in dem Gewebe,
das die Wand der Tasche, in welche der Träger implantiert worden ist, bildet,
vorhanden sind. Bevorzugter Weise werden die Polynukleotide aus
dem Träger über eine
Zeitdauer freigesetzt (das heißt,
es gibt eine anhaltende Freisetzung der Polynukleotide), vorzugsweise
während
der ersten 14 Tage nach der Implantation, insbesondere während der
ersten 7 Tage nach der Implantation.
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Die
Infektionen können
durch Krankheitserreger, die Viren, Fungi bzw. Pilze oder Bakterien
umfassen, verursacht werden. Die Bakterienarten, die medizinische
vorrichtungs-assoziierte Infektionen verursachen können, umfassen
gram-positive und gram- negative Bakterien, die zum Beispiel Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus spp. und Enterococcus
spp. umfassen.
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Ein
Polynukleotid, das ein antimikrobisches Peptid codiert, kann zum
Beispiel erlangt werden von Insekten-, bakteriellen, amphibischen,
marinen, Säugetier-
und Pflanzenquellen. Bevorzugter Weise ist das Polynukleotid von
einem Menschen. Ob das Peptid, das durch ein Polynukleofid codiert
wurde, ein antimikrobisches Peptid ist, kann durch bekannte Verfahren
des Standes der Technik getestet werden. Zum Beispiel offenbart
Turner et al. (Antimicrobische. Agens Chemother, 42, 2206-2214 (1998))
radiale Diffusionsuntersuchungen, Bouillon-Mikrodosieruntersuchungen und Kolonienzähluntersuchungen,
um die antimikrobischen Eigenschaften eines Peptids zu messen. Die
antimikrobischen Eigenschaften eines Peptids können auch durch Evaluierender
Membran-Permeabilisierung gemessen werden, zum Beispiel die Membran-Permeabilisierung
der inneren und äußeren Membranen
von zum Beispiel E. coli (Turner et al., Antimicrobische. Agens
Chemotherapie 42, 2206-2214 (1998)). Andere Verfahren zum Testen
der antimikrobischen Eigenschaften eines Peptids sind zum Beispiel
verfügbar
bei Steinberg et al. (In: Methods in Molecular Biology, Vol. 78:
Antibacterial peptide protocols, Shafer (ed.), Humana Press, Totowa,
New Jersey, pp. 169-186 (1997)). Ohne die Absicht, einschränkend zu
sein, Beispiele von Polynukleotiden, die antimikrobische Peptide
codieren, umfassen Thrombozyten (siehe Krijgsveld et al., J. Biol.
Chem., 275, 20374-20381
(2000) und die Codierungssequenzen, offenbart in den folgenden GenBank
Zugriffsnummern; NM_021010, AJ277280, AF295370, AJ237673, AF217245,
NM_004345, AF071216, U50931, AF040153, Z71389, U73945, M97925, Z38026.
Optional kann ferner ein Polynukleotid, das ein antimikrobisches
Peptid codiert, einen Codierungsbereich umfas sen, der ein Signalpeptid codiert.
Nukleotid-Sequenzen, die viele Signalpeptide codieren, sind aus
dem Stand der Technik bekannt und können an einen Codierungsbereich
derart gebunden werden, dass die Nukleotide ein Signalpeptid codieren
und die Nukleotide, die einen Codierungsbereich umfassen, benachbart
und in dem gleichen Leserahmen sind.
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Der
Codierungsbereich, der die antimikrobischen Peptide codiert, ist
typischer Weise in einen Vektor eingefügt. Ein Vektor ist ein replizierendes
Polynukleotid, wie ein Plasmid-Vektor, rivaler Vektor, Cosmid-Vektor
oder künstlicher
Chromosom-Vektor, an welchen ein anderes Polynukleotid angefügt werden
kann, um die Replikation des angefügten Polynukleotids zu bewirken.
