DE60105258T2

DE60105258T2 - Mobilitaetsveraendernde cyaninfarbstoffe

Info

Publication number: DE60105258T2
Application number: DE60105258T
Authority: DE
Inventors: M. Steven MENCHEN; C. Scott BENSON; B. Barnett ROSENBLUM; H. Shaheer KHAN
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 2000-01-04
Filing date: 2001-01-03
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2021-01-04
Also published as: JP2003519275A; ATE275172T1; ES2225468T3; US6716994B1; EP1244749B1; WO2001049790A3; WO2001049790A2; DK1244749T3; US20050107617A1; EP1244749A2; DE60105258D1; CA2396067A1; AU2756901A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein Fluoreszenzfarbstoffverbindungen, die als molekulare Sonden verwendbar sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Cyanin-Fluoreszenzfarbstoffverbindungen, die mobilitätsmodifiziert sind, zur Verwendung in Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Einführung einer automatischen Vier-Farben-DNA-Sequenzierung des Sanger-Typs revolutionierte die Geschwindigkeit, mit der DNA-Abschnitte verlässlich sequenziert werden können. Beim Vier-Farben-DNA-Sequenzieren des Sanger-Typs wird eine einzelsträngige interessierende Ziel-DNA mit einem komplementären Primer hybridisiert und der Primer wird mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart eines Gemisches von 2'-Desoxyribonukleotiden, das zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primerverlängerung fähig ist (z. B. dATP, dGTP, dCTP und dTTP oder dUTP), und eines Gemisches aus vier markierten Terminatoren enzymatisch verlängert. Jeder der Terminatoren ist mit einer unterschiedlichen, spektral auflösbaren Fluoreszenzmarkierung markiert und stoppt eine Primerverlängerung bei einer einzigen Art von Zielnukleotid ab. Ein Gemisch von Terminatoren wird derart verwendet, dass ein Abstoppvorgang bei jeder Art von Zielnukleotid erreicht wird. Das Produkt dieser Primerverlängerung oder Sequenzierungsreaktion ist ein verschachtelter Satz von markierten Primer-Verlängerungsprodukten, in denen das 3'-terminale Nukleotid durch die Farbe seiner Fluoreszenzmarkierung identifizierbar ist. Diese Produkte werden sodann elektrophoretisch aufgetrennt, typischerweise in einer einzigen Gelspur oder Kapillare, und die Sequenz der Ziel-DNA wird aus den Farben der sich ergebenden Elektrophoresebanden bestimmt.
Um Uneindeutigkeiten beim Bestimmen der Sequenz der Ziel-DNA zu vermeiden, sollten die Farbstoffe, die zum Markieren der Primer-Verlängerungsprodukte verwendet werden, entweder den Produkten keine elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungen verleihen oder gleichmäßige Mobilitätsverschiebungen verleihen. Jedoch verleihen in den meisten Fällen verschiedene Arten an Farbstoffen erheblich unterschiedliche elektrophoretische Mobilitätsverschiebungen. Da die Farbstoffe voneinander spektral auflösbar sein müssen, müssen Farbstoffe mit unterschiedlichen Strukturen und daher ziemlich unterschiedlichen verliehenen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungen verwendet werden. Obwohl Sätze an Terminatoren, die an Primer-Verlängerungsprodukte ähnliche Mobilitätsverschiebungen verleihen, erhältlich sind, ist ein vernünftiges Entwickeln solcher Sätze von "mobilitätsabgestimmten" Terminatoren gegenwärtig nahezu unmöglich. Eher werden die Sätze durch empirischen Versuch und Irrtum erhalten. Gegenwärtig gibt es keine Verfahren, durch die man vorhersehbar die elektrophoretischen Mobilitäten, die durch mit gewünschten Farbstoffen markierten Terminatoren verliehen werden, verändern, ohne die spektralen Eigenschaften der Farbstoffe zu verändern und/oder die Fähigkeiten der markierten Terminatoren, als Substrate für polymerisierende Enzyme zu fungieren, zu gefährden. Dementsprechend sind diese Gegenstand der Erfindung.
3. ZUSAMMEMFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese und andere Gegenstände werden erfindungsgemäß bereitgestellt, wobei erfindungsgemäß in einem Aspekt Cyanin-Farbstoffverbindungen mit der Struktur
oder ein Salz davon bereitgestellt werden, worin: k, l und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 1 sind,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Halogenatom, -CN-, -CF₃-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl- und 5- bis 14-gliedriger Heteroarylgruppe oder, wenn k und m 1 sind und l 0 ist, sodann -CR₁=CR₂-CR₅=CR₆-CR₇= auch eine cyclische Alkenbrücke
sein kann, worin R¹⁰ und R^10' jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, O, Halogenatom, -CN-, -CF₃-, -OR-, -SR-, -NRR-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl- oder 5–14-gliedriger Heteroarylgruppe, wobei jede R-Gruppe unabhängig H oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist, und p eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, wobei die gestrichelten Linien bei den Substituenten R^10' Bindungen darstellen, die unabhängig voneinander entweder Einfachbindungen oder Doppelbindungen sein können, abhängig von den Identitäten der Substituenten,
MM eine mobilitätsmodifizierende Gruppe mit 2 bis 7 anionischen Substituenten ist,
L ein Linker ist,
LG eine verbindende Gruppe ist,
Z und Z' jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus S, O, Se und CR⁸R⁹, worin R⁸ und R⁹, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe sind oder, wenn zusammengenommen, eine (C₄-C₅)-Alkyleno- oder (C₄-C₅)-Alkanogruppe sind,
R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²², wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einer (C₁-C₆)-Alkylgruppe, (C₁-C₆)-Alkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 2–6-gliedriger Heteroalkylgruppe, 2–6-gliedriger Heteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Arylheteroalkylgruppe, 6–16-gliedriger Arylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5–10-gliedriger Heteroarylgruppe, 5–10-gliedriger Heteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5–6-gliedriger Heteroarylheteroarylgruppe, 5–6-gliedriger Heteroarylheteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehrere W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Heteroarylalkylgruppe, 6–16-gliedriger Heteroarylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Heteroarylheteroalkylgruppe und 6–16-gliedriger Heteroarylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist,
oder, wenn mit einer benachbarten Rⁿ-Gruppe zusammengenommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer (C₆-C₁₀)-Arylenogruppe, (C₆-C₁₀)-Arylenogruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–10-gliedriger Heteroarylenogruppe und 6–10-gliedriger Heteroarylenogruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist,
jede W-Gruppe unabhängig eine R-, X-, =O-, -OR-, =S-, -SR-, -NRR-, =NR-, (C₁-C₆)-Perhalogenalkyl-, -CX₃-, -CN-, -OCN-, -SCN-, -NO-, -NO₂-, =N₂-, -N₃-, -NHOH-, -S(O)₂R-, -C(O)R-, -C(S)R-, -C(O)OR'-, -C(S)OR'-, -C(O)SR'-, -C(S)SR'- und -C(NR)NRR-Gruppe ist, worin:
jede X-Gruppe unabhängig ein Halogenatom ist,
jede R-Gruppe unabhängig H, eine -NR''R''-, -C(O)R''-, -S(O₂)R''-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist und
jede R'-Gruppe unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl- und (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist, und jede R''-Gruppe unabhängig H, eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist. Die erfindungsgemäßen Cyanin-Farbstoffverbindungen weisen eine mobilitätsmodifizierende Gruppe auf, die ermöglicht, die elektrophoretischen Mobilitäten von mit den Farbstoffen markierten Polynukleotiden einzustellen oder in einer vorhersehbaren Weise abzustimmen.
Cyanin-Farbstoffe sind eine gut anerkannte Klasse von Fluoreszenzmolekülen, die im Allgemeinen erste und zweite heteroaromatische Stammringsysteme aufweisen, die über eine Methin-, Polymethin- oder cyclische Alkylenbrücke miteinander kovalent verbunden sind. Die Farbstoffe können Homodimere sein, in denen die ersten und zweiten heteroaromatischen Stammringsysteme beide Mitglieder der gleichen Klasse sind, oder sie können Heterodimere sein, in denen die ersten und zweiten heteroaromatischen Stammringsysteme beide Mitglieder verschiedener Klassen sind. Die Stammringsysteme können gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die zum Ändern der spektralen, chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften der Farbstoffe dienen können.
Die Erfindung betrifft die Klasse von Cyanin-Farbstoffen, in der beide heteroaromatischen Stammringe zu der Klasse von Ringen gehören, die allgemein als Benzazole/Benzazolium-Verbindungen bezeichnet werden. Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe umfassen allgemein: (i) ein erstes heteroaromatisches Benzazol/Benzazolium-Stammringsystem, das an dem Stickstoffatom des heteroaromatischen Rings mit einer verbindenden Gruppe substituiert ist, (ii) ein zweites heteroaromatisches Benzazol/Benzazolium-Stammringsystem, das an dem Stickstoffatom des heteroaromatischen Rings mit einer mobilitätsmodifizierenden Gruppe substituiert ist, und (iii) eine Brücke, die die ersten und zweiten Benzazol/Benzazolium-Stammringe über deren jeweilige C-2-Kohlenstoffatome verbindet. Die ersten und zweiten Benzazol/Benzazolium-Stammringsysteme können gleich oder unterschiedlich sein und können mit einer oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen Substituentengruppen gegebenenfalls substituiert sein. Vorzugsweise sind beide Benzazol/Benzazolium-Stammringsystem die gleichen oder unterschiedliche substituierte oder unsubstituierte Indolin/Indolinium-Ringsysteme. Abhängig von der spezifischen Anwendung kann die verbindende Gruppe verwendet werden, um die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe an andere Moleküle oder Substanzen, vorzugsweise über eine kovalente Anbindung, zu konjugieren.
Da sich die mobilitätsmodifizierten und verbindenden Gruppen an sich gegenüberliegenden Enden des Cyanin-Farbstoffs (d. h. an unterschiedlichen heteroaromatischen Ringen) befinden, behalten sehr signifikant Nukleoside/tide und/oder Nukleosid/tid-Analoga, die mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen markiert sind, z. B. markierte 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate und markierte terminierende Ribonukleosid-5'-triphosphate (z. B. 2',3'-Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphate) eine hohe Aktivität als Substrate für DNA-polymerisierende Enzyme bei, was die mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe für eine Verwendung in Nukleinsäure-Sequenzierungsanwendungen auf Fluoreszenzbasis ideal macht. Außerdem sind die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe, da die elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden, die mit den mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen markiert sind, vorhersehbar abgeglichen werden können, um mit denjenigen, die mit an deren Farbstoffen markiert sind, übereinzustimmen, ideal für eine Verwendung in Vier-Farben-Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen auf Fluoreszenzbasis, da Sätze von Farbstoffen mit übereinstimmenden Mobilitäten zusätzlich zu gewünschten spektralen und biologischen Eigenschaften leicht erhalten werden können.
Die mobilitätsmodifizierende Gruppe umfasst eine angehängte Gruppe, die eine Vielzahl von Ladungen durch eine Substitution mit einem oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen geladenen Substituenten trägt. Die angehängte Gruppe kann eine jegliche Gruppe sein, die fähig ist, mit der gewünschten Anzahl von geladenen Substituenten substituiert zu werden, aber ist typischerweise eine Gruppe mit der Struktur -D-D', worin D eine (C₁-C₆)-Alkyldiyl- oder 2–6-gliedrige Heteroalkyldiylgruppe ist und D' eine (C₁-C₆)-Alkyl-, 2–6-gliedrige Heteroalkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl-, (C₅-C₁₄)-Arylaryl-, 5–14-gliedrige Heteroaryl- oder 5–14-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppe ist. Wenn D eine Heteroalkyldiylgruppe ist, muss sie an das Stickstoffatom des Benzazol/Benzazolium-Rings über eine Alkyldiylgruppe gebunden sein. Bevorzugt unter den verschiedenen D-Gruppen ist eine (C₁-C₆)-Alkylenogruppe, insbesondere (C₁-C₆)-Alkanogruppen wie Methano-(-CH₂-), Ethano-(-CH₂-CH₂-), Propanogruppe(-CH₂-CH₂-CH₂-), etc.
Die Polarität der geladenen Substituenten, die die angehängte Gruppe substituieren, hängt von der Richtung der gewünschten elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung ab. Wenn eine Zunahme an elektrophoretischer Mobilität erwünscht ist, sollten anionische Substituenten verwendet werden. Wenn eine Abnahme an elektrophoretischer Mobilität erwünscht ist, sollten kationische Substituenten verwendet werden. Wenn viele geladene Substituenten verwendet werden, können sie gleich oder unterschiedlich sein und können sogar gemischte Polaritäten aufweisen, obwohl in den meisten Fällen alle geladenen Substituenten die gleiche Polarität aufweisen werden.
Die Anzahl von geladenen Substituenten, die die angehängte Gruppe substituieren, hängt von der gewünschten Nettoladung der mobilitätsmodifizierenden Gruppe ab, die ihrerseits von der Identität des geladenen Substituenten und dem Ausmaß an notwendiger Mobilitätsmodifizierung abhängt. Die geladenen Substituenten können eine jegliche Substituentengruppe mit einer Nettoladung bei dem gewünschten verwendeten pH-Wert (typischerweise einem pH-Wert von 6 bis 10) sein. Geeignete kationische Substituenten umfassen beispielhaft und ohne Begrenzung permanente Kationen wie quaternäre Ammoniumverbindungen, insbesondere diejenigen der Formel -N⁺RRR, worin jede R-Gruppe unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist, und Kationen, die von Basen abstammen. Permanente Kationen oder kationische Substituenten, die von starken Basen abstammen ("starke kationische Substituenten"), wie diejenigen mit einem pK_a-Wert von etwa 8 oder mehr, sind bevorzugt, da diese starken kationischen Substituenten bei den pH-Werten, die herkömmlich in biologischen Tests wie Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, vollständig ionisiert sind.
Geeignete anionische Substituenten umfassen Gruppen mit einem pK_a-Wert von 6 oder weniger und umfassen beispielsweise und ohne Begrenzung -C(O)O^–-, -P(O)(O^–)₂-, -P(O)(OH)(O^–)-, -O-P(O)₂(O^–)-, -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppen (einschließlich jeglicher dazugehöriger Gegenionen). Anionische Substituenten, die von starken Säuren abstammen ("starke anionische Substituenten") wie diejenigen mit einem pK_a-Wert von 3 oder weniger sind bevorzugt, da diese starken anionischen Substituenten bei den pH-Werten, die in biologischen Tests wie Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen herkömmlich verwendet werden, vollständig ionisiert sind. Bevorzugt unter den starken anionischen Substituenten sind -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppen.
Zusätzlich zu den gewünschten geladenen Substituenten kann die angehängte Gruppe mit einem oder mehreren zusätzlichen ungeladenen Substituenten weiter substituiert sein. Solche ungeladenen Substituenten können einer Vielzahl von Zwecken dienen, z. B. um die Wasserlöslichkeit des mobilitätsmodifizierenden Farbstoffs zu erhöhen, eine nicht spezifische Bindung der mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe zu vermindern und/oder die Wechselwirkungen zwischen Chromophoren vielfach markierter Verbindungen zu vermindern, wodurch ein Fluoreszenzlöschen vermindert wird.
Elektronen-delokalisierende Brücken, die zum Verbinden der heteroaromatischen Ringe der Farbstoffe verwendet werden, umfassen in nicht begrenzender Weise Methin-, Polymethin-, Squarin- und cyclische Alkenbrücken. Die Brücken können mit einem oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen Substituenten gegebenenfalls substituiert sein, die typischerweise zum Erhöhen der chemischen Stabilität und/oder Photostabilität des Farbstoffs und/oder zum Erhöhen seiner Quantenausbeute dienen.
Die verbindende Gruppe weist die Struktur -L-LG auf, worin L ein Linker und LG eine verbindende Gruppe ist, die verwendet werden kann, um den mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoff an eine andere Verbindung oder ein anderes Substrat wie ein Protein, Nukleosid/tid, Polynukleotid, Polymer, Partikel, etc., vorzugsweise mittels einer kovalenten Anbindung, zu konjugieren. Die Identität der verbindenden Gruppe LG wird von der Art der gewünschten Konjugation abhängen. Zum Beispiel kann die Konjugation (i) durch ionische Wechselwirkungen vermittelt werden, wobei in diesem Fall die verbindende Gruppe LG eine geladenen Gruppe ist, (ii) durch hydrophobe Wechselwirkungen vermittelt werden, wobei in diesem Fall die verbindende Gruppe LG eine hydrophobe Gruppe ist, (iii) durch kovalente Anbindung vermittelt werden, wobei in diesem Fall die verbindende Gruppe LG eine reaktive funktionelle Gruppe (R_x) ist, die entweder zum Ausbilden einer kovalenten Bindung mit einer weiteren komplementären funktionellen Gruppe (F_x) fähig ist oder fähig ist, derart aktiviert zu werden, um eine kovalente Bindung mit einer komplementären funktionellen Gruppe (F_x) zu bilden, oder (iv) über die Verwendung von Paaren von spezifischen bindenden Molekülen wie Biotin und Avidin/Streptavidin vermittelt werden, wobei in diesem Fall die verbindende Gruppe LG ein Mitglied des Paares z. B. Biotin ist.
Die verbindende Gruppe LG ist an dem Stickstoffatom des Benzazol/Benzazolium-Rings über einen Linker L gebunden. Abhängig von der Anwendung kann der Linker L hydrophob, hydrophil, lang oder kurz und/oder starr, halbstarr oder flexibel sein. Ungeachtet der Identität des Linkers L muss er, um ein nachteiliges Beeinflussen der spektralen Eigenschaften des Cyanin-Farbstoffchromophors zu vermeiden, an das Stickstoffatom der Benzazol/Benzazolium-Verbindung über eine Alkyldiylgruppe gebunden sein.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß markierte Konjugate bereitgestellt, umfassend einen erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoff und ein anderes Molekül oder eine andere Substanz. Der mobilitätsmodifizierende Cyanin-Farbstoff ist an das andere Molekül oder die andere Substanz, typischerweise über eine kovalente Anbindung, über eine verbindende Gruppe LG, wie vorstehend beschrieben, konjugiert. Einmal konjugiert stellt der Farbstoff eine geeignete Fluoreszenzmarkierung für einen nachfolgenden Nachweis bereit. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe können verwendet werden, um eine große Vielzahl von Molekülen und Substanzen, einschließlich Aminosäuren, Proteinen, Antikörpern, Enzymen, Rezeptoren, Nukleosiden/tiden, Nukleinsäu ren, Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Hormonen, Vitaminen, Arzneimitteln, Metaboliten, Toxinen, organischen Polymeren, etc., fluoreszierend zu markieren. Die Farbstoffe können auch verwendet werden, um Partikel wie Nanopartikel, Mikrosphären oder Liposome zu markieren. Das Molekül oder die Substanz kann mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen, die gleich oder verschieden sein können, markiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das markierte Konjugat ein markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon. Der Farbstoff kann entweder an die Zucker- oder Nukleobasengruppe des aufnahmebereiten Nukleosids/tids oder Nukleosid/tid-Analogons konjugiert werden, aber ist gewöhnlich an die Nukleobasengruppe konjugiert.
Das markierte Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon kann enzymatisch einbaubar sein, wobei in diesem Fall es zweckmäßigerweise zusammen mit einer Matrizennukleinsäure, einem Primer und geeigneten polymerisierenden Enzymen verwendet werden kann, um markierte Polynukleotide enzymatisch herzustellen. Eine besonders bevorzugte Klasse von enzymatisch einbaubaren markierten Nukleosiden/tiden und Nukleosid/tid-Analoga sind markierte Terminatoren, da solche Terminatoren zweckmäßigerweise in Sequenzierungsreaktionen des Sanger-Typs verwendet werden können, um markierte Polynukleotidsequenzierungsfragmente mit definierten Gel-elektrophoretischen Mobilitäten herzustellen.
Alternativ dazu kann das markierte Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon synthetisch einbaubar sein wie ein markiertes nukleosidisches oder nicht nukleosidisches Phosphoramidit-Synthesereagenz. Solche Reagenzien können zweckmäßigerweise zusammen mit Standardfestphasen-Oligonukleotid-Synthesereagenzien und -trägern verwendet werden, um synthetische Polynukleotide und/oder Polynukleotid-Analoga an deren 3'-Terminus, deren 5'-Terminus und/oder an einer oder mehreren inneren Positionen mit erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen zu markieren.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren zum Verwenden der erfindungsgemäßen Farbstoffe bereitgestellt, um eine Zielnukleinsäure zu sequenzieren. Das Verfahren umfasst allgemein ein Ausbilden einer Reihe von unterschiedlich großen Primer-Verlängerungsprodukten, die mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert sind, Auftrennen der Reihe von unterschied lich großen markierten Verlängerungsprodukten, typischerweise auf einer Größenbasis, und Nachweisen der aufgetrennten markierten Verlängerungsprodukte, basierend auf der Fluoreszenz der Markierung. Die Sequenz der Zielnukleinsäure wird sodann gemäß bekannter Verfahren zusammengesetzt.
Die Reihe von unterschiedlich großen markierten Verlängerungsprodukten kann zweckmäßigerweise dadurch hergestellt werden, dass ein Primer-Ziel-Hybrid gemäß bekannter Verfahren enzymatisch verlängert wird. Zum Beispiel kann die Reihe von markierten Verlängerungsprodukten dadurch erhalten werden, dass ein Primer, der mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff oder Farbstoffpaar markiert ist, verwendet wird und das Hybrid aus markiertem Primer und Ziel in Gegenwart einer Polymerase, eines Gemisches von enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primerverlängerung fähig sind, und mindestens eines typischerweise unmarkierten Terminators, der eine Primerverlängerung nach Einbau abstoppt (z. B. ein 2',3'-Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphat), enzymatisch verlängert wird. Alternativ dazu kann die Reihe von markierten Verlängerungsprodukten dadurch erhalten werden, dass ein unmarkierter Primer verwendet wird und das Hybrid aus unmarkiertem Primer und Ziel in Gegenwart einer Polymerase, eines Gemisches von enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primerverlängerung fähig sind, und mindestens eines Terminators, der mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert ist, enzymatisch verlängert wird. In jeder Ausführungsform dient die Polymerase dazu, den Primer mit enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga zu verlängern, bis ein Terminator eingebaut wird, der die Verlängerungsreaktion abstoppt. Einmal abgestoppt wird die Reihe an markierten Verlängerungsprodukten aufgetrennt, typischerweise auf Größenbasis, und die aufgetrennten markieren Verlängerungsprodukte werden basierend auf der Fluoreszenz der Markierungen nachgewiesen. Die Sequenz des Ziels wird sodann durch herkömmliche Mittel erhalten.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein Gemisch von vier unterschiedlichen Terminatoren in einer einzigen Verlängerungsreaktion verwendet. Jeder unterschiedliche Terminator ist zum Abstoppen einer Primerverlängerung bei einem unterschiedlichen Matrizennukleotid fähig, z. B. ein Gemisch aus 7-Deaza-ddATP, ddCTP, 7-Deaza-ddGTP und ddTTP oder ddUTP, und ist mit einem unterschiedlichen spektral auflösbaren Fluorophor markiert, wobei mindestens eines der Fluorophore ein erfindungsgemäßer mobilitätsmodifizierender Farbstoff ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein Hybrid aus unmarkiertem Primer und Zielnukleinsäure in Gegenwart einer Polymerase, eines Gemisches von enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primerverlängerung fähig sind, und eines Gemisches der vier unterschiedlichen markierten Terminatoren enzymatisch verlängert. Nach auf Größe basierender Auftrennung wird eine Reihe von aufgetrennten markierten Verlängerungsprodukten erhalten, in der die Emissionseigenschaften (d. h. Farbe) jedes aufgetrennten Verlängerungsprodukts die Identität seines 3'-terminalen Nukleotids anzeigt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind alle markierten Terminatoren unter Verwendung einer einzigen Strahlungsquelle anregbar.
Alternativ dazu können Terminatoren ohne enzymatisch verlängerbare Nukleotide verwendet werden. In diesem Fall wird der Primer nur durch eine einzige Base verlängert. Wieder kann der Primer markiert sein oder alternativ dazu können ein oder mehrere Terminatoren markiert sein. Vorzugsweise wird ein Gemisch aus vier unterschiedlichen markierten Terminatoren verwendet, wie vorstehend beschrieben. Diese "Minisequenzierungs"-Ausführungsformen sind zum Identifizieren von Polymorphismen in chromosomaler DNA oder cDNA besonders verwendbar.
In einem noch weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß mobilitätsabgestimmte Sätze von markierten Terminatoren und/oder Polynukleotidprimern bereitgestellt, die zweckmäßigerweise in Sequenzierungsreaktionen des Sanger-Typs verwendet werden können, um Sequenzierungsleitern mit abgestimmten elektrophoretischen Mobilitäten herzustellen. Für Vier-Farben-Nukleinsäure-Sequenzierungsanwendungen können ein oder mehrere herkömmliche Cyanin-Farbstoffe mit den gewünschten spektralen Eigenschaften ausgewählt werden und die jeweiligen relativen Mobilitäten von damit markierten Polynukleotidfragmenten erhalten werden. Die Cyanin-Farbstoffe können sodann gemäß den hierin beschriebenen Prinzipien einfach mobilitätsmodifiziert werden, um die elektrophoretischen Mobilitäten von damit markierten Polynukleotiden einzustellen, wie erforderlich, um, Sätze von Farbstoffen zu erhalten, die mobilitätsabgestimmt sind. Ein bevorzugter Satz von mobilitätsabgestimmten Terminatoren umfasst die Verbindungen 31, 32, 33 und 34 (vgl. den nachstehenden Abschnitt 5.10, infra). Ein bevorzugter Satz von mobilitätsabgestimmten Polynukleotidprimern umfasst Primer, die mit den Farbstoffchromophoren der Verbindungen 31, 32, 33 und 34 markiert sind.
In einem letzten Aspekt werden erfindungsgemäß Kits bereitgestellt, die die er findungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe und/oder erfindungsgemäßen markierten Konjugate und Reagenzien umfassen, die zum Markieren von Molekülen und/oder zum Durchführen von Tests wie Nukleinsäure-Sequenzierung verwendbar sind.
Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe stellen signifikante Vorteile gegenüber gegenwärtig erhältlichen Cyanin-Farbstoffen bereit. Da die mobilitätsmodifizierende Gruppe die spektralen Eigenschaften des Cyanin-Farbstoffchromophors nicht signifikant verändert, sind diese Farbstoffe in nahezu jeder Anwendung verwendbar, die Fluoreszenzfarbstoffe verwendet. Jedoch aufgrund ihrer Fähigkeit, die elektrophoretischen Mobilitäten von damit markierten Polynukleotiden vorhersehbar zu verändern, stellen die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe die Fähigkeit bereit, mobilitätsabgestimmte Sätze von Fluoreszenzfarbstoffen für Anwendungen herzustellen, die die elektrophoretische Trennung von markierten Polynukleotiden einschließen, wie automatisierte Nukleinsäure-Sequenzierung. Insbesondere können gemischte Farbstoffsätze (d. h. Farbstoffe mit unterschiedlichen Strukturen) zweckmäßigerweise in automatisierten Sequenzierungsanwendungen aufgrund der Fähigkeit, die entsprechenden Mobilitäten von damit erfindungsgemäß markierten Polynukleotiden abzustimmen, verwendet werden. Außerdem behalten enzymatisch einbaubare Nukleoside/tide, enzymatisch einbaubare Nukleosid/tid-Analoga und Terminatoren, die mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen markiert sind, hohe enzymatische Aktivität mit den Polymerasen bei, die herkömmlicherweise in automatisierten Nukleinsäure-Sequenzierungsverfahren verwendet werden, einschließlich thermostabiler Polymerasen wie AMPLITAQ^® DNA-Polymerase FS (PE Biosystems, Foster City, CA).
4. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
4.1 Abkürzungen

Die Abkürzungen, die in der gesamten Beschreibung verwendet werden, um bestimmte Nukleobasen, Nukleoside und/oder Nukleotide zu bezeichnen, sind die jenigen, die herkömmlicherweise in dem Fachgebiet verwendet werden, und sind wie nachstehend angegeben:

Ausdruck	Abkürzung
Adenin	A
7-Deazaadenin	7-Deaza-A
N⁶-Δ²-Isopentenyladenin	6iA
N⁶-Δ²-Isopentenyl-2-methylthioadenin	2ms6iA
Cytosin	C
Guanin	G
6-Thioguanin	6sG
7-Deazaguanin	7-Deaza-G
N²-Dimethylguanin	2dmG
7-Methylguanin	7mG
Thymin	T
4-Thiothymin	4sT
Uracil	U
Dihydrouracil	D
4-Thiouracil	4sU
Base Y	Y
Ribonukleosid-5'-triphosphat	NTP
Adenosin-5'-triphosphat	ATP
7-Deazaadenosin-5'-triphosphat	7-Deaza-ATP
Cytidin-5'-triphosphat	CTP
Guanosin-5'-triphosphat	GTP
7-Deazaguanosin-5'-triphosphat	7-Deaza-GTP
Thymidin-5'-triphosphat	TTP
Uridin-5'-triphosphat	UTP
2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphat	dNTP
2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat	dATP
2'-Desoxy-7-deazaadenosin-5'-triphosphat	7-Deaza-dATP
2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat	dCTP
2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat	dGTP
2'-Desoxy-7-deazaguanosin-5'-triphosphat	7-Deaza-dGTP
2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat	dTTP
2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat	dUTP

4.2 Definitionen
Wie hierin verwendet, sollen die nachstehenden Begriffe die nachstehenden Bedeutungen aufweisen:
"Spektral auflösbar" bedeutet bezüglich eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen, dass die Fluoreszenz-Emissionsbanden der entsprechenden Farbstoffe ausreichend getrennt, d. h. ausreichend nicht überlappend, sind, so dass die Farbstoffe, entweder allein oder wenn sie an andere Moleküle oder Substanzen konjugiert sind, voneinander auf der Basis ihrer Fluoreszenzsignale unter Verwendung von Standard-Fotonachweissystemen, wie Fotodetektoren, die eine Reihe von Bandfiltern und Photomultipliern verwenden, ladungsgekoppelte Bauelemente (CCD), Spektrographen, usw., unterscheidbar sind, wie durch die Systeme veranschaulicht, die in den US-PSen 4,230,558 und 4,811,218 oder in Wheeless et al., 1985, Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis, Seiten 21–76, Academic Press, New York, beschrieben sind. Vorzugsweise sind alle Farbstoffe, die einen spektral auflösbaren Satz von Farbstoffen umfassen, durch eine einzige Strahlungsquelle anregbar.
"Mobilitätsabgestimmt" betrifft einen Satz von Fluoreszenzfarbstoffen, der, wenn er zur Markierung gleich langer Polynukleotide mit einem Farbstoffmolekül für jedes Polynukleotidmolekül verwendet wird, verschieden markierte Polynukleotide mit im Wesentlichen ähnlichen elektrophoretischen Mobilitäten ergibt. Typischerweise werden die relativen elektrophoretischen Mobilitäten der markierten Polynukleotide um weniger als etwa ein halbes Nukleotid variieren. Vorzugsweise sind die mobilitätsabgestimmten Farbstoffe spektral auflösbar, wie vorstehend definiert.
