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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Immunerkrankungen. Insbesondere
betrifft die Autoimmunerkrankungen, allergische Erkrankungen und Transplantationsabstoßung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
immunologische Toleranz von eigenen Antigenen ist ein notwendiger
Mechanismus, um einen Organismus vor der Zerstörung durch das eigene Immunsystem
zu schützen.
Wenn dieser Mechanismus versagt, wodurch die Proliferation selbstreaktiver
Immunzellen ermöglicht
wird, entwickelt sich im Wirt eine autoimmune Erkrankung. Es hat
sich gezeigt, daß viele
dieser Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Lupis, Myathania Gravis
und rheumatoide Arthritis, das Ergebnis des Verlusts der Selbst-Toleranz in T- und
B-Lymphozyten sind.
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Der
Fas-Ligand (CD95L) spielt eine wesentliche Rolle sowohl bei der
[1] [2] und Effektorfunktion [3] des Immunsystems sowie bei der
Aufrechterhaltung des immunulogischen Privilegs [4] [5] [6–8]. T-Lymphozyten verwenden
CD95L zur Induktion der Apoptose in Zielzellen und werden ebenfalls
nach einer Antigenstimulation durch die Prozesse des aktivierungsinduzierten
Zelltods (AICD) für
CD95L empfänglich.
[9] [10] T-Lymphozyten,
die mit eigenen Proteinen reagieren, spielen eine wesentliche Rolle
bei der autoimmunen Pathologie. Es wurden beispielsweise auf Myelin
reaktive T-Zellen in Patienten mit Multipler Sklerose gezeigt [12]
[13] [14] und bei der experimentellen autoimmunen Encephelomyelitis wurde
gezeigt, daß Maus-
und Rattenmodelle sowohl pathogen sind als auch die Erkrankung zwischen syngenen
Tieren übertragen
können
[15–18]
Möglichkeiten
zur Senkung einer Immunantwort auf ein Antigen durch Verwendung
einer Kombination aus Antigen und derivatisierten Aminosäuren sind
bekannt [28]. Die Induktion von T-Zelltoleranz gegen Antigene, die
von Antigen-präsentierenden
Zellen durch Expression von Fast auf diesen Zellen exprimiert werden,
ist bekannt [29].
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Es
besteht ein fortdauernder Bedarf im Stand der Technik nach zusätzlichen
Vorrichtungen zur Behandlung autoimmuner Erkrankungen, wie beispielsweise
allergischen Erkrankungen und Transplantationsabstoßung.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegende Erfindung, Zusammensetzungen zur
Vermeidung oder Senkung einer pathologischen Immunantwort, wie beispielsweise
einer autoimmunen Antwort, einer allergischen Antwort oder einer
Transplantationsabstoßung,
zur Verfügung
zu stellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen
von Nanokügelchen,
Antigen-präsentierenden
Zellen, Nukleinsäureexpressionsvektoren
oder Liposomen zur Verfügung zu
stellen, die bei einer Verhinderung oder Senkung einer Immunantwort
nützlich
sind.
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Diese
und andere erfindungsgemäße Aufgaben
werden durch zur Verfügungstellung
von Nukleinsäurezusammensetzungen
erreicht. Die Nukleinsäure
codiert für
ein erstes und ein zweites Protein, welche ein Molekül bilden,
das die Apoptose oder Inaktivierung von T-Zellen beziehungsweise
einem pathogenen Antigen induziert. Antigen-präsentierende Zellen
exprimieren sowohl das erste als auch das zweite Protein. Antigen-spezifische
T-Zellen werden von Antigen-präsentierenden
Zellen aktiviert, die das pathogene Antigen exprimieren. Aktivierte
Antigen-spezifische
T-Zellen werden von dem ersten Protein, das von den Antigen-präsentierenden
Zellen exprimiert wird, abgetötet
oder inaktiviert. Somit kann eine Immunantwort auf das Antigen verhindert
werden.
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Es
werden auch Nanokügelchen
zur Verfügung
gestellt, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül, das für ein ersten und ein zweites
Protein codiert, umfassen. Das erste Protein induziert die Apoptose oder
Inaktivierung von T-Zellen
und das zweite Protein umfaßt
ein pathogenes Antigen. Das pathogene Antigen ist in der Lage, Antigen-spezifische
T-Zellen zu aktivieren. Das erste Protein ist in der Lage, aktivierte
Antigen-spezifische T-Zellen
abzutöten
oder zu inaktivieren.