Ein Vektor kann linear oder kreisförmig sein. Bevorzugter Weise
ist der Vektor ein Plasmid. Ein Vektor sieht die Expression des
antimikrobisch en Peptids, codiert durch den Codierungsbereich,
vor. Vektorkonstruktionen, die ein Polynukleotid der Erfindung enthalten,
verwenden Standard-Ligaturtechniken des Standes der Technik. Siehe
zum Beispiel Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or Ausubel, R.M., ed.
Current Protocols in Molecular Biology (1994). Typischer Weise ist
ein Vektor zur Replikation in einem bakteriellen Wirt, zum Beispiel
E. coli, im Stande. Optional ist ein Vektor zur Replikation in einer
eukaryotischen Zelle im Stande. Bevorzugter Weise integriert sich
ein Vektor nicht in die genomische DNA, vorhanden in einer eukaryotischen
Zelle.
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Ein
Vektor umfasst optional Regulatorsequenzen, die an den Codierungsbereich
wirksam gebunden sind. Die Erfindung ist nicht durch das Verwenden
eines beliebigen Partikel-Promoters
beschränkt,
von denen eine breite Vielfalt bekannt ist. Promoter wirken als
Regulatorsignale, die RNA-Polymerase in einer Zelle binden, um Transkription
eines Codierungsbereichs stromabwärts (3'Richtung) zu initiieren. Der Promoter;
der in der Erfindung verwendet wird, kann ein konstitutiver oder
ein induzierbarer Promoter sein. Er kann mit Bezug auf den Patienten, der
die medizinische Vorrichtung erhält,
heterolog sein, muss aber nicht.
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Promotersequenzen
sind für
Eukaryoten bekannt. Wirksam an die meisten eukaryotischen Codierungsbereiche
gebunden, ist ein AT-reicher Bereich, der ungefähr 25 bis 30 Basen stromaufwärts von
der Stelle, wo Transkription initiiert wurde, lokalisiert. Häufig ist
eine andere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromaufwärts von
dem Start der Transkription gefunden wurde, der CXCAAT-Bereich,
wo X ein beliebiges Nukleotid sein kann. Wirksam an die 3'Enden der meisten
eukaryotischen Codierungsbereiche gebunden, ist eine AATAAA-Sequenz, die ein
Signal zur Addition von dem Poly A-Rest an dem 3'Ende des mRNA, das aus der Transkription
der Codierungssequenz resultiert, sein kann. Diese Sequenzen können entsprechend
in einen Vektor eingefügt
werden. Der Promoter, der normalerweise an einen Codierungsbereich,
der ein antimikrobisches Peptid codiert, wirksam gebunden ist, kann
auch verwendet werden.
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Transkription
eines Codierungsbereichs, der ein antimikrobisches Peptid codiert,
aus Vektoren in der Zelle eines Patienten, der eine medizinische
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung erhält, kann zum Beispiel durch
Promoter, die aus den Genomen von Viren wie Polyoma-Virus, Hühnerpocken-Virus,
Adenovirus, (wie Adenovirus 2), Bovine-Papillomavirus, Hühner-Sarkom-Virus,
Cytomegalovirus, einem Retrovirus und Hepatitis-B-Virus enthalten
sind, gesteuert werden.
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Transkription
in einer Zelle des Patienten eines Codierungsbereichs, der ein antimikrobisches Peptid
codiert, kann durch Einsetzen einer Verstärker-Sequenz in den Vektor
gesteigert werden. Verstärker
sind cis-wirkende Elemente der DNA, die üblicherweise etwa 10 bis 300
Nukleotide aufweisen, die auf einen Promoter wirken, um ihre Transkription zu
steigern. Verstärker
sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig, es sind 5' und 3' Codierungsbereiche
gefunden worden, innerhalb eines Introns sowie innerhalb der Codierungssequenz
selbst. Viele Verstärker-Sequenzen
sind nun aus Säugetiergenen (Globin,
Elastase, Albumin, Alpha-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Verstärker aus
eukaryotischen Zellviren sind ebenfalls bekannt und umfassen den SV40-Verstärker an
der späten
Seite des Replikationsursprungs, des Cytomegalovirus frühen Promoter-Verstärker, des
Polyoma-Verstärker
an der späten
Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Verstärker. Der
Verstärker
kann in den Vektor bei einer 5' oder
3' Position an den
Codierungsbereich, der ein antimikrobisch es Peptid codiert, gespalten werden,
ist aber bevorzugter Weise bei einer Stelle 5' des Promoters lokalisiert.