"Mobilitätsmodifizierendes Farbstoffchromophor" betrifft einen erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoff ohne seine verbindende Gruppe -L-LG. Das mobilitätsmodifizierende Farbstoffchromophor, das von dem mobilitätsmodifizierenden Farbstoff gemäß der Strukturformel (I.A) abstammt, weist die Struktur:
auf worin k, l, m, Z, Z', R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹, R²² und MM wie für die Strukturformel (I.A), infra, definiert sind und die gepunktete Linie, die aus dem heteroaromatischen Ringstickstoffatom herausragt, die Anbindungsstelle der verbindenden Gruppe -L-LG darstellt.
"Nukleobase" betrifft einen substituierten oder unsubstituierten stickstoffhaltigen heteroaromatischen Stammring eines Typs, der herkömmlicherweisein Nukleinsäuren gefunden wird. Typischerweise, aber nicht notwendigerweise, ist die Nukleobase zum Ausbilden von Watson-Crick- und/oder Hoogsteen-Wasserstoffbindungen mit einer geeignet komplementären Nukleobase fähig. Beispielhafte Nukleobasen umfassen in nicht begrenzender Weise Purine wie 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, Adenin (A), Ethenoadenin, N⁶-Δ²-Isopentenyladenin (6iA), N⁶-Δ²-Isopentenyl-2-methylthioadenin (2ms6iA), N⁶-Methyladenin, Guanin (G), Isoguanin, N²-Dimethylguanin (dmG), 7-Methylguanin (7mG), 2-Thiopyrimidin, 6-Thioguanin (6sG), Hypoxanthin und O⁶-Methylguanin, 7-Deazapurine wie 7-Deazaadenin (7-Deaza-A) und 7-Deazaguanin (7-Deaza-G), Pyrimidine wie Cytosin (C), 5-Propinylcytosin, Isocytosin, Thymin (T), 4-Thiothymin (4sT), 5,6-Dihydrothymin, O⁴-Methylthymin, Uracil (U), 4-Thiouracil (4sU) und 5,6-Dihydrouracil (Dihydrouracil, D), Indole wie Nitroindol und 4-Methylindol, Pyrrole wie Nitropyrrol, Nebularin, Base (Y), etc. Zusätzliche beispielhafte Nukleobasen finden sich in Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Seiten 385–394, CRC Press, Boca Raton, FL, und den darin zitierten Literaturan gaben. Bevorzugte Nukleobasen sind Purine, 7-Deazapurine und Pyrimidine. Besonders bevorzugte Nukleobasen sind die normalen Nukleobasen, die infra definiert sind, und deren herkömmliche Analoga, z. B. 2ms6iA, 6iA, 7-Deaza-A, D, 2dmG, 7-Deaza-G, 7mG, Hypoxanthin, 4sT, 4sU und Y.
"Normale Nukleobase" betrifft eine Nukleobase, die natürlicherweise auftritt und kodiert, d. h. Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin oder Uracil.
"Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer Nukleobase besteht, die kovalent, typischerweise über ein heteroaromatisches Ringstickstoffatom, an das C1'-Kohlenstoffatom eines Pentosezuckers gebunden ist. Typische Pentosezucker umfassen in nicht begrenzender Weise diejenigen Pentosen, in denen ein oder mehrere der Kohlenstoffatome jeweils unabhängig voneinander mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen substituiert sind, worin jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkyl- oder (C₅-C₁₄)-Arylgruppe ist. Der Pentosezucker kann gesättigt oder ungesättigt sein. Beispiele für Pentosezucker umfassen in nicht begrenzender Weise Ribose, 2'-Desoxyribose, 2'-(C₁-C₆)-Alkoxyribose, 2'-(C₅-C₁₄)-Aryloxyribose, 2',3'-Didesoxyribose, 2',3'-Didehydroribose, 2'-Desoxy-3'-halogenribose, 2'-Desoxy-3'-fluorribose, 2'-Desoxy-3'-chlorribose, 2'-Desoxy-3'-aminoribose, 2'-Desoxy-3'-(C₁-C₆)-alkylribose, 2'-Desoxy-3'-(C₁-C₆)-alkoxyribose, 2'-Desoxy-3'-(C₅-C₁₄)-aryloxyribose, 2',3'-Didesoxy-3'-halogenribose und 2',3'-Didesoxy-3'-fluorribose.
Wenn die Nukleobase ein Purin oder ein 7-Deazapurin ist, ist der Pentosezucker an die N9- oder C8-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase ein Pyrimidin ist, ist der Pentosezucker an die N1-Position der Nukleobase gebunden (vgl. z. B. Kornberg und Baker, 1992, DNA Replication, 2. Ausgabe, Freeman, San Francisco), mit der Ausnahme von Pseudouridinen, bei denen der Pentosezucker an die C5-Position der Uracilnukleobase gebunden ist. Bevorzugte Nukleoside sind diejenigen, in denen die Nukleobase ein Purin, ein 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon einer normalen Nukleobase ist und der Pentosezucker ein jeglicher der vorstehend aufgeführten beispielhaften Pentosezucker ist.
"Normales Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer normalen Nukleobase besteht, die über die N1-(C, T oder U) oder N9-(A oder G)Position der Nukleobase an das C1'-Kohlenstoffatom der Ribose oder 2'-Desoxyribose kovalent gebunden ist.
"Nukleosid-Analogon" betrifft ein Nukleosid, in dem der Pentosezucker durch ein Pentosezucker-Analogon ersetzt ist. Beispiele für Pentosezucker-Analoga umfassen in nicht begrenzender Weise substituierte oder nicht substituierte Furanosen mit mehr oder weniger als fünf Ringatomen, z. B. Erythrosen und Hexosen und substituierte oder nicht substituierte acyclische Zucker mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Ein oder mehrere der Kohlenstoffatome können unabhängig voneinander mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen substituiert sein, worin jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkyl- oder (C₅-C₁₄)-Arylgruppe ist.
"Nukleotid" betrifft ein Nukleosid, in dem ein oder mehrere, typischerweise ein Pentosekohlenstoffatom mit einem Phosphatester der Formel:
substituiert ist, worin α eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. Vorzugsweise ist α 2 und der Phosphatester ist an das 3'- oder 5'-Kohlenstoffatom der Pentose gebunden. Besonders bevorzugte Nukleotide sind diejenigen, in denen die Nukleobase ein Purin, ein 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon ist.
"Normales Nukleotid" betrifft ein normales Nukleosid, in dem das 3'- oder 5'-Kohlenstoffatom der Ribose oder 2'-Desoxyribose mit einem Phosphatester mit der Formel:
substituiert ist, worin α eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist. Bevorzugte normale Nukleotide sind diejenigen, in denen α 2 ist und der Phosphatester an das 5'-Kohlenstoffatom der Ribose (NTP) oder 2'-Desoxyribose (dNTP) gebunden ist.
"Nukleotid-Analogon" betrifft ein Nukleotid, in dem der Pentosezucker und/oder ein oder mehrere der Phosphatester mit dessen/deren entsprechendem Analogon ersetzt ist. Beispiele für Pentosezucker-Analoga sind diejenigen, die vorstehend in Verbindung mit Nukleosid-Analoga beschrieben wurden. Beispiele für Phosphatester-Analoga umfassen in nicht begrenzender Weise Alkylphosphonate, Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphotriester, Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphoroselenoate, Phosphorodiselenoate, Phosphoroanilothioate, Phosphoroanilidate, Phosphoroamidate, Borphosphate, etc., einschließlich jeglicher dazugehöriger Gegenionen, falls vorhanden.
Auch eingeschlossen in der Definition von "Nukleotid-Analogon" sind Nukleobasen-Monomere, die in Polynukleotid-Analoga polymerisiert werden können, in denen der DNA/RNA-Phosphatester und/oder das Zuckerphosphatester-Rückgrat durch eine andere Bindungsart ersetzt ist.
"Enzymatisch einbaubares Nukleotid oder Nukleotid-Analogon" betrifft ein Nukleotid oder Nukleotid-Analogon, das fähig ist, als ein Substrat für ein polymerisierendes Enzym in einer Matrizen-gerichteten Nukleinsäuresynthesereaktion derart zu fungieren, dass es in eine wachsende Polynukleotid- oder Polynukleotid-Analogon-Kette enzymatisch eingebaut wird. Typische enzymatisch einbaubare Nukleotide und Nukleotid-Analoga sind diejenigen, in denen der Zucker eine Pentose ist. Bevorzugte enzymatisch einbaubare Nukleotide sind diejenigen, in denen die Nukleobase ein Purin, ein 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon ist und die Pentose ein Pentose-5'-triphosphat ist, wie NTPs, dNTPs und ddNTPs.
"Enzymatisch verlängerbares Nukleotid oder Nukleotid-Analogon" betrifft ein enzymatisch einbaubares Nukleotid oder Nukleotid-Analogon, das, wenn es in eine wachsende Polynukleotid- oder Polynukleotid-Analogon-Kette eingebaut wird, einen Einbau von weiteren Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga unterstützt. Folglich weisen enzymatisch verlängerbare Nukleotide oder Nukleotid-Analoga eine Hydroxylgruppe auf, die zum Ausbilden einer kovalenten Bindung mit einem weiteren nachfolgenden Nukleotid oder Nukleotid-Analogon fähig ist. Typische enzymatisch verlängerbare Nukleotide und Nukleotid-Analoga sind diejenigen, in denen der Zucker eine Pentose ist. Bevorzugte enzymatisch verlängerbare Nukleotide sind diejenigen, in denen die Nukleobase ein Purin, 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon ist und der Pentosezucker ein 3'-Hydroxylpentose-5'-triphosphat ist, wie NTPs und dNTPs.
"Terminator" betrifft ein enzymatisch einbaubares Nukleotid oder Nukleotid-Analogon, das einen Einbau von nachfolgenden Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga nicht unterstützt. Typische Terminatoren sind diejenigen, in denen die Nukleobase ein Purin, 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon ist und die Zuckergruppe eine Pentose ist, die einen 3'-Substituenten beinhaltet, der eine weitere Synthese blockiert. Substituenten, die eine weitere Synthese blockieren, umfassen in nicht begrenzender Weise Amino-, Desoxy-, Halogen-, Alkoxy- und Aryloxygruppen. Beispiele für Terminatoren umfassen in nicht begrenzender Weise diejenigen, in denen die Zucker-Phosphatester-Gruppe 2',3'-Didesoxyribose-5'-triphosphat, 2',3'-Didesoxy-3''-aminoribose-5'-triphosphat, 2',3'-Didesoxy-3''-halogenribose-5'-triphosphat, 2',3'-Didesoxy-3''-fluorribose-5'-triphosphat, 2'-Desoxy-3'-(C₁-C₆)-alkoxyribose-5'-triphosphat, 2'-Desoxy-3'-(C₅-C₁₄)-aryloxyribose-5'-triphosphat, 2',3'-Didesoxy-3''-(C₁-C₆)-alkylribose-5'-triphosphat und 2',3'-Didehydroribose-5'-triphosphat ist.
"Nukleosid/tid" betrifft ein Nukleotid und/oder ein Nukleotid und/oder ein Gemisch davon.
"Polynukleotid" betrifft eine lineare Polymerkette von Nukleotid-Monomereinheiten, die miteinander durch Phosphatester-Internukleosid-Bindungen kovalent verbunden sind. Wenn nicht anders angegeben, umfasst "Polynukleotid", wie hierin verwendet, Polymere einer jeglichen Länge, einschließlich Oligonukleotiden, Polynukleotiden und Nukleinsäuren, wie diese Begriffe herkömmlicherweise in dem Fachgebiet verwendet werden. In dem Fall, dass Polynukleotide von spezifischen Größenbereichen vorgesehen sind, ist die Anzahl von Monomereinheiten spezifisch beschrieben. Folglich können erfindungsgemäße Polynukleotide eine Größe von wenigen Monomereinheiten (z. B. 4 bis 40) bis mehreren hunderten Monomereinheiten, zu mehreren tausend Monomereinheiten oder noch mehr Monomereinheiten aufweisen. Immer wenn ein Polynukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt ist, z. B. "ATGCCTG", soll verstanden werden, dass die Sequenz in der 5'-→3'-Richtung angegeben ist. 2'-Desoxyribopolynukleotiden ist der Buchstabe "d" vorangestellt, z. B. "d(ATGCCTG)".
Polynukleotide können aus einer einzigen Art einer Zuckergruppe, wie in dem Fall von RNA und DNA, oder Gemischen von verschiedenen Zuckergruppen, wie in dem Fall von RNA/DNA-Chimeren, bestehen. Bevorzugte Polynukleotide sind Ribopolynukleotide und 2'-Desoxyribopolynukleotide gemäß den nachstehenden Strukturformeln:
worin:
jede B-Gruppe unabhängig eine Nukleobase, vorzugsweise ein Purin, 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon ist,
jedes m die Länge des entsprechenden Polynukleotids definiert und von Null bis Tausenden, Zehntausenden oder noch mehr reichen kann,
jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff-, Halogen-, Fluoratom, (C₁-C₈)-Alkyl-, -OR''- und -NR''R''-Gruppe, worin jede R''-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkyl- oder (C₅-C₁₄)-Arylgruppe ist, oder zwei benachbarte R-Gruppen zusammen genommen werden, um eine Bindung auszubilden derart, dass der Ribosezucker 2',3'-Didehydroribose ist, und
jede R'-Gruppe unabhängig eine Hydroxygruppe oder
ist, worin α 0, 1 oder 2 ist.
In den bevorzugten vorstehend beschriebenen Ribopolynukleotiden und 2'-Desoxyribopolynukleotiden sind die Nukleobasen B an das C1'-Kohlenstoffatom der Zuckergruppe kovalent gebunden, wie vorstehend beschrieben.
"Polynukleotid-Analogon" betrifft ein Polynukleotid, in dem mindestens eine Nukleosid-Monomereinheit ein Nukleosid-Analogon ist und/oder mindestens eine Phosphatester-Internukleosid-Bindung ein Phosphatester-Analogon ist, wie vorstehend definiert. Auch eingeschlossen in der Definition von Polynukleotid-Analoga sind Polynukleotide, in denen die Phosphatester- und/oder Zuckerphosphatester-Internukleosid-Bindungen durch andere Arten von Bindungen ersetzt sind, wie N-(2-Aminoethyl)glycinamide und andere Amide (vgl, z. B. Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497–1500, WO 92/20702, US-PS 5,719,262 , US-PS 5,698,685), Morpholine (vgl. US-PS 5,698,685 , US-PS 5,378,841 , US-PS 5,185,144 ), Carbamate (vgl. Stirchak & Summerton, 1987, J. Org. Chem. 52: 4202), Methylen(methylimino) (vgl. Vasseur et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 4006), 3'-Thioformacetale (vgl. Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58: 2983), Sulfamate (vgl. US-PS 5,470,967 ) und andere (vgl. z. B. US-PS 5,817,781 , Frier & Altman, 1997, Nucl. Acids Res. 25: 4429 und die darin zitierten Literaturhinweise).
"Alkylgruppe" betrifft eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte, geradkettige oder cyclische monovalente Kohlenwasserstoffgruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkans, -alkens oder -alkins ableitet. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Methylgruppe, Ethylgruppen wie Ethanyl-, Ethenyl-, Ethinylgruppe, Propylgruppen wie Propan-1-yl-, Propan-2-yl-, Cyclopropan-1-yl-, Prop-1-en-1-yl-, Prop-1-en-2-yl-, Prop-2-en-1-yl-, Cycloprop-1-en-1-yl-, Cycloprop-2-en-1-yl-, Prop-1-in-1-yl-, Prop-2-in-1-yl-Gruppe, etc., Butylgruppen wie Butan-1-yl-, Butan-2-yl-, 2-Methylpropan-1-yl-, 2-Methylpropan-2-yl-, Cyclobutan-1-yl-, But-1-en-1-yl-, But-1-en-2-yl-, 2-Methylprop-1-en-1-yl-, But-2-en-1-yl-, But-2-en-2-yl-, Buta-1,3-dien-1-yl-, Buta-1,3-dien-2-yl-, Cyclobut-1-en-1-yl-, Cyclobut-1-en-3-yl-, Cyclobuta-1,3-dien-1-yl-, But-1-in-1-yl-, But-1-in-3-yl-, But-3-in-1-yl-Gruppe, etc. und dergleichen. Wo spezifische Sättigungsgrade vorgesehen sind, wird die Nomenklatur "Alkanyl-", "Alkenyl-" und/oder "Alkinylgruppe" verwendet, wie nachstehend definiert. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkylgruppen (C₁-C₆)-Alkylgruppen.
"Alkanylgruppe" betrifft eine gesättigte verzweigte, geradkettige oder cyclische Alkylgruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkans ableitet. Typische Alkanylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Methanyl-, Ethanylgruppe, Propanylgruppen wie Propan-1-yl-, Propan-2-yl-(Isopropyl-), Cyclopropan-1-yl-Gruppe, etc., Butanylgruppen wie Butan-1-yl-, Butan-2-yl-(sec-Butyl-), 2-Methylpropan-1-yl-(Isobutyl-), 2-Methylpropan-2-yl-(t-Butyl-), Cyclobutan-1-yl-Gruppe, etc. und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkanylgruppen (C₁-C₆)-Alkanylgruppen.
"Alkenylgruppe" betrifft eine ungesättigte verzweigte, geradkettige oder cyclische Alkylgruppe mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkens ableitet. Die Gruppe kann entweder in der cis- oder trans-Konformation hinsichtlich der Doppelbindungen) vorliegen. Typische Alkenylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Ethenylgruppe, Propenylgruppen wie Prop-1-en-1-yl-, Prop-1-en-2-yl-, Prop-2-en-1-yl-, Prop-2-en-2-yl-, Cycloprop-1-en-1-yl-, Cycloprop-2-en-1-yl-Gruppe, Butenylgruppen wie But-1-en-1-yl, But-1-en-2-yl-, 2-Methylprop-1-en-1-yl-, But-2-en-1-yl-, But-2-en-1-yl-, But-2-en-2-yl-, Buta-1,3-dien-1-yl-, Buta-1,3-dien-2-yl-, Cyclobut-1-en-1-yl-, Cyclobut-1-en-3-yl-, Cyclobuta-1,3-dien-1-yl-Gruppe, etc. und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkenylgruppe eine (C₂-C₆)-Alkenylgruppe.
"Alkinylgruppe" betrifft eine ungesättigte verzweigte, geradkettige oder cyclische Alkylgruppe mit mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkins ableitet. Typische Alkinylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Ethinylgruppe, Propinylgruppen wie Prop-1-in-1-yl-, Prop-2-in-1-yl-Gruppe, etc., Butinylgruppen wie But-1-in-1-yl-, But-1-in-3-yl-, But-3-in-1-yl-Gruppe, etc. und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkinylgruppe eine (C₂-C₆)-Alkinylgruppe.
"Alkyldiylgruppe" betrifft eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte, geradkettige oder cyclische bivalente Kohlenwasserstoffgruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem von zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen eines Stammalkans, -alkens oder -alkins oder durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkans, -alkens oder -alkins ableitet. Die zwei monovalenten Radikalzentren oder jede Valenz des bivalenten Radikalzentrums kann mit den gleichen oder unterschiedlichen Atomen Bindungen ausbilden. Typische Alkyldiylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Methandiylgruppe, Ethyldiylgruppen wie Ethan-1,1-diyl-, Ethan-1,2-diyl-, Ethen-1,1-diyl-, Ethen-1,2-diylgruppe, Propyldiylgruppen wie Propan-1,1-diyl-, Propan-1,2-diyl-, Propan-2,2-diyl-, Propan-1,3-diyl-, Cyclopropan-1,1-diyl-, Cyclopropan-1,2-diyl-, Prop-1-en-1,1-diyl-, Prop-1-en-1,2-diyl-, Prop-2-en-1,2-diyl-, Prop-1-en-1,3-diyl-, Cycloprop-1-en-1,2-diyl-, Cycloprop-2-en-1,2-diyl-, Cycloprop-2-en-1,1-diyl-, Prop-1-in-1,3-diylgruppe, etc., Butyldiylgruppen wie Butan-1,1-diyl-, Butan-1,2-diyl-, Butan-1,3-diyl-, Butan-1,4-diyl-, Butan-2,2-diyl-, 2-Methylpropan-1,1-diyl-, 2-Methylpropan-1,2-diyl-, Cyclobutan-1,1-diyl-, Cyclobutan-1,2-diyl-, Cyclobutan-1,3-diyl-, But-1-en-1,1-diyl-, But-1-en-1,2-diyl-, But-1-en-1,3-diyl-, But-1-en-1,4-diyl-, 2-Methylprop-1-en-1,1-diyl-, 2-Methanylidenpropan-1,1-diyl-, Buta-1,3-dien-1,1-diyl-, Buta-1,3-dien-1,2-diyl-, Buta-1,3-dien-1,3-diyl-, Buta-1,3-dien-1,4-diyl-, Cyclobut-1-en-1,2-diyl-, Cyclobut-1-en-1,3-diyl-, Cyclobut-2-en-1,2-diyl-, Cyclobuta-1,3-dien-1,2-diyl-, Cyclobuta-1,3-dien-1,3-diyl-, But-1-in-1,3-diyl-, But-1-in-1,4-diyl-, Buta-1,3-diin-1,4-diylgruppe, etc. und dergleichen. Wo spezifische Sättigungsgrade vorgesehen sind, wird die Nomenklatur Alkanyldiyl-, Alkenyldiyl- und/oder Akinyldiylgruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkyldiylgruppe eine (C₁-C₆)-Alkyldiylgruppe. Auch bevorzugt sind gesättigte acyclische Alkanyldiylgruppen, in denen die Radikalzentren an den terminalen Kohlenstoffatomen vorliegen, z. B. Methandiyl-(Methano-), Ethan-1,2-diyl-(Ethano-), Propan-1,3-diyl-(Propano-), Butan-1,4-diyl-(Butano-)Gruppe und dergleichen (auch als Alkylenogruppen, wie infra definiert, bezeichnet).
"Alkylenogruppe" betrifft eine geradkettige Alkyldiylgruppe mit zwei terminalen monovalenten Radikalzentren, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem der zwei terminalen Kohlenstoffatomen des geradkettigen Stammalkans, -alkens oder -alkins ableitet. Typische Alkylenogruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Methanogruppe, Ethylenogruppen wie Ethano-, Etheno-, Ethinogruppe, Propylenogruppen wie Propano-, Prop[1]eno-, Propa[1,2]dieno-, Prop[1]inogruppe, etc., Butylenogruppen wie Butano-, But[1]eno-, But[2]eno-, Buta[1,3]dieno-, But[1]ino-, But[2]ino-, But[1,3]diinogruppe, etc. und dergleichen. Wo spezifische Sättigungsgrade vorgesehen sind, wird die Nomenklatur Alkano-, Alkeno- und/oder Alkinogruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkylenogruppe eine (C₁-C₅)- oder (C₁-C₄)-Alkylenogruppe. Auch bevorzugt sind geradkettige gesättigte Alkanogruppen, z. B. Methano-, Ethano-, Propano-, Butanogruppe und dergleichen.
"Heteroalkyl-, Heteroalkanyl-, Heteroalkenyl-, Heteroalkanyl-, Heteroalkyldiyl- und Heteroalkylenogruppen" betreffen Alkyl-, Alkanyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkyl-diyl- bzw. Alkylenogruppen, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome (und jegliche dazugehörige Wasserstoffatome) jeweils unabhängig voneinander mit den gleichen oder unterschiedlichen Heteroatomgruppen ersetzt sind. Typische Heteroatomgruppen, die in diese Gruppen eingebaut werden können, umfassen in nicht begrenzender Weise -O-, -S-, -O-O-, -S-S-, -O-S-, -NR'-, =N-N=, -N=N-, -N=N-NR'-, -PH-, -P(O)₂-, -O-P(O)₂-, -SH₂-, -S(O)₂-, -SnH₂- und dergleichen, worin jede R'-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Alkanyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylaryl-, Arylalkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- oder Heteroaryllieteroarylgruppe, wie hierin definiert, ist.
"Acyclische heteroatomare Brücke" betrifft eine bivalente Brücke, in der die Rückgratatome ausschließlich Heteroatome sind. Typische acyclische heteroatomare Brücken umfassen in nicht begrenzender Weise jegliche der verschiedenen vorstehend aufgeführten heteroatomaren Gruppen, entweder allein oder in Kombinationen.
"Cyclische Heteroalkylgruppe" betrifft eine gesättigte oder ungesättigte cyclische Alkylgruppe, in der ein oder mehrere Kohlenstoffatome (und jegliche dazugehörige Wasserstoffatome) unabhängig voneinander mit dem gleichen oder verschiedenen Heteroatom ersetzt sind. Typische Heteroatome zum Ersetzen des Kohlenstoffatoms/der Kohlenstoffatome umfassen in nicht begrenzender Weise N, P, O, S, Si, etc. In dem Fall, dass ein spezifischer Sättigungsgrad vorgesehen ist, wird die Nomenklatur "cyclische Heteroalkanylgruppe" oder "cyclische Heteroalkenylgruppe" verwendet. Typische cyclische Heteroalkylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Gruppen, die von Epoxiden, Imidazolidin, Morpholin, Piperazin, Piperidin, Pyrazolidin, Pyrrolidin, Quinuclidin und dergleichen abstammen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die cyclische Heteroalkylgruppe eine 3–6- gliedrige cyclische Heteroalkylgruppe. Besonders bevorzugte cyclische Heteroalkylgruppen sind Morpholino-, Pyrrolidino-, Pipyridino-, Tetrahydrothiopheno-, Tetrahydrofuranyl- und Tetrahydropyranylgruppe.
"Aromatisches Stammringsystem" betrifft ein ungesättigtes cyclisches oder polycyclisches Ringsystem mit einem konjugierten n-Elektronensystem. Spezifisch eingeschlossen in der Definition von "aromatischem Stammringsystem" sind kondensierte Ringsysteme, in denen einer oder mehrere der Ringe aromatisch sind und einer oder mehrere der Ringe gesättigt oder ungesättigt sind, wie z. B. Indan, Inden, Phenalen, etc. Typische aromatische Stammringsysteme umfassen in nicht begrenzender Weise Aceanthrylen, Acenaphthylen, Acephenanthrylen, Anthracen, Azulen, Benzol, Chrysen, Coronen, Fluoranthen, Fluoren, Hexacen, Hexaphen, Hexalen, αs-Indacen, s-Indacen, Indan, Inden, Naphthalen, Octacen, Octaphen, Octalen, Ovalen, Penta-2,4-dien, Pentacen, Pentalen, Pentaphen, Perylen, Phenalen, Phenanthren, Picen, Pleiaden, Pyren, Pyranthren, Rubicen, Triphenylen, Trinaphthalen und dergleichen.
"Arylgruppe" betrifft eine monovalente aromatische Kohlenwasserstoffgruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines aromatischen Stammringsystems ableitet. Typische Arylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Gruppen, die von Aceanthrylen, Acenaphthylen, Acephenanthrylen, Anthracen, Azulen, Benzol, Chrysen, Coronen, Fluoranthen, Fluoren, Hexacen, Hexaphen, Hexalen, αs-Indacen, s-Indacen, Indan, Inden, Naphthalen, Octacen, Octaphen, Octalen, Ovalen, Penta-2,4-dien, Pentacen, Pentacen, Pentaphen, Perylen, Phenalen, Phenanthren, Picen, Pleiaden, Pyren, Pyranthren, Rubicen, Triphenylen, Trinaphthalen und dergleichen abstammen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylgruppe eine (C₅-C₁₄)-Arylgruppe, wobei (C₅-C₁₀) noch mehr bevorzugt ist. Besonders bevorzugte Arylgruppen sind Cyclopentadienyl-, Phenyl- und Naphthylgruppe.
"Aryldiylgruppe" betrifft eine bivalente aromatische Kohlenwasserstoffgruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem von zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen eines aromatischen Stammringsystems oder durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von einem einzigen Kohlenstoffatom eines aromatischen Stammringsystems ableitet. Die zwei monovalenten Radikalzentren oder jede Valenz des bivalenten Zentrums kann Bindungen mit dem/den gleichen oder verschiedenen Atomen) ausbilden. Typische Aryldiyl gruppen umfassen in nicht begrenzender Weise bivalente Gruppen, die von Aceanthrylen, Acenaphthylen, Acephenanthrylen, Anthracen, Azulen, Benzol, Chrysen, Coronen, Fluoranthen, Fluoren, Hexacen, Hexaphen, Hexalen, αs-Indacen, s-Indacen, Indan, Inden, Naphthalen, Octacen, Octaphen, Octalen, Ovalen, Penta-2,4-dien, Pentacen, Pentalen, Pentaphen, Perylen, Phenalen, Phenanthren, Picen, Pleiaden, Pyren, Pyranthren, Rubicen, Triphenylen, Trinaphthalen und dergleichen abstammen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Aryldiylgruppe eine (C₅-C₁₄)-Aryldiylgruppe, wobei (C₅-C₁₀) noch bevorzugter ist. Die am meisten bevorzugten Aryldiylgruppen sind bivalente Gruppen, die von Benzol und Naphthalen abstammen, insbesondere Phena-1,4-diyl-, Naphtha-2,6-diyl- und Naphtha-2,7-diylgruppe.
"Arylenogruppe" betrifft eine bivalente Brückengruppe mit zwei benachbarten monovalenten Radikalzentren, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem von zwei benachbarten Kohlenstoffatomen eines aromatischen Stammringsystems ableitet. Ein Anbinden einer Arylenobrückengruppe, zum Beispiel Benzogruppe, an ein aromatisches Stammringsystem, zum Beispiel Benzol, ergibt ein kondensiertes aromatisches Ringsystem, zum Beispiel Naphthalen. Es wird angenommen, dass die Brücke die Maximalanzahl von nicht kumulierten Doppelbindungen aufweist, übereinstimmend mit ihrer Anbindung an dem sich ergebenden kondensierten Ringsystem. Wenn eine Arylenogruppe dadurch gebildet wird, dass zwei benachbarte Substituenten an einer Struktur, die alternative Substituenten beinhaltet, zusammengenommen werden, ersetzen die Kohlenstoffatome der Arylenobrücke die verbrückenden Kohlenstoffatome der Struktur, um ein doppeltes Zählen von Kohlenstoffatomen zu vermeiden. Als ein Beispiel soll die nachstehende Struktur betrachtet werden:
worin:
R¹, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist oder, wenn mit R² zusammengenommen, eine (C₅-C₁₄)-Arylenogruppe ist, und
R², wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist, oder, wenn mit R¹ zusammengenommen, eine (C₅-C₁₄)-Arylenogruppe ist.