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Mit
der vorliegenden Erfindung wird auch eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt,
die ein Liposom mit mindestens einem Nukleinsäuremolekül, das für ein erstes und ein zweites
Protein codiert, umfaßt.
Das erste Protein induziert die Apoptose oder Inaktivierung von
T-Zellen und das
zweite Protein umfaßt
ein pathogenes Antigen. Das pathogene Antigen ist in der Lage, Antigen-spezifische T-Zellen
zu aktivieren und das erste Protein ist in der Lage, aktivierte
Antigen-spezifische T-Zellen abzutöten oder zu inaktivieren.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die einen Nukleinsäurevektor
umfaßt, welcher
für ein
erstes und ein zweites Protein codiert. Das erste Protein induziert
die Apoptose oder Inaktivierung von T-Zellen und das zweite Protein
umfaßt ein
pathogenes Antigen. Das pathogene Antigen ist in der Lage, Antigen-spezifische
T-Zellen zu aktivieren und das erste Protein ist in der Lage, aktivierte Antigen-spezifische
T-Zellen abzutöten
oder zu inaktivieren.
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In
einer weitere Ausführungsform
der Erfindung wird eine Zusammensetzung mit genetisch veränderten
Zellen zur Verfügung
gestellt. Die Zelle umfaßt
mindestens ein Nukleinsäuremolekül, das für ein erstes
und ein zweites Protein codiert. Das erste Protein induziert die
Apoptose oder Inaktivierung von T-Zellen und das zweite Protein
umfaßt
ein pathogenes Antigen. Das pathogene Antigen ist in der Lage, Antigen-spezifische
T-Zellen zu aktivieren und das erste Protein ist in der Lage, aktivierte
Antigen-spezifische
T-Zellen abzutöten
oder zu inaktivieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt daher der Technik für die Behandlung von autoimmunen
Erkrankungen, Transplantationsabstoßung und allergischen Erkrankungen
nützliche
Zusammensetzungen zur Verfügung.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNG
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1.
Die Parallelzuführung
von Fas-Ligand/Lac Z hebt die CTL-Immunantwort auf β-gal auf. Es wurde Saline allein
(•), 1 μg p43-FasL-DNA
in Nanopartikeln (∎), 1 μg
p43-cLacZ in Nanopartikeln (♦),
1 μg LacZ/FasL
in Nanopartikeln (
)
oder 1 μg p43-cLacZ
in Nanopartikeln in ein Bein und 1 μg p43-FasL in Nanopartikeln
ins andere Bein (
)
von Mäusen
injiziert und nach zwei Wochen erneut injiziert. T-Zellen wurden
aus der Milz und den Lymphknoten der Mäuse isoliert und auf β-gal-spezifische Cytotoxizität untersucht.
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2.
Systemische Aufhebung der β-gal-CTL-Immunanfworf
durch Parallelzuführung von
FasL-Ligand/LacZ. Es wurde Saline allein (•), 50 μg p43-FasL nackte DNA ins linke
Bein (∎), 50 μg p43-FasL
nackte DNA ins linke Bein und LacZ/FasL-DNA-Nanopartikel (2 μg der Gesamt-DNA)
ins rechte Bein (♦),
100 μg p43-FasL nackte
DNA ins linke Bein (
)
oder 100 μg
p43-FasL nackte DNA ins linke Bein und LacZ/FasL-DNA-Nanopartikel
(2 μg der
Gesamt-DNA) ins rechte Bein (
)
dreimal innerhalb von zwei Wochen in Mäuse injiziert. T-Zellen wurden
aus der Milz und den Lymphknoten der Mäuse isoliert und auf β-gal-spezifische Cytotoxizität untersucht.
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3.
Antigen-spezifische Induktion der Toleranz mit LacZ/FasL-Nanoparfikeln. Es
wurde Saline (•),
p43-cLacZ-Nanopartikel (1 μg)
(∎), LacZ/FasL-Nanopartikel (2 μg) (♦), pcHA-Vektor (50 μg) ins linke
Bein (
)
oder p43-cLacZ-Nanopartikel (1 μg)
ins rechte Bein und pcHA-Vektor (50 μg) ins linke Bein (
)
bei 0, 2 und 4 Wochen in Mäuse
injiziert. Die aus der Milz und den Lymphknoten geernteten T-Zellen
wurden auf eine CTL-Antwort auf β-gal (
3A) oder auf HA (
3B)
untersucht.
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4.