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Ein
Vektor kann optional eine Ribosom-Bindungsstelle (zum Beispiel eine
Kozak-Stelle) und eine Startstelle (zum Beispiel der Codon ATG)
umfassen, um Translation der transkribierten Nachricht zu initiieren,
um das antimikrobische Peptid zu produzieren. Er kann auch eine
Terminationssequenz zum Beenden der Translation umfassen. Eine Terminationssequenz
ist typischer Weise ein Codon, für
welches keine entsprechende Aminoacetyl-tRNA existiert, daher endet
die Peptid-Synthese. Der Vektor kann optional ferner eine Transkriptions-Terminierungssequenz
umfassen. Transkriptions-Terminierungssequenzen in Vektoren für eukaryotische
Zellen umfassen typischer Weise ein Polyadenylationssignal an 3' des Codierungsbereichs.
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Die
Polynukleotide, die als ein Teil der medizinischen Vorrichtung enthalten
sind, können
als nackte DNA vorhanden sein. Zum Beispiel können die Polynukleotide in
Lösung
aufgelöst
oder zum Beispiel durch Kalziumphosphat ausgefällt werden. Alternativ können die
Polynukleotide eingeschlossen werden. Zum Beispiel können die
Polynukleotide in einem synthetischen Lipid-Doppelschicht-Vesikel eingeschlossen
werden, zum Beispiel umfassend ein Liposom. Beispiele von Liposomen
umfassen multivesikuläre
Liposome, unilaminare Liposome, multilamellare Liposome und plurilamellare
Liposome. Liposom-Einkapselung kann das gesteuerte Freisetzen von
Polynukleotiden, die in den Liposomen vorhanden sind, bereitstellen.
Herstellungsverfahren von Liposomen, die die Freisetzungsrate eines
eingekapselten Materials in eine wässrige Umgebung steuern, sind
aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel U.S. Pat.
Nr. 5,993,850 (Sankaram et al.); und U.S. Pat. Nr. 5,077,056 (Bally
et al.)). Die Polynukleotide können
kondensiert sein. Kondensierte DNA ist DNA, die zu isolierten Sphären oder
Toroiden verdichtet bzw. zusammengedrängt wurde, so dass die Interaktion
der DNA mit der Lösung
minimal ist. DNA kann in einen kondensierten Zustand durch Neutralisierung
ihrer Ladung verdichtet werden, zum Beispiel durch Addition eines
Polykations, oder anderweitig ihre Interaktionen mit der Lösung reduzieren.
Jedoch kann das Polykation Aggregation oder Ausfällung der DNA verursachen,
wenn ein chaotropes Agens bzw. Mittel nicht verwendet wird, um es
zu verhindern. Verdichtung kann daher durch vernünftiges Verwenden sowohl von
dem Polykation (um die DNA zu kondensieren) als auch (wie benötigt) von
einem chaotropen Agens (um Aggregation oder Ausfällung zu verhindern) ausgeführt werden.
Verfahren zum Kondensieren von DNA sind aus dem Stand der Technik
bekannt, siehe zum Beispiel U.S. Pat. Nr. 5,877;302 (Hanson). Beispiele
von Polykationen umfassen zum Beispiel Polylysin, Arg-Lys gemischte Polymer,
Polyarginin, Polyornithin, Histonen, Avidin, Protaminen und Polyethylenimin.