Wenn R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom sind, ist die sich ergebende Verbindung Benzol. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine C₆-Aryleno-(Benzo-)Gruppe ist, ist die sich ergebende Verbindung Naphthalen. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine C₁₀-Aryleno-(Naphthaleno-)Gruppe ist, ist die sich ergebende Verbindung Anthracen oder Phenanthren. Typische Arylenogruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Aceanthryleno-, Acenaphthyleno-, Acephenanthryleno-, Anthraceno-, Azuleno-, Benzeno-(Benzo-), Chryseno-, Coroneno-, Fluorantheno-, Fluoreno-, Hexaceno-, Hexapheno-, Hexaleno-, αs-Indaceno-, s-Indaceno-, Indeno-, Naphthaleno-(Naphtho-), Octaceno-, Octapheno-, Octaleno-, Ovaleno-, Penta-2,4-dieno-, Pentaceno-, Pentaleno-, Pentapheno-, Peryleno-, Phenaleno-, Phenanthreno-, Piceno-, Pleiadeno-, Pyreno-, Pyranthreno-, Rubiceno-, Triphenyleno-, Trinaphthalenogruppe und dergleichen. In dem Fall, dass eine spezifische Anbindung vorgesehen ist, sind die beteiligten verbrückenden Kohlenstoffatome (der Arylenobrücke) in Klammern angegeben, zum Beispiel [1,2]Benzeno([1,2]Benzo), [1,2]Naphthaleno, [2,3]Naphthaleno, etc. Folglich ist in dem vorstehenden Beispiel, wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine [2,3]Naphthalenogruppe ist, die sich ergebende Verbindung Anthracen. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine [1,2]Naphthalenogruppe ist, die sich ergebende Verbindung Phenanthren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Arylenogruppe eine (C₅-C₁₄)-Arylenogruppe, wobei (C₅-C₁₀) noch mehr bevorzugt ist.
"Arylarylgruppe" betrifft eine monovalente Kohlenwasserstoffgruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Ringsystems ableitet, indem zwei oder mehrere identische oder nicht identische aromatische Stammringsysteme direkt über eine Einfachbindung zusammen verbunden sind, wobei die Anzahl solcher direkten Ringverbindungen eins weniger beträgt als die Anzahl von beteiligten aromatischen Stammringsystemen. Typische Arylarylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Biphenyl-, Triphenyl-, Phenylnaphthyl-, Binaphthyl-, Biphenylnaphthylgruppe und dergleichen. In dem Fall, dass die Anzahl von Kohlenstoffatomen in einer Arylarylgruppe spezifiziert ist, betreffen die Zahlen die Kohlenstoffatome, die jeden aromatischen Stammring umfassen. Zum Beispiel ist eine (C₅-C₁₄)-Arylarylgruppe eine Arylarylgruppe, in der jeder aromatische Ring 5 bis 14 Kohlenstoffatome umfasst, z. B. Biphenyl-, Triphenyl-, Binaphthyl-, Phenylnaphthylgruppe, etc. Vorzugsweise ist jedes aromatische Stammringsystem einer Arylarylgruppe unabhängig voneinander eine (C₅-C₁₄)-aromatische Gruppe, mehr bevorzugt eine (C₅-C₁₀)-aromatische Gruppe. Auch bevorzugt sind Arylarylgruppen, in denen alle aromatischen Stammringsysteme identisch sind, z. B. Biphenyl-, Triphenyl-, Binaphthyl-, Trinaphthylgruppe, etc.
"Biarylgruppe" betrifft eine Arylarylgruppe mit zwei identischen aromatischen Stammsystemen, die direkt durch eine Einfachbindung zusammen verbunden sind. Typische Biarylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Biphenyl-, Binaphthyl-, Bianthracylgruppe und dergleichen. Vorzugsweise sind die aromatischen Ringsysteme (C₅-C₁₄)-aromatische Ringe, mehr bevorzugt (C₅-C₁₀)-aromatische Ringe. Eine besonders bevorzugte Biarylgruppe ist die Biphenylgruppe.
"Arylalkylgruppe" betrifft eine acyclische Alkylgruppe, in der eines der Wasserstoffatome, die an ein Kohlenstoffatom, typischerweise ein terminales oder sp³-Kohlenstoffatom, gebunden sind, durch eine Arylgruppe ersetzt ist. Typische Arylalkylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Benzyl-, 2-Phenylethan-1-yl-, 2-Phenylethen-1-yl-, Naphthylmethyl-, 2-Naphthylethan-1-yl-, 2-Naphthylethen-1-yl-, Naphthobenzyl-, 2-Naphthophenylethan-1-yl-Gruppe und dergleichen. In dem Fall, dass spezifische Alkylgruppen vorgesehen sind, wird die Nomenklatur Arylalkanyl-, Arylalkenyl- und/oder Arylalkinylgruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylalkylgruppe eine (C₆-C₂₀)-Arylalkylgruppe, z. B. die Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe der Arylalkylgruppe ist eine (C₁-C₆)-Gruppe und die Arylgruppe ist eine (C₅-C₁₄)-Gruppe. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylalkylgruppe eine (C₆-C₁₃)-Gruppe, z. B. die Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe der Arylalkylgruppe ist eine (C₁-C₃)-Gruppe und die Arylgruppe ist eine (C₅-C₁₀)-Gruppe.
"Arylheteroalkylgruppe" betrifft eine acyclische Heteroalkylgruppe, in der eines der Wasserstoffatome, die an ein Kohlenstoff- oder Heteroatom, typischerweise ein terminales Kohlenstoff- oder Heteroatom, gebunden sind, durch eine Arylgruppe ersetzt ist. In dem Fall, dass Arylheteroalkylgruppen spezifische Sättigungsgrade aufweisen sollen, wird die Nomenklatur Arylheteroalkanyl-, Arylheteroalkenyl- und/oder Arylheteroalkinylgruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylheteroalkylgruppe eine 6–26-gliedrige Arylheteroalkylgruppe, z. B. ist die Heteroalkylgruppe 1–6-gliedrig und die Arylgruppe ist eine (C₅-C₂₀)-Arylgruppe. In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist die Arylheteroalkylgruppe 6 bis 13 Mitglieder auf, d. h. die Heteroalkylgruppe ist 1–3-gliedrig und die Arylgruppe ist eine (C₅-C₁₀)-Arylgruppe.
"Heteroaromatisches Stammringsystem" betrifft ein aromatisches Stammringsystem, in dem ein oder mehrere Kohlenstoffatome (und jegliche dazugehörige Wasserstoffatome) jeweils unabhängig voneinander mit dem gleichen oder einem unterschiedlichen Heteroatom ersetzt sind. Typische Heteroatome zum Ersetzen der Kohlenstoffatome umfassen in nicht begrenzender Weise N, P, O, S, Si, etc. (einschließlich dazugehöriger Wasserstoff- oder anderer Atome). Spezifisch eingeschlossen in die Definition von "heteroaromatische Stammringsysteme" sind kondensierte Ringsysteme, in denen einer oder mehrere der Ringe aromatisch sind und einer oder mehrere der Ringe gesättigt oder ungesättigt sind, z. B. Arsindol, Chroman, Chromen, Indol, Indolin, Xanthen, etc. Typische heteroaromatische Stammringsysteme umfassen in nicht begrenzender Weise Arsindol, Carbazol, β-Carbolin, Chroman, Chromen, Cinnolin, Furan, Imidazol, Indazol, Indol, Indolin, Indolizin, Isobenzofuran, Isochromen, Isoindol, Isoindolin, Isochinolin, Isothiazol, Isoxazol, Naphthyridin, Oxadiazol, Oxazol, Perimidin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Phenazin, Phthalazin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazin, Pyrazol, Pyridazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Pyrrolizin, Chinazolin, Chinolin, Chinolizin, Chinoxalin, Tetrazol, Thiadiazol, Thiazol, Thiophen, Triazol, Xanthen und dergleichen.
"Heteroarylgruppe" betrifft eine monovalente heteroaromatische Gruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Atom eines heteroaromatischen Stammringsystems ableitet. Typische Heteroarylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Gruppen, die von Acridin, Arsindol, Carbazol, β-Carbolin, Chroman, Chromen, Cinnolin, Furan, Imidazol, Indazol, Indol, Indolin, Indolizin, Isobenzofuran, Isochromen, Isoindol, Isoindolin, Isochinolin, Isothiazol, Isoxazol, Naphthyridin, Oxadiazol, Oxazol, Perimidin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Phenazin, Phthalazin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazin, Pyrazol, Pyridazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Pyrrolizin, Chinazolin, Chinolin, Chinolizin, Chinoxalin, Tetrazol, Thiadiazol, Thiazol, Thiophen, Triazol, Xanthen und dergleichen abstammen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylgruppe eine 5–14-gliedrige Heteroarylgruppe, wobei 5–10-gliedrige Heteroarylgruppen besonders bevorzugt sind. Die am meisten bevorzugten Heteroarylgruppen sind diejenigen, die von Thiophen, Pyrrol, Benzothiophen, Benzofuran, Indol, Pyridin, Chinolin, Imidazol, Oxazol und Pyrazin abstammen.
"Heteroaryldiylgruppe" betrifft eine bivalente heteroaromatische Gruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem von zwei unterschiedli chen Atomen eines heteroaromatischen Stammringsystems oder durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von einem einzigen Atom eines heteroaromatischen Stammringsystems ableitet. Die zwei monovalenten Radikalzentren oder jede Valenz des einzigen bivalenten Zentrums kann mit dem/den gleichen oder unterschiedlichen Atomen) Bindungen ausbilden. Typische Heteroaryldiylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise bivalente Gruppen, die von Acridin, Arsindol, Carbazol, β-Carbolin, Chroman, Chromen, Cinnolin, Furan, Imidazol, Indazol, Indol, Indolin, Indolizin, Isobenzofuran, Isochromen, Isoindol, Isoindolin, Isochinolin, Isothiazol, Isoxazol, Naphthyridin, Oxadiazol, Oxazol, Perimidin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Phenazin, Phthalazin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazin, Pyrazol, Pyridazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Pyrrolizin, Chinazolin, Chinolin, Chinolizin, Chinoxalin, Tetrazol, Thiadiazol, Thiazol, Thiophen, Triazol, Xanthen und dergleichen abstammen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroaryldiylgruppe eine 5–14-gliedrige Heteroaryldiylgruppe, wobei 5–10-gliedrige Gruppen besonders bevorzugt sind. Die am meisten bevorzugten Heteroaryldiylgruppen sind bivalente Gruppen, die von den bevorzugten Heteroarylgruppen Thiophen, Pyrrol, Benzothiophen, Benzofuran, Indol, Pyridin, Chinolin, Imidazol, Oxazol und Pyrazin abstammen.
"Heteroarylenogruppe" betrifft eine bivalente Brückengruppe mit zwei benachbarten monovalenten Radikalzentren, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem von zwei benachbarten Atomen eines heteroaromatischen Stammringsystems ableitet. Ein Anbinden einer Heteroarylenobrückengruppe, zum Beispiel Pyridinogruppe, an ein aromatisches Stammringsystem, zum Beispiel Benzol, ergibt ein kondensiertes heteroaromatisches Ringsystem, zum Beispiel Chinolin. Es wird angenommen, dass die Brücke die Maximalanzahl von nicht kumulierten Doppelbindungen aufweist, übereinstimmend mit ihrer Anbindung an dem sich ergebenden kondensierten Ringsystem. Wenn ein Heteroarylenosubstituent dadurch gebildet wird, dass zwei benachbarte Substituenten an einer Struktur, die alternative Substituenten beinhaltet, zusammengenommen werden, ersetzen die Ringatome der Heteroarylenobrücke die verbrückenden Ringatome der Struktur, um ein doppeltes Zählen von Ringatomen zu vermeiden. Als ein Beispiel soll die nachstehende Struktur betrachtet werden:
worin:
R¹, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist oder, wenn mit R² zusammengenommen, eine 5- bis 14-gliedrige Heteroarylenogruppe ist, und
R², wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom ist, oder, wenn mit R¹ zusammengenommen, eine 5- bis 14-gliedrige Heteroarylenogruppe ist.
Wenn R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom sind, ist die sich ergebende Verbindung Benzol. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine 6-gliedrige Heteroaryleno-(z. B. Pyridino-)Gruppe ist, ist die sich ergebende Verbindung Isochinolin, Chinolin oder Chinolizin. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine 10-gliedrige Heteroarylenogruppe (z. B. Isochinolin) ist, ist die sich ergebende Verbindung z. B. Acridin oder Phenanthridin. Typische Heteroarylenogruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Acridino-, Carbazolo-, β-Carbolino-, Chromeno-, Cinnolino-, Furano-, Imidazolo-, Indazoleno-, Indoleno-, Indolizino-, Isobenzofurano-, Isochromeno-, Isoindoleno-, Isochinolino-, Isothiazoleno-, Isoxazoleno-, Naphthyridino-, Oxadiazoleno-, Oxazoleno-, Perimidino-, Phenanthridino-, Phenanthrolino-, Phenazino-, Phthalazino-, Pteridino-, Purino-, Pyrano-, Pyrazino-, Pyrazoleno-, Pyridazino-, Pyridino-, Pyrimidino-, Pyrroleno-, Pyrrolizino-, Chinazolino-, Chinolino-, Chinolizino-, Chinoxalino-, Tetrazoleno-, Thiadiazoleno-, Thiazoleno-, Thiopheno-, Triazoleno-, Xanthenogruppe und dergleichen. In dem Fall, dass eine spezifische Anbindung vorgesehen ist, sind die beteiligten verbrückenden n Atome (der Heteroarylenobrücke) in Klammern angegeben, zum Beispiel [1,2]Pyridino, [2,3]Pyridino, [3,4]Pyridino, etc. Folglich ist in dem vorstehenden Beispiel, wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine [1,2]Pyridinogruppe ist, die sich ergebende Verbindung Chinolizin. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine [2,3]Pyridinogruppe ist, die sich ergebende Verbindung Chinolin. Wenn R¹ mit R² zusammengenommen eine [3,4]Pyridinogruppe ist, die sich ergebende Verbindung Isochinolin. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylenogruppe eine 5- bis 14-gliedrige Heteroarylenogruppe, wobei eine 5- bis 10-gliedrige Gruppe noch mehr bevorzugt ist. Die am meisten bevorzugten Heteroarylenogruppen sind diejenigen, die von den bevorzugten Heteroarylgruppen Thiophen, Pyrrol, Benzothiophen, Benzofuran, Indol, Pyridin, Chinolin, Imidazol, Oxazol und Pyrazin abstammen.
"Heteroarylheteroarylgruppe" betrifft eine monovalente heteroaromatische Gruppe, die sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Atom eines Ringsystems ableitet, indem zwei oder mehrere identische oder nicht identische heteroaromatische Stammringsysteme über eine Einfachbindung direkt miteinander verbunden sind, wobei die Anzahl solcher direkten Ringverbindungen um eins geringer ist als die Anzahl von beteiligten heteroaromatischen Stammringsystemen. Typische Heteroarylheteroarylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Bipyridyl-, Tripyridyl-, Pyridylpurinyl-, Bipurinylgruppe, etc. In dem Fall, dass die Anzahl an Atomen spezifiziert ist, betreffen die Zahlen die Anzahl an Atomen, die jegliche heteroaromatische Stammringsysteme umfassen. Zum Beispiel ist eine 5–14-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppe eine Heteroarylheteroarylgruppe, in der jedes heteroaromatische Stammringsystem 5 bis 14 Atome umfasst, z. B. Bipyridyl-, Tripuridylgruppe, etc. Vorzugsweise ist jedes heteroaromatische Stammringsystem unabhängig eine 5–14-gliedrige heteroaromatische Gruppe, mehr bevorzugt eine 5–10-gliedrige heteroaromatische Gruppe. Auch bevorzugt sind Heteroarylheteroarylgruppen, in denen alle heteroaromatischen Stammringsysteme identisch sind. Die am meisten bevorzugten Heteroarylheteroarylgruppen sind diejenigen, in denen jede Heteroarylgruppe von den bevorzugten Heteroarylgruppen Thiophen, Pyrrol, Benzothiophen, Benzofuran, Indol, Pyridin, Chinolin, Imidazol, Oxazol und Pyrazin abstammen.
"Biheteroarylgruppe" betrifft eine Heteroarylheteroarylgruppe mit zwei identischen heteroaromatischen Stammringsystemen, die durch eine Einfachbindung direkt miteinander verbunden sind. Typische Biheteroarylgruppen umfassen in nicht begrenzender Weise Bipyridyl-, Bipurinyl-, Bichinolinylgruppe und dergleichen. Vorzugsweise sind die heteroaromatischen Ringsysteme 5–14-gliedrige heteroaromatische Ringe, mehr bevorzugt 5–10-gliedrige heteroaromatische Ringe. Die am meisten bevorzugten Biheteroarylgruppen sind diejenigen, in denen die Heteroarylgruppen von den bevorzugten Heteroarylgruppen Thiophen, Pyrrol, Benzothiophen, Benzofuran, Indol, Pyridin, Chinolin, Imidazol, Oxazol und Pyrazin abstammen.
"Heteroarylalkylgruppe" betrifft eine acyclische Alkylgruppe, in der eines der Wasserstoffatome, die an ein Kohlenstoffatom, typischerweise ein terminales oder sp³-Kohlenstoffatom, gebunden sind, durch eine Heteroarylgruppe ersetzt ist. In dem Fall, dass spezifische Alkylgruppen vorgesehen sind, wird die Nomenklatur Heteroarylalkanyl-, Heteroarylalkenyl- und/oder Heteroarylalkinylgruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylalkylgruppe eine 6–20-gliedrige Heteroarylalkylgruppe, z. B. ist die Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe der Heteroarylalkylgruppe eine 1–6-gliedrige Gruppe und die Heteroaryl gruppe ist eine 5–14-gliedrige Heteroarylgruppe. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylalkylgruppe eine 6–13-gliedrige Heteroarylalkylgruppe, z. B. ist die Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe 1–3-gliedrig und die Heteroarylgruppe ist eine 5- bis 10-gliedrige Heteroarylgruppe.
"Substituiert" betrifft eine Gruppe, in der ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander mit dem/den gleichen oder verschiedenen Substituenten ersetzt ist/sind. Typische Substituenten umfassen in nicht begrenzender Weise -X-, -R-, -O^–-, =O-, -OR-, -SR-, -S^–-, =S-, -NRR-, =NR-, Perhalogen-(C₁-C₆)-alkyl-, -CX₃-, -CF₃-, -CN-, -OCN-, -SCN-, -NO-, -NO₂-, =N₂-, -N₃-, -S(O)₂O^–-, -S(O)₂OH-, -S(O)₂R-, -OS(O)₂O^–-, -OS(O)₂OH-, -OS(O)₂R-, -P(O)(O^–)₂-, -P(O)(OH)(O^–)-, -OP(O)₂(O^–)-, -C(O)R-, -C(S)R-, -C(O)OR-, -C(O)O^–-, -C(O)SR- und -C(NR)NRR-Gruppe, worin jede X-Gruppe unabhängig ein Halogenatom ist, jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoff-, Halogenatom, eine Alkyl-, Alkanyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Arylaryl-, Arylheteroalkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl-, Heteroarylheteroaryl-, -NR'R'-, -C(O)R'- oder -S(O)₂R'-Gruppe ist und jede R'-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Alkanyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Arylheteroalkyl-, Arylaryl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- oder Heteroarylheteroarylgruppe ist.
4.3 Die Verbindungen
Wie in dem Abschnitt "Hintergrund" beschrieben, weisen die Fluoreszenzfarbstoffe, die zum Markieren von Polynukleotiden in Anwendungen wie Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, häufig einen signifikanten Einfluss auf deren elektrophoretische Mobilitäten auf. Diese Unterschiede hinsichtlich elektrophoretischer Mobilitäten sind nicht erwünscht, da sie zu signifikanten Vieldeutigkeiten in Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen auf Fluoreszenzbasis, insbesondere in Vier-Farben-Sequenzierungsreaktionen, führen können, in denen mit unterschiedlichen terminierenden Basen terminierte Fragmente in einer einzigen Gelspur oder Kapillare aufgetrennt werden. Zum Beispiel wird in Vier-Farben-Nukleinsäure-Sequenzierungsverfahren des Sanger-Typs die Basensequenz durch Korrelation einer Farbe mit einem Terminierungsereignis bestimmt. Die Abfolge der Farben ergibt direkt die Reihenfolge der Basensequenz in einem Elektrophoreseexperiment. Eine Farbstoffmarkierung kann eine Verschiebung von mehr als 10 bis 12 Basen bei der elektrophoretischen Mobilität eines markierten Fragments einführen, im Vergleich mit dem entsprechenden nicht markierten Fragment. Wenn alle vier Markierungen dieselbe Mobilitätsverschiebung verleihen, wird sodann die korrekte Reihenfolge von Banden auf dem Elektrophoresegel oder der Spur erhalten. Jedoch, wenn eine der Farbstoffmarkierungen eine Mobilitätsverschiebung verleiht, die zu der unterschiedlich ist, die von den anderen dreien verliehen wird, werden alle mit diesem Farbstoff markierten Fragmente Leserahmen-verschoben sein hinsichtlich Fragmenten, die mit den anderen Farbstoffen markiert sind. Da die Fragmente außerhalb der Reihenfolge elektrophoretisch aufgetrennt werden, wird eine nicht korrekte Sequenz erhalten werden.
Als eine Folge erfolgten Anstrengungen, um Familien von Farbstoffen zu entwickeln, die minimale relative Mobilitätsverschiebungen zwischen markierten Polynukleotidfragmenten induzieren (Ju et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 4347–4351; Ju et al., 1995, Anal. Biochem. 231: 131–140; Ju et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24: 1144–1148; Metzker et al., 1996, Science 271: 1420–1422; Hung et al., 1996, Anal. Biochem. 243: 15–27; Hung et al., 1997, Anal. Biochem. 252: 78–88). Im Allgemeinen wurde dies durch Anpassen der Struktur des Farbstoff-DNA-Linkers erreicht (Metzker et al., 1996, supra).
Kürzlich wurde festgestellt, dass solche Mobilitätsverschiebungen sehr viel ersichtlicher mit Kapillar-Array-Elektrophorese (CAE) als mit herkömmlicher Platten-Gel-Elektrophorese (Marsh et al., 1997, J. Capillary Electrophoresis 4: 83–89) sind. Folglich können Farbstoffe, die abgestimmte Mobilitäten in einem Platten-Gel-Format aufweisen, immer noch signifikante relative Mobilitätsverschiebungen in dem wünschenswerteren CAE-Format mit höherem Durchsatz zeigen (Tu et al., 1997, Nucl. Acids Res. 26: 2797–2802). Als eine Folge dieser Feststellung untersuchten Bashkin und Mitarbeiter kürzlich die elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden, die mit bestimmten Cyanin-Farbstoffen markiert waren (Tu et al., 1998, supra). Durch diese Untersuchungen wurde festgestellt, dass mehrere Faktoren eine Rolle bei den festgestellten elektrophoretischen Mobilitäten von markierten Polynukleotiden spielen. Am bemerkenswertesten sind die Nettoladung des Farbstoffs und die Positionen) von geladenen Substituenten auf dem Farbstoff. Obwohl bestimmte Trends beobachtet wurden, katalogisierten die Autoren einfach die beobachteten elektrophoretischen Mobilitäten. Die Autoren untersuchten nicht die Wirkung von Substitutionen auf die biologische Aktivität von Nukleotiden, die mit den Farbstoffen markiert waren.
Erfindungsgemäß wird eine neue Klasse von Cyanin-Fluoreszenzfarbstoffverbindungen bereitgestellt, die diese und andere Begrenzungen im Stand der Technik überwinden. Die erfindungsgemäßen Cyanin-Farbstoffverbindungen sind an einer der heteroaromatischen Ringstickstoffatome mit einer angehängten Gruppe substituiert, die eine Vielzahl von Ladungen trägt ("mobilitätsmodifizierende Gruppe"). Durch Anpassen der Anzahl von Ladungen, die von der angehängten -Gruppe getragen werden, können die elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden, die mit den mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen markiert sind, zum Abstimmen mit den elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden, die mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, vorhersehbar abgestimmt oder eingestellt werden. Bemerkenswerterweise können die mobilitätsverleihenden Charakteristika eines spezifischen "Stamm"-Cyanin-Farbstoffs modifiziert werden, ohne signifikant die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs zu verändern. Außerdem behalten enzymatisch einbaubare Nukleotide und Nukleotid-Analoga, die mit den mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen markiert sind, einen hohen Grad an biologischer Aktivität als Substrate für die Polymeraseenzyme, die herkömmlicherweise in Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, wie die thermostabile Polymerase AMPLITAQ^®DNA-Polymerase, FS (PE Biosystems, Foster City, CA), bei. Folglich erlauben die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe, dass Sätze von mobilitätsabgestimmten Farbstoffen und/oder mobilitätsabgestimmten markierten Nukleosiden/tiden und -Analoga mit spezifizierten spektralen und/oder biologischen Eigenschaften leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe gehören zu der bekannten Klasse von Fluoreszenzmolekülen, die herkömmlicherweise als Cyanin-Farbstoffe bekannt sind. Cyanin-Farbstoffe umfassen im Allgemeinen erste und zweite stickstoffhaltige heteroaromatische Stammringsysteme, die über eine verbrückende. Gruppe zusammen kovalent verbunden sind (vgl. z. B. US-PS 5,569,587 ). Die Erfindung betrifft die Klasse von Cyanin-Farbstoffen, in der beide heteroaromatischen Stammringsysteme zu der Klasse von Ringen gehören, die allgemein in dem Cyanin-Farbstoffgebiet als Benzazole/Benzazolium-Verbindungen bezeichnet werden.
Heteroaromatische Benzazol/Benzazolium-Ringsysteme weisen die nachstehende allgemeine Struktur auf:
worin:
Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -S-, -O-, -Se- und -CRR-, worin jede R-Gruppe, wenn für sich genommen, unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist oder, wenn mit einer anderen R-Gruppe zusammengenommen, eine (C₄-C₅)-Alkyleno- oder (C₄-C₅)-Alkanogruppe ist. In der dargestellten Struktur bezeichnet die gestrichelte Linie eine Bindung; die entweder eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung sein kann. Da die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe an dem Ringstickstoffatom substituiert sind, wird die Frage, ob, die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist, von der Natur des C2-Substituenten abhängen. Wenn die Bindung eine Einfachbindung ist, ist das Ringsystem ein Benzazol. Wenn die Bindung eine Doppelbindung ist, ist das Ringstickstoffatom positiv geladen und das Ringsystem ist eine Benzazoliumgruppe. Wie es hierin genauer beschrieben werden wird, können die verschiedenen Kohlenstoffatome an den Positionen C4, C5, C6 und C7 unabhängig voneinander mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Substituenten substituiert sein.
In der vorstehenden Struktur ist, wenn Z S ist, das heteroaromatische Ringsystem eine substituierte oder unsubstituierte Benzothiazol/Benzothiazoliumgruppe. Wenn Z O ist, ist das heteroaromatische Ringsystem eine substituierte oder unsubstituierte Benzoxazol/Benzoxazoliumgruppe. Wenn Z Se ist, ist das heteroaromatische Ringsystem eine substituierte oder unsubstituierte Benzoselenazol/Benzoselenazoliumgruppe. Wenn Z CRR ist, ist das heteroaromatische Ringsystem eine substituierte oder unsubstituierte Indolin/Indoliniumgruppe.
Obwohl beide Ringe zu der gleichen allgemeinen Klasse gehören, müssen sie nicht identisch sein. Auch müssen sie beide keine Mitglieder der gleichen Unterklasse sein. Zum Beispiel kann ein Ring eine substituierte oder unsubstituierte Benzoxazol/Benzoxazoliumgruppe sein und der andere Ring kann eine substituierte oder unsubstituierte Indolin/Indoliniumgruppe sein. Erfindungsgemäße mobilitätsmodifizierende Farbstoffe, in denen beide Ringe Mitglieder der gleichen Unterklasse sind, werden als "Homodimere" bezeichnet. Diejenigen Farbstoffe, in denen jeder Ring ein Mitglied einer unterschiedlichen Unterklasse ist, werden als "Heterodimere" bezeichnet. Die Substitutionsmuster der Ringe der homodimeri schen und/oder heterodimerischen erfindungsgemäßen Farbstoffe können, müssen aber nicht identisch sein.
In den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen ist das heteroaromatische Ringstickstoffatom eines der Benzazol-/Benzazolium-Stammringsysteme mit einer mobilitätsmodifizierenden Gruppe substituiert. Das heteroaromatische Ringstickstoffatom des anderen Stammringsystems ist mit einer verbindenden Gruppe zum Konjugieren des mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffs an andere Moleküle oder Substanzen substituiert. Die Art der mobilitätsmodifizierenden und verbindenden Gruppen werden genauer infra beschrieben.
Die heteroaromatischen Ringsysteme können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der gleichen oder verschiedenen Substituenten substituiert sein, die dazu dienen können, die spektralen, chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften der Farbstoffe zu verändern, wie es vollständiger nachstehend beschrieben wird. Die Substitutionsmuster des Rings können, müssen aber nicht identisch sein.
Die Anbindung der mobilitätsmodifizierenden Gruppe und verbindenden Gruppe an unterschiedliche heteroaromatische Ringstickstoffatome stellt ein wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe dar, das mehrere wichtige Folgen hat. Es ist bekannt, dass ein Substituieren der aromatischen Ringe von Chromophoren und Fluorophoren wie Cyanin-Farbstoffen häufig deren spektralen Eigenschaften in einer unvorhersehbaren Weise verändert. Obwohl es nicht vollständig verstanden wird, wird angenommen, dass solche spektralen Veränderungen teilweise auf Störungen der elektronischen Delokalisierung des Chromophors oder Fluorophors beruhen. Ein Anbinden der mobilitätsmodifizierenden und verbindenden Gruppen an heteroaromatische Ringstickstoffatome minimiert diese spektralen Veränderungen, was zu mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen mit spektralen Eigenschaften führt, die im Wesentlichen ähnlich zu denjenigen der entsprechenden nicht modifizierten Farbstoffe sind. Als eine Folge kann, sobald ein Farbstoff mit wünschenswerten spektralen Eigenschaften identifiziert ist, er einfach gemäß den hierin beschriebenen Prinzipien modifiziert werden, um seinen Einfluss auf die elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden, die mit dem sich ergebenden mobilitätsmodifizierenden Farbstoff markiert sind, vorhersehbar zu verändern, ohne des sen spektrale Eigenschaften zu verändern. Außerdem erlaubt ein Anbringen der mobilitätsmodifizierenden und verbindenden Gruppen an unterschiedliche heteroaromatische Ringsysteme, dass die Farbstoffe an Nukleotide und Nukleotid-Analoga konjugiert werden können, ohne die Fähigkeit der sich ergebenden markierten Nukleotide und Nukleotid-Analoga, als Substrate für polymerisierende Enzyme zu fungieren, zu beeinflussen.
Auf der vorstehenden Grundlage wird der Fachmann anerkennen, dass nahezu jeder Benzazol/Benzazolium-Cyanin-Farbstoff, der in dem Fachgebiet bekannt ist oder der später entwickelt wird, vorteilhafterweise gemäß den hierin beschriebenen Prinzipien mobilitätsmodifiziert werden kann.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe Homodimere, d. h. Benzazol/Benzazolium-Ringe sind Mitglieder der gleichen Unterklasse, obwohl sie unterschiedliche Substitutionsmuster aufweisen können. Mehr bevorzugt sind Benzazol/Benzazolium-Ringe die gleichen oder verschiedenen substituierten oder nicht substituierten Indolin/Indolinium-Ringsysteme. Verschiedene mobilitätsmodifizierende Farbstoffe, die von einer Vielzahl von verschiedenen Benzazol/Benzazolium-Ringen umfasst sind, werden genauer infra beschrieben.
Benzazol/Benzazolium-Ringe sind kovalent aneinander über ihre C2-Kohlenstoffatome mittels einer verbrückenden Gruppe gebunden, die eine ausgedehnte elektronische Delokalisierung erlaubt. Brücken, die eine ausgedehnte Elektronendelokalisierung erlauben, umfassen in nicht begrenzender Weise Methin-, Polymethin-, Squarin- und cyclische Alkylenbrücken. Die verschiedenen Kohlenstoffatome der Brücken können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der gleichen oder verschiedenen Substituenten substituiert sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₆)-Alkylgruppe, Halogen-, Fluor-, Chloratom, CN-, CF₃-, (C₅-C₁₄)-Aryl- und 5- bis 14-gliedriger Heteroarylgruppe. In einer Ausführungsform ist die Brücke eine Methin- oder Polymethinbrücke.
Für die Polymethinbrücken beeinflusst die Anzahl von Methingruppen (-CH=) zwischen den heteroaromatischen Ringsystemen die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs (vgl. z. B. Brooker et al., supra). Im Allgemeinen werden, je größer die Anzahl an Methingruppen ist, die Wellenlängen der Absorptions- und Emissionsspektren größer. Folglich kann die Länge und Zusammensetzung der Brücke abgestimmt werden, um die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs, wie gewünscht, einzustellen. Für Farbstoffe, die zum Fluoreszieren entwickelt wurden, wenn sie unter Verwendung einer roten (630–650 nm) Anregungsquelle angeregt werden, sind bevorzugte Polymethinbrücken diejenigen, in denen die Summe von k, l und m zwei beträgt. Besonders bevorzugte Methin- und Polymethinbrücken sind diejenigen, in denen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷, falls vorhanden, jeweils ein Wasserstoffatom sind. Eine besonders bevorzugte Polymethinbrücke ist -CH=CH-CH=CH-CH=.
In einer weiteren Ausführungsform ist die. Brücke eine cyclische Alkylenbrücke gemäß der Strukturformel (B.2):
worin:
p eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist,
R¹ und R⁷ wie vorstehend definiert sind und
R¹⁰ und R^10' jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff-, Sauerstoff-, Halogenatom, -F, -Cl, -CN, -CF₃, -OR, -SR, -NRR, einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl- oder 5- bis 14-gliedriger Heteroarylgruppe, worin jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist.
In der Strukturformel (B.2) stellen die gepunkteten Linien an dem Substituenten R^10' Bindungen dar, die entweder Einfachbindungen oder Doppelbindungen sein können, abhängig von dem Substituenten. Zum Beispiel kann, wenn R^10' ein Sauerstoffatom ist, es an das Kohlenstoffatom doppelt gebunden sein, wodurch ein Carbonylsubstituent gebildet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Brücken gemäß der Strukturformel (B.2) diejenigen Verbindungen, in denen p zwei ist und/oder R¹, R⁷, R¹⁰ und R^10' jeweils ein Wasserstoffatom sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen Brücken gemäß der Strukturformel (B.2) diejenigen Verbindungen, in denen p 0 ist, R¹ und R⁷ jeweils ein Wasserstoffatom sind, R¹⁰ und R^10' jeweils ein Sauerstoffatom sind und die Bindung, die den Substituenten R^10' verbindet, eine Doppelbindung ist.
Die mobilitätsmodifizierende Gruppe MM stellt das Schlüsselmerkmal der erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe dar. Durch Beeinflussen von MM können Cyanin-Farbstoffe mit den gewünschten elektrophoretischen Mobilitätseigenschaften leicht erhalten werden. Die mobilitätsmodifizierende Gruppe umfasst im Allgemeinen eine angehängte Gruppe, die eine oder mehrere Ladungen durch Substitution mit einem oder mehreren der gleichen oder verschiedenen anionischen oder kationischen Substituenten trägt. Die angehängte Gruppe kann eine jegliche Gruppe sein, die fähig ist, mit der gewünschten Anzahl von geladenen Substituenten substituiert zu werden, aber ist typischerweise eine Gruppe mit der Struktur -D-D', worin D eine Bindung, (C₁-C₆)-Alkyldiyl-, 2- bis 6-gliedrige Heteroalkyldiyl- oder 1- bis 6-gliedrige acyclische heteroatomare Brücke ist und D' eine (C₁-C₆)-Alkyl-, 2- bis 6-gliedrige Heteroalkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl-, (C₅-C₁₄)-Arylaryl-, 5- bis 14-gliedrige Heteroaryl- oder 5- bis 14-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppe ist. Vorzugsweise ist D eine Bindung, wenn D' eine (C₁-C₆)-Alkyl- oder 2- bis 6-gliedrige Heteroarylgruppe ist, oder D ist eine (C₁-C₆)-Alkylenogruppe, wenn D' eine (C₅-C₁₄)-Aryl-, (C₅-C₁₄)-Arylaryl-, 5- bis 14-gliedrige Heteroaryl- oder 5- bis 14-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppe ist. Bevorzugt unter den verschiedenen D'-Gruppen sind lineare und verzweigte (C₃-C₆)-Alkylgruppen (insbesondere Alkanylgruppen), lineare und verzweigte 3- bis 6-gliedrige Heteroalkylgruppen (insbesondere Heteroalkanylgruppen)_; (C₄-C₈)-Cycloalkylgruppen (insbesondere Cycloalkanyl- und Cyclohexanylgruppen), 4- bis 8-gliedrige Heterocycloalkylgruppen (insbesondere Heterocycloalkanyl- und Piperidylgruppen), (C₅-C₁₀)-Arylgruppen (insbesondere Phenyl- und Naphthylgruppen), (C₅-C₁₀)-Arylarylgruppen (insbesondere Biaryl- und Biphenylgruppen), 5- bis 10-gliedrige Heteroarylgruppen (insbesondere Pyridyl-, Pyrrolyl-, Indolyl-, Chinolinyl-, Thiophenyl- und Benzothiophenylgruppen) und 5- bis 10-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppen (insbesondere Biheteroarylgruppen, die aus den vorstehenden bevorzugten Heteroarylgruppen aufgebaut sind).
Ein direktes Anbringen von aromatischen Ringen wie Aryl-, Arylaryl-, Heteroaryl- und Heteroarylheteroarylgruppen an das heteroaromatische Ringstickstoffatom von Benzazol/Benzazolium-Cyanin-Farbstoffen hat eine nicht vorhersehbar große Wirkung auf die spektralen Absorptions- und Emissionseigenschaften des Cyanin-Farbstoffs. Zur Vermeidung der Einführung dieser nicht vorhersehbaren spektralen Verschiebungen sollte der Substituent D derart ausgewählt werden, dass Substituent D' an das heteroaromatische Ringstickstoffatom über eine Alkyldiylgruppe gebunden ist. Wenn D' eine (C₅-C₁₄)-Aryl-, (C₅-C₁₄)-Arylaryl-, 5- bis 14-gliedrige Heteroaryl- oder 5- bis 14-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppe ist, ist der Substituent D typischerweise eine (C₁-C₆)-Alkyldiyl-, vorzugsweise eine (C₁-C₆)-Alkyleno- und mehr bevorzugt eine (C₁-C₆)-Alkanogruppe wie Methano- (-CH₂-), Ethano- (-CH₂CH₂-), Propanogruppe (-CH₂CH₂CH₂-), etc. Diese D-Gruppen trennen die mobilitätsmodifizierende Gruppe von dem heteroaromatischen Ringstickstoffatom, um die spektralen Eigenschaften des sich ergebenden Farbstoffs nicht nachteilig zu beeinflussen. Die aromatischen Ringe können direkt an das Benzazol/Benzazolium-Ringstickstoffatom gebunden sein, wenn spektrale Verschiebungen gewünscht sind. Die am meisten bevorzugten angehängten Gruppen gemäß der Struktur -D-D' sind diejenigen, in denen D eine (C₁-C₆)-Alkyleno- oder (C₁-C₆)-Alkanogruppe ist und D' eine Phenyl-, Pyridyl-, Pyrrolyl-, Indolyl-, Chinolinyl-, Thiophenyl- und Benzothiophenylgruppe ist, und diejenigen, in denen D eine Bindung ist und D' eine (C₃-C₆)-Alkyl-, insbesondere (C₃-C₆)-Alkanylgruppe ist.
Ob anionische oder kationische geladene Substituenten verwendet werden, um die angehängte Gruppe zu substituieren, wird von der Richtung der gewünschten Mobilitätsverschiebung abhängen. Wenn eine Erhöhung der relativen elektrophoretischen Mobilität erwünscht ist, wird die angehängte Gruppe mit anionischen Substituenten substituiert sein. Wenn eine Abnahme der relativen elektrophoretischen Mobilität erwünscht ist, wird die angehängte Gruppe mit kationischen Substituenten substituiert sein. Diese Substituenten werden nachstehend genauer beschrieben.
Die Größe der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungen, die durch die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe vermittelt werden, relativ zu Polynukleotiden, die mit dem entsprechenden nicht modifizierten Farbstoff (oder einem weiteren interessierenden Farbstoff) markiert sind, steht in Beziehung mit der Nettoladung der mobilitätsmodifizierenden Gruppe MM. Die Nettoladung von MM ist andererseits abhängig von der Anzahl und den Identitäten von geladenen Substituenten, die die angehängte Gruppe umfassen. Für geladene Substituenten, die vollständig bei etwa neutralem pH-Wert ionisiert sind (d. h. einem pH-Wert von 6 bis 8), wurde festgestellt, dass die elektrophoretische Mobilität linear mit der Nettoladung zunimmt, d. h. jede Einheit an Zunahme oder Abnahme, die die mobilitätsmodifizierende Gruppe MM an die Nettoladung des Farbstoffs beisteuert, verändert die elektrophoretische Mobilität von Polynukleotiden, die mit dem mobilitätsmodifizierenden Farbstoff markiert sind, um ein Nukleotid relativ zu Polynukleotiden, die mit dem entsprechenden nicht modifizierten Farbstoff markiert sind. Folglich sollte etwa eine Nettoladung zu der mobilitätsmodifizierenden Gruppe für jede Nukleotidänderung an relativer gewünschter elektrophoretischer Mobilität zugesetzt werden.
Um Ladungen in einer vorhersehbaren Weise zuzusetzen, sind Substituenten mit permanenten Ladungen oder diejenigen, die bei den pH-Werten, die herkömmlicherweise bei Nukleinsäure-Elektrophoreseanwendungen verwendet werden (typischerweise einem pH-Wert von 6 bis 10), vollständig ionisiert sind, bevorzugt. Geeignete kationische Substituenten umfassen beispielsweise und in nicht begrenzender Weise quaternäre Ammoniumgruppen und Gruppen mit einem pK_a-Wert von 8 oder mehr, einschließlich z. B. -NRR-, -NRRR⁺-, Morpholino- und Piperidinogruppe, worin jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist (und jegliche dazugehörige Gegenionen). Bevorzugte kationische Substituenten sind quaternäre Ammoniumgruppen der Formel -N⁺RRR, worin jede R-Gruppe unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist. Wenn mehrere kationische Substituenten verwendet werden, kann jeder Substituent der gleiche oder ein unterschiedlicher sein. Geeignete anionische Substituenten sind Gruppen mit einem pK_a-Wert von etwa 6 oder weniger, vorzugsweise 3 oder weniger, und umfassen beispielsweise und in nicht begrenzender Weise -C(O)O^–-, -P(O)(O^–)₂-, -P(O)(OH)(O^–)-, -O-P(O)₂(O^–)-, -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppe (einschließlich jeglicher dazugehöriger Gegenionen).
Die geladenen Substituenten können an die angehängte Gruppe direkt gebunden sein oder sie können von der angehängten Gruppe über ein oder mehrere dazwischen liegende Atome beabstandet sein, wie über eine (C₁-C₆)-Alkyldiyl-, (C₁-C₆)-Alkyleno-, 1- bis 6-gliedrige Heteroalkyldiyl- oder eine 2- bis 6-gliedrige Heteroalkylenogruppe oder alternativ dazu über eine 2- bis 6-gliedrige acyclische Brücke. Ein Auswählen der geeigneten Anzahlen) und Identitäten) an geladenen Substituenten, um eine gewünschte Änderung der elektrophoretischen Mobilität basierend auf dem pK_a-Wert des gewünschten geladenen Substituenten zu erreichen, der pH-Wert des Tests und die Nettoladung des zu mobilitätsmodifizierenden Farbstoffs liegen innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns.
In Ausführungsformen, in denen der mobilitätsmodifizierende Cyanin-Farbstoff eine verbindende Gruppe beinhaltet, die eine verbindende Gruppe umfasst, die zum kovalenten Konjugieren des Farbstoffs an ein anderes Molekül (wie infra beschrieben) fähig ist, kann die Selektivität der Konjugationsreaktion zweckmäßigerweise durch Auswählen von geladenen Substituenten gesteuert werden, die unter den Konjugationsbedingungen nicht reagieren oder aktiviert werden. Aufgrund ihrer nicht reaktiven Art in Gegenwart einer Vielzahl von konjugierenden Reagenzien und Bedingungen und ihrem niedrigen pK_a-Wert sind -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppen bevorzugte anionische Substituenten, insbesondere in den Fällen, in denen eine Carboxyl- oder Carboxylatgruppe verwendet wird, um den modifizierten Farbstoff an die anderen Moleküle oder Substanzen kovalent zu konjugieren.
Zusätzlich zu den geladenen Substituenten kann die angehängte Gruppe mit einem oder mehreren zusätzlichen Substituenten weiter substituiert sein, ohne die spektralen Eigenschaften oder die erreichte relative elektrophoretische Mobilitätsänderung nachteilig zu beeinflussen. Solche Substituenten können einer Vielzahl von Zwecken dienen. Zum Beispiel können polare Substituenten die Wasserlöslichkeit des mobilitätsmodifizierenden Farbstoffs erhöhen und sterisch sperrige Substituenten können die nicht spezifische Bindung des mobilitätsmodifizierenden Farbstoffs erniedrigen als auch die Wechselwirkungen zwischen Farbstoffen in Molekülen, die mit mehreren Farbstoffen markiert sind, vermindern, wodurch ein Fluoreszenzlöschen vermindert wird. Substituenten, die zum Verleihen dieser und anderer wünschenswerter Eigenschaften fähig sind, werden dem Fachmann ersichtlich sein.
Nahezu jeder Substituent, der nicht nachteilig die verliehene Mobilitätsverschiebung und/oder andere wünschenswerte Eigenschaften der mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe beeinflusst, kann verwendet werden. Typischerweise sind solche zusätzlichen Substituenten bei dem gewünschten verwendeten pH-Wert ungeladen. Folglich umfassen zusätzliche nicht geladene Substituenten, die zum Substituieren der angehängten Gruppe verwendet werden können, in nicht begrenzender Weise eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe, (C₁-C₆)-Alkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 2- bis 6-gliedrige Heteroalkylgruppe, 2- bis 6-gliedrige Heteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₆)- Arylarylgruppe, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₁₆)-Arylalkylgruppe, (C₅-C₁₆)-Arylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6- bis 16-gliedrige Arylheteroalkylgruppe, 6- bis 16-gliedrige Arylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5- bis 10-gliedrige Heteroarylgruppe, 5- bis 10-gliedrige Heteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5- bis 6-gliedrige Heteroarylheteroarylgruppe, 5- bis 6-gliedrige Heteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6- bis 16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe, 6- bis 16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6- bis 16-gliedrige Heteroarylheteroalkylgruppe und 6- bis 16-gliedrige Heteroarylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, worin:
jede W-Gruppe unabhängig eine -R-, -X-, =O-, -OR-, =S-, -SR-, -NRR-, =NR-, (C₁-C₆)-Perhalogenalkyl-, -CX₃-, -CN-, -OCN-, -SCN-, -NO-, -NO₂-, =N₂-, -N₃-, -NHOH-, -S(O)₂R-, -C(O)R-, -C(S)R-, -C(O)OR'-, -C(S)OR'-, -C(O)SR'-, -C(S)SR'- und -C(NR)NRR-Gruppe ist,
jede X-Gruppe unabhängig ein Halogenatom (vorzugsweise -F, -Cl oder -Br) ist,
jede R-Gruppe unabhängig -H, eine -NR''R''-, -C(O)R''-, -S(O₂)R''-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist und
jede R'-Gruppe unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl- und (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist, und jede R''-Gruppe unabhängig -H, eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist Die verschiedenen R-, R'- und R''-Gruppen können mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen, wie vorstehend definiert, weiter substituiert sein.
Solche zusätzlichen Substituenten sind vorzugsweise Gruppen, die unter den Bedingungen, die zum Konjugieren der Farbstoffe an andere Moleküle oder Substanzen verwendet werden, nicht reagieren oder nicht aktiviert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, falls vorhanden, sind jegliche zusätzlichen Substituenten jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, -X-, -OR-, -NRR-, -CF₃-, -CN-, -NO₂- und -C(O)R-Gruppe, worin jede R-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine -NR'R'-, -C(O)R'-, -S(O)₂R'-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl- oder (C₂-C₆)-Alkinylgruppe ist, jede R'-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl- oder (C₂-C₆)-Alkinylgruppe ist und X -F, -Cl oder -Br ist. Am meisten bevorzugt schließt die mobilitätsmodifizierende Gruppe keine zusätzlichen Substituenten ein.
Wie der Fachmann zugeben wird, können die Hydrophobizität der angehängten Gruppe und die Nettoladung der mobilitätsmodifizierenden Gruppe MM die Wasserlöslichkeit des sich ergebenden mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffs beeinflussen. Da mobilitätsmodifizierende Farbstoffe, die in wässrigen Puffern und Lösungen, die herkömmlicherweise in Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen und/oder Hybridisierungstests verwendet werden, löslich sind, erwünscht sind, sollten die Hydrophobizität der angehängten Gruppe und Nettonegativladung der mobilitätsmodifizierenden Gruppe MM so abgestimmt werden, dass der sich ergebende Farbstoff in diesen Puffern und Lösungen löslich ist. Im Allgemeinen kann die Hydrophobizität der angehängten Gruppe mit sich erhöhender Nettoladung von MM erhöht werden. Der Fachmann kann leicht eine geeignete Kombination von Hydrophobizität der angehängten Gruppe und Nettoladung von MM derart auswählen, um den gewünschten Grad an Löslichkeit für spezifische Anwendungen beizubehalten.
Es wurde festgestellt, dass Polynukleotide, die mit herkömmlichen Cyanin-Farbstoffen wie dem monosulfonierten Benzocyanin-Farbstoff BenzoCy5, der nachstehend dargestellt ist:
BenzoCy5 markiert sind, elektrophoretische Mobilitäten aufweisen, die bis zu 4 Basen langsaurer sind als Polynukleotide, die mit Dibenzorhodamin-Farbstoffen (vgl, z. B. US-PS 5,936,087 ) oder erweiterten Rhodamin-Farbstoffen (vgl. z. B. US-Anmeldung Nr. 09/325,243, Aktenzeichen 4446) markiert sind. Ein Ersetzen der monosulfonierten Alkylgruppe auf dem BenzoCy5-Farbstoff durch das Mobilitätsmodifizierungsmittel 2,4-Bissulfonatosphenylmethan-1-yl-Gruppe, um den nachstehend dargestellten mobilitätsmodifizierenden BenzoCy5-Farbstoff zu ergeben, erhöhte die relativen elektrophoretischen Mobilitäten von markierten Polynukleotiden um eine Base:
Mobilitätsmodifizierendes BenzoCy5
Da Rot-emittierende Farbstoffe wie Dibenzo- und erweiterte Rhodamine wünschenswerte Eigenschaften für Nukleinsäure-Sequenzierungsanwendungen aufweisen, sind bevorzugte erfindungsgemäße mobilitätsmodifizierende Farbstoffe diejenigen, die elektrophoretische Mobilitäten aufweisen, die mit diesen Rhodamin-Farbstoffen abgestimmt sind Solche mobilitätsmodifizierende Farbstoffe werden mobilitätsmodifizierende Gruppen aufweisen, die 2 bis 7 anionische Substituenten, typischer 2 bis 5 anionische Substituenten tragen, abhängig von der Identität des Rhodamin-Farbstoffs, der mobilitätsabgestimmt ist, und der gesamten Nettoladung des Substituenten, der die heteroaromatischen Benzazol/Benzazolium-Ringe substituiert.
Folglich ist in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform die mobilitätsmodifizierende Gruppe MM eine substituierte Arylalkanylgruppe gemäß der Strukturformel (MM.1):
worin:
n eine ganze Zahl von 1 bis 6 (vorzugsweise 1 bis 3) ist,
R²⁴, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom, ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe ist oder, wenn mit R²⁵ zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe ist, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist,
R²⁵, wenn für sieh genommen, ein Wasserstoffatom, ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe ist oder, wenn mit R²⁴ oder R²⁶ zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe ist, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist,
R²⁶, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom, ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe ist oder, wenn mit R²⁵ oder R²⁷ zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe ist, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist,
R²⁷, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom, ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe ist oder, wenn mit R²⁶ oder R²⁸ zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe ist, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist,
R²⁸, wenn für sich genommen, ein Wasserstoffatom, ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe ist oder, wenn mit R²⁷ zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe ist, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist,
mit der Maßgabe, dass die MM-Gruppe eine Nettoladung von mindestens etwa –2 bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 10 aufweist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der Strukturformel (MM.1) sind mindestens zwei der Gruppen R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸ von Wasserstoffatom verschieden und n ist 1.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der Strukturformel (MM.1) ist n 1, R²⁴ und R²⁶ sind jeweils unabhängig voneinander eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-, vorzugsweise -S(O)₂O^–-Gruppe und R²⁵, R²⁷ und R²⁸ sind jeweils ein Wasserstoffatom.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der Strukturformel (MM.1) sind mindestens drei der Gruppen R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸ von Wasserstoffatom verschieden und n ist 1.
In einer noch weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der Strukturformel (MM.1) sind mindestens vier der Gruppen R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸ von Wasserstoffatom verschieden und n ist 1.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der Strukturformel (MM.1) sind mindestens fünf der Gruppen R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸ verschieden von Wasserstoffatom und n ist 1.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die mobilitätsmodifizierende Gruppe MM eine substituierte Alkanylgruppe gemäß der Strukturformel (MM.2):
worin:
o eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
q eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
R²⁹ ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe ist, jede R³⁰-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, einem stark anionischen Substituenten, einer -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppe, und
R³¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, einem stark anionischen Substituenten, einer -S(O)₂O^–-, -O-S(O)₂O^–-Gruppe und -CH₃-Gruppe,
mit der Maßgabe, dass die MM-Gruppe eine Nettoladung von mindestens etwa –2 bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 10 aufweist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform von mobilitätsmodifizierenden Gruppen gemäß der Strukturformel (MM.2) ist mindestens eine der R³⁰-Gruppen ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe, vorzugsweise eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der Strukturformel (MM.2) ist o 1, q ist 1, R³⁰ ist eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe und R³¹ ist eine -CH₃-Gruppe.
Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe umfassen eine verbindende Gruppe der Formel -L-LG, worin L ein Linker ist und LG eine verbindende Gruppe ist, zum Konjugieren der Farbstoffe an andere Moleküle oder Substanzen. Die Art des Linkers L und der verbindenden Gruppe LG wird von der spezifischen Anwendung und der Art an gewünschter Konjugation abhängen. Der Linker kann hydrophil oder hydrophob, lang oder kurz, starr, halbstarr oder flexibel sein, abhängig von der spezifischen Anwendung. Der Linker kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten oder einer oder mehreren zusätzlichen verbindenden Gruppen substituiert sein, die gleich oder unterschiedlich zu der verbindenden Gruppe LG sein können, wobei eine "polyvalente" verbindende Gruppe bereitgestellt wird, die zum Konjugieren mit mehreren Molekülen oder Substanzen fähig ist. Vorzugsweise umfasst jedoch der Linker L keine solchen zusätzlichen Substituenten oder verbindenden Gruppen.
Eine große Vielzahl von Linkem L, die aus stabilen Bindungen bestehen und zum Beabstanden von verbindenden Gruppen wie LG von Molekülen geeignet sind, sind bekannt und umfassen beispielsweise und in nicht begrenzender Weise Alkyldiyl-, substituierte Alkyldiyl-, Alkyleno-, substituierte Alkyleno-, Heteroalkyldiyl-, substituierte Heteroalkyldiyl-, Heteroalkyleno-, substituierte Heteroalkylenogruppen, acyclische heteroatomare Brücken, Aryldiyl-, substituierte Aryldiyl-, Arylaryldiyl-, substituierte Arylaryldiyl-, Arylalkyldiyl-, substituierte Arylalkyldiyl-, Heteroaryldiyl-, substituierte Heteroaryldiyl-, Heteroarylhetero aryldiyl-, substituierte Heteroarylheteroaryldiyl-, Heteroarylalkyldiyl-, substituierte Heteroarylalkyldiyl-, Heteroarylheteroalkyldiyl-, substituierte Heteroarylheteroalkyldiylgruppen und dergleichen. Folglich kann der Linker L Einfach-, Doppel-, Dreifachbindungen oder aromatische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen und/oder Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen umfassen und kann daher Funktionalitäten wie Carbonyl-, Ether-, Thioether-, Carboxamid-, Sulfonamid-, Harnstoff-, Urethan-, Hydrazingruppen, etc. beinhalten. In einer Ausführungsform weist der Linker L 1 bis 20 Nichtwasserstoffatome auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C, N, O und S, und besteht aus einer jeglichen Kombination von Ether-, Thioether-, Amin-, Ester-, Carboxamid-, Sulfonamid-, Hydrazid-, aromatischen und heteroaromatischen Bindungen.
Eine Auswahl eines Linkers mit Eigenschaften, die für eine spezifische Anwendung geeignet sind, liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmann. Zum Beispiel kann in dem Fall, dass ein starrer Linker erwünscht ist, L ein starres Polypeptid wie Polyprolin, eine starre polyungesättigte Alkyldiylgruppe oder eine Aryldiyl-, Biaryldiyl-, Arylaryldiyl-, Heteroaryldiyl-, Biheteroaryldiyl-, Heteroarylheteroaryldiylgruppe, etc. sein. Wenn ein flexibler Linker erwünscht ist, kann L ein flexibles Polypeptid wie Polyglycin oder eine flexible gesättigte Alkanyldiyl- oder Heteroalkanyldiylgruppe sein. Hydrophile Linker können zum Beispiel Polyalkohole oder Polyether wie Polyalkylenglykole sein. Hydrophobe Linker können zum Beispiel Alkyldiyl- oder Aryldiylgruppen sein. Linker, die für eine Verwendung in den meisten biologischen Anwendungen geeignet sind, umfassen (C₁-C₁₂)-Alkyldiylgruppen, insbesondere Alkanylenogruppen wie Methano- (-CH₂-), Ethano- (-CH₂-CH₂-), Propano- (-CH₂-CH₂-CH₂-), Butano- (-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-), Pentano- (-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-) und Hexanogruppe (-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-), und (C₆-C₂₆)-Arylalkyldiylgruppen, insbesondere diejenigen mit der Strukturformel -(CH₂)_i-Φ- oder -(CH₂)_i-ψ-, worin jedes i unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, Φ eine Phenyldiylgruppe (insbesondere Phena-1,3-diyl- oder Phena-1,4-diylgruppe) und ψ eine Naphthyldiylgruppe (insbesondere Naphtha-2,6-diyl- oder Naphtha-2,7-diylgruppe) ist. Analoga dieser Linker L mit einem oder mehreren Heteroatomen, insbesondere Heteroatomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus O, S, N und NR'', worin R'' ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist, können auch zweckmäßigerweise verwendet werden, um die verbindende Gruppe LG von den erfindungsgemäßen Farbstoffen zu beabstanden. Linker L, die auf spezifische Anwendungen zugeschnitten sind, werden genauer infra beschrieben.
Die Farbstoffe können an eine Vielzahl von unterschiedlichen Molekülen und Substanzen unter Verwendung einer Fülle von verschiedenen Konjugationsmitteln konjugiert werden. Zum Beispiel kann die Konjugation über hydrophobe Wechselwirkungen, ionische Anziehung, über die Verwendung von Paaren von spezifischen bindenden Molekülen wie Biotin und Avidin/Streptavidin oder durch kovalente Anbindung vermittelt werden. Wenn eine Konjugation über hydrophobe Wechselwirkungen erwünscht ist, ist eine verbindende Gruppe LG eine hydrophobe Gruppe, die zum Ausbilden von hydrophoben Wechselwirkungen mit einer hydrophoben Gruppe auf dem Molekül oder der Substanz, das/die konjugiert werden soll, fähig ist. Typische hydrophobe Gruppen umfassen in nicht begrenzender Weise unsubstituierte und substituierte Aryl-, Arylalkyl-, Arylaryl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- und Heteroarylheteroarylgruppen. Wenn die hydrophobe Gruppe substituiert ist, sind die Substituenten vorzugsweise nicht polar, mehr bevorzugt hydrophob. Geeignete hydrophobe Gruppen zum Ausbilden von nicht kovalenten Konjugaten werden dem Fachmann ersichtlich sein.
Wenn eine Konjugation über ionische Anziehung erwünscht ist, ist die verbindende Gruppe LG eine geladene Gruppe mit einer Nettoladung einer Polarität, die zu einer Nettoladung auf dem Molekül oder der Substanz, das/die konjugiert werden soll, entgegengesetzt ist. Typische geladene Gruppen umfassen beispielsweise und in nicht begrenzender Weise quaternäre Ammonium-, Carboxylat- und Sulfonatgruppen, einschließlich Salzen davon. Eine Vielzahl von cyclischen quaternären Ammoniumgruppen, die für eine Verwendung als LG geeignet sind, sind in der US-PS 5,863,753 (vgl. z. B. Spalten 8 bis 9) beschrieben.
Wenn eine Konjugation über Paare von spezifischen bindenden Molekülen wie Biotin und Avidin/Streptavidin erwünscht ist, wird LG ein Mitglied des bindenden Paars darstellen. Das Molekül oder die Substanz, das/die konjugiert werden soll, wird das andere Mitglied des bindenden Paars tragen. In dem Fall, dass eines der Mitglieder des spezifischen bindenden Paars ein kleines Molekül ist, wie Biotin oder ein Hormon, umfasst dieses Mitglied vorzugsweise LG. Eine Vielzahl von Biotinen, die fähig sind, kovalent an reaktive funktionelle Gruppen wie Aminen gebunden zu werden, sind käuflich erhältlich (z. B. Molecular Probes, Eugene, OR). Diese Biotine können in die erfindungsgemäßen Farbstoffe eingebaut werden, um Biotin-markierte Farbstoffe zu ergeben, die für eine nicht kovalente Konjugation an eine Vielzahl von Avidin/Streptavidin-markierten Molekülen oder Substanzen geeignet sind.
Andere Beispiele für spezifische bindende Paare, die die verbindende Gruppe LG umfassen können, sind in der TABELLE 1, infra, bereitgestellt.
TABELLE 1 Beispiele für spezifische bindende Paare
Vorzugsweise ist die verbindende Gruppe LG zum Vermitteln einer Konjugation über kovalente Anbindung fähig. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist die verbindende Gruppe LG typischerweise eine reaktive funktionelle Gruppe (R_x). Kovalente Konjugate werden dadurch erhalten, dass ein erfindungsgemäßer Farbstoff, der eine reaktive Gruppe R_x einschließt, mit einem Molekül oder einer Substanz umgesetzt wird, das/die eine oder mehrere funktionelle Gruppen F_x, die zu der reaktiven Gruppe R_x komplementär sind, enthält oder modifiziert ist, um diese zu enthalten.
Die exakten Identitäten von R_x und F_x werden von der Art der erwünschten kovalenten Bindung und der Chemie, die zum Ausbilden der kovalenten Bindung verwendet wird, abhängen. Im Allgemeinen ist die reaktive Gruppe R_x eine funktionelle Gruppe, die zum Umsetzen mit einer komplementären funktionellen Gruppe F_x unter spezifizierten Reaktionsbedingungen fähig ist, um eine kovalente Bindung auszubilden. Jedoch wird der Fachmann verstehen, dass eine Vielzahl von funktionellen Gruppen, die typischerweise unter bestimmten Reaktionsbedingungen nicht realtiv sind, aktiviert werden können, um reaktiv zu werden. Gruppen, die aktiviert werden können, um reaktiv zu werden, umfassen zum Beispiel Carbonsäuren und -ester, einschließlich Salzen davon. Solche Gruppen werden hierin als "aktivierbare Vorläufer" bezeichnet und sollen insbesondere in dem Ausdruck "reaktive Gruppe" eingeschlossen sein.
Paare von reaktiven Gruppen R_x und komplementären Gruppen F_x, die zum Ausbilden von kovalenten Bindungen miteinander unter einer Vielzahl von unterschiedlichen Reaktionsbedingungen geeignet sind, sind bekannt. Ein jegliches von diesen komplementären Paaren von Gruppen kann verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Farbstoffe an andere Verbindungen oder Substanzen kovalent zu konjugieren. In einer geeigneten Ausführungsform umfassen die reaktive Gruppe R_x und komplementäre funktionelle Gruppe F_x komplementäre Elektrophile und Nukleophile (oder deren entsprechende aktivierbaren Vorläufer). In einer weiteren geeigneten Ausführungsform ist die reaktive Gruppe R_x eine photoaktivierbare Gruppe, die lediglich nach Bestrahlung mit Strahlung einem geeigneten Wellenlänge chemisch aktiv wird, und die komplementäre funktionelle Gruppe F_x ist eine Gruppe, die zum Ausbilden einer kovalenten Bindung mit der chemisch reaktiven Spezies fähig ist. Solche photoaktivierbaren Gruppen können zweckmäßigerweise verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Farbstoffe an andere Moleküle und/oder Substanzen über Strahlung zu vernetzen.
Eine Fülle von komplementären Elektrophil/Nukleophil-Paaren und photoaktivierbaren Gruppen, die zum kovalenten Zusammenkonjugieren zweier Moleküle geeignet sind, sind bekannt. Die tatsächliche Auswahl von komplementären Paaren und/oder einer photoaktivierbaren Gruppe wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen und wird dem Fachmann ersichtlich sein. Beispiele für komplementäre Elektrophile und Nukleophile, die für eine Verwendung in einer großen Vielzahl von Zusammenhängen geeignet sind, sind in TABELLE 2 gezeigt, wobei eine Umsetzung zwischen den angegebenen elektrophilen und nukleophilen Spezies die angegebene kovalente Bindung ergibt. Bedingungen, unter denen die kovalenten Bindungen ausgebildet werden können, sind bekannt.
TABELLE 2 Beispiele für einige Wege zu geeigneten kovalenten Bindungen
Wie in dem Fachgebiet verstanden wird, weisen die "aktivierten Ester" von. TABELLE 2 im Allgemeinen die Formel -C(O)Ω auf, worin Ω eine gute Abgangsgruppe ist. Beispielhafte gute Abgangsgruppen umfassen beispielsweise und in nicht begrenzender Weise Oxysuccinimidyl-, N-Succinimidyl-, Oxysulfosuccinimidyl-, 1-Oxybenzotriazolyl- und -OR^a-Gruppen, worin R^a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (C₄-C₂₀)-Cycloalkyl- (z. B. Cyclohexyl-), 4- bis 20-gliedriger Heterocycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Arylgruppe, (C₅-C₂₀)-Arylgruppe, die mit einer oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen elektronenziehenden Gruppen (z. B. -NO₂, -F, -Cl, -CN, -CF₃, etc.) substituiert ist, 5- bis 20-gliedriger Heteroarylgruppe, 5- bis 20-gliedriger Heteroarylgruppe, die mit einer oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen elektronenziehenden Gruppen substituiert ist, n-Dialkylaminoalkylgruppen (z. B. 3-Dimethylaminopropylgruppe) und N-Morpholinomethylgruppe, oder R^a wird verwendet, um ein Anhydrid der Formel -OCOR^b oder -OCNR^bNHR^c auszubilden, worin R^b und R^c jeweils unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Perhalogenalkyl-, (C₁-C₆)-Perfluoralkyl- und (C₁-C₆)-Alkoxygruppe. Ein bevorzugter aktivierter Ester ist ein NHS-Ester.
Beispielhafte photoaktivierbare Gruppen, die für eine Konjugation über strahlungsaktivierte Quervernetzung geeignet sind, umfassen in nicht begrenzender Weise Azido-(-N₃), 4-Azidophenyl- und 2-Nitro-4-azidophenylgruppe. Eine Konjugation unter Verwendung von photoaktivierbaren Gruppen beinhaltet typi scherweise ein Bestrahlen, eines Gemisches, das die photoaktivierbaren Farbstoffe und das Molekül oder die Substanz, das/die konjugiert werden soll, umfasst, gefolgt von einer Trennung von nicht umgesetzten Farbstoffen und Nebenprodukten.
Wie vom Fachmann anerkannt wird, kann die reaktive Gruppe R_x jede der vorstehend beschriebenen elektrophilen, nukleophilen oder photoaktivierbaren Gruppen umfassen. Die Auswahl einer reaktiven Gruppe R_x, die zum kovalenten Konjugieren der erfindungsgemäßen Farbstoffe an das andere Molekül oder die andere Substanz verwendet wird, hängt typischerweise von der Identität der komplementären funktionellen Gruppe F_x auf dem Molekül oder der Substanz, das/die konjugiert werden soll, ab. Die Arten von komplementären funktionellen Gruppen, die typischerweise auf Molekülen oder Substanzen, die konjugiert werden sollen, vorhanden sind, umfassen in nicht begrenzender Weise Amine, Thiole, Alkohole, Phenole, Aldehyde, Ketone, Phosphate, Imidazole, Hydrazine, Hydroxylamine, mono- und disubstituierte Amine, Halogenide, Epoxide, Sulfonatester, Carbonsäuren oder Carboxylate oder eine Kombination dieser Gruppen. Eine einzige Art an komplementärer funktioneller Gruppe kann auf dem Molekül oder der Substanz verfügbar sein (was für Polysaccharide typisch ist), oder eine Vielzahl von unterschiedlichen komplementären funktionellen Gruppen kann verfügbar sein (z. B. Amine, Thiole, Alkohole, Phenole), was für Proteine typisch ist. Das Molekül oder die Substanz kann an mehr als einen Farbstoff, der der gleiche oder ein unterschiedlicher sein kann, konjugiert werden. Obwohl eine gewisse Selektivität dadurch erhalten werden kann, dass die Reaktionsbedingungen vorsichtig gesteuert werden, wird die Selektivität einer Konjugation am besten durch eine geeignete Wahl einer reaktiven Gruppe R_x hinsichtlich der verfügbaren komplementären funktionellen Gruppe(n) F_x erhalten. In Fällen, in denen das Molekül oder die Substanz, das/die konjugiert werden soll, keine verfügbare(n) komplementäre(n) funktionelle(n) Gruppe(n) F_x enthält, kann es/sie unter Verwendung einer jeglichen einer Vielzahl von Standardtechniken modifiziert werden, um solche Gruppen zu enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die reaktive Gruppe R_x eine Gruppe, die sich mit einem Amin, einem Thiol oder einem Alkohol umsetzt oder die leicht aktiviert werden kann, um sich damit umzusetzen. Eine bevorzugte reaktive Gruppe R_x, die zum Umsetzen mit einer Hydroxylgruppe fähig ist, ist ein Phosphoramidit. Eine bevorzugte reaktive Gruppe R_x, die zum Umsetzen mit einem Amin fähig ist, ist eine Carbonsäure oder ein aktivierter Ester, am meisten bevorzugt ein N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)-Ester. Der NHS-Ester kann zweckmäßigerweise dadurch erhalten werden, dass ein erfindungsgemäßer Farbstoff, der eine reaktive Gruppe R_x des Carbonsäuretyps beinhaltet, mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines Aktivierungsmittels (z. B. Dicyclohexylcarbodiimid) gemäß bekannten Verfahren umgesetzt wird. Die Herstellung von Farbstoffen mit reaktiven Gruppen des Phosphoramidittyps wird in einem späteren Abschnitt beschrieben.
Für eine Beschreibung der verschiedenen reaktiven Gruppen R_x und entsprechenden komplementären funktionellen Gruppen F_x, die zweckmäßigerweise verwendet werden können, um die erfindungsgemäßen Farbstoffe an eine Vielzahl von biologischen und anderen Molekülen oder Substanzen kovalent zu konjugieren, als auch von Reaktionsbedingungen, unter denen die Konjugationsreaktionen erfolgen können, vgl. Haugland, 1996, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc., Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3: 2, und Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, als auch die Literaturhinweise, die in allen der vorstehenden Literaturhinweise zitiert sind. Zusätzliche geeignete Gruppen finden sich in der US-PS 5,268,486 (vgl. z. B. Spalten 15 bis 17).
Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe werden nun unter Hinweis auf verschiedene bevorzugte Ausführungsformen weiter beschrieben. Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe Verbindungen gemäß der Strukturformel (I.A):
worin:
R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff-, Halogenatom, -F, -Cl, -CN, -CF₃, einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl- oder 5- bis 14-gliedriger Heteroarylgruppe,
k eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist,
l eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist,
Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -S-, -O-, -Se- und -CR⁸R⁹-,
worin R⁸ und R⁹, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe sind oder, wenn zusammen genommen, eine (C₄-C₅)-Alkyleno- oder (C₄-C₅)-Alkanogruppe sind,
Z' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -S-, -O-, -Se- und -CR^8'R^9'-,
worin R^8' und R^9', wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe sind oder, wenn zusammen genommen, eine (C₄-C₅)-Alkyleno- oder (C₄-C₅)-Alkanogruppe sind,
L und R_x ein Linker bzw. eine reaktive Gruppe, wie vorstehend beschrieben, sind,
MM eine mobilitätsmodifizierende Gruppe, wie vorstehend beschrieben, ist,
R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²², wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, einer (C₁-C₆)-Alkylgruppe, (C₁-C₆)-Alkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 2–6-gliedriger Heteroalkylgruppe, 2–6-gliedriger Heteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Arylheteroalkylgruppe, 6–16-gliedriger Arylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5–10-gliedriger Heteroarylgruppe, 5–10-gliedriger Heteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5–6-gliedriger Heteroarylheteroarylgruppe, 5–6-gliedriger Heteroarylheteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehrere W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Heteroarylalkylgruppe, 6–16-gliedriger Heteroarylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Heteroarylheteroalkylgruppe und 6–16-gliedriger Heteroarylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist,
oder, wenn mit einer benachbarten Rⁿ-Gruppe zusammengenommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer (C₆-C₁₀)-Arylenogruppe, (C₆-C₁₀)-Arylenogruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–10-gliedriger Heteroarylenogruppe und 6–10- gliedriger Heteroarylenogruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist,
jede W-Gruppe unabhängig eine -R-, -X-, =O-, -OR-, =S-, -SR-, -NRR-, =NR-, (C₁-C₆)-Perhalogenalkyl-, -CX₃-, -CN-, -OCN-, -SCN-, -NO-, -NO₂-, =N₂-, -N₃-, -NHOH-, -S(O)₂R-, -C(O)R-, -C(S)R-, -C(O)OR'-, -C(S)OR'-, -C(O)SR'-, -C(S)SR'- und -C(NR)NRR-Gruppe ist,
jede X-Gruppe unabhängig ein Halogenatom (vorzugsweise -F, -Cl oder -Br) ist,
jede R-Gruppe unabhängig -H, eine -NR''R''-, -C(O)R''-, -S(O₂)R''-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist,
jede R'-Gruppe unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl- und (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist, und
jede R''-Gruppe unabhängig -H, eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist. Die verschiedenen R-, R'- und R''-Gruppen können mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen W-Gruppen, wie vorstehend definiert, weiter substituiert sein.
Eine Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß der Strukturformel (I.A) umfasst diejenigen Verbindungen, in denen L, R_x und die mobilitätsmodifizierende Gruppe MM eine ihrer entsprechenden vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen darstellen.
Eine weitere Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß der Strukturformel (I.A) umfasst diejenigen Verbindungen, in denen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ jeweils ein Wasserstoffatom sind und/oder die Summe von k, l und m 2 beträgt.
Eine noch weitere Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß der Strukturformel (I.A) umfasst diejenigen Verbindungen, in denen Z und Z' gleich sind, R²⁰ und R^13' gleich sind, R²¹ und R¹² gleich sind und/oder R²² und R¹¹ gleich sind.
Eine noch weitere Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß der Strukturformel (I.A) umfasst diejenigen Verbindungen, in denen jegliche Aryleno gruppen, die durch Zusammennehmen von zwei benachbarten Rⁿ-Gruppen gebildet werden, jeweils unabhängig voneinander eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe sind, die mit einem oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen starken anionischen Substituenten substituiert ist.
Eine noch weitere Klasse von besonders bevorzugten Farbstoffen gemäß der Strukturformel (I.A) umfasst diejenigen Verbindungen, in denen Z -CR⁸R⁹- ist, worin R⁸ eine (C₁-C₃)-Alkanylgruppe ist und R⁹ eine (C₁-C₃)-Alkanylgruppe ist, und Z' -CR^8'R^9'- ist, worin R^8' eine (C₁-C₃)-Alkanylgruppe ist und R^9' eine (C₁-C₃)-Alkanylgruppe ist. Noch mehr bevorzugt sind diejenigen Verbindungen, in denen Z und Z' gleich sind, insbesondere Farbstoffe, in denen R⁸, R^8', R⁹, R^9' gleich sind.
Eine noch weitere Klasse von besonders bevorzugten Verbindungen gemäß der Strukturformel (I.A) umfasst Verbindungen gemäß den Strukturformeln (I.D), (I.E), (I.F), (LG), (I.H), (I.I), (I.J) und (I.K):

worin:
R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹, R²², R³⁰, R³¹, R³², R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶ und R³⁷ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppe.
Besonders bevorzugt unter den Verbindungen der Strukturformeln (I.D), (I.E), (I.F), (I.G), (I.H), (I.I), (I.J) und/oder (I.K) sind diejenigen Verbindungen, in denen R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹, R²², R³⁰, R³¹, R³², R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶ und R³⁷ jeweils ein Wasserstoffatom sind.
Eine besonders bevorzugte Klasse von mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen gemäß den Strukturformeln (I.D) und/oder (I.H) sind diejenigen Verbindungen, in denen eine oder zwei der Gruppen R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁴ und/oder eine oder zwei der Gruppen R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²² jeweils unabhängig voneinander eine -S(O)₂O^–- oder -O-S(O)₂O^–-Gruppe sind und die verbleibenden R-Gruppen jeweils ein Wasserstoffatom sind.
Eine besonders bevorzugte Klasse von mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen gemäß den Strukturformeln (I.E) und/oder (I.I) sind Verbindungen, in denen R¹¹, R¹², R²¹ und R²² jeweils ein Wasserstoffatom sind, eine oder zwei der Gruppen R³⁰, R³¹, R³² und R³³ und/oder eine oder zwei der Gruppen R³⁴, R³⁵, R³⁶ und R³⁷ jeweils unabhängig voneinander eine -S(O)₂O^–- oder -O-S-(O)₂O^–-Gruppe sind und die verbleibenden R-Gruppen jeweils ein Wasserstoffatom sind.
Eine besonders bevorzugte Klasse von mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen gemäß den Strukturformeln (I.F) und/oder (I.J) sind Verbindungen, in denen R¹¹ und R¹² jeweils ein Wasserstoffatom sind, eine oder zwei der Gruppen R³⁰, R³¹, R³² und R³³ und/oder eine oder zwei der Gruppen R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²² jeweils unabhängig voneinander eine -S(O)₂O^–- oder -O-S-(O)₂O^–-Gruppe sind und die verbleibenden R-Gruppen jeweils ein Wasserstoffatom sind.
Eine besonders bevorzugte Klasse von mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen gemäß den Strukturformeln (LG) und/oder (I.K) sind Verbindungen, in denen R²¹ und R²² jeweils ein Wasserstoffatom sind, eine oder zwei der Gruppen R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁴ und/oder eine oder zwei der Gruppen R³⁴, R³⁵, R³⁶ und R³⁷ jeweils unabhängig voneinander eine -S(O)₂O^–- oder -O-S-(O)₂O^–-Gruppe sind und die verbleibenden R-Gruppen jeweils ein Wasserstoffatom sind.
Repräsentative beispielhafte bevorzugte Farbstoffe gemäß den Strukturformeln (I.D), (I.E), (I.F) und/oder (I.G) werden in dem Abschnitt "Beispiele" bereitgestellt. Die entsprechenden Farbstoffe gemäß den Strukturformeln (I.H), (I.I), (I.J) und/oder (I.K) sind auch bevorzugt.
Der Fachmann wird anerkennen, dass die verschiedenen Verbindungen, die durch die Formeln (I), (I.A), (I.D), (I.E), (I.F), (I.G), (I.H), (I.I), (I.J) und (I.K) umfasst sind, als auch deren verschiedene Konjugate und Reagenzien, die infra beschrieben sind, das Phänomen der Tautomerie zeigen können. Abhängig von den verschiedenen Substituenten enthalten viele dieser Verbindungen auch chirale Zentren. Die verschiedenen Verbindungen können ferner das Phänomen der Konformationsisomerie oder geometrischen Isomerie zeigen. Da die Formelzeichnungen innerhalb dieser Beschreibung nur eine der möglichen tautomeren, enantiomeren, konformationsisomeren oder geometrischen isomeren Formen darstellen können, sollte verstanden werden, dass jegliche tautomere, enantiomere, konformationsisomere oder geometrische isomere Formen der Verbindungen erfindungsgemäß umfasst sind, die die erwünschten Aktivitäten und/oder Eigenschaften, die hierin beschrieben sind, aufweisen.
Außerdem beinhalten alle hierin beschriebenen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffverbindungen und folglich deren entsprechende Konjugate und Reagenzien geladene Gruppen. Es soll verstanden werden, dass alle hierin beschriebenen Verbindungen jegliche erforderlichen Gegenionen beinhalten, selbst wenn sie nicht ausdrücklich dargestellt sind. Typische negativ geladene Gegenionen zum Ausgleichen des heteroaromatischen Imminiumstickstoffatoms und/oder positiv geladener Substituenten, die die mobilitätsmodifizierende Gruppe MM ausmachen, umfassen in nicht begrenzender Weise Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Alkansulfonat, Alkensulfonat, Alkinsulfonat, Arylsulfonat, Phosphat, Perchlorat, Periodat, Tetrafluoroborat, Tetrarylborat, Nitrat und Anionen von aromatischen oder aliphatischen Carbonsäuren. Typische positiv geladene Gegenionen zum Ausgleichen von anionischen Substituenten auf der mobilitätsmodifizierenden Gruppe umfassen in nicht begrenzender Weise Na⁺, K⁺, Li⁺, quaternäre Ammoniumionen, etc. Gegenionen, die zum Ausgleichen anderer Substituenten geeignet sind, werden von der Ladung des Substituenten abhängen und werden dem Fachmann ersichtlich sein.
4.4 Syntheseverfaharen
Der synthetische Weg zu den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen erfordert die Synthese von drei Vorläufern: (i) eines Stammbenzazolium-Ringsystems E mit einer mobilitätsmodifizierenden Gruppe MM, die an das Benzazolium-Ringstickstoffatom gebunden ist, (ii) eines Stammbenzazo lium-Ringsystems A mit einer verbindenden Gruppe (-L-LG), die an das Benzazolium-Ringstickstoffatom gebunden ist, und (iii) einer Quelle für die Brücke, die die Ringe A und E verbindet. Obwohl die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe nicht vorher beschrieben wurden, wird die Chemie, die zum Herstellen und Vereinigen dieser Vorläufer benötigt wird, um jegliche der hierin beschriebenen Verbindungen zu ergeben, im Allgemeinen von dem Fachmann wohl verstanden.
Zum Beispiel sind Verfahren, die zum Synthetisieren von Benzazolium-Vorläufern gemäß den Strukturformeln (A.1) und (E.1) geeignet sind, in der US-PS 5,436,134 (insbesondere in den Spalten 13 bis 33) beschrieben:
Zusätzliche geeignete Verfahren sind in den US-PSen 5,863,753, 5,321,130, 5,410,030, 5,534,416, 5,582,977 und 5,658,751 als auch in den darin zitierten verschiedenen Literaturhinweisen beschrieben.
In den Strukturformeln (A.1) und (E.1) sind MM, L, R_x, Z, Z', R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²² wie vorstehend für die Strukturformel (I.A) definiert und R⁴⁰ und R^40' sind Substituenten, deren Art durch das Syntheseverfahren bestimmt wird, das zum Koppeln des Benzazolium-Vorläufers mit jedem anderen verwendet wird. Wenn die Brücke, die die zwei Heterocyclen verbindet, eine Methinbrücke ist, ist sodann eine der Gruppen R⁴⁰ und R^40' eine Alkylthio- (herkömmlicherweise Methylthio-), Chlor-, Brom- oder Iodgruppe und die andere der Gruppen R⁴⁰ und R^40' ist eine Methylgruppe. Die Methylgruppe wird in die Endverbindung eingebaut.
Verbindungen, in denen die Heterocyclen über eine Polymethinbrücke oder eine cyclische Alkylenbrücke gemäß der Strukturformel (B.2) verbunden sind, können durch Verfahren synthetisiert werden, die bekannt sind. Bevorzugte Syntheseverfahren, die mit bestimmten bevorzugten mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen, einschließlich einer verbindenden Gruppe der Formel -L-R_x und einer Polymethinbrücke, veranschaulicht sind, sind nachstehend in den Schemata (I) und (II) zusammengefasst. Die verschiedenen Schritte können wie erforderlich angepasst werden, um die ganze Breite von erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen zu synthetisieren.
In den Schemata (I) und (II) sind n, R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸ wie vorstehend für die Strukturformel (MM.1) definiert, Z, Z', L, R_x, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²² sind wie vorstehend für die Strukturformel (I.A) definiert, Ph ist eine Phenylgruppe, Ac₂O ist Essigsäureanhydrid, Ac ist Acetat und EtOH ist Ethanol.
Mit Bezug auf Schema (I) wird der Benzazolium-Vorläufer 5 dadurch erhalten, dass ein Aldehyd-Vorläufer der erwünschten mobilitätsmodifizierenden Gruppe 1 zu seinem entsprechenden Alkohol 2 in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Natriumborhydrid reduziert wird. Alkohol 2 wird sodann mit HBr behandelt, um das entsprechende Bromid 3 zu ergeben. Das Bromid 3 wird mit Benzazol 4 in Nitrobenzol-Lösungsmittel unter Argonatmosphäre und bei 190°C umgesetzt, um den entsprechenden mobilitätsmodifizierenden Vorläufer 5 zu ergeben. Die Verbindungen 1 sind entweder käuflich erhältlich oder können unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden.
Schemata zum Synthetisieren bestimmter beispielhafter aromatischer Vorläufer 3 und analogen aliphatischen Vorläufern, die für den mobilitätsmodifizierenden Benzazol-Ring 11 geeignet sind, um den mobilitätsmodifizierten Cyanin-Vorläufer 12 gemäß dem Schema (I) zu ergeben, sind nachstehend in den Schemata (Ia) bzw. (Ib) veranschaulicht.
Schema (Ia)
Schema (Ib)
Mit Bezug auf Schema (Ia) wird der käuflich erhältliche Aldehyd 41 zu dem Alkohol mit Natriumborhydrid in Wasser reduziert, was den Benzylalkohol 42 ergibt, der nach Behandlung mit Wasserstoffbromid und einem Metallbromidsalz das benzylische Bromid 43 ergibt. Das benzylische Bromid 43 kann verwendet werden, um den Indolinin-Vorläufer zu dem Cyanin-Farbstoff mit dem Disulfonat-Mobilitätsmodifizierungsmittel gemäß dem Schema (I) zu funktionalisieren, oder kann als ein Ausgangsmaterial verwendet werden, um die Länge der Bindung zwischen dem sulfonierten aromatischen Ring und dem Indolinin-Stickstoffatom zu erhöhen. Als Beispiele können 43 mit Kohlenstoffmonoxid und Wasserstoff mit einem Palladium-Katalysator carbonyliert werden, um den Aldehyd 44 zu ergeben. Die Reduktion von 44 zu dem Alkohol 45 mit Lithiumaluminiumhydrid, gefolgt von Behandlung von 45 mit Bromwasserstoffsäure mit Lithiumbromid ergibt das Bromid 46, das verwendet werden kann, um den Indolinin-Vorläufer zu dem Cyanin-Farbstoff gemäß dem Schema (I) mit einem Ethyllinker zwischen dem aromatischen Disulfonat und dem Indolinin-Stickstoffatom zu funktionalisieren. Zusätzlich kann 43 mit dem Natriumsalz von Dimethylmalonat kondensiert werden, um den Dimethylester 47 zu ergeben. Die Hydrolyse des Esters zu der Disäure, die zu der Monosäure mit Wärme decarboxyliert wird, gefolgt von Isolierungsaufarbeitung mit Chlorwasserstoffsäure ergibt die freie Säure 48. Die Reduktion von 48 mit Lithiumaluminiumhydrid, um den Alkohol 49 zu ergeben, gefolgt von Behandlung von 49 mit Bromwasserstoffsäure mit Lithiumbromid ergibt das Bromid 50, das verwendet werden kann, um den Indolinin-Vorläufer zu dem Cyanin-Farbstoff gemäß dem Schema (I) mit einem Propyllinker zwischen dem aromatischen Disulfonat und dem Indolinin-Stickstoffatom zu funktionalisieren.
Mit Bezug auf Schema (Ib) kann das käuflich erhältliche Propandiolbromid 51 zu dem Brompropandisulfat 52 umgewandelt werden und Propandiole 53 (synthetisiert gemäß Serves et al., 1995, Phosphorus, Sulfur Silicon Relat. Elem 101: 75–82) und 55 (synthetisiert gemäß Ni und Matile, 1998, Chem. Commun., Seiten 755–56) können zu den Brompropandisulfaten 54 bzw. 56 durch Behandlung der Diole mit Schwefeltrioxid gemäß Standardverfahren (vgl. z. B. Everett Gilbert, "Sulfonation and Related Reactions", Robert E. Krieger Publishing Co., Huntington, New York, 1977, Kapitel 6) umgewandelt werden. Bromdisulfate 52, 54 und 56 können verwendet werden, um den Indolinin-Cyanin-Farbstoffvorläufer mit dem Disulfat-Mobilitätsmodifizierungsmittel gemäß dem Schema (I) zu funktionalisieren, was Disulfate mit Methyl-, Ethyl- bzw. Bromlinkern zwischen dem Indolinin-Stickstoffatom und dem Disulfatanteil der Kette ergibt.
Die verschiedenen Vorläufer des mobilitätsmodifizierenden Farbstoffs werden sodann kondensiert, um den vervollständigten Farbstoff zu bilden, wie in Schema (II), supra, veranschaulicht. Mit Bezug auf Schema (II) wird der Brückenvorläufer 7 mit dem mobilitätsmodifizierenden Vorläufer 5 in Gegenwart eines Überschusses an Anhydrid umgesetzt und zum Refluxieren erhitzt (typischerweise etwa 120 bis 140°C), um die Verbindung 8 zu ergeben. Die Verbindung 8 wird sodann mit der Benzazolium-Verbindung 6 (die gemäß Schema (I) oder Standardverfahren synthetisiert wird) in Gegenwart einer Base und eines polaren Lösungsmittels kondensiert, um den mobilitätsmodifizierenden Farbstoff 9 zu ergeben.
Der Fachmann wird anerkennen, dass, obwohl das Schema II einen spezifischen Brückenvorläufer 7 zeigt, analoge Vorläufer verwendet werden können, um mobilitätsmodifizierende Cyanin-Farbstoffe mit verschiedenen Brücken unter Verwendung von, zum Beispiel, denjenigen Verfahren herzustellen, die in den US-PSen 5,436,134, 5,863,753, 5,321,130, 5,410,030, 5,534,416, 5,582,977 und 5,658,751 als auch in den verschiedenen darin zitierten Literaturhinweisen beschrieben sind. Zusätzlich können abhängig von der Art der Gruppen Z, Z', L, R_x und/oder der verschiedenen R-Substituenten diese Gruppen ein Schützen während aller oder einiger der Syntheseschritte und/oder eine Umsetzung mit aktivierenden Gruppen für eine weitere Derivatisierung des Farbstoffs benötigen. Gruppen, die zum Schützen und/oder Aktivieren spezifischer Funktionalitäten geeignet sind, als auch Verfahren für deren Entfernung sind bekannt und werden dem Fachmann ersichtlich sein. Eine Anleitung zum Auswählen geeigneter Schutzgruppen kann zum Beispiel in Greene & Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc., New York, gefunden werden.
Ein signifikanter Vorteil der Schemata (I) und (II) besteht darin, dass -S(O)₂O^–- und -O-S(O)₂O^–-Gruppen auf entweder dem Mobilitätsmodifizierungsmittel oder den heteroaromatischen Stammringen unter den verwendeten Bedingungen nicht reaktiv sind und daher keinen Schutz benötigen. Zusätzlich benötigt, wenn die reaktive Gruppe R_x eine Carboxylgruppe oder ein Salz davon ist, sie keinen Schutz während der Synthesebedingungen, die in Schema (II) zusammengefasst sind. Folglich sind die Schemata (I) und (II) das bevorzugte Verfahren zum Synthetisieren von Verbindungen gemäß den Strukturformeln (I.D), (I.E), (I.F), (I.G), (I.H), (I.I), (I.J) und (I.K).
4.5 Reagenzien und Konjugate, die die Farbstoffverbindungen enthalten
Reagenzien können mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen markiert oder konjugiert werden. Reagenzien können nahezu jegliches Molekül oder jegliche Substanz sein, an das/die die erfindungsgemäßen Farbstoffe konjugiert werden können, einschließlich beispielsweise und in nicht begrenzender Weise Proteinen, Polypeptiden, Polysacchariden, Nukleosiden, Nukleotiden, Polynukleotiden, Lipiden, Festträgern, organischer und anorganischer Polymere und Kombinationen und Zusammensetzungen davon wie Chromosomen, Nuklei, lebenden Zellen (z. B. Bakterien oder anderen Mikroorganismen, Säugetierzellen, Geweben, etc.) und dergleichen. Die Farbstoffe können mit dem Reagenz über die verbindende Gruppe durch eine Vielzahl von Mitteln, einschließlich hydrophober Anziehung, ionischer Anziehung, kovalenter Anbindung, oder mit Hilfe von Paaren von spezifischen bindenden Molekülen, wie vorstehend beschrieben, konjugiert werden. Vorzugsweise werden die Farbstoffe über eine kovalente Anbindung konjugiert.
Eine Konjugation ergibt sich typischerweise aus einem Mischen geeigneter reaktiver mobilitätsmodifizierender Cyanin-Farbstoffe und der Moleküle oder Substanzen, die konjugiert werden sollen, in einem geeigneten Lösungsmittel, in dem beide löslich sind, unter Verwendung bekannter Verfahren, gefolgt von Abtrennung des Konjugats von jeglichen nicht konjugierten Ausgangsmaterialien oder unerwünschten Nebenprodukten. Das Farbstoffkonjugat kann trocken oder in Lösung für eine spätere Verwendung gelagert werden.
4.5.1 Nukleosid/tid-Reagenzien
Eine bevorzugte Klasse von Konjugaten umfasst Nukleoside/tide und Nukleosid/tid-Analoga, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind. Solche markierten Nukleoside/tide sind insbesondere zum Markieren von Polynukleotiden, die durch enzymatische Synthese gebildet werden, geeignet, z. B. markierte Nukleotidtriphosphate, die im Zusammenhang mit Matrizen-gerichteter Primer-Verlängerung, PCR-Amplifikation, Polynukleotidsequenzierung des Sanger-Typs und/oder Nick-Translations-Reaktionen verwendet werden. Mit Bezug auf das nachstehende Schema (III) werden Farbstoff-markierte Nukleosid/tid- und/oder Nukleosid/tid-Analogon-Konjugate im Allgemeinen dadurch erhalten, dass ein Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon, das modifiziert wurde, um eine verbindende Gruppe der Formel -L-F_x (35) zu enthalten, mit einem Farbstoff gemäß der Strukturformel (I.A), in der LG eine reaktive Gruppe R_x (35) ist, kondensiert wird, um ein Farbstoff-markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon gemäß der Strukturformel (II) zu ergeben.
Schema (III)
In dem Schema (III) sind L und R_x ein Linker bzw. eine reaktive Gruppe, wie vorstehend beschrieben, D stellt ein mobilitätsmodifizierendes Farbstoffchromophor dar, F_x ist eine komplementäre funktionelle Gruppe, wie vorstehend beschrieben, L' ist eine Bindung oder ein zweiter Linker, NUC stellt ein Nukleosid/tid oder ein Nukleosid/tid-Analogon dar und R⁴¹ stellt eine kovalente Bindung dar, die durch Umsetzen von R_x und F_x gebildet wird, wie es nachstehend genauer beschrieben werden wird.
Während der Kondensation setzen sich die reaktive Gruppe R_x und die komplementäre funktionelle Gruppe F_x um, um die kovalente Bindung R⁴¹ auszubilden. Folglich wird von dem Fachmann anerkannt werden, dass die reaktive Gruppe R_x und die komplementäre funktionelle Gruppe F_x jeweils die entsprechenden Mitglieder der verschiedenen Paare von komplementären Gruppen, die supra beschrieben wurden, ausmachen können, wie die verschiedener Paare von komplementären Elektrophilen und Nukleophilen, die in TABELLE 2 aufgeführt sind. Vorzugsweise ist eine der Gruppen R_x oder F_x (vorzugsweise F_x) eine Amin-, Thiol- oder Hydroxylgruppe, am meisten bevorzugt eine primäre Amingruppe, und die andere der Gruppen R_x oder F_x (vorzugsweise R_x) ist eine Gruppe, die zum Umsetzen mit einer Amin-, Thiol- oder Hydroxylgruppe fähig ist, am meisten bevorzugt eine Carbonsäuregruppe oder ein Salz, ein Ester oder aktivierter Ester davon. Folglich ist eine besonders bevorzugte kovalente Bindung R⁴¹ eine Amidgruppe der Formel -C(O)NR⁴⁵-, worin R⁴⁵ ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist.
Die komplementäre funktionelle Gruppe F_x ist an NUC über einen Linker L' gebunden. Die komplementäre funktionelle Gruppe F_x kann an NUC direkt gebunden sein, wobei in diesem Fall L' eine Bindung darstellt, oder sie kann von NUC durch ein oder mehrere dazwischen liegende Atome beabstandet sein, wobei in diesem Fall L' einen Linker darstellt. Ein jeglicher der Linker L, die vorstehend im Zusammenhang mit den mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen an sich beschrieben wurden, kann für den Linker L' verwendet werden. Bevorzugte Linker L' werden nachstehend genauer beschrieben.
Die komplementäre funktionelle Gruppe F_x kann an NUC bei einer Vielzahl von unterschiedlichen Positionen gebunden sein, z. B. der Nukleobase, dem Zucker und/oder dem Phosphatester oder einer anderen Rückgratgruppe. Nukleoside/tide und Nukleosid/tid-Analoga, die geeigneterweise an diesen verschiedenen Positionen derart modifiziert sind, dass sie mit den Farbstoffpaaren erfindungsgemäß konjugiert werden können, sind bekannt. Vorzugsweise ist die komplementäre Gruppe F_x an die Nukleobase über einen Linker L' gebunden. Wenn die Nukleobase ein 7-Deazapurin ist, ist L' gewöhnlich an die C7- oder C8-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase ein. Pyrimidin ist, ist L' gewöhnlich an die C5-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase ein Purin ist, ist L' gewöhnlich an die C7-Position der Nukleobase gebunden. Linker L', die zum kovalenten Konjugieren der erfindungsgemäßen Farbstoffe an die Nukleobase von NUC geeignet sind, sind in den US-PSen 5,821,356, 5,770,716 und der US-Anmeldung Nr. 08/833,854, eingereicht am 10. April 1997, beschrieben.
Bevorzugte Linker L' zum kovalenten Konjugieren der erfindungsgemäßen Farbstoffe an die Nukleobase von NUC umfassen (C₁-C₂₀)-Alkylenogruppen, 2–20-gliedrige Heteroalkyldiylgruppen und 2–20-gliedrige Heteroalkylenogruppen, insbesondere (C₁–C₂₀)-Alkyleno-, (C₁-C₂₀)-Alkenogruppen, 2–20-gliedrige Heteroalkinogruppen und 2–20-gliedrige Heteroalkenogruppen. Ein besonders bevorzugter Linker L' ist -C≡C-CH₂-, worin das terminale sp-Kohlenstoffatom an die Nukleobase von NUC kovalent gebunden ist und das terminale Methylenkohlenstoffatom (sp³) kovalent an R⁴¹ in den Verbindungen der Strukturformel (II) oder an F_x der Verbindung 35 gebunden ist.
Zusätzliche bevorzugte Linker L' zum kovalenten Konjugieren der Farbstoffe oder der erfindungsgemäßen Farbstoffe an die Nukleobase von NUC umfassen Propargylethoxygruppen gemäß der Strukturformel -C≡C-CH₂-O-CH₂-CH₂-NR⁴⁷-R⁴⁸-, worin R⁴⁷ ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist und R⁴⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-(CH₂)_r, -C(O)-CHR⁴⁹-, -C(O)-C≡C-CH₂- und -C(O)-Φ-(CH₂)_r-, worin jedes r unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist und Φ eine C₆-Aryldiylgruppe oder eine 6-gliedrige Heteroaryldiylgruppe, vorzugsweise eine Phena-1,4-diylgruppe
darstellt und R⁴⁹ ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe oder eine Aminosäureseitenkette (einschließlich Seitenketten von sowohl Gen-kodierten als auch nicht kodierten Aminosäuren) ist. Mit diesen Linkern L' ist das terminale sp-Kohlenstoffatom an die Nukleobase von NUC gebunden und die andere terminale Gruppe ist an R⁴¹ in den Verbindungen der Strukturformel (II) oder an F_x der Verbindung 35 gebunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die markierten Nukleoside/tide und/oder Nukleosid/tid-Analoga gemäß der Strukturformel (II) markierte enzymatisch einbaubare Nukleotide, markierte enzymatisch verlängerbare Nukleotide oder markierte Terminatoren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die markierten Nukleoside/tide und Nukleosid/tid-Analoga diejenigen, die aus Schema (III) erhalten werden, in dem die Verbindung 36 eine Verbindung gemäß den Strukturformel (I.A), (I.D), (I.E), (I.F), (I.G), (I.H), (I.I), (I.J) oder (I.K) oder eine jegliche der bevorzugten Ausführungsformen davon ist und/oder Verbindung 35 eine Verbindung gemäß der Strukturformel (IIa)
ist, worin:
B eine Nukleobase ist,
F_x eine komplementäre funktionelle Gruppe, wie vorstehend beschrieben, ist,
L' ein Linker, wie vorstehend beschrieben, ist,
R⁷⁰ und R⁷¹, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, einer Hydroxylgruppe und einer Gruppe, die eine Polymerase-vermittelte Matrizen-gerichtete Polymerisation blockiert, oder, wenn zusammen genommen, eine Bindung derart bilden, das der dargestellte Zucker eine 2',3'-Didehydroribose ist, und
R⁷² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, einem Phosphatester der Formel
worin α eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, und einem Phosphatester-Analogon. Typischerweise ist F_x eine Aminogruppe der Formel -NHR⁵¹, worin R⁵¹ ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist, kann aber eine jegliche der nukleophilen oder elektrophilen Gruppen, die in TABELLE 2, supra, aufgeführt sind, sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Strukturformel (IIa) ist B eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon, ein 7-Deazapurin, ein Purin oder ein Pyrimidin und die Gruppe L' ist eine ihrer vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist B eine Nukleobase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, 7-Deazaadenin, Cytosin, Guanin, 7-Deazaguanin, Thymin und Uracil. Wenn die bevorzugte Nukleobase B ein Purin oder ein 7-Deazapurin ist, ist die Pentosegruppe an die N⁹-Position der Nukleobase gebunden und, wenn die bevorzugte Nukleobase B ein Pyrimidin ist, ist die Pentosegruppe an die N¹-Position der Nukleobase gebunden. Der Linker L' ist an die Nukleobase B, wie vorstehend beschrieben, gebunden.
In der Strukturformel (IIa) sind, wenn beide Gruppen R⁷⁰ und R⁷¹ Hydroxylgruppen sind, die sich ergebenden Verbindungen, die in Schema (III) hergestellt werden, markierte Ribonukleoside/tide. Wenn R⁷⁰ ein Wasserstoffatom ist und R⁷¹ eine Hydroxylgruppe ist, sind die sich ergebenden Verbindungen markierte 2'-Desoxyribonukleoside/tide. Wenn R⁷⁰ und R⁷¹ jeweils ein Wasserstoffatom sind, sind die sich ergebenden Verbindungen 2',3'-Didesoxyribonukleoside/tide. Markierte 2',3'-Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphate (ddNTPs) finden spezifische Verwendung als Terminatoren in DNA-Sequenzierungsverfahren des Sanger-Typs, die einen Fluoreszenznachweis verwenden. Markierte 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate (dNTPs) finden spezifische Verwendung als Mittel zum Markieren von DNA-Polymerase-Verlängerungsprodukten, z. B. in der Polymerasekettenreaktion oder Nick-Translation. Markierte Ribonukleosid-5'-triphosphate (NTPs) finden spezifische Verwendung als Mittel zum Markieren von RNA-Polymerase-Verlängerungsprodukten.
Mit Bezug auf das Schema (III), supra, wird die Synthese von Alkinylaminogruppe-derivatisierten Verbindungen 35, die zum Konjugieren der erfindungsgemäßen Farbstoffe an Nukleoside/tide und/oder Nukleosid/tid-Analoga geeignet sind, in der EP 87 305 844.0 und Hobbs et al., 1989, J. Org. Chem. 54: 3420, gelehrt. Kurz zusammengefasst werden die Alkinylaminogruppe-derivatisierten Nukleotide dadurch gebildet, dass das geeignete Halogennukleosid (gewöhnlich 5-Iodpyrimidin- und 7-Iod-7-deazapurindidesoxynukleoside, wie von Hobbs et al., 1989, supra, gelehrt) und Cu(I) in einem Kolben vorgelegt werden, der Kolben mit Argon gespült wird, um Luft zu entfernen, und trockenes DMF zugegeben wird, gefolgt von der Zugabe eines Alkinylamins, von Triethylamin und Pd(0). Das Reaktionsgemisch wird für mehrere Stunden gerührt oder, bis eine Dünn-Schicht-Chromatographie einen Verbrauch des Halogennukleosids anzeigt. Wenn ein nicht geschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann das Alkinylamino-Nukleosid dadurch isoliert werden, dass das Reaktionsgemisch einkonzentriert und auf einem Silicagel unter Verwendung eines Elutionslösungsmittels, das Ammoniumhydroxid zum Neutralisieren des in der Kopplungsreaktion gebildeten Halogenwasserstoffs enthält, chromatographisch aufgetrennt wird. Wenn ein geschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann Methanol/Methylenchlorid zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden, gefolgt von der Bicarbonatform eines stark basischen Anionenaustauschharzes. Die Aufschlämmung kann sodann für etwa 45 Minuten gerührt, gefiltert werden und das Harz wird mit zusätzlichem Ethanol/Methylenchlorid gespült. Die vereinigten Filtrate können einkonzentriert und durch Flashchromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Methanol/Methylenchlorid-Gradienten aufgereinigt werden. Die entsprechenden Nukleosidmono-, -di- und -triphosphate werden durch. Standardtechniken erhalten (vgl. z. B. die Verfahren, die in den US-PSen 5,821,356, 5,770,716 und in der US-Anmeldung Nr. 08/833,854, eingereicht am 10. April 1997, wie supra erörtert, beschrieben sind). Verfahren zum Synthetisieren der Verbindung 35, die mit einem Propargylethoxyamido-Linker L' modifiziert ist, können auch in diesen Patenten und in dieser Anmeldung gefunden werden.
Zusätzliche Syntheseverfahren, die für eine Verwendung beim Synthetisieren von Verbindungen gemäß der Strukturformel (II) geeignet sind, sind z. B. in Gibson et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6455–6467, Gebeyehu et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 4513–4535, Haralambidis et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 4856–4876, Nelson et al., 1986, Nucleosides and Nucleotides, 5 (3): 233–241, Bergstrom et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 374–375, US-PSen 4,855,225, 5,231,191 und US-Anmeldung Nr. 5,449,767 beschrieben. Ein jegliches dieser Verfahren kann routinemäßig wie erforderlich angepasst oder modifiziert werden, um den vollständigen Bereich der hierin beschriebenen markierten Nukleoside/tide und Nukleosid/tid-Analoga zu synthetisieren.
4.5.2 Phosphoramidit-Reagenzien
Eine weitere bevorzugte Klasse von erfindungsgemäßen Reagenzien umfasst Phosphoramiditverbindungen, die die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe enthalten. Solche Phosphoramidit-Reagenzien sind insbesondere für die automatisierte chemische Synthese von Polynukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind, geeignet. Solche Phosphoramidit-Reagenzien bilden, wenn sie mit einer Hydroxylgruppe wie einer 5'-Hydroxylgruppe eines Nukleosids/tids oder Polynukleotids umgesetzt werden, eine Phosphitesterbindung, die ihrerseits oxidiert wird, um eine Phosphatesterbindung zu ergeben. Für eine genauere Beschreibung der Phosphoramidit-Chemie vgl. z. B. Caruthers et al, US-PSen 4,458,066 und 4,415,732 und Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England. Die Phosphoramidit-Reagenzien können nukleosidisch oder nicht nukleosidisch sein, wie es nachstehend genauer beschrieben werden wird.
4.5.2.1 Nicht nuklesidische Phosphoramidit-Reagenzien
In einem Aspekt sind die erfindungsgemäßen Phosphoramidit-Reagenzien nicht nukleosidische Verbindungen gemäß der Strukturformel (III):
worin:
N, O und P Stickstoff-, Sauerstoff- bzw. Phosphoratome darstellen,
L'' eine Bindung oder einen Linker, wie es nachstehend vollständiger beschrieben werden wird, darstellt,
R⁴¹ eine Bindung oder eine Bindung, wie vorstehend für die Strukturformel (II) definiert, darstellt,
L einen Linker, wie vorstehend für die Strukturformel (I) definiert, darstellt,
D ein erfindungsgemäßes Farbstoffchromophor oder ein geschütztes Derivat davon darstellt,
R⁶⁰ eine Phosphitester-Schutzgruppe ist,
R⁶¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₃-C₁₀)- Cycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Aryl- und (C₆-C₂₆)-Arylalkylgruppe oder, wenn mit R⁶² zusammengenommen, eine geradkettige oder verzweigte (C₂-C₁₀)-Alkylenogruppe oder eine geradkettige oder verzweigte 2–10-gliedrige Heteroalkylenogruppe bildet und
R⁶², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₃-C₁₀)-Cycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Aryl- und (C₆-C₂₆)-Arylalkylgruppe oder, wenn mit R⁶¹ zusammengenommen, eine geradkettige oder verzweigte (C₂-C₁₀)-Alkylenogruppe oder eine geradkettige oder verzweigte 2–10-gliedrige Heteroalkylenogruppe bildet.
Gemäß der Strukturformel (III) ist R⁶⁰ eine Phosphitester-Schutzgruppe, die eine unerwünschte Verlängerung des Polynukleotids, an das das Phosphoramidit gebunden ist, verhindert. Im Allgemeinen ist R⁶⁰ stabil gegenüber Polynukleotidsynthese-Bedingungen und immer noch fähig, von einem synthetischen Polynukleotidprodukt mit einem Reagenz entfernt zu werden, dass die Integrität des Polynukleotids oder des Farbstoffs nicht nachteilig beeinflusst. Eine Vielzahl von Phosphitestergruppen mit diesen Charakteristiken ist bekannt. Vorzugsweise ist R⁶⁰ eine Methyl-, β-Cyanethyl- oder 4-Nitrophenylethylgruppe.
Obwohl es nicht in der Strukturformel (III) gezeigt ist, ist das Farbstoffchromophor D an den Linker L an dem heteroaromatischen Imminium-Stickstoffatom gebunden, wie in der Strukturformel (I) gezeigt. In einigen Fällen kann D funktionelle Gruppen enthalten, die ein Schützen benötigen, entweder während der Synthese des Phosphoramidit-Reagenzes oder während seiner anschließenden Verwendung zum Markieren von Molekülen wie Polynukleotiden. Die verwendete(n) Schutzgruppe(n) wird/werden von der Art der funktionellen Gruppen abhängen und wird/werden dem Fachmann ersichtlich sein. Im Allgemeinen soll ten die verwendeten Schutzgruppen unter den sauren Bedingungen, die herkömmlicherweise in einer Polynukleotidsynthese verwendet werden, um 5'-Hydroxyl-Schutzgruppen (z. B. Dimethoxytritylgruppe) zu entfernen, stabil und unter den basischen Bedingungen, die zum Entschützen und/oder Abspalten von synthetischen Polynukleotiden von Harzen verwendet werden, labil sein. Eine Anleitung zum Auswählen von geeigneten Schutzgruppen kann. z. B. in Greene & Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., New York, gefunden werden.
Es sollte jedoch angemerkt werden, dass Cyanin-Farbstoffe im Allgemeinen unter den basischen Bedingungen, die typischerweise zum Entschützen und/oder Abspalten von synthetischen Polynukleotiden von Syntheseharzen verwendet werden, nicht vollständig stabil sind. Folglich sollten jegliche verwendete basenlabile Schutzgruppen unter relativ milden basischen Bedingungen (z. B. Aussetzen gegenüber Ammoniumhydroxid oder 0,05 M Kaliumcarbonat in Methanol für zwei Stunden oder weniger bei einer Temperatur von 55°C oder weniger oder alternativ dazu Aussetzen gegenüber einem 50 : 50-Gemisch von Ammoniumhydroxid und 40%igem wässrigem Methylamin für 90 Minuten bei Raumtemperatur oder 5 Minuten bei 65°C) entfernbar sein. Natürlich sollten jegliche exocyclische Amine oder andere Funktionalitäten auf den Nukleosidphosphoramiditen, die zum Synthetisieren des Polynukleotids verwendet werden, das mit den Verbindungen gemäß der Strukturformel (III) markiert werden wird, auch mit solchen milden basenlabilen Schutzgruppen geschützt sein. Geeignete Gruppen sind bekannt und umfassen z. B. Isobutyryl-, Phenoxyacetyl-, 4-Isopropylphenoxyacetyl- und Acetylgruppe. Andere Schutzgruppen mit diesen Eigenschaften werden dem Fachmann ersichtlich sein. Polynukleotid-Synthesereagenzien und -träger mit geeigneten basenlabilen Bindungs- und Schutzgruppen als auch Reagenzien für deren Entfernung und/oder Abspaltung sind käuflich erhältlich (vgl. z. B. Produktkatalog von Glen Research, Sterling, VA 20164).
Der Phosphoramiditanteil des Moleküls ist an das Farbstoffchromophor D über eine Bindung -L''-R⁴¹-L- gebunden. Wie es nachstehend genauer beschrieben werden wird, kann die Bindung -L''-R⁴¹-L- eine Vielzahl von Formen einnehmen, muss aber allgemein eine Bindung sein, die (i) gegenüber DNA-Synthese-Bedingungen stabil ist, (ii) mit Oligonukleotid-Ziel-Hybridisierung nicht wesentlich wechselwirkt und (iii) die Fluoreszenz des Farbstoffs, an die es gebunden ist, nicht löscht, z. B. US-PSen 5,231,191, 5,258,538, 4,757,141 und 5,212,304.
Die Zusammensetzung von -L''-R⁴¹-L- wird teilweise durch die Verfahren bestimmt, die zum Synthetisieren der Phosphoramidit-Reagenzien verwendet werden. Zum Beispiel können geeineterweise geschützte mobilitätsmodifizierende Farbstoffe gemäß der Strukturformel (I), in denen die verbindende Gruppe LG eine Hydroxylgruppe ist, zweckmäßigerweise unter Verwendung von Standardverfahren und -ragenzien phosphityliert werden, um Phosphoramidite gemäß der Strukturformel (III) zu ergeben. In diesen Fällen ist L ein jeglicher der vorste hend beschriebenen Linker, der mit den Polynukleotidsynthese-Bedingungen kompatibel ist, und -L''-R⁴¹ stellt eine Bindung dar.
Alternativ dazu können Farbstoffe der Formel (I), in denen die verbindende Gruppe LG eine reaktive Gruppe R_x ist, zweckmäßigerweise dadurch "umgewandelt" werden, um eine Hydroxylgruppe zu enthalten, dass der Farbstoff mit einem "Adaptermolekül" umgesetzt wird, das eine Hydroxylgruppe und eine funktionelle Gruppe komplementär zu der reaktiven Gruppe R_x enthält, wie eine jegliche der vorstehend beschriebenen komplementären funktionellen Gruppen F_x (vgl. z. B. die TABELLE 2, supra). Analog zu den Verbindungen der Strukturformel (II) bildet in den Verbindungen der Strukturformel (III) die Reaktion zwischen der reaktiven Gruppe R_x und der funktionellen Gruppe F_x die Bindung R⁴¹. Das Sauerstoffatom, das zwischen dem Phosphoratom und dem Linker L" liegt, wird von dem Adaptermolekül beigesteuert. Folglich sind Adaptermoleküle, die zum Bereitstellen einer für die Phosphitylierung geeigneten Hydroxylgruppe verwendbar sind, im Allgemeinen Verbindungen mit der Struktur R⁶³-O-L''-F_x, worin R⁶³ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe, vorzugsweise eine säurelabile Hydroxyl-Schutzgruppe ist, wie genauer infra beschrieben. Vorzugsweise ist F_x eine Amingruppe der Formel -NHR⁵⁶, worin R⁵⁶ ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist, und die reaktive Gruppe R_x des Farbstoffs ist eine Carboxyl- oder Carboxylatgruppe oder ein aktivierter Ester davon, so dass R⁴¹ in den Verbindungen der Strukturformel (III) eine Amidgruppe oder eine substituierte Amidgruppe der Formel -NR⁵⁶-C(O)- ist, worin R⁵⁶ wie vorstehend beschrieben ist.
Linker L'' ist analog zu dem Linker L und daher kann er flexibel oder starr, lang oder kurz oder hydrophob oder hydrophil sein, abhängig von der spezifischen Anwendung. Der Linker L'' kann einer der vorstehend beschriebenen Linker L oder L' sein, die gegenüber Polynukleotidsynthese-Bedingungen stabil sind. Eine Auswahl eines geeigneten Linkers wird von der spezifischen Anwendung abhängen und wird dem Fachmann ersichtlich sein. Zum Beispiel kann der Linker L" eine (C₁-C₃₀)-Alkyldiylgruppe, 1- bis 30-gliedrige Heteroalkyldiylgruppe, (C₅-C₁₄)-Aryldiyl-, (C₅-C₁₄)-Arylaryldiyl-, (C₆-C₂₆)-Arylalkyldiylgruppe, 6- bis 26-gliedrige Arylheteroalkyldiylgruppe, 5- bis 14-gliedrige Heteroaryldiylgruppe, 5- bis 14-gliedrige Heteroarylheteroaryldiylgruppe, 6- bis 26-gliedrige Heteroarylalkyldiylgruppe oder 6- bis 26-gliedrige Heteroarylheteroalkyldiylgruppe sein. Bevorzugte Linker L'' umfassen Alkyleno- und Heteroalkylenogruppen, insbesondere (C₁-C₃₀)- Alkanogruppen, und lineare Polyethylenoxide mit der Formel -(CH₂CH₂O)_u-CH₂CH₂-, worin u eine ganze Zahl von 1 bis 30, vorzugsweise 2 bis 10 und mehr bevorzugt 2 bis 6 ist.
Der Fachmann wird anerkennen, dass Verbindungen gemäß der Strukturformel (III) zum Markieren des 5'-Endes von synthetischen Polynukleotiden mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen besonders geeignet sind. Jedoch kann es in vielen Fällen erwünscht sein, das 3'-Ende zu markieren und/oder interne Markierungen bereitzustellen, die zwischen den Nukleosiden eines synthetischen Polynukleotids liegen. In diesen Fällen sollte der Linker L'' (oder alternativ der Linker L) eine Hydroxylgruppe für eine anschließende Synthese bereitstellen. Die Hydroxylgruppe für eine anschließende Synthese ist während der Phosphitylierungsreaktion mit einer säurelabilen Schutzgruppe geschützt, wie denjenigen, die typischerweise verwendet werden, um die primäre 5'-Hydroxylgruppe der 2'-Desoxyribonukleosidphosphoramidite zu schützen, die herkömmlicherweise in einer Polynukleotidsynthese verwendet werden, wie genauer infra beschrieben. Bevorzugte Linker L'' (oder alternativ dazu L) gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt umfassen verzweigte (C₁-C₃₀)-Alkylgruppen, die mit einer Hydroxylgruppe substituiert sind. Besonders bevorzugte Phosphoramidit-Reagenzien gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt sind Verbindungen gemäß der Strukturformel (III.A):
worin:
N, P und O Stickstoff-, Phosphor- bzw. Sauerstoffatome darstellen,
R⁴¹, L, D, R⁶⁰, R⁶¹ und R⁶² wie vorstehend für die Strukturformel (III) definiert sind,
R⁶³ ein Wasserstoffatom oder eine säurelabile Hydroxyl-Schutzgruppe ist und
ν eine ganze Zahl von 1 bis 30, vorzugsweise 1 bis 5 ist.
In den Verbindungen der Strukturformel (III.A) ist R⁶³ ein Wasserstoffatom oder eine säurelabile Hydroxyl-Schutzgruppe. Vorzugsweise ist R⁶³ eine Triphenylmethyl-(Trityl-)Gruppe oder ein Derivat davon, das mit einem oder mehreren der gleichen Elektronen-zuführenden Substituenten substituiert ist. Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "Elektronen-zuführend" die Tendenz eines Substituenten, Valenzelektronen an benachbarte Atome in dem Molekül, von dem es ein Teil ist, freizusetzen, d. h. es ist hinsichtlich der Nachbaratome elektropositiv.
Vorzugsweise umfassen Elektronen-zuführende Substituenten Amino-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₈)-Aryl, (C₁-C₆)-Alkoxygruppen und dergleichen. Mehr bevorzugt ist/sind der/die Elektronen-zuführende(n) Substituent(en) (eine) Methoxygruppe(n). Beispielhafte säurelabile Tritylderivate umfassen 4,4'-Dimethoxytrityl-, d. h. Bis(p-anisyl)phenylmethyl-, Monomethoxytrityl-, α-Naphthyldiphenylmethyl-, Tri(p-methoxyphenyl)methylgruppe und dergleichen. Anbindungs- und Abspaltungsbedingungen für diese und andere Tritylgruppen können in Greene und Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, und Gait; 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England, gefunden werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden in den Verbindungen der Strukturformeln (III) und (III.A) R⁶¹ und R⁶² für sich genommen und sind jeweils unabhängig voneinander eine verzweigte oder geradkettige (C₁-C₆)-Alkylgruppe, mehr bevorzugt eine verzweigte oder geradkettige (C₁-C₆)-Alkanylgruppe. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind R⁶¹ und R⁶² jeweils unabhängig voneinander eine Propan-2-yl-(Isopropyl-), Butan-2-yl-, Butan-3-yl-, 2-Methylpropan-1-yl-(Isobutyl-) oder 2-Methylpropan-2-yl-(t-Butyl-)Gruppe.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden in der Verbindung der Strukturformeln (III) und (III.A) R⁶¹ und R⁶² zusammen genommen und bilden eine geradkettige (C₂-C₅)-Alkanobrücke oder eine (C₂-C₁₀)-verzweigte Alkanobrücke, in der die Hauptkette oder -brücke 2 bis 5 Kohlenstoffatome enthält. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform bilden R⁶¹ und R⁶², wenn sie mit dem Stickstoffatom zusammen genommen werden, eine 5- bis 8-gliedrige Heteroalkylgruppe, die gegebenenfalls ein oder mehrere zusätzliche Heteroatome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, enthält. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bilden R⁶¹ und R⁶², wenn sie mit dem Stickstoffatom zusammen genommen werden, eine Morpholinogruppe.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist in den Verbindungen der Strukturformeln (III) und (III.A) D ein Chromophor, das von der Struktur (I), (I.A), (I.D), (I.E), (I.F) oder (I.G) oder einer jeglichen ihrer bevorzugten Ausführungsformen abstammt.
Phosphoramidit-Reagenzien gemäß den Strukturformeln (III) und (III.A) können durch eine Vielzahl von bekannten Verfahren synthetisiert werden. Hydroxylgruppen und andere reaktive Funktionalitäten des Farbstoffchromophors werden mit Schutzgruppen geschützt, die unter den gewünschten Bedingungen herkömmlicherweise mit einem DNA-Synthese-Entschützungsmittel wie Ammoniak, Ethanolamin, Iod, Methylamin/Ammoniumhydroxid-Gemischen und Gemischen von t-Butylamin/Wasser/Methanol (1 : 2 : 1) (vgl. z. B. US-PS 5,231,191 ) entfernt werden können. Bevorzugte Schutzgruppen umfassen Ester von Benzoesäure oder Pivalinsäure. Am meisten bevorzugt sind die Schutzgruppen unter mild basischen Bedingungen entfernbar, wie supra beschrieben.
Jegliche Hydroxylgruppen auf L, L' oder L'' für eine anschließende Synthese werden mit einer säurelabilen Schutzgruppe, vorzugsweise 4,4'-Dimethoxytritylgruppe, vor einer Phosphitylierung geschützt. Falls die verbindende Gruppe LG des geschützten Farbstoffs eine Hydroxylgruppe ist, kann sie gemäß Standardverfahren phosphityliert werden. Falls die verbindende Gruppe eine reaktive Gruppe R_x, wie z. B. eine Carboxylgruppe, enthält, wird sie z. B. mit Carbodiimid aktiviert und mit einem Adaptermolekül, z. B. Ethanolamin, Hexanolamin oder dergleichen, in N,N-Dimethylformamid (DMF) oder einem anderen ähnlichen aprotischen Lösungsmittel umgesetzt, um einen geschützten Farbstoff mit einer Hydroxylfunktionalität zu ergeben. Die Hydroxylgruppe wird sodann mit einem Phosphitylierungsmittel unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. Di(N,N-diisopropylamino)methoxyphosphin in Acetonitril mit katalytischen Mengen an Tetrazoldiisopropylamin, umgesetzt, um das Phosphoramidit zu ergeben (vgl. z. B. US-PS 5,231,191 ).
4.5.2.2 Nukleosidische Phosphoramidit-Reageanzien
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Phosphoramidit-Reagenzien 2'-Desoxyribonukleosid-5'-phosphoramidite gemäß der Strukturformel (IV):
worin:
B eine Nukleobase oder ein geschütztes Derivat davon ist,
L', R⁴¹, L, D, R⁶⁰, R⁶¹ und R⁶² wie vorstehend für die Strukturformel (III) beschrieben sind und
R⁶³ wie vorstehend für die Strukturformel (III.A) beschrieben ist.
Wenn B ein Purin oder 7-Deazapurin ist, ist die dargestellte 2'-Desoxyribosegruppe an die N⁹-Position des Purins oder Deazapurins gebunden. Alternativ dazu ist, wenn B ein Pyrimidin ist, die 2'-Desoxyribosegruppe an die N¹-Position des Pyrimidins gebunden. B und D sind über eine Bindung -L'-R⁴¹-L- verbunden, die typischerweise durch die Umsetzung von komplementären reaktiven und funktionellen Gruppen gebildet wird, wie vorstehend genau beschrieben. Falls B ein Purin ist, ist L' an die C-8-Position des Purins gebunden, während, falls B ein 7-Deazapurin ist, L' an die C-7-Position des 7-Deazapurins gebunden ist. Falls B ein Pyrimidin ist, ist L' an die C-5-Position des Pyrimidins gebunden. Die Anbindungsstelle von L' an andere Nukleobasen werden dem Fachmann ersichtlich sein.
Wie von dem Fachmann anerkannt werden wird, können die exocyclischen Amine oder andere Funktionalitäten der Nukleobase B ein Schützen während der Synthese des Phosphoramidit-Reagenzes und/oder während seiner anschließenden Verwendung zum Synthetisieren von markierten Polynukleotiden benötigen. Die ausgewählte(n) spezifische(n) Schutzgruppe(n) wird/werden von der Identität der Nukleobase oder des Nukleobasen-Analogons abhängen und wird/werden dem Fachmann ersichtlich sein. Im Allgemeinen werden Schutzgruppen verwendet, die herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Nukleinsäuresynthese verwendet werden. Zum Beispiel können die exocyclischen Amine von Adenin und Cytosin mit Benzoylgruppen (Bz) geschützt werden und das exocyclische Amin von Guanin kann mit Dimethylformamid (dmf) oder Isobutyrylgruppe (iBu) unter Verwendung herkömmlicher N-Acylierungsverfahren geschützt werden. Das O⁶- Amid-Sauerstoffatom von Guanin als auch das O⁴-Amid-Sauerstoffatom von Thymin und/oder Uracil können auch gegebenenfalls mit z. B. Phosphinothioyl-, 2-Nitrophenyl- oder substituierten Ethylgruppen (z. B. Cyanethylgruppe) unter Verwendung herkömmlicher Techniken geschützt werden (vgl. z. B. Deskalov et al., 1981, Bull. Chem. Soc. Japan 54: 3076, Jones et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 4755, Gaffney & Jones, 1982, Tetrahedron Lett. 23: 2257, Trichtinger et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24: 211, Himmelsbach et al., 1981, Tetrahedron Lett. 40: 59).
Vorzugsweise ist die Nukleobase mit Gruppen geschützt, die unter milden basischen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, leicht entfernt werden. Schutzgruppen, die unter solchen milden basischen Bedingungen entfernbar sind, sind bekannt. Zum Beispiel können Polynukleotide, die mit dA^Bz-, dC^Bz-, dG^iBu- und dT-Phosphoramiditen (und deren entsprechenden Harzen) synthetisiert wurden, in 90 Minuten oder weniger unter Verwendung eines 50 : 50-Gemisches von Ammoniumhydroxid und 40%igem wässrigem Methylamino (Aldrich M2, 775-1), abhängig von der Temperatur (5 Minuten bei 65°C; 90 Minuten bei 25°C), abgespalten und entschützt werden. Polynukleotide, die mit dA^iBz-, dA^Pac-, dC^Ac-, dG^iPr-Pac- und dT-Phosphoramiditen (und deren entsprechenden Harzen) synthetisiert wurden, können in zwei Stunden bei Raumtemperatur mit Ammoniumhydroxid oder 0,05 M Kaliumcarbonat in Methanol abgespalten und entschützt werden. Folglich sind bevorzugte exocyclische Amin-Schutzgruppen für Adenin Benzoyl- (Bz), Isobutyryl- (iBu) und Phenoxyacetylgruppe (Pac). Bevorzugte exocyclische Amin-Schutzgruppen für Cytosin sind Bz und Acetylgruppe (Ac). Bevorzugte exocyclische Amin-Schutzgruppen für Guanin sind iBu und 4-Isopropylphenoxyacetylgruppe (iPr-Pac). Die tatsächliche Schutzgruppe, die für eine spezifische Nukleobase ausgewählt wird, wird von dem Schützen der anderen Nukleobase abhängen und wird dem Fachmann ersichtlich sein.
Bevorzugte Verbindungen gemäß der Strukturformel (IV) umfassen diejenigen Verbindungen, in denen L'' eine der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des Linkers L' ist und L, D, R⁶⁰, R⁶¹, R⁶² und/oder R⁶³ ihre entsprechenden bevorzugten Ausführungsformen sind, die vorstehend in Zusammenhang mit der Strukturformel (III) oder (III.A) beschrieben wurden.
Die 2'-Desoxyribonukleosidphosphoramidite gemäß der Strukturformel (IV) können unter Verwendung von Standardverfahren, wie nachstehend in Schema (IV) veranschaulicht, mit einem Propargyllinker L', reaktiven Carboxylgruppen R_x und komplementären funktionellen primären Aminogruppen F_x synthetisiert werden.
Schema (IV)
In dem Schema (IV) sind R⁶⁰, R⁶¹, R⁶², R⁶³, B, L und D wie vorstehend für die Strukturformel (IV) definiert und BP ist eine geschützte Nukleobase oder ein geschütztes Nukleobasen-Analogon.
Gemäß Schema (IV) wird das Nukleosid 60 zum Schützen jeglicher exocyclischer Amine unter Verwendung von Standardverfahren N-acyliert, was das geschützte Nukleosid 61 ergibt. Das geschützte Nukleosid 61 wird mit dem Chlorid 62 (z. B. 4,4'-Dimethoxytritylchlorid) umgesetzt, um das 5'-geschützte Nukleosid 63 zu ergeben. Die Verbindung 63 wird mit der Verbindung 64 in Gegenwart von Pal ladium(0) umgesetzt, was das geschützte Propargyllinker-modifizierte Nukleosid 65 ergibt. Die t-Butylsilyl-Schutzgruppe des Propargylamino-Linkers wird mit Tetrabutylammoniumfluorid (nBu₄N⁺F^–) selektiv entfernt, um das geschützte Nukleosid 66 zu ergeben. Sodann wird das geschützte Nukleosid 66 mit dem Farbstoff dadurch markiert, dass es mit dem Farbstoff 67 unter Bedingungen umgesetzt wird, bei denen sich die reaktive Gruppe des Farbstoffs mit der komplementären funktionellen Gruppe des geschützten Nukleosids umsetzt, um eine kovalente Bindung zu bilden. In dem spezifischen in Schema (IV) veranschaulichten Beispiel wird die reaktive Carboxylgruppe des Farbstoffs 67 zweckmäßigerweise zu einem reaktiven Ester, z. B. einem NHS-Ester, mit Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid umgewandelt. Der aktivierte NHS-Ester wird sodann mit der Verbindung 66 umgesetzt, um das Farbstoff-markierte Nukleosid 65 zu ergeben, das mit der Verbindung 69 phosphityliert wird, um das Phosphoramidit 70 zu ergeben. Jegliche reaktive Gruppen auf dem Farbstoffchromophor D oder Linker L können wie vorstehend beschrieben geschützt werden. Verfahren zum Synthetisieren von Verbindungen gemäß der Strukturformel (IV), einschließlich Linkern L und Bindungen R₄₁, die von denjenigen, die in Schema (IV) gezeigt sind, unterschiedlich sind, können durch Routinemodifikation des vorstehenden Verfahrens durch Zurückgreifen auf andere herkömmliche Syntheseverfahren (vgl. z. B. Meyer, "Incorporation of Modified Bases into Oligonucleotides" in Methods in Molecular Biology Volume 26: Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Kapitel 2, Agarwal, Hrsg., 1994, Humana Press, Totowa, NJ, als auch die darin zitierten Literaturhinweise) oder durch Routinemodifikation der Verfahren synthetisiert werden, die im Zusammenhang mit den Verbindungen der Strukturformel (III) bereitgestellt wurden.
Markierte 2'-Desoxyribonukleosid-3'-phosphoramidite gemäß der Strukturformel (IV) sind zum Bereitstellen von Markierungen an die 3'-, 5'- und/oder internen Positionen von chemisch synthetisierten Polynukleotiden besonders geeignet.
4.5.2.3 Polynukleotid-Reagenzien
Eine noch weitere bevorzugte Klasse von erfindungsgemäßen Reagenzien umfasst Polynukleotide oder Polynukleotid-Analoga, die mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffen markiert sind. Solche markierten Polynukleotide oder Analoga sind in einer Vielzahl von wichtigen Zusammenhängen verwendbar, einschließlich als DNA-Sequenzierungsprimer, PCR-Primer, Oligo nukleotid-Hybridisierungssonden, Oligonukleotid-Ligationssonden und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen markierten Polynukleotide oder Polynukleotid-Analoga mehrere Farbstoffe, die so positioniert sind, dass zwischen ihnen ein Fluoreszenzenergie-Übergang stattfindet. Solche Vielfarben-Energieübergang-Polynukleotide finden als spektral einstellbare Sequenzierungsprimer, wie z. B. in Ju et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347–4351, beschrieben, und als Hybridisierungssonden Anwendung, wie z. B. in Lee et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 3761–3766, beschrieben.
Markierte Polynukleotide und/oder Polynukleotid-Analoga können entweder enzymatisch, z. B. unter Verwendung einer DNA-Polymerase oder -Ligase (vgl. z. B. Stryer, 1981, Biochemistry, Kapitel 24, W. H. Freeman and Company), oder durch chemische Synthese synthetisiert werden, z. B. durch das Phosphoramidit-Verfahren, das Phosphit-Triester-Verfahren und dergleichen (vgl. z. B. Gait, 1990, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, England). Markierungen können während einer enzymatischen Synthese unter Verwendung der markierten vorstehend beschriebenen enzymatisch einbaubaren Nukleoside/tide und Nukleosid/tid-Analoga oder während einer chemischen Synthese unter Verwendung der vorstehend beschriebenen markierten nicht nukleosidischen oder nukleosidischen Phosphoramidit-Reagenzien eingebaut werden. Alternativ dazu können die Markierungen im Anschluss an eine Synthese über herkömmliche Konjugationsreaktionen eingebaut werden.
Im Allgemeinen kann, falls das markierte Polynukleotid unter Verwendung einer enzymatischen Synthese hergestellt wird, das nachstehende Verfahren verwendet werden. Eine Ziel-DNA wird denaturiert und ein Oligonukleotid-Primer wird an die Matrizen-DNA hybridisiert. Ein Gemisch von enzymatisch einbaubaren Nukleosiden/tiden oder Nukleosid/tid-Analoga, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Matrizen-gerichteten enzymatischen Verlängerung des mit dem Primer versehenen Ziels fähig sind (z. B. ein Gemisch, das dGTP, dATP, dCTP und dTTP oder dUTP einschließt), wird zu dem mit Primer versehenen Ziel gegeben. Zumindest ein Teil der Nukleoside/tide oder Nukleosid/tid-Analoga ist mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffverbindung markiert oder sind markierte Terminatoren, wie vorstehend beschrieben. Sodann wird ein Polymeraseenzym zu dem Gemisch unter Bedingungen gegeben, bei denen das Polymeraseenzym aktiv ist.
Ein markiertes Polynuklentid wird durch den Einbau der markierten Nukleoside/tide oder Nukleosid/tid-Analoga oder Terminatoren während einer Polymerase-vermittelten Strangsynthese gebildet. In einem alternativen enzymatischen Syntheseverfahren werden zwei Primer anstelle von einem verwendet: einer, der zu dem (+)-Strang des Ziels komplementär ist, und ein weiterer, der zu dem (–)-Strang des Ziels komplementär ist, die Polymerase ist eine thermostabile Polymerase und die Reaktionstemperatur wird zwischen einer Denaturierungstemperatur und einer Verlängerungstemperatur cyclisiert, wodurch ein markiertes Komplement zu der Zielsequenz durch PCR exponentiell synthetisiert wird (vgl. z. B. PCR Protocols, 1990, Innis et al., Hrsg., Academic Press).
Markierte Polynukleotide oder Polynukleotid-Analoga können auch unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens oder anderer Lösungs- oder Festphasenverfahren chemisch synthetisiert werden. Genaue Beschreibungen der Chemie, die zum Ausbilden von Polynukleotiden durch das Phosphoramiditverfahren verwendet werden, sind an anderer Stelle bereitgestellt (vgl. z. B. Caruthers et al., US-PSen 4,458,066 und 4,415,732, Caruthers et al., 1982, Genetic Engineering 4: 1–17, Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, 1990, Seiten 61 bis 6–22, Applied Biosystems, Teil Nr. 901237).
Das Phosphoramiditverfahren der Polynukleotidsynthese ist wegen seines wirksamen und schnellen Koppelns an einen Festträger das bevorzugte Verfahren. Die Synthese erfolgt mit der wachsenden Polynukleotidkette, die an einen Festträger gebunden ist, so dass ein Überschuss an Reagenzien, die in der flüssigen Phase vorliegen, durch Dekantieren, Filtration, etc. leicht entfernt werden kann, wodurch der Bedarf für Aufreinigungsschritte zwischen Synthesezyklen vermieden wird.
Das Nachstehende beschreibt kurz die Schritte eines typischen Polynukleotidsynthesezyklusses unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens. Zuerst wird ein Festträger, einschließlich eines geschützten Nukleosidmonomers, mit Säure, z. B. Trichloressigsäure, behandelt, um die 5'-Hydroxyl-Schutzgruppe zu entfernen, was die Hydroxylgruppe für eine anschließende Kopplungsreaktion freisetzt. Eine aktivierte Zwischenverbindung wird sodann durch gleichzeitige Zugabe eines geschützten Nukleosidphosphoramidit-Monomers und einer schwachen Säure, z. B. Tetrazol, zu der Reaktion gebildet. Die schwache Säure protoniert das Stickstoffatom des Phosphoramidits, wodurch eine reaktive Zwi schenverbindung ausgebildet wird. Die Nukleosidzugabe ist innerhalb von 30 Sekunden abgeschlossen. Sodann erfolgt ein Capping-Schritt, der jegliche Polynukleotidketten terminiert, die keine Nukleosidaddition durchlaufen haben. Ein Cappen erfolgt vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol. Die Internukleotidbindung wird sodann von dem Phosphit zu dem stabileren Phosphotriester durch Oxidation unter Verwendung von Iod als dem bevorzugten Oxidationsmittel und Wasser als dem Sauerstoffdonor umgewandelt. Nach Oxidation wird die Hydroxyl-Schutzgruppe mit einer protischen Säure, z. B. Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure, entfernt und der Zyklus wird wiederholt, bis die Kettenverlängerung abgeschlossen ist. Nach Synthese wird die Polynukleotidkette von dem Träger unter Verwendung einer Base, z. B. Ammoniumhydroxid oder t-Butylamin, abgespalten. Die Abspaltungsreaktion entfernt auch jegliche Phosphat-Schutzgruppen, z. B. Cyanethylgruppen. Schließlich werden die Schutzgruppen auf den exocyclischen Aminen der Basen und jegliche Schutzgruppen auf den Farbstoffen durch Behandeln der Polynukleotidlösung in einer Base bei einer erhöhten Temperatur, z. B. 55°C, entfernt. Vorzugsweise werden die verschiedenen Schutzgruppen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen mild basischen Bedingungen entfernt.
Jegliche der Nukleosidphosphoramidit-Monomere können Farbstoff-markierte Phosphoramidite sein, wie vorstehend beschrieben. Falls die 5'-terminale Position des Nukleotids markiert wird, kann ein erfindungsgemäßes markiertes nicht nukleotidisches Phosphoramidit während des endgültigen Kondensationsschrittes verwendet werden. Falls die 3'-terminale Position oder eine oder mehrere interne Positionen des Oligonukleotids markiert werden, kann ein erfindungsgemäßes markiertes nukleosidisches Phosphoramidit während eines jeglichen der Kondensationsschritte oder alternativ dazu unter Verwendung der erfindungsgemäßen nicht nukleosidisches Phosphoramidite verwendet werden.
Im Anschluss an die Synthese kann das Polynukleotid bei einer Reihe von Positionen markiert werden, einschließlich des 5'-Endes (vgl. z. B. Oligonucleotides and Analogs, Eckstein, 1990, Hrsg., Kapitel 8, IRL Press, Orgel et al., 1983, Nucleic Acids Research 11 (18): 6513, US-PS 5,118,800 ), des Phosphodiesterrückgrats (vgl. z. B. Orgel et al., supra, bei Kapitel 9) oder des 3'-Endes (vgl. z. B. Nelson, 1992, Nucleic Acids Research 20 (23): 6253–6259, US-PSen 5,401,837, 5,141,813). Für einen gründlichen Überblick von Oligonukleotidmarkierungsverfahren ver gleiche R. Haugland in Excited States of Biopolymers, Steiner Hrsg., Plenum Press, NY (1983).
In einem bevorzugten chemischen Markierungsverfahren nach einer Synthese wird ein Oligonukleotid wie folgt markiert. Ein Farbstoff, der eine verbindende Carboxygruppe umfasst, wird zu dem N-Hydroxysuccinimidester durch Umsetzen mit etwa 1 Äquivalent an 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid und etwa 3 Äquivalenten an N-Hydroxysuccinimid in trockenem Ethylacetat für drei Stunden bei Raumtemperatur umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wird mit 5% HCl gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und zu einem Feststoff einkonzentriert, der in DMSO wieder suspendiert wird. Der-DMSO-Farbstoff-Grundstock wird sodann im Überschuss (10–20 ×) zu einem Aminohexyl-derivatisierten Oligonukleotid in 0,25 M Bicarbonat/Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von 9,4 gegeben und es wird ihm ermöglicht, sich für 6 Stunden umzusetzen, z. B. US-PS 4,757,141 . Das Farbstoff-markierte Oligonukleotid wird von nicht umgesetztem Farbstoff mittels Passage durch eine Größenausschlusschromatographiesäule abgetrennt, wobei mit Puffer, z. B. 0,1 M Triethylaminacetat (TEAA), eluiert wird. Die Fraktion mit dem nicht bearbeiteten markierten Oligonukleotid wird durch HPLC mit reverser Phase unter Verwendung einer Gradientenelution weiter aufgereinigt.
4.6 Kits
In einem letzten Aspekt sind erfindungsgemäß Kits umfasst, die die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffe und/oder markierte Konjugate umfassen. In einer Ausführungsform sind die Kits zum Konjugieren der erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe an andere Moleküle oder Substanzen geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen einen erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierten Farbstoff, einschließlich einer optionalen verbindenden Gruppe, und Puffer, Lösungsmittel, etc., die zum Konjugieren des Farbstoffs an ein anderes Molekül oder eine andere Substanz geeignet sind.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Kits zum Markieren von enzymatisch synthetisierten Polynukleotiden mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen ein erfindungsgemäßes markiertes enzymatisch einbaubares Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon, ein Gemisch aus enzymatisch einbaubaren Nukleosiden/tiden oder Nukleosid/tid-Analoga, die zum Unterstützen einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, und ein polymerisierendes Enzym. Vorzugsweise ist das markierte enzymatisch einbaubare Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon eine Verbindung gemäß der Strukturformel (II oder II.A), am meisten bevorzugt ein markierter Terminator. Bevorzugte polymerisierende Enzyme sind thermostabile Polymerasen wie AMPLITAQ^®DNA-Polymerase FA (PE Biosystems, Foster City, CA).
In einer letzten Ausführungsform sind die Kits zum Markieren von synthetischen Polynukleotiden mit den erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen geeignet. Solche Kits umfassen im Allgemeinen ein erfindungsgemäßes markiertes Phosphoramidit-Reagenz und Synthesereagenzien und/oder Festträger, gegebenenfalls zum Durchführen einer Oligonukleotidsynthese.
4.7 Verfahren, die die erfindungsgemäßen Farbstoff und Reagenzien verwenden
Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe und Konjugate, die die Farbstoffe enthalten, sind für ein jegliches Verfahren gut geeignet, das einen Fluoreszenznachweis verwendet, insbesondere wässrige Anwendungen und Verfahren, die den gleichzeitigen Nachweis von mehreren räumlich überlappenden Analyten erfordern. Die verschiedenen erfindungsgemäßen Farbstoffe und Konjugate sind insbesondere zum Identifizieren von Klassen von Polynukleotiden gut geeignet, die einem biochemischen Auftrennverfahren wie Elektrophorese unterzogen wurden oder die zwischen Stellen in einer räumlich adressierbaren Hybridisierungsanordnung verteilt wurden.
In einer bevorzugten Kategorie von Verfahren, die hierin als "Fragmentanalyse"- oder "genetische Analyse"-Verfahren bezeichnet werden, werden markierte Polynukleotidfragmente über Matrizen-gerichtete enzymatische Synthese unter Verwendung von markierten Primern oder Nukleotiden, zum Beispiel durch Ligation oder Polymerase-gerichtete Primerverlängerung, gebildet. Die Fragmente werden einem größenabhängigen Auftrennverfahren, zum Beispiel Elektrophorese oder Chromatographie, unterzogen und die aufgetrennten Fragmente werden nach der Auftrennung nachgewiesen, zum Beispiel durch Laser-induzierte Fluoreszenz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Klassen von Po lynukleotiden gleichzeitig aufgetrennt und die verschiedenen Klassen werden durch spektral auflösbare Markierungen unterschieden.
Ein solches Fragmentanalyse-Verfahren, das als amplifiziertes Fragmentlängenpolymorphismus-Detektion (AmpFLP) bekannt ist, basiert auf amplifizierten Fragmentlängenpolymorphismen, das heißt, Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen, die durch PCR amplifiziert werden. Diese amplifizierten Fragmente von unterschiedlicher Größe dienen als gekoppelte Marker für ein Verfolgen von Mutantengenen über Familien. Je näher das amplifizierte Fragment zu dem Mutantengen auf dem Chromosom liegt, desto größer ist die Verwandtschaftskorrelation. Da Gene für viele genetische Erkrankungen noch nicht identifiziert wurden, dienen diese Verwandtschaftsmarker dazu, eine Bewertung eines Krankheitsrisikos oder einen Vaterschaftstest zu unterstützen. In der AmpFLP-Technik können die Polynukleotide unter Verwendung eines markierten Polynukleotid-PCR-Primers oder unter Verwendung von markierten Nukleotidtriphosphaten in der PCR markiert werden.
In einem weiteren solchen Fragmentanalyse-Verfahren, das als Nick-Translation bekannt ist, wird eine Reaktion verwendet, um nicht markierte Nukleotide in einem doppelsträngigen (ds) DNA-Molekül mit markierten Nukleotiden zu ersetzen. Freie 3'-Hydroxylgruppen werden innerhalb der dsDNA durch "Nicks", die durch eine Behandlung mit Desoxyribonuclease I (DNAse I) verursacht werden, gebildet. DNA-Polymerase I katalysiert sodann die Addition eines markierten Nukleotids an das 3'-Hydroxyl-Ende des Nicks. Zur gleichen Zeit beseitigt die 5'- zu 3'-Exonucleaseaktivität dieses Enzyms das Nukleotid an dem 5'-Phosphoryl-Ende des Nicks. Ein neues Nukleotid mit einer freien 3'-OH-Gruppe wird an der Position des ursprünglichen ausgeschnitten Nukleotids eingebracht und der Nick wird um eine Nukleotideinheit in die 3'-Richtung verschoben. Diese 3'-Verschiebung wird zu der aufeinander folgenden Addition neuer markierter Nukleotide in die dsDNA führen. Das Nick-translatierte Polynukleotid wird sodann zum Beispiel unter Verwendung eines Auftrennverfahrens wie Elektrophorese analysiert.
Ein weiteres beispielhaftes Fragmentanalyse-Verfahren basiert auf einer variablen Anzahl von Tandem-Wiederholungen oder VNTRs. VNTRs sind Regionen doppelsträngiger DNA, die benachbarte mehrfache Kopien einer bestimmten Sequenz enthalten, wobei die Anzahl von sich wiederholenden Einheiten variabel ist. Beispiele von VNTR-Loci sind pYNZ22, pMCT118 und Apo B. Eine Untergruppe von VNTR-Verfahren sind diejenigen Verfahren, die auf dem Nachweis von Mikrosatelliten-Wiederholungen oder kurzen Tandem-Wiederholungen (STRs) basieren, das heißt Tandem-Wiederholungen von DNA, die durch eine kurze (2–4 Basen) Wiederholungssequenz gekennzeichnet sind. Eine der am häufigsten eingefügten repetitiven DNA-Familien in Menschen ist die (dC-dA)n-(dG-dT)n-Dinukleotid-Wiederholungsfamilie (auch als die (CA)n-Dinukleotid-Wiederholungsfamilie bezeichnet). Es wird angenommen, dass so viel wie 50 000 bis 100 000 (CA)n-Wiederholungsregionen in dem menschlichen Genom, typischerweise mit 15–30 Wiederholungen pro Block, vorhanden sind. Viele dieser Wiederholungsregionen sind bezüglich der Länge polymorph und können folglich als geeignete genetische Marker fungieren. Vorzugsweise, wird bei VNTR- oder STR-Verfahren eine Markierung in die Polynukleotidfragmente unter Verwendung eines markierten PCR-Primers eingebracht.
In einem besonders bevorzugten Fragmentanalyse-Verfahren werden Klassen, die erfindungsgemäß identifiziert werden, hinsichtlich terminaler Nukleotide definiert, so dass eine Übereinstimmung zwischen den vier möglichen terminalen Basen und den Mitgliedern eines Satzes von spektral auflösbaren Farbstoffen hergestellt wird. Solche Sätze werden leicht aus den erfindungsgemäßen Farbstoffen und Energie-Übertragungs-Farbstoffpaaren dadurch zusammengestellt, dass Emissions- und Absorptionsbandbreiten mit käuflich erhältlichen Spektrophotometern gemessen werden. Mehr bevorzugt treten die Klassen in dem Zusammenhang der chemischen oder Kettenterminationsverfahren einer DNA-Sequenzierung auf und am meisten bevorzugt treten die Klassen in dem Zusammenhang der Kettenterminationsverfahren auf, das heißt Didesoxy-DNA-Sequenzierung oder Sequenzierung des Sanger-Typs.
Eine Sequenzierung des Sanger-Typs beinhaltet die Synthese eines DNA-Strangs durch eine DNA-Polymerase in vitro unter Verwendung einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA-Matrize, deren Sequenz bestimmt werden soll. Eine Synthese wird bei einer definierten Stelle eingeleitet, basierend darauf, wo sich ein Oligonukleotid-Primer an die Matrize anlagert. Die Synthesereaktion wird durch Einbau eines Terminators abgestoppt, der eine fortgesetzte DNA-Verlängerung nicht unterstützt. Wenn geeignete Anteile an dNTPs und einem einzigen Terminator, der komplementär zu A, G, C oder T ist, verwendet werden, wird eine Enzym-katalysierte Polymerisation in einer Fraktion der Verlängerungsprodukte an einer jeglichen Stelle abbrechen, an der der Terminator eingebaut wird. Falls markierte Primer oder markierte Terminatoren für jede Reaktion verwendet werden, kann die Sequenzinformation durch Fluoreszenz nach Auftrennung der sich ergebenden Primer-Verlängerungsprodukte durch Elektrophorese mit hoher Auflösung nachgewiesen werden. In dem Kettenabbruchverfahren können erfindungsgemäße Farbstoffe entweder an Sequenzierungsprimer oder Terminatoren gebunden sein. Die Farbstoffe können an eine komplementäre Funktionalität an dem 5'-Ende des Primers, zum Beispiel der Beschreibung in Fung et al., US-PS 4,757,141 folgend, an der Base eines Primers oder an der Base eines Terminators, zum Beispiel über die Alkinylaminogruppe oder andere vorstehend beschriebene verbindende Gruppen, gebunden sein. Konzentrationsbereiche für die verschiedenen Enzyme, Primer, dNTPs und markierten Terminatoren sind diejenigen, die herkömmlicherweise in dem Fachgebiet verwendet werden.
In jedem der vorstehenden Fragmentanalyse-Verfahren werden markierte Verlängerungsprodukte vorzugsweise durch elektrophoretische Verfahren aufgetrennt, z. B. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach, 1981, Rickwood und Hames, Hrsg., IRL Press Limited, London, Osterman, 1984, Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Band 1, Springer-Verlag, Berlin, oder US-PSen 5,374,527, 5,624,800 und/oder 5,552,028. Vorzugsweise ist die Art einer elektrophoretischen Matrix ein quervernetztes oder nicht quervernetztes Polyacrylamid mit einer Konzentration (Gewicht zu Volumen) von etwa 2–20 Gew.-%. Mehr bevorzugt beträgt die Polyacrylamidkonzentration etwa 4–8%. Vorzugsweise umfasst, in dem Zusammenhang mit einer DNA-Sequenzierung, die Elektrophoresematrix ein Denaturierungsmittel, zum Beispiel Harnstoff, Formamid und dergleichen. Genaue Verfahren zum Herstellen solcher Matrizes sind in Maniatis et al., 1980, "Fractionation of Low Molecular Weight DNA and RNA in Polyacrylamide Gels Containing 98% Formamide or 7 M Urea", Methods in Enzymology, 65: 299–305, Maniatis et al., 1975, "Chain Length Determination of Small Double- and Single-Stranded DNA Molecules by Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Biochemistry, 14: 3787–3794, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 179–185, und ABI PRISM^TM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, Januar 1995, Kapitel 2 (p/n 903433, The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA), beschrieben. Die optimalen Elektrophoresebedingungen, zum Beispiel Polymerkonzentration, pH-Wert, Temperatur, Konzentration des Denaturierungsmittels, die in einer bestimmten Auftrennung verwendet werden, hängen von vielen Faktoren ab, einschließlich unter anderem des Größenbereichs der zu trennenden Nuk leinsäuren, deren Basenzusammensetzungen, ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind, und der Art der Klassen, für die eine Information durch Elektrophorese gesucht wird. Demzufolge kann eine Anwendung der Erfindung ein vorausgehendes Standardtesten zur Optimierung von Bedingungen für bestimmte Auftrennungen erfordern.
Nach einer elektrophoretischen Auftrennung werden die markierten Verlängerungsprodukte dadurch nachgewiesen, dass die Fluoreszenzemission von den Markierungen gemessen wird. Um einen solchen Nachweis durchzuführen, werden die markierten Produkte durch Standardmittel, zum Beispiel Quecksilberlampen von hoher Intensität, Laser oder dergleichen, bestrahlt. Die Bestrahlungswellenlänge wird von den spektralen Eigenschaften der spezifischen Markierung abhängen. Vorzugsweise ist das Bestrahlungsmittel ein Laser mit einem Bestrahlungsstrahl bei einer Wellenlänge von mehr als 620 nm. Da die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe im Allgemeinen Strahlung in dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums absorbieren und emittieren, ist mehr bevorzugt das Bestrahlungsmittel ein 633-Festkörper-HeNe-Laser bei 638 nm. Mehrere Argon-Ionen-Laser sind käuflich erhältlich, die gleichzeitig bei diesen Linien kohärente Strahlung erzeugen, zum Beispiel Cyonics, Ltd. (Sunnyvale, Kalifornien) Modell 2001, oder dergleichen. Die Fluoreszenz wird sodann durch ein strahlungsempfindliches Nachweisgerät, zum Beispiel einen Photomultiplier, eine ladungsgekoppelte Vorrichtung oder dergleichen, nachgewiesen. Beispielhafte Elektrophoresenachweissysteme sind an anderer Stelle beschrieben, zum Beispiel US-PSen 5,543,026, 5,274,240, 4,879,012, 5,091,652 und 4,811,218.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Primer nicht markiert und die Sequenzierungsreaktion umfasst zusätzlich zu der Polymerase und dem Gemisch aus dNTPs ein Gemisch aus vier unterschiedlichen Terminatoren, wobei einer komplementär zu A ist, einer komplementär zu G ist, einer komplementär zu C ist und einer komplementär zu T ist. Jeder der unterschiedlichen Terminatoren ist mit einem unterschiedlichen spektral auflösbaren Farbstoff markiert. Einer der Terminatoren ist mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff markiert. Da jeder der markierten Terminatoren bei einer unterschiedlichen Wellenlänge fluoresziert, wird nach einer Auftrennung auf Größenbasis die Identität des 3'-terminalen Nukleotids jedes Verlängerungsprodukts durch die Wellenlänge (oder Farbe) der Markierung identifiziert. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann jede der unterschiedlichen spektral auflösbaren Markierungen unter Verwendung einer einzigen Strahlungsquelle angeregt werden. Ein Satz solcher bevorzugten markierten Terminatoren wird in dem Abschnitt "Beispiele" bereitgestellt. Andere Sätze werden von den spektralen Anregungs- und Emissionseigenschaften der verschiedenen Markierungen, der beschriebenen Mobilitätsverschiebung, etc. abhängen und werden leicht erhalten, wie hierin beschrieben.
Die Erfindung wurde beschrieben und die nachstehenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen und nicht zu begrenzen.
5. BEISPIEL: Verbindungssynthesen
Dieses Beispiel stellt Syntheseverfahren für bestimmte beispielhafte erfindungsgemäße Verbindungen bereit.
5.1. Synthese von 4-(Hydroxymethyl)-1,3-benzoldisulfonsäuredinatriumsalz (Verbindung 42)
4-Formyl-1,3-benzoldisulfonsäuredinatriumsalzhydrat (41 von Aldrich Chemical Co.) (15 g) wurde in Methanol (300 ml) gelöst, gefolgt von der langsamen Zugabe von Natriumborhydrid (1,5 g). Der Lösung wurde ermöglicht, über Nacht zu rühren. Ein weißes Präzipitat wurde abgefiltert und der Überstand wurde zur Trockne unter vermindertem Druck verdampft, was 41 als einen weißen Feststoff (15,5 g) ergab. Die NMR (D₂O) zeigte ein Singulett bei 4,95 ppm, entsprechend zu den benzylischen Methylenprotonen, und das Fehlen eines Singuletts bei 10,6 ppm, entsprechend zu dem Aldehydproton.
5.2 Synthese von 4-(Brommethyl)-1,3-benzoldisulfonsäuredinatriumsalz (Verbindung 43)
4-(Hydroxymethyl)-1,3-benzoldisulfonsäuredinatriumsalz (42 des Vorstehenden) (8 g) und Lithiumbromid (3 g) wurden in 48% Bromwasserstoffsäure (95 g) gelöst und bei 80°C 12 Stunden erhitzt. Das unlösliche Material wurde filtriert und der Überstand wurde zur Trockne unter vermindertem Druck verdampft. Der sich ergebende weiße Feststoff wurde in 300 ml Aceton refluxiert und das unlösliche Material wurde abgefiltert. Die Aceton-lösliche Fraktion wurde zur Trockne unter vermindertem Druck verdampft, was ein Gemisch von 42 und 43 als einen lohfarbenen Feststoff (3,2 g) ergab. Die NMR (D₂O) zeigte ein Singulett bei 4,95 ppm, entsprechend zu den benzylischen Hydroxymethylmethylenprotonen von 42, und ein Singulett bei 4,90 ppm, entsprechend zu den benzylischen Brommethylmethylenprotonen von 43. Ein Integrieren der Protonensignale zeigte, dass das Verhältnis von Hydroxylmethylmethylenprotonen von 42 zu Brommethylmethylenprotonen von 43 1 : 2 betrug.
5.3 Synthese von N-Benzyl-alkyliertem 2,3,3-Trimethylbenz(e)indolenin Verbindung 58)
2,3,3-Trimethylbenz(e)indolenin 57 (Aldrich Chemical) (1 g, 0,004785 mol) wurde mit zwei Äquivalenten an 2,4-Disulfobenzylbromid 43 (3,2 g, 0,00957 mol) in 3 ml wasserfreiem Nitrobenzol gemischt. Nach Erhitzen unter Rühren bei 190°C für 30 Minuten unter einer Argonatmosphäre wurde die Reaktion abgekühlt und Ether wurde zugesetzt, um die nicht bearbeitete 1-(2,4-Disulfobenzyl)-2,3,3-tri methylbenz(e)indolenin-Zwischenverbindung 55 zu präzipitieren. Die nicht bearbeitete Verbindung 55 wurde durch Suspension in Methanol und Präzipitation mittels Diethylether wieder kristallisiert. Die reine Verbindung 58 wurde sodann durch Filtration isoliert und in einem Vakuumofen getrocknet, um einen lohfarbenen Feststoff (1 g, 39%ige Ausbeute) zu ergeben.
5.4 Synthese von N-Hexanoat-alkyliertem 2,3,3-Trimethylbenz(e)indolenin (Verbindung 53)
2,3,3-Trimethylbenz(e)indolenin 57 (4 g, 0,0159 mol) wurde mit 1 Äquivalent an 6-Bromhexansäure 43 (3,1 g, 0,0159 mol) in 8 ml wasserfreiem Nitrobenzol gemischt. Die Reaktion wurde erhitzt (120°C) und 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt, die Reaktion wurde abgekühlt und Ether wurde zugegeben, um das nicht bearbeitete 1-(6-Carboxyhexyl)-2,3,3-Trimethylbenz(e)indolenin 59 zu präzipitieren. Die nicht bearbeitete Verbindung 59 wurde durch Suspension in Ethanol und Präzipitation mittels Diethylether wieder kristallisiert. Die reine Verbindung 59 wurde sodann durch Filtration isoliert und in einem Vakuumofen getrocknet, um 5,02 g als einen cremefarbenen Feststoff (71%ige Ausbeute) zu ergeben.
5.5 Synthese der Cyanin-Farbstoff-Zwischenverbindung 20
Die N-Hexyl-6-carboxylat-modifizierte Indolenin-Zwischenverbindung 59 (1,2 g, 0,00341 mol) wurde mit 1,2 Äquivalenten an Malonaldehydbis(phenylimin)monohydrochlorid (Aldrich Chemical) (1,05 g, 0,0041 mol) in 15 ml Essigsäureanhydrid gemischt. Nach 1,5-stündigem Refluxieren wurde die Reaktion abgekühlt und Diethylether wurde zugegeben, um die Zwischenverbindung 20 in quantitativer Ausbeute als einen lohfarbenen Feststoff zu präzipitieren.
5.6 Synthese des mobilitätsmodifizierenden Cyanin-Farbstoffs MM-Cy5 (Verbindung 21)
Die Zwischenverbindung 20 (100 mg, 0,000174 mol) wurde mit einem Äquivalent an 1-(2,4-Disulfobenzyl)-2,3,3-trimethylbenz(e)indolenin-Zwischenverbindung 58 (94 mg, 0,000174 mol), 2 Äquivalenten an trockenem Triethylamin (49 μl) und 5 ml trockenem Ethanol gemischt. Nach 30-minütigem Rühren unter Refluxieren wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und der nicht bearbeitete mobilitätsmodifizierende Farbstoff 21 wurde mit Diethylether präzipitiert. Der Farbstoff 21 wurde durch Chromatographie auf Silicagel aufgereinigt, wobei mit Methanol : CH₂Cl₂ (1 : 4) eluiert wurde, gefolgt von nochmaliger Kristallisation aus Metha nol/Diethylether, um 57 mg an Farbstoff 21 als dunkelblaues Pulver (40%ige Ausbeute) zu ergeben.
5.7 Synthese des MM-Cy5-NHS-Esters (Verbindung 22)
Der mobilitätsmodifizierende Cyaninfarbstoff 21 (30 mg, 0,00003674 mol) 2 ml an trockenem Dimethylformamid, 6 Äquivalente an Diisopropylethylamin (40 μl) und 15 Äquivalente an O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetraxnethyluroniumtetrafluoroborat wurden bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt. Die Reaktion wurde mit 5% HCl abgestoppt, dreimal mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und konzentriert, um den nicht bearbeiteten NHS-Ester 22 als einen blauen Feststoff zu ergeben. Der NHS-Ester 22 wurde durch Chromatographie auf Silicagel aufgereinigt, wobei mit Methanol/CH₂Cl₂/AcOH (15 : 85 : 0,1) eluiert wurde. Der aufgereinigte NHS-Ester 22 wurde sodann aus Methanol/Diethylether wieder kristallisiert, was ein dunkelblaues Pulver (27 mg, 80%ige Ausbeute) ergab.
5.8 Synthese von 7-Propargylamino-ddATP (Verbindung 23)
7-Propargylamino-ddATP 23 wurde gemäß den in der US-PS 5,151,507 beschriebenen Verfahren synthetisiert.
5.9 Synthese des MM-Cy5-markierten Terminators 7-Deaza-ddATP (Verbindung 24)
Die Verbindung 23 (10 μl einer 30 mM Lösung in 100 mM TEA-Bicarbonat, pH-Wert von 7,0) wurde zur Trockne verdampft. Sie wurde sodann in 50 μl 250 mM Bicarbonat-Puffer (pH-Wert von 9,0) wieder suspendiert. Eine Lösung des NHS-Esters 22 (5 μl einer Stammlösung von 5 mg/60 μl in Dimethylsulfoxid) wurde hinzugegeben und im Dunkeln über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC (AX-300 Anionenaustauscher) aufgereinigt. Die Fraktionen, die dem markierten Terminator 24 entsprachen, wurden einkonzentriert und durch HPLC (C-8 reverse Phase) wieder aufgereinigt. Das Endprodukt wurde unter vermindertem Druck getrocknet und mit 250 mM CAPSO, pH-Wert von 9,6, verdünnt.
5.10 Synthese von zusätzlichen Farbstoff-markierten Terminatoren
Die nachstehenden zusätzlichen Terminatoren wurden unter Verwendung von Synthesestrategien synthetisiert, die zu den vorstehend zusammengefassten ähnlich sind. Die Benzorhodamin-NHS-Ester-Vorläufer wurden wie in der US-PS 5,936,087 beschrieben synthetisiert. Die erweiterten Rhodamin-NHS-Ester-Vorläufer wurden wie in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung Nr. 09/325,243, eingereicht am 17. November 1998, beschrieben synthetisiert. Die verschiedenen Linker-modifizierten ddNTPs wurden wie in der US-PS 5,821,356 und/oder 5,770,716 beschrieben synthetisiert.
6. BEISPIEL: Terminatoren, die mit erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffen markiert sind dienen als Substrate für polymerisierende Enzyme
Die Terminatoren 25, 26, 27, 27, 29, 30, 31, 32, 33 und 34 wurden verwendet, um Sequenzierungsfragmente gemäß dem Protokoll herzustellen, das in der US-PS 5,948,648 (Beispiel 12) oder US-PS 5,847,162 (Beispiele 8 bis 10) beschrieben ist. Mobilitätsmodifizierende Terminatoren 29 und 32 behielten hohe biologische Aktivität bei, wie es durch deren wirksamen Einbau in die terminierten Fragmente belegt wurde.
7. BEISPIEL: Die erfindungsgemäßen mobilitätsmodifizierenden Farbstoffe verschieben die relativen elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotiden
7.1 Experimentelles Protokoll
Die Sequenzierungsfragmente, die aus den Sequenzierungsreaktionen in dem vorstehenden Beispiel hergestellt wurden, wurden auf einen ABI PRIZM^®310 genetischen Analysegerät (PE Biosystems, Foster City, CA), das mit einem Rotlaser modifiziert war, eingesetzt und gemäß dem Herstellerprotokoll oder den in der US-PS 5,948,648 oder 5,847,162 beschriebenen Protokollen elektrophoretisch aufgetrennt.
7.2 Ergebnisse
Die elektrophoretischen Mobilitäten von Fragmenten, die mit den Cyanin-Farbstoffen markiert waren, in Relation zu denjenigen, die mit den Rhodamin-Farbstoffen markiert waren, sind in der nachstehenden TABELLE 1 tabellarisch dargestellt. In der Tabelle bezeichnet eine positive (+) Verschiebung Fragmente, die schneller als die Standards wanderten. Eine negative (–) Verschiebung bezeichnet Fragmente, die langsamer als die Standards wanderten.
TABELLE 1 Relative Mobilitäten von Farbstoff-markierten Sequenzierungsfragmenten Relative Mobilitäten (Baseneinheiten)
Wie in TABELLE 1 gezeigt, wandern Fragmente, die aus monosulfonierten Benzocyanin-Farbstoff-markierten Terminatoren 25 (ddA), 30 (ddG) und 34 (ddU) hergestellt wurden, zwei oder mehrere Basen langsamer während einer Elektrophorese relativ zu DNA-Fragmenten, die aus Dibenzorhodamin-Farbstoff( US-PS 5,936,087 )-markierten Terminatoren 26 (ddG), 27 (ddA), 23 (ddG) und 31 (ddC) oder erweitertem Rhodamin-Farbstoff(US-Anmeldung Nr. 09/325,243, Anwaltaktenzeichen: 4446)-markierten Terminator 33 (ddU) hergestellt wurden. Ein erfindungsgemäßes Mobilitätsmodifizieren des monosulfonierten Farbstoffs durch Ersetzen der Monosulfonatgruppe durch eine bissulfonierte mobilitätsmodifizierende Gruppe erhöht die relativen elektrophoretischen Mobilitäten von Polynukleotidfragmenten, die mit dem mobilitätsmodifizierenden Farbstoff markiert sind, um eine Base, wie durch die markierten Fragmente gezeigt, die mit den Terminatoren 24 (ddA), 29 (ddG) und 32 (ddC) hergestellt wurden.

Claims

Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff der Struktur
oder ein Salz davon, worin: k, l und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 1 sind, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Halogenatom, -CN-, -CF₃-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₅-C₁₄)-Aryl- und 5- bis 14-gliedriger Heteroarylgruppe oder, wenn k und m 1 sind und 10 ist, sodann -CR₁=CR₂-CR₅=CR₅-CR₇= auch eine cyclische Alkenbrücke
sein kann, worin R¹⁰ und R^10' jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, O, Halogenatom, -CN-, -CF₃-, -OR-, -SR-, -NRR-, (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₆-C₁₄)-Aryl- oder 5–14-gliedriger Heteroarylgruppe, wobei jede R-Gruppe unabhängig H oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist, und p eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, wobei die gestrichelten Linien bei den Substituenten R^10' Bindungen darstellen, die unabhängig voneinander entweder Einzelbindungen oder Doppelbindungen sein können, abhängig von den Identitäten der Substituenten, MM eine mobilitätsmodifizierende Gruppe mit 2 bis 7 anionischen Substituenten ist, L ein Linker ist, LG eine verbindende Gruppe ist, Z und Z' jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus S, O, Se und CR⁸R⁹, worin R⁸ und R⁹, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe sind oder, wenn zusammengenommen, eine (C₄-C₅)-Alkyleno- oder (C₄-C₅)-Alkanogruppe sind, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹ und R²², wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, einer (C₁-C₆)-Alkylgruppe, (C₁-C₆)-Alkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 2–6-gliedriger Heteroalkylgruppe, 2–6-gliedriger Heteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, (C₅-C₁₀)-Arylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, (C₅-C₆)-Arylarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Arylheteroalkylgruppe, 6–16-gliedriger Arylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5–10-gliedriger Heteroarylgruppe, 5–10-gliedriger Heteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 5–6-gliedriger Heteroarylheteroarylgruppe, 5–6-gliedriger Heteroarylheteroarylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehrere W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Heteroarylalkylgruppe, 6–16-gliedriger Heteroarylalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–16-gliedriger Heteroarylheteroalkylgruppe und 6–16-gliedriger Heteroarylheteroalkylgruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, oder, wenn mit einer benachbarten Rⁿ-Gruppe zusammengenommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer (C₆-C₁₀)-Arylenogruppe, (C₆-C₁₀)-Arylenogruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, 6–10-gliedriger Heteroarylenogruppe und 6–10-gliedriger Heteroarylenogruppe, die unabhängig mit einer oder mehreren W-Gruppen substituiert ist, jede W-Gruppe unabhängig eine R-, X-, =O-, -OR-, =S-, -SR-, -NRR-, =NR-, (C₁-C₆)-Perhalogenalkyl-, -CX₃-, -CN-, -OCN-, -SCN-, -NO-, -NO₂-, =N₂-, -N₃-, -NHOH-, -S(O)₂R-, -C(O)R-, -C(S)R-, -C(O)OR'-, -C(S)OR'-, -C(O)SR'-, -C(S)SR'- und -C(NR)NRR-Gruppe ist, worin: jede X-Gruppe unabhängig ein Halogenatom ist, jede R-Gruppe unabhängig H, eine -NR''R''-, -C(O)R''-, -S(O₂)R''-, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₃)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist und jede R'-Gruppe unabhängig eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl- und (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist, und jede R''-Gruppe unabhängig H, eine (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Aryl-, (C₆-C₁₆)-Arylalkylgruppe, 5–10-gliedrige Heteroarylgruppe oder 6–16-gliedrige Heteroarylalkylgruppe ist.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, in dem MM die Struktur:
aufweist, oder ein Salz davon, worin: n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einem stark anionischen Substituenten, einer -S(O)₂O^–- und -OS(O)₂O^–-Gruppe oder R²⁴ und R²⁵, wenn zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe sind, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -OS(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist, oder R²⁵ und R²⁶, wenn zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe sind, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -OS(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist, oder R²⁶ und R²⁷, wenn zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe sind, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂-O^–- oder -OS(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist, oder R²⁷ und R²⁸, wenn zusammengenommen, eine Benzogruppe oder eine Benzogruppe sind, die mit einem oder mehreren stark anionischen Substituenten, -S(O)₂O^–- oder -OS(O)₂O^–-Gruppen unabhängig substituiert ist.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, in dem MM die Struktur:
aufweist, oder ein Salz davon, worin: o eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, q eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, R²⁹ ein stark anionischer Substituent, eine -S(O)₂O^–- oder -OS(O)₂O^–-Gruppe ist, jede R³⁰-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, einem stark anionischen Substituenten, einer -S(O)₂O^–- und -OS(O)₂O^–-Gruppe, und R³¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, einem stark anionischen Substituenten, einer -S(O)₂O^–-, -OS(O)₂O^–- und -CH₃-Gruppe.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, in dem Z CR⁸R⁹ ist, worin R⁸ und R⁹ jeweils unabhängig voneinander (C₁-C₆)-Alkanogruppen sind, und Z' CR^8'R^9' ist, worin R^8' und R^9' jeweils unabhängig voneinander (C₁-C₆)-Alkanogruppen sind.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 4, wobei Z und Z' jeweils C(CH₃)₂-Gruppen sind.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, wobei L ausgewählt ist aus C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, C₅-C₂₀-Aryldiyl-, substituierter C₅-C₂₀-Aryldiyl-, C₆-C₂₆-Arylalkyldiyl- und substituierter C₆-C₂₆-Arylalkyldiylgruppe.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, wobei k und l 1 sind und m 0 ist und R₁, R₂, R₃, R₄ und R₇ jeweils H sind.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 7, wobei L -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂- (eine Pentanogruppe) ist.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 7, wobei L ein Polyether ist.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 9, wobei der Polyether ein Palyalkylenglykol ist.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, wobei LG ausgewählt ist aus Biotin-, Carbonsäure-, Ester-, Sulfonat-, Acylhalogenid-, Alkylhalogenid-, Sulfonylhalogenid-, Maleimid-, Azid-, Amin-, Hydroxyl-, Thiol- und Phosphoramiditgruppe.
Mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

oder ein Salz davon, worin: R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁹, R²⁰, R²¹, R²², R³⁰, R³¹, R³², R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶ und R³⁷ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einer -S(O)₂O^–- und -OS(O)₂O^–-Gruppe.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon der Struktur: NUC-L'-R⁴¹-L-D oder ein Salz davon, worin: D ein mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1 mit der Struktur:
ist, L ein erster Linker ist, ausgewählt aus C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, C₅-C₂₀-Aryldiyl-, substituierter C₅-C₂₀-Aryldiyl-, C₆-C₂₆-Arylalkyldiyl- und substituierter C₆-C₂₆-Arylalkyldiylgruppe, worin L an das Stickstoffatom von D an der gestrichelten Linie gebunden ist, R⁴¹ eine kovalente Bindung ist, NUC ein Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon ist und L' ein zweiter Linker ist, der an die Nukleobasen- oder Zuckergruppe von NUC gebunden ist.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon nach Anspruch 13, das enzymatisch einbaubar ist.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon nach Anspruch 13, das ein Terminator ist.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon nach Anspruch 13, das enzymatisch verlängerbar ist.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon nach Anspruch 13, in dem NUC-L'- zusammengenommen die Struktur:
aufweist, oder ein Salz davon, worin: B eine Nukleobase ist, L' eine (C₁-C₂₀)-Alkyldiyl-, (C₁-C₂₀)-Alkyleno-, (C₂-C₂₀)-Alkino-, (C₂-C₂₀)-Alkenogruppe, 2–20-gliedrige Heteroalkyldiylgruppe, 2–20-gliedrige Heteroalkylenogruppe, 2–20-gliedrige Heteroalkinogruppe oder 2–20-gliedrige Heteroalkenogruppe ist, R⁷⁰ und R⁷¹, wenn für sich genommen, jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einer Hydroxylgruppe und einer Gruppe, die eine Polymerase-vermittelte Matrizen-gerichtete Polymerisation blockiert, oder, wenn zusammengenommen, eine Bindung derart bilden, dass der dargestellte Zucker eine 2',3'-Didehydroribose ist, und R⁷² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl-, Monophosphat-, Diphosphat-, Triphosphatgruppe und einem Phosphatesteranalogon.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon nach Anspruch 17, in dem L' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -C≡CCH₂-, wobei das terminale sp-Kohlenstoffatom kovalent an die Nukleobase B gebunden ist und das terminale Methylen (sp³)-Kohlenstoffatom kovalent an R⁴¹ gebunden ist, und -C≡C-CH₂OCH₂CH₂NR⁴⁷R⁴⁸-, wobei R⁴⁷ H oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist und R⁴⁸ eine -C(O)(CH₂)_r-, -C(O)CHR⁴⁹-, -C-C(O)C≡CCH₂- oder -C(O)-Φ-(CH₂)_r-Gruppe ist, worin jedes r unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist und Φ eine C₆-Aryldiylgruppe oder eine 6-gliedrige Heteroaryldiylgruppe ist und R⁴⁹ H, eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe oder eine Seitenkette einer kodierenden oder nicht-kodierenden Aminosäure ist, und wobei das terminale sp-Kohlenstoffatom kovalent an die Nukleobase B gebunden ist und die andere terminale Gruppe kovalent an R⁴¹ gebunden ist.
Markiertes Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon nach Anspruch 17, in dem die Nukleobase B ein Purin, ein 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon einer normalen Nukleobase ist.
Mobilitätsmodifizierendes Phosphoramiditreagens der Struktur:
oder ein Salz davon, worin: N, O und P Stickstoff-, Sauerstoff- bzw. Phosphoratome sind, D ein mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1 oder ein. geschütztes Derivat davon mit der Struktur:
ist, L ein erster Linker ist, ausgewählt aus C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, C₅-C₂₀-Aryldiyl-, substituierter C₅-C₂₀-Aryldiyl-, C₆-C₂₆-Arylalkyldiyl- und substituierter C₆-C₂₆-Arylalkyldiylgruppe, worin L an das Stickstoffatom von D an der gestrichelten Linie gebunden ist, R⁴¹ eine Bindung oder eine kovalente Bindung ist, L'' eine Bindung oder ein zweiter Linker ist, R⁶⁰ eine Phosphitesterschutzgruppe ist, R⁶¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₃-C₁₀)-Cycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Aryl- und (C₆-C₂₆)-Arylalkylgruppe oder, wenn mit R⁶² zusammengenommen, eine geradkettige oder verzweigte (C₂-C₁₀)-Alkylenogruppe oder eine geradkettige oder verzweigte 2–10-gliedrige Heteroalkylenogruppe bildet und R⁶², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₃-C₁₀)-Cycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Aryl- und (C₆-C₂₆)-Arylalkylgruppe oder, wenn mit R⁶¹ zusammengenommen, eine geradkettige oder verzweigte (C₂-C₁₀)-Alkylenogruppe oder eine geradkettige oder verzweigte 2–10-gliedrige Heteroalkylenogruppe bildet.
Mobilitätsmodifizierendes Phosphoramiditreagens nach Anspruch 20, das die Struktur:
aufweist, worin: N, P und O Stickstoff-, Phosphor- bzw. Sauerstoffatome sind, R⁴¹, L, D, R⁶⁰, R⁶¹ und R⁶² wie vorstehend definiert sind, R⁶³ H oder eine säurelabile Hydroxylschutzgruppe ist und ν eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist.
Mobilitätsmodifizierendes Phosphoramiditreagens der Struktur:
oder ein Salz davon, worin: O, P und N Sauerstoff-, Phosphor- bzw. Stickstoffatome sind, B eine Nukleobase oder ein geschütztes Derivat davon ist, D ein mobilitätsmodifizierender Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1 oder ein geschütztes Derivat davon mit der Struktur:
ist, L ein erster Linker ist, ausgewählt aus C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, substituierter C₁-C₁₂-Heteroalkyldiyl-, C₅-C₂₀-Aryldiyl-, substituierter C₅-C₂₀-Aryldiyl-, C₆-C₂₆-Arylalkyldiyl- und substituierter C₆-C₂₆-Arylalkyldiylgruppe, worin L an das Stickstoffatom von D an der gestrichelten Linie gebunden ist, R⁴¹ eine Bindung oder eine kovalente Bindung ist, L' eine Bindung oder ein zweiter Linker ist, R⁶⁰ eine Phosphitesterschutzgruppe ist, R⁶¹, wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Aryl- und (C₆-C₂₆)-Arylalkylgruppe oder, wenn mit R⁶² zusammengenommen, eine geradkettige oder verzweigte (C₂-C₂₀)-Alkylenogruppe oder eine geradkettige oder verzweigte 2–10-gliedrige Heteroalkylenogruppe bildet und R⁶², wenn für sich genommen, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₁-C₆)-Alkanyl-, (C₂-C₆)-Alkenyl-, (C₂-C₆)-Alkinyl-, (C₃-C₁₀)-Cycloalkyl-, (C₅-C₂₀)-Aryl- und (C₆-C₂₆)-Arylalkylgruppe oder, wenn mit R⁶¹ zusammengenommen, eine geradkettige oder verzweigte (C₂-C₁₀)-Alkylenogruppe oder eine geradkettige. oder verzweigte 2–10-gliedrige Heteroalkylenogruppe bildet, und R⁶³ H oder eine säurelabile Hydroxylschutzgruppe ist.
Mobilitätsmodifizierendes Phosphoramiditreagens nach Anspruch 22, in dem R⁴¹ die Struktur -C(O)NR⁵⁶- aufweist, worin R⁵⁶ H oder eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist.
Polynukleotid, das mit einem mobilitätsmodifizierenden Farbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
Markiertes Polynukleotid, das durch das Verfahren eines Umsetzers eines mobilitätsmodifizierenden Farbstoffs nach Anspruch 1, wobei LG eine N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Gruppe ist, mit einem Amino-derivatisierten Polynukleotid hergestellt wird.
Verfahren zum Herstellen eines markierten Primer-Verlängerungs-Produkts, umfassend den Schritt einer enzymatischen Verlängerung eines Primer-Ziel-Hybrids in Gegenwart eines Gemisches von enzymatisch verlängerbaren Nukleotiden, die zur Förderung einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, und eines Terminators, wobei der Primer oder der Terminator mit einem mobilitätsmodifizierenden Farbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 26, in dem der Terminator ein Gemisch von vier verschiedenen Terminatoren ist, von denen einer bei einer Matrize A terminiert, einer bei einer Matrize G terminiert, einer bei einer Matrize C terminiert und einer bei einer Matrize T oder U terminiert, und wobei mindestens einer der Terminatoren mit einem mobilitätsmodifizierenden Farbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27, in dem jeder der vier verschiedenen Terminatoren mit einem unterschiedlichen, spektral-auflösbaren Fluorophor markiert ist und einer der Terminatoren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 29 und Verbindung 32.
Kit zum Herstellen eines markierten Primer-Verlängerungs-Produkts, umfassend enzymatisch verlängerbare Nukleotide, die zum Fördern einer kontinuierlichen Primer-Verlängerung fähig sind, und einen Terminator, wobei der Primer oder der Terminator mit einem mobilitätsmodifizierenden Cyaninfarbstoff nach Anspruch 1 markiert ist.
Kit nach Anspruch 29, in dem der Terminator einen Satz von vier unterschiedlichen mobilitätsmodifizierten Terminatoren ist, wobei einer bei einer Matrize A terminiert, einer bei einer Matrize G terminiert, einer bei einer Matrize C terminiert und einer bei einer Matrize T oder U terminiert.
Kit nach Anspruch 29, in dem der Satz an vier unterschiedlichen Terminatoren ein Satz von mobilitätsabgestimmten Terminatoren ist.
Kit nach Anspruch 29, in dem der Satz an mobilitätsabgestimmten Terminatoren eine Verbindung ausgewählt aus Anspruch 12 umfasst.