Anforderung für
Parallelzuführung von
Fas-Ligand und LacZ-Vektoren.
Es wurde Saline (
),
50 μg nacktes
p43-LacZ (•),
50 μg nacktes p43-LacZ
ins linke Bein und LacZ/FasL-DNA-Nanopartikel (2 μg der Gesamt-DNA) ins rechte Bein
(∎), 50 μg
nacktes p43-cLacZ (♦),
eine Mischung aus 50 μg p43-cLacZ
und 50 μg
p43-FasL (
)
bei 0, 2 und Wochen in Mäuse
injiziert. Zwei Wochen nach den letzten Injektionen wurden die T-Zellen
aus der Milz und den Lymphknoten geerntet und auf eine CTL-Antwort auf β-gal untersucht.
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5.
Die Auswirkungen der LacZ/FasL-Nanopartikelinjektion auf die β-gal-Immunität vorher
und nachher immunisierter Mäuse.
Es wurde Saline (•), dreimal
1 μg p43-LacZ-Nanopartikel
(∎), dreimal 50 μg
nacktes p43-LacZ (♦),
zweimal 2 μg LacZ/FasL-Nanopartikel,
gefolgt von dreimal 1 μg p43-LacZ
in Nanopartikeln (
),
oder dreimal mit 1 μg p43-LacZ-Nanopartikeln,
gefolgt von zweimal 2 μg LacZ/FasL-Nanopartikeln
(
),
in Mäuse
injiziert. In 2-Wochen-Intervallen
fanden AL1-Immunisierungsinjektionen statt und die Toleranzinjektionen
fanden in 1-Wochen-Intervallen statt. Drei Wochen nach der letzten
Injektion wurden T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten isoliert
und auf β-gal-spezifische Cytotoxizität untersucht.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Es
ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfinder, daß die Parallel-Expression eines
pathogenen Antigens und eines Zellproteins in Einzelzellen, das die
aktivierten T-Zellen abtötet
oder inaktiviert, zur Aktivierung und zum Antigen-induzierten Zelltod (AICD)
in reaktiven Zellen führt.
Man glaubt, daß die Wechselwirkung
von T-Zellen mit Proteinepitopen, die in den Molekülen der
MHC-Klassen I und II der Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)
gebunden sind, zu einer Antigen-spezifischen Aktivierung von T-Zellen
führt.
Diese aktivierten T-Zellen wechselwirken dann mit einem Zellprotein,
das die aktivierten T-Zellen inaktiviert oder abtötet, indem
diesen Zellen der Vollzug der Apoptose induziert wird. Es wurde
zudem von den Erfindern herausgefunden, daß die durch Phasentrennung
am Rand einer Kugel gebildeten Nanokügelchen aus mehr als einer
codierenden Sequenz für
die Erzielung einer Parallel-Transfektion, ohne spezielle generationswechselnde
Konstrukt zu erfordern, effizient sind.
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Erfindungsgemäße pathogene
Antigene sind solche, gegen die eine pathologische Immunreaktion gerichtet
ist. Daher kann das Antigen beispielsweise ein Allergen, ein Autoantigen
oder ein Transplantationsantigen sein. Autoimmune Antigene sind
bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Multipler Sklerose, Rheumatoider
Arthritis, Myasthenia gravis und Lupis Erithmatosis maßgeblich.
Andere Krankheiten, an denen eine autoimmune Komponente beteiligt
ist, sind die Insulin-abhängige
Diabetes Mellitus und die Crohns Erkrankung.
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Nukleinsäuren, die
für ein
pathogenes Antigen nach Wahl codieren, können ein Targeting-Signal,
welches das Protein zu dem Antigen-Präsentationssystem
der MHC-Klasse II leitet, beinhalten. Ein besonders bevorzugtes
Targeting-System ist das LAMP-1-Targeting-System. Siehe U.S. Patent-Nr. 5633234,
auf das hierin ausdrücklich
vollinhaltlich Bezug genommen wird. Das LAMP-Targeting-System führt Proteine
zu Bearbeitungs- und Präsentationszwecken
zum endosomalen/lysosomalen System. Es hat sich gezeigt, daß LAMP-vermitteltes,
lysosomales Antigen-Targeting
die Immunreaktion auf das Antigen durch einen Mechanismus erhöhter Antigen-Präsentation
an CD4+-T-Helferzellen erhöht. Im
Gegensatz dazu ist kein bestimmtes Targeting-System zur Antigen-Präsentation
in System der MHC-Klasse I erforderlich. Eine Präsentation über das System der MHC-Klasse
I aktiviert die CD8+ cytotoxischen T-Zellen. Eine Aktivierung und
anschließende
Zerstörung
von CD4+- und CD8+-Populationen hebt sowohl die Antikörper- als
auch die zelluläre Immunantwort
auf.
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Es
können
Nukleinsäuren
verwendet werden, die für
ein beliebiges zelluläres
Protein codieren, das die Apoptose oder Inaktivierung von T-Zellen
induziert. Das zelluläre
Protein kann ein Oberflächenprotein
oder ein sekretiertes Protein sein, für das die aktivierten T-Zellen
einen Rezeptor exprimieren. Die Expression des Rezeptors wird vorzugsweise über die
Aktivierung der T-Zellen hochreguliert. Geeignete zelluläre Proteine
schließen,
ohne Einschränkung, den
Fas-Liganden und TNFα ein.
Sekretierte Proteine wie Cytokine und Chemokine können ebenso
verwendet werden.
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Die
Verhinderung einer Immunantwort schließt eine Senkung, Verminderung,
Verbesserung und totale Eliminierung ein. Die Immunanwort kann mit
Hilfe der Messung einer beliebigen biologischen Komponente des Immunsystems
oder durch Abschätzung
der Symptome eines behandelten Patienten oder Säugetiers abgeschätzt werden.
Siehe, Kapitel 2, "The
Induction, Measurement, and Manipulation of the Immune Response", in Immunology,
the immune system in health and disease, Janeway, Travers, Hunt
und Walport, Current Biology Limited, NY, 1997. Vorzugsweise wird
eine Senkung um mindestens 25% erreicht. Insbesondere bevorzugt
wird eine Senkung um mindestens 50%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95%
erreicht.
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Die
erfindungsgemäße Applikation
von Nukleinsäuren
kann über
ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren erfolgen.
Während
die Zuführung
von Nanokügelchen,
die mit beiden codierenden Sequenzen am Rand der Kugel eine Phasentrennung
vollziehen, erwünscht
ist, können
andere im Stand der Technik bekannte Zuführungssysteme, einschließlich, aber
nicht beschränkend
auf, Liposomen, viralen Partikeln, nackter DNA, Genpistolen und
dergleichen, verwendet werden. Zellen, die ex vivo transfiziert
wurden, können
auch für
die Zuführung
der Nukleinsäuren
in einen Säuger
verwendet werden. Die Zellen können
Antigen-präsentierende Zellen
oder Muskelzellen sein. Vorzugsweise sind sie autolog. Obwohl sich
die Anmelder nicht an eine bestimmte Theorie oder einen Ablaufmechanismus festlegen
möchten,
scheint es so, daß eine
Parallel-Transfektion von Zellen mit beiden Komponenten, der codierenden
Sequenz für
das pathogene Antigen und der codierenden Sequenz für das zelluläre Protein,
welches die Apoptose oder Inaktivierung induziert, erforderlich
ist. Daher sind Verfahren, die die Möglichkeit einer Parallel-Transfektion
maximieren, bevorzugt. Die zwei codierenden Sequenzen können auf
einem einzelnen Nukleinsäuremolekül vorliegen oder
sie können
beispielsweise physikalisch in einem Komplex gebunden sein. Ein
Fachmann wird in der Lage sein, die zielgerichtete Anordnung, die
für die vorliegende
spezielle Anwendung am geeignetsten ist, auszuwählen.
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Die
Aufnahme der Nukleinsäuren
durch Antigen-präsentierende
Zellen kann auf im Stand der Technik bekannte Weise durchgeführt werden.
Siehe Akbari et al., J. Exp. Med. 189:169–177; Casares et al, J. Exp.
Med. 186:1481–1486;
Condon et al, Nature Medicine 2:1122–1128; und Porgador et al,
J. Exp. Med. 188:1075–1082.
Wenn es erwünscht
ist, daß ein
Targeting-Rest die Anzahl Antigen-präsentierender Zellen, die die
DNA aufnehmen, erhöht,
kann man N418, CD83, die MHC-Klasse II, CD80 und CD86 (B7.1 und
B7.2) und CD40 für
das Targeting verwenden. Es können
beispielsweise Antikörper oder Teile
von Antikörpern,
die für
diese Zellhersteller spezifisch sind, an die Nanokügelchen
gebunden werden.
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Erfindungsgemäß nützliche
Expressionsvektoren sind Moleküle,
die die Transkription und