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Optional
kann ein Polynukleotid, das eingekapselt oder kondensiert ist, wirksam
auf ausgewählte
Zellarten, bevorzugter Weise Granulozyten, Monozyten, Makrophagen,
Neutrophilen, Thrombozyten, T-Zellen, B-Zellen oder Fibroblasten
gerichtet sein. Ein Verfahren, das verwendet wird, um Liposome wirksam
auf ausgewählte
Targetzellen zu führen
bzw. zu richten, umfasst die Bindung von Antikörpern, die insbesondere an
ein Epitop an die Fläche
der Targetzelle binden. Verfahren zum Züchten von Antikörpern gegen
Zellen, Zellmembranen oder isolierte Zellflächenantigene sind aus dem Stand
der Technik bekannt. Ein anderes Verfahren, das verwendet wird, um
Liposome wirksam auf ausgewählte
Targetzellen zu führen,
umfasst die Bindung von Rezeptorliganden an die Fläche der
eingekapselten oder kondensierten Polynukleotide. Bevorzugter Weise
ist der Rezeptorligand kovalent. gebunden, zum Beispiel durch Vernetzung
der Liganden mit der Fläche
der eingekapselten oder kondensierten Polynukleotide. Bevorzugter
Weise ist ein Rezeptorligand insbesondere durch einen Rezeptor,
der durch die Targetzellen getragen wird, gebunden. Eine Klasse
von Rezeptorliganden von Bedeutung sind Kohlenhydrate, insbesondere
Mono- und Oligosaccharide. Geeignete Liganden umfassen Galaktose,
Lactose und Mannose. Zum Beispiel kann Mannose wie ein Rezeptorligand verwendet
werden, um die Polynukleotide auf Makrophagen und Monozyten zu richten,
und Mannose-6-Phosphate können
wie ein Rezeptorligand verwendet werden, um die Polynukleotide auf
Fibroblasten zu richten.
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Zellen, die ein antimikrobisches
Peptid exprimieren
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Zellen,
die geeignet für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, umfassen eine
breite Vielfalt von eukaryotischen Zellen, die antimikrobische Peptide
exprimieren. Die Zellen (zum Beispiel ein Makrophag) können ein
antimikrobisches Peptid natürlich
exprimieren. Alternativ können
die Zellen modifiziert werden, um ein Polynukleotid, das hier beschrieben
wurde (siehe den Abschnitt mit dem Titel „Polynukleotide"), zu enthalten,
derart, dass die Zelle ein antimikrobisches Peptid exprimiert. Eine
Zelle, die ein antimikrobisches Peptid (zum Beispiel ein Makrophag)
auf natürliche
Weise exprimiert, kann modifiziert werden, um ein Polynukleotid,
das ein antimikrobisches Peptid codiert, zu enthalten. Bevorzugter Weise
sind die Zellen, die mit einer medizinischen Vorrichtung assoziiert
sind, auch fähig,
die antimikrobisch en Peptide zu sekretieren. Geeignete Zellen zum
Verwenden in der vorliegenden Erfindung umfassen typischer Weise
inflammatorische Zellen, die zum Beispiel Makrophagen umfassen.
Andere geeignete Zellen sind Mesenchymzellen oder Mesodermalzellen,
die Endothelzellen und Fibroblasten umfassen, aber darauf nicht
beschränkt
sind, ob sie autolog oder allogen, gentechnisch verändert oder
nicht modifiziert sind, um ein Polynukleotid, das ein antimikrobisches
Peptid codiert, zu enthalten. Mischungen bzw. Mixturen von solchen
Zellen können
auch verwendet werden. Inflammatorische Zellen sind insbesondere
zum Verwenden in der vorliegenden Erfindung geeignet, da sie antimikrobische
Peptide natürlich
exprimieren.
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Bevorzugter
Weise sind die verwendeten Zellen geeignet, modifiziert zu werden,
um ein Polynukleotid, das ein antimikrobisches Peptid codiert, zu enthalten,
zum Beispiel durch ex vivo Gentransfer. Ex vivo Gentransfer ist
ein Prozess, durch den Zellen aus einem Körper entfernt werden, bevorzugter
Weise dem Körper
des Patienten, der den IPG erhält, und
unter Verwendung bekannter Techniken genetisch verändert werden,
gewöhnlicher
Weise durch die Einführung,
zum Beispiel durch Transfektion, von Polynukleotiden in die Zellen
in vitro.
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Die
modifizierten Zellen werden dann an den Körper für therapeutische Zwecke zurückgegeben. Ein
Polynukleotid, das in eine Zelle eingeführt worden ist, zum Beispiel
durch ex vivo Gentransfer, wird als ein eingebrachtes bzw. eingesetztes
Polynukleotid bezeichnet. Ex vivo Gentransfer ist ein effektiver Ansatz,
da die Targetzellen, die in der Prozedur verwendet werden, wie benötigt manipuliert
werden können,
um Gentransfereffizienz und dadurch die Effektivität der gesamten
Prozedur zu optimieren. Typischer Weise verwendet der ex vivo Gentransfer
Zelltypen, die aus dem Körper
leicht erhalten werden können,
ex vivo kultiviert und dann an den Körper zurückgegeben werden können. Solche
Zellen umfassen Blut- und Knochenmarkzellen, Leder- Hepatozyten,
Haut- Fibroblasten, Muskel- Myoblasten, Vaskular-Endothelzellen und inflammatorische
Zellen.
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Es
gibt eine breite Vielfalt von Verfahren, die verwendet werden können, um
Polynukleotide an die eukaryotischen Zellen abzugeben, wenn sie
modifiziert werden, um ein antimikrobisches Peptid zu exprimieren,
insbesondere zu sekretieren. Diese sind für Fachleute bekannt. Die gewünschten
Polynukleotide können
in einen zugehörigen
bzw. entsprechenden Vektor eingefügt werden. Es gibt eine Anzahl
von Viren, lebend oder inaktiv, die rekombinante Viren, die auch
verwendet werden können,
enthalten. Ein Retrovirus kann gentechnisch verändert werden, um eine beliebige
Vielfalt von Codierungsbereichen zu bieten. Adenovirus ist in einer
Vielfalt von Experimenten verwendet worden, um Polynukleotide abzugeben,
die fähig
sind, ein Polypeptid in ein Zelle zu bringen und zu exprimieren.
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Abhängig von
der maximalen Genomgröße, das
ein besonderes Virusgenom akkommodieren kann oder das mit einem
Viruspartikel assoziiert werden kann, kann der Virus, der ein Polynukleotid
an die Zelle abgibt, ein Polynukleotid, das ein oder mehrere Polypeptide
codiert, umfassen. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Endothelzellen von einem Patienten
erhalten und in Zellkultur gezüchtet.
Während
der Proliferation in der Zellkultur werden sie mit einem gentechnisch
veränderten
Retrovirus infiziert, der den Codierungsbereich, der das antimikrobische
Peptid in die Chromosome der infizierten Zellen codiert, integriert.
Dies kann zum Beispiel gemäß den Lehren
von U.S. Pat. Nr. 5,674,722 (Mulligan et al.) und Dichek et al.,
Mol. Biol. Med., 8, 257-266 (1991) ausgeführt werden.
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Die
Zellen können
direkt auf den Träger
beschichtet und durch ein Polymer bedeckt, inkorporiert in das Polymer,
oder oben auf eine Polymerbeschichtung oder -film auf den Träger beschichtet
werden. Sie können
auch innerhalb eines mikroskopischen Container-Vehikels enthalten
sein, das stimuliert werden kann, um das antimikrobische Peptid,
exprimiert durch die Zellen, freizusetzen. Das mikroskopische Container-Vehikel
kann auf den Träger
beschichtet und durch ein Polymer bedeckt, inkorporiert in das Polymer,
oder oben auf eine Polymerbeschichtung oder -film auf den Träger beschichtet
werden. Bevorzugter Weise exprimieren die Zellen das antimikrobische
Peptid über
eine Zeitdauer, insbesondere während
der ersten 14 Tage nach der Implantation, im Spezielleren während der
ersten 7 Tage nach der Implantation.
-
Die
vorhergehenden speziellen Ausführungsformen
sind für
die Anwendung der Erfindung illustrativ. Es ist daher zu verstehen,
dass andere Zweckmäßigkeiten,
die Fachleuten des hier Offenbarten bekannt sind, verwendet werden
können, ohne
von der Erfindung abzuweichen, welche durch die beiliegenden Ansprüche definiert
wird.