DE60110593T2

DE60110593T2 - Entfernung von zellen mit viren

Info

Publication number: DE60110593T2
Application number: DE60110593T
Authority: DE
Inventors: L. Harold ATKINS; C. John BELL; J. Conrad HEILMAN; D. Brian LICHTY; M. Robert LORENCE; S. Michael ROBERTS; F. David STOJDL
Original assignee: University of Ottawa; Wellstat Biologics Corp
Current assignee: University of Ottawa; Wellstat Biologics Corp
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2021-06-27
Also published as: AU7926401A; HK1052950B; AU2001279264B2; CA2412493A1; EP1297121A2; WO2002000233A2; ZA200300016B; US20040109878A1; CN1250711C; JP2013075921A; US7192580B2; IL153570A; US20020037543A1; WO2002000233A3; DE60110593D1; CN1454254A; ATE294858T1; HK1052950A1; RU2270685C2; US20070141033A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf Viren, die in der Lage sind, unerwünschte Zellen aus einer Zellmischung abzureinigen (zu reduzieren oder zu eliminieren). Unerwünschte Zellen schließen neoplastische Zellen ein. Die gegenständliche Erfindung bezieht sich ebenfalls auf das Reinigen unerwünschter Zellen aus Knochenmark- oder peripheren Blutzellernten bei der Behandlung von Säugern, einschließlich Krebspatienten und Transplantatempfängern.
Hintergrund der Erfindung
Ex-vivo-Reinigungstechniken zeigten einen begrenzten Erfolg für die autologe Knochenmark- oder Stammzelltransplantation in Patienten mit Leukämie oder anderen Malignitäten. Ein Ziel der Reinigung von Knochenmark oder peripheren Blutvorläuferzellen (PBPC) ist, neoplastische Zellen zu entfernen, während sie nur eine geringe Wirkung auf normale Stammzellen und hämatopoetische Vorläuferzellen hat. Die Transplantation des gereinigten Knochenmarks geschieht nach myeloablativer Therapie, wie einer Chemotherapie oder Bestrahlung mit hoher Dosis [siehe z. B. R. K. Stuart, 1993, Semin. Oncol. 20 (5 Suppl 6): 40–54); L. C. Hammert und E. D. Ball, 1997, Curr. Opin. Hematol., 4: 423–428; M. J. Schneidkraut, et al., 1996, J. Hematother., 5: 631–646]. Die Transplantation jeglicher neoplastischer Zellen mit dem Knochenmark unterwirft den Patienten dem Risiko für den Rückfall der Malignität (siehe z. B. S. A. Rummel und G. Van Zant, 1994, J. Hematother., 3: 213–218; G. Kvalheim et al., 1996, J. Hematother., 5: 427–436). Verfahren, die gegenwärtig Studien durchmachen, um selektiv neoplastische Zellen abzutöten, schließen die Verwendung chemotherapeutischer Mittel (wie 4-Hydroperoxycyclophosphamid; siehe z. B. J. M. Bird, 1996, Bone Marrow Transplant, 18: 309–313), mo noklonale Antikörper (siehe z. B. L. C. Hammert und E. D. Ball, 1997, Blood Rev., 11: 80–90), photodynamische Therapie (siehe z. B. L. Villeneuve, 1999, Biotechnol. Appl. Biochem., 30: 1–17) und virale Vektoren wie Adenovirus (siehe z. B. M. Hirai et al., 1999, Acta Haematol., 101: 97–105; F. C. Marini et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5: 1557–1568) ein. Experimente zeigten jedoch kürzlich, dass lebensfähige Krebszellen in dem Knochenmark oder den PBPC nach der therapeutischen Reinigung verblieben, was zu Rückfall der Malignität führte. Eine andere Hauptbegrenzung der gegenwärtigen Verfahren der Ex-vivo-Reinigung ist die verzögerte Transplantatinkorporation wegen Beschädigung normaler Stammzellen und/oder früher hämatopoetischer Vorläuferzellen (S. A. Rummel und G. Van Zant, 1994, J. Hematother., 3: 213–218; Damon et al., 1996, Bone Marrow Transplant., 17: 93–99). Vorläuferzellen, die aktiv proliferierend sind, sind folglich sehr empfindlich für das Abtöten durch die meisten chemotherapeutischen Mittel, einschließlich Hydroperoxycyclophosphamid. Der resultierende Verlust früher Vorläuferzellen bewirkt eine verlängerte Neutrocytopenie und/oder Thrombocytopenie, die den Patienten einem erhöhen Risiko für eine lebensbedrohliche Infektion und/oder Blutung unterwirft. Ein cytotoxisches oder cytolytisches Tumormittel, das normale hämatopoetische Zellen ausspart, ist ein wichtiger Fortschritt bei der Krebstherapie.
Die Behandlung von Neoplasmen mit Viren ist beschrieben in Belch et al., Blood, Band 92, Nr. 10, Suppl. 1, Teil 1–2, 1998-11-15, Seiten 104A–105A.
Die PCT-Anmeldungen von Roberts et al. (WO/9918799 und PCT US 98/21230) beziehen sich auf die Behandlung von Neoplasmen mit Viren.
Ziele der Erfindung
Es ist ein Ziel der Erfindung, Viren bereitzustellen für die Reduktion oder Elimination von unerwünschten Zellen in Mischungen aus erwünschten und unerwünschten Zellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Viren für die Reduktion oder Elimination neoplastischer Zellen in Mischungen normaler und neoplastischer Zellen bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel, Viren für die Ex-vivo-Reinigung neoplastischer Zellen aus normalen hämatopoetischen Zellen wie Knochenmark- oder peripheren Blutvorläuferzellen bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, die Verwendung von vesikulärem Stomatitisvirus bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs in einem Säuger bereitzustellen:

a) worin Knochenmark- oder periphere Blutzellen aus diesem Säuger entfernt worden sind,
b) worin diese Knochenmark- oder peripheren Blutzellen ex vivo mit dem vesikulären Stomatitisvirus in Kontakt gebracht werden,
c) worin eine myeloablative Behandlung an diesem Säuger durchzuführen ist, und
d) worin die gereinigten hämatopoetischen Zellen aus Schritt b) in diesen Säuger zu transplantieren sind.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, die Verwendung des vesikulären Stomatitisvirus bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs in einem Säuger, der ein Knochenmark- oder peripheres Blutstammzelltransplantatempfängt, bereitzustellen, worin:

a) die geernteten Zellen des Transplantates ex vivo mit vesikulärem Stomatitisvirus in Kontakt gebracht werden, und
b) die gereinigten Zellen diesem Säuger zu verabreichen sind.

Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reduktion oder Eliminierung neoplastischer Zellen in einer Ex-vivo-Mischung normaler hämatopoetischer Zellen und neoplastischer Zellen, umfassend das In-Kontakt-bringen dieser Mischung mit vesikulärem Stomatitisvirus.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von vesikulärem Stomatitisvirus bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs in einem Säuger:

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von vesikulärem Stomatitisvirus bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs in einem Säuger, der ein Knochenmark- oder peripheres Blutstammzelltransplantat empfängt, worin:

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung von Viren und die Verwendung von Viren für die Reduktion oder Elimination unerwünschter Zellen wie neoplastischer Zellen in einer Mischung aus erwünschten Zellen und unerwünschten Zellen. Diese Erfindung stellt Viren und Verfahren für die Abreinigung (Reduktion oder Eliminierung) unerwünschter Zellen von normalen Zellen unter Verwendung von Viren ex vivo bereit. Unerwünschte Zellen in hämatopoetischen Zelltransplantaten, die durch Viren in der vorliegenden Erfindung entfernt wurden, schließen neoplastische Zellen ein. Die Behandlung des Säugers besteht aus a) Entfernen von Knochenmark- oder peripheren Blutzellen aus diesem Säuger, b) Kontaktieren dieser Knochenmark- oder peripheren Blutzellen ex vivo mit einem Virus, c) Durchführen einer myeloablativen Behandlung an diesem Säuger und d) Transplantieren der gereinigten hämatopoetischen Zellen aus Schritt b) in diesem Säuger.
Verfahren der Erfindung
Reinigen neoplastischer Zellen
Die Inkubation von Mischungen normaler Zellen und neoplastischer Zellen mit Viren resultiert in der selektiven Abtötung der neoplastischen Zellen und nicht der normalen Zellen. Wirksame Mittel der Abreinigung neoplastischer Zellen von hämatopoetischen Zellen können bei der Behandlung von Krebs in Säugern mit autologer Knochenmark- oder peripherer Blutstammzelltransplantation verwendet werden. Zum Beispiel werden Knochenmark- oder periphere Blutstammzellen von einem Säuger mit einem Neoplasma mit einem Virus vor der Transplantation in Kontakt gebracht, um einen Rückfall an dem Neoplasma zu verhindern. Neoplastische Zellen, die durch die Verfahren der Erfindung gereinigt werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf (1) Leukämie, (2) Lymphom, (3) Karzinome wie Brustkrebs, Lungenkrebs, Colonkrebs, Prostatakrebs und Pankreaskrebs, (4) Sarkomen und (5) Krebsen neuroepithelialen Ursprungs wie Melanom und Neoblastom.
Diverse Viren wie RNS-Viren [wie z. B., jedoch nicht begrenzt auf vesikuläres Stomatitisvirus (VSV), Newcastle-Disease-Virus (NDV) und Reovirus] können verwendet werden, um neoplastische Zellen von normalen hämatopoetischen Zellen abzureinigen. Normale hämatopoetische Zellen sind gegen Infektion durch viele Viren, einschließlich RNS-Viren, resistent. Normale menschliche Knochenmarkzellen sind z. B. resistent gegen die Infektion durch VSV, einem Rhabdovirus, wie bestimmt sowohl durch die infektiöse Virusproduktion als auch durch die Lebensfähigkeit. Normale Knochenmarkzellen von zwei Donoren erzeugten kein infektiöses Virus, sogar wenn sie mit einer hohen Multiplizität der Infektion infiziert worden sind (z. B. zehn plaquebildende Einheiten (pfu)/Zelle; siehe Beispiel 1). Infizierte Knochenmarkkulturen waren von scheininfizierten Kulturen in ihrer Fähigkeit, das normale Spektrum hämatopoetischer Zelltypen nach In-vitro-Kultur in Methylcellulose auszubilden, nicht unterscheidbar. Als ein anderes Beispiel, mit CD34+ angereichertes normales menschliches Knochenmark war gegen Infektion durch NDV, ein Virus aus einer anderen Familie (Paramyxovirus) resistent; siehe Roberts et al., WO 99/18799.
Viele Arten neoplastischer Zellen sind hoch empfindlich gegen Zellabtötung durch viele Viren, einschließlich RNS-Viren. Als ein Beispiel, unter Verwendung von VSV waren die akuten myelogenen Leukämiezelllinien OCI/AML3, OCI/AML4 und OCI/AML5 hoch empfänglich für die VSV-Infektion mit 0,05 pfu/Zelle, wodurch 50% der Zellen nach 24 Stunden abgetötet wurden, und so wenig wie 0,0003 pfu/Zelle, wodurch 50% nach 48 Stunden abgetötet wurden (Beispiel 1). Der Indiana-Serotyp von VSV, der bei diesem Experiment verwendet worden ist, wurde in Maus-L929-Zelle vermehrt und daraus geerntet. Als ein anderes Beispiel, es wurde von diversen Tumorzelltypen gezeigt, dass sie empfindlich sind für VSV, einschließlich Ovarialkarzinom, Fibrosarkom, Lungenkarzinom, Melanom, Prostatakarzinom und Leukämiezellen (siehe Beispiel 3). NDV tötet ebenfalls die meisten menschlichen neoplastischen Zellen ab (siehe Roberts et al., WO 99/18799).
Die selektive Eliminierung neoplastischer Zellen aus einer Co-Kultur mit normalen hämatopoetischen Zellen kann mit einer Reihe von Viren erzielt werden. Zum Beispiel tötete VSV in Co-Kulturen von OCI/AML3-Leukämiezellen mit normalen Knochenmarkzellen (in einem Verhältnis von 1:9 und 1:3) sämtliche Leukämiezellen ab, während es nur eine geringe bis gar keine Wirkung auf die normalen hämatopoetischen Zellen hatte (Beispiel 2). Der Indiana-Serotyp von VSV, der in diesem Experiment verwendet wurde, wurde vermehrt und geerntet aus Maus-L929-Zellen. Diese Daten zeigen die selektive Zerstörung von Leukämiezellen in einer gemischten Population aus normalem Knochenmark und der Nutzen von Viren, wie VSV bei der Knochenmarkreinigung. Als ein anderes Beispiel wurde eine selektive Eliminierung neoplastischer Zellen in einer gemischten Kultur normaler Zellen mit NDV gezeigt. Der NDV-Stamm PPMK107, ein dreifach plaque-gereinigtes Isolat des mesogenen NDV-Stammes MK107, tötete menschliche Oralkarzinomzellen in einer gemischten Kultur mit normalen Fibroblasten selektiv ab (siehe Roberts et al., WO 99/18799).
Screening unerwünschter Zellen
Unerwünschte Zellen der vorliegenden Erfindung können neoplastische Zellen mit chromosomalen Deletionen oder Umordnungen eines Gens oder von Genen einschließen, die Proteine oder Modulatoren der zellulären Interferonantwort kodieren, oder die eine anderweitig defektive Interferonantwort beherbergen (O. R. Colamonici et al., 1992, Blood, 80: 744–749; M. Heyman et al., 1994, Leukemia, 8: 425–434; C. Billard et al., 1986, Blood, 67: 821–826). Die fein verteilte Natur von Knochenmark- oder PBPC-Populationen erlaubt die leichte Verwendung der Analyse mit dem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) bei der Bestimmung des Interferonansprechzustandes der Zelle. Sonden für das Interferonansprechen schließen chromosomale Hybridisierungssonden für Gendeletionen oder -umordnungen und Sonden, wie Antikörper für die Analyse zellulärer Rezeptoren und Bestandteile von Signaltransduktionswegen, die in die zelluläre Antwort auf Interferon verwickelt sind, ein.
Verbindungen der Erfindung
Die Viren der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, unerwünschte Zellen, wie neoplastische Zellen, von erwünschten Zellen, wie normale hämatopoetische Zellen, zu unterscheiden. Einzelsträngige Viren. Viren der Erfindung sind vesikuläres Stomatitisvirus (VSV).
Hierin beschrieben, sind die "Interferon-sensitiven Viren", beschrieben in Roberts et al., WO 99/18799. Die Viren replizieren und töten selektiv neoplastische Zellen ab, basierend auf dem selektiven Mangel dieser Zellen zu einer IFN-vermittelten antiviralen Antwort.
Die Rhabodovirusfamilie besteht aus eng verwandten, umhüllten, nicht segmentierten, negative-sense-RNS-Viren und schließt die folgenden Gattungen, die Tiere infizieren, ein: (1) die Vesikulovirus-Gattung (z. B. vesikuläres Stomatitisvirus, VSV), (2) die Lyssavirus-Gattung (z. B. Rabiesvirus) und (3) die Ephemerovirus-Gattung [B. Dietzschold et al., 1996, Rhabdoviruses. In: Fields Virology, 3. Auflage (Hrsg. B. N. Fields et al.), S. 1137–1159].
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das vesikuläre Stomatitisvirus (VSV) verwendet. Es wurden etliche serologisch unterschiedliche VSV-Stämme, zusammen mit einer Vielzahl charakterisierter Mutanten identifiziert. Die natürlichen Wirte von VSV schließen Insekten, Nager und domestizierte landwirtschaftliche Nutztiere ein. Allgemein kamen nur sehr wenige Personen Nordamerikas in Kontakt mit dem Virus, wobei sich die meisten menschlichen Infektionen Laborpersonal und Landwirte zugezogen hatten. Bei Menschen sind die Infektionen entweder symptomlos oder als erkältungsähnliche Symptome manifestiert. VSV-Stämme schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Indiana, New Jersey, Piry, Coccal und Chandipura. Während die hierin offenbarten Beispiele sich auf VSV-Indiana beziehen, sollte verstanden werden, dass ein Fachmann, indem er die in diesem Dokument umrissenen Verfahren befolgt, leicht in der Lage sein wird, andere VSV-Stämme und Derivate von VSV, einschließlich Mutanten von VSV, zu screenen, die selektiv neoplastische Zellen abtöten.
Für gewisse Zwecke ist es wünschenswert, ein klonales Virus zu gewinnen, um die genetische Homogenität eines bestimmten Virusstammes sicherzustellen oder zu steigern und um fehlerhafte, störende Partikel zu entfernen. Die Entfernung defekter störender Partikel sorgt für eine erhöhte Reinheit in dem Endprodukt, wie abgeschätzt durch die Anzahl der Gesamtviruspartikel pro infektiöses Partikel. Klonales Virus kann durch Plaquereinigung oder durch andere wie in Roberts et al., WO 99/18799, beschriebene Mittel erzeugt werden.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Virus genetisch modifiziert, wie z. B., um seine Selektivität für neoplastische Zellen zu steigern. Verfahren der genetischen Manipulation von Rhabdoviren wie VSV sind gut etabliert (A. Roberts und J. K. Rose, Virology, 1998, 247: 1–6), was es möglich macht, die genetischen Eigenschaften des Virus zu ändern.
Ferner können Standardtechniken, die Fachleuten wohl bekannt sind, verwendet werden, um VSV genetisch zu modifizieren und um gewünschte Gene in das VSV-Genom einzuführen, um rekombinante VSVs zu produzieren (z. B. Sambrook et al., 1989, A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press). In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann das G-Protein von VSV modifiziert werden, um Fusionen zu erzeugen, die spezifische Stellen auf Tumorzellen zum Ziel nehmen. In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das VSV genetisch geändert, um eines oder mehrere Suizidgene zu exprimieren, die in der Lage sind, eine Prodroge zu einem toxischen Metaboliten zu metabolisieren, wodurch den mit VSV infizierten Tumorzellen möglich gemacht wird, dass sie durch die Verabreichung einer Prodroge abgetötet werden. VSV, das modifiziert worden ist, um das Herpesvirusthymidinkinase- oder das Cytosindesaminasegen zu exprimieren, kann verwendet werden, um Gancyclovir bzw. 5-FC in eine toxische Verbindung umzuwandeln. Es wird jedoch verstanden, dass andere Suizidgene ebenfalls verwendet werden können.
Formulierung und Verabreichung
Hierin wird ein Kit für die Verwendung bei der Ex-vivo-Reinigung unerwünschter Zellen aus einer Mischung erwünschter und unerwünschter Zellen beschrieben. Der Kit schließt vorher abgemessene Mengen an formuliertem Virus oder Viren ein, die geeignet sind, eine Mischung zu behandeln, die eine gewisse Anzahl erwünschter und unerwünschter Zellen enthält. Vorteilhafte Formulierungen schließen Hilfsmittel ein, die das Virus gegen den Verlust an Infektiosität stabilisieren oder die die Lebensfähigkeit oder das Überleben der erwünschten Zellen fördern. Ein vorteilhafterer Kit erzeugt dafür, dass das Kontaktieren der Virusformulierung mit der Zielzellmischung in einem aseptischen Schritt geschieht, ohne den Bedarf für eine Bioeinschlussausrüstung. Ein Beispiel solch einer Vorrichtung ist ein kompartimentierter Sammelbehälter für die Zielzellmischung, der das zuvor abgemessene Virus in einem gesonderten Kompartiment enthält. Die Schaffung eines offenen Weges zwischen den Kompartimenten erlaubt den Kontakt zwischen dem Virus, der Zielzellpopulation und einem oder mehreren Hilfsmitteln. Kontakt mit dem Virus und Hilfsmitteln, falls getrennt, kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Ein weiteres vorteilhaftes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Typ eines kompartimentierten Behälters, der die optimale Temperatur für die Viruszellwechselwirkung während der Kontaktzeit zwischen dem Virus oder den Viren und der Zielmischung erwünschter und unerwünschter Zellen aufrechterhält. Eine andere vorteilhafte Ausführung der Erfindung bezieht sich auf einen Kit, der die Trennung der kontaktierten Mischung aus Zellen von dem Virus, den Hilfsmitteln oder beiden nach einer geeigneten Zeitdauer erlaubt. Die geeignete Kontaktzeit würde einem Fachmann bekannt sein oder von ihm bestimmt werden.
Geeignete Formulierungen für Viren der vorliegenden Erfindung schließen jene ein, die für Viren aufgelistet sind, die bei der Behandlung von Neoplasmen verwendet worden sind (Roberts et al., 1999, PCT WO 99/18799). Zusätzlich schließen vorteilhafte Formulierungen Verbindungen oder biologische Substanzen ein, die eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten auf die erwünschten Zellen in der Mischung aus erwünschten und unerwünschten Zellen haben: Differenzieren, Proliferieren, Aussparen, Stimulieren, Schützen und Induzieren von Inaktivität. Zum Beispiel schließen Verbindungen und biologische Substanzen dieser Typen Cytokine, Peptidregulatoren des Zellzyklus, Interleukine, Wachstumsfaktoren, Energiequellen, Vitamine und Elektrolyte ein. Andere wünschenswerte Hilfsstoffe schließen Kälteschutzverbindungen ein.
Es ist eine wirksame Virusmenge bei der Erfindung für die Reduktion oder Elimination der unerwünschten Zellen unter Aufrechterhaltung der erwünschten Zellen zu verwenden. Es wird von Fachleuten verstanden werden, dass die für die Reduktion oder Elimination der unerwünschten Zellen zu verwendende Virusmenge in Abhängigkeit von dem ausgewählten Virus, dem Typ und der Menge unerwünschter Zellen und dem Typ und der Menge zu bewahrender, wünschenswerter Zellen variieren wird. Zum Beispiel wird VSV in einer Konzentration von 0,00001 bis 10 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle verwendet und vorteilhafter von 0,0003 bis 10 pfu pro Zelle.
In einem anderen vorteilhaften Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Virus verwendet, um die Mischung neoplastischer Zellen und normaler Zellen in Kontakt zu bringen, die vor, während oder nach dem Kontakt mit Interferon behandelt werden. Interferon sorgt für den erhöhten Schutz normaler Zellen (siehe Beispiel und siehe Roberts et al., WO 99/18799). Das Interferon (IFN) wird aus der Gruppe mit Klasse-I-Interferon (Alpha, Beta und Omega) und Klasse-II-Interferon (Gamma) und rekombinanten Versionen und Analoga davon ausgewählt, wie z. B. diskutiert in T. Sreevalsoun, 1995 (in: Biologic Therapy of Cancer, zweite Auflage, herausgegeben von V. T. DeVita, Jr., et al., J. B. Lippincott Company, Philadelphia, S. 347–364).
In einem anderen vorteilhaften Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Virus verwendet, um die Mischung neoplastischer Zellen und normaler Zellen, die mit einem chemotherapeutischen Mittel vor, während oder nach dem Kontakt mit diesem Virus behandelt werden, in Kontakt zu bringen. Das chemotherapeutische Mittel wird verwendet, um weiter die Lebensfähigkeit der neoplastischen Zellen zu reduzieren.
Die folgenden Beispiele sind erläuternd, jedoch nicht begrenzend für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Andere geeignete Modifikationen oder Anpassungen einer Reihe von Bedingungen und Parametern, auf die man normalerweise bei der klinischen Therapie stößt und die für Fachleute offensichtlich sind, liegen im Sinn und Schutzumfang dieser Erfindung.
Beispiel 1: Selektive Abtötung von Leukämiezellen und anormalen Knochenmarkzellen durch vesikuläres Stomatitisvirus, wie bestimmt in gesonderten Zellkulturen
Der VSV-Serotyp Indiana wurde auf Maus-L929-Zellen plaque-gereinigt. Ein einzelner Plaque wurde verwendet, um eine Monoschicht aus L929-Zellen zu infizieren, und 18 Stunden später wurde der Überstand geerntet und der Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 Minuten ausgesetzt. Der geklärte Überstand wurde dann durch ein 0,2 Mikronfilter (Millipore) filtriert und wurde dann auf L-Zellen titriert und bei –80°C in Aliquoten gelagert. Einzelne Aliquoten des Virus wurden nur einmal verwendet.
Normale Knochenmarkkulturen aus zwei gesonderten, gesunden Donoren waren gegen die Infektion durch diesen Indiana-Serotyp des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) resistent. Normale Knochenmarkzellen produzierten keine infektiösen VSV-Partikel, sogar wenn sie mit einer Multiplizität der Infektion von 10 pfu/Zelle infiziert worden waren. Darüber hinaus waren die infizierten Knochenmarkkulturen nicht unterscheidbar von scheininfizierten Kulturen in ihrer Fähigkeit, das normale Spektrum hämatopoetischer Zelltypen nach In-vitro-Kultur in Methylcellulose auszubilden. Im Gegensatz dazu waren die AML-Zelllinien OCI/AML3, OCI/AML4 und OCI/AML5 hoch empfänglich für die VSV-Infektion mit 0,05 pfu/Zelle, wodurch 50% der Zellen nach 24 Stunden abgetötet wurden, und so wenig wie 0,0003 pfu/Zelle, wodurch 50% nach 48 Stunden abgetötet wurden.
Beispiel 2: Selektives Abtöten von Leukämiezellen durch vesikuläres Stomatitisvirus in gemischten Kulturen, die normale Knochenmarkzellen enthalten
Der in diesem Beispiel verwendete VSV-Serotyp Indiana wurde zubereitet, wie angegeben in Beispiel 1. In Co-Kulturen von leukämischen OCI/AML3-Zellen, gemischt mit normalen Knochenmarkzellen (Verhältnis 1:9) hatte VSV selektive oncolytische Eigenschaften. In diesem Experiment (Tabelle 1) wurden Co-Kulturen mit VSV mit einer Multiplizität der Infektion von 1 Plaque bildenden Einheit (pfu)/Zelle oder 5 pfu/Zelle für 24 Stunden infiziert und wurden dann in Methylcellulose mit oder ohne Wachstumsfaktoren ausplattiert. In der Anwesenheit von Wachstumsfaktor wuchsen sowohl normale Knochenmark- als auch Tumorzellen, während nur OCI/AML3-Zellen Kolonien in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren bildeten. Koloniezählungen wurden nach 14 Tagen durchgeführt (Tabelle 1) und zeigten eine vollständige Ablation wachstumsfaktorunabhängiger Leukämiezellen und das Verschonen von normalen Knochenmarkvorläuferzellen. Identische Ergebnisse wurden beobachtet, wenn eine 1:3-Mischung aus OCI/AML3-Zellen und normalen Knochenmarkzellen verwendet wurde. Diese Daten zeigen die selektive Zerstörung von Leukämiezellen in einer gemischten Population aus normalem Knochenmark und der Nutzen von VSV bei der Ex-vivo-Knochenmarkreinigung.
Tabelle 1. Selektive Abtötung akuter myelogener Leukämie-(AML-)Zellen, co-kultiviert mit normalem Knochenmark. Kolonien pro Schale (die 10⁴ Zellen empfingen), beobachtet zwei Wochen nach VSV-Infektion, werden unten in der Tabelle aufgeführt für neoplastische Zellen (Leukämie) und normale hämatopoetische Zellen (neutrophil, gemischt und Monocyten).
Beispiel 3: VSV wächst selektiv in und tötet neoplastische Zellen ab im Vergleich mit normalen Zellen, wie bestimmt in gesonderten Zellkulturen
Eine Reihe normaler und transformierter Zelllinien wurden entweder unbehandelt oder vorbehandelt mit 100 Einheiten IFN-Alpha, infiziert mit VSV-Indiana, mit einer MOI von 0,1 pfu/ml und für 18 Stunden bei 37°C inkubiert (Tabelle 2). Kulturmedien aus jeder Probe wurden für die VSV-Produktion titriert. Die Vorbehandlung der normalen Zellkulturen mit Interferon reduzierte die virale Produktion auf < 1000 infektiöse virale Partikel pro ml, während die Tumorzelllinien fortfuhren, reichliche Mengen an Viruspartikeln zu produzieren (10⁵–10⁸ plaquebildende Einheiten pro ml). In Tumorzellen wurde ein schnelleres und fulminanteres Wachstum von VSV beobachtet als in primären normalen Zellkulturen fibroblastischen oder epithelialen Ursprungs. Die Unterschiede zwischen den zahlreichen Zelltypen wurden nicht nur durch die Produktion von Viruspartikeln, sondern auch durch die cytopathischen Wirkung (cpe), die auf dem Niveau der Mikroskopie beobachtet wurde, widergespiegelt.
Tabelle 2. Virusausbeute an VSV nach Übernachtinfektion zahlreicher Zelllinien, entweder unbehandelt oder behandelt mit IFN

Claims

Verfahren zur Verringerung oder Eliminierung neoplastischer Zellen in einem ex vivo Gemisch von normalen hämatopoietischen Zellen und neoplastischen Zellen, umfassend das In-Kontakt-Bringen des Gemisches mit einem vesikulären Stomatitisvirus (vesicular stomatitis virus).
Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die neoplastischen Zellen Leukämiezellen sind.
Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die neoplastischen Zellen Lymphomzellen sind.
Verfahren, wie in Anspruch 1 bis 3 beansprucht, worin die hämatopoietischen Zellen Knochenmarkszellen sind.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, worin die hämatopoietischen Zellen periphere Blutzellen sind.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, zusätzlich umfassend das Verabreichen eines chemotherapeutischen Mittels vor, während oder nach dem In-Kontakt-Bringen mit dem vesikulären Stomatitisvirus.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, zusätzlich umfassend das Verabreichen eines Interferons vor, während oder nach dem In-Kontakt-Bringen mit dem vesikulären Stomatitisvirus.
Verwendung eines vesikulären Stomatitisvirus bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Säuger: (a) worin Knochenmarks- oder periphere Blutszellen aus dem Säuger entnommen worden sind, (b) worin die Knochenmarks- oder peripheren Blutszellen ex vivo mit dem vesikulären Stomatitisvirus in Kontakt gebracht werden, (c) worin eine myeloablative Behandlung an dem Säuger durchgeführt werden soll, und (d) worin die gereinigten bzw. gespülten hämatopoietischen Zellen aus Schritt (b) in den Säuger transplantiert werden sollen.
Verwendung nach Anspruch 8, worin die myeloablative Behandlung eine hochdosierte Chemotherapie ist.
Verwendung eines vesikulären Stomatitisvirus bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs in einem Säuger, der ein Transplantat von Knochenmarks- oder peripheren Blutstammzellen erhält, worin (a) die geernteten Zellen des Transplantats ex vivo mit vesikulärem Stomatitisvirus in Kontakt gebracht werden, und (b) die gereinigten bzw. gespülten Zellen an den Säuger verabreicht werden sollen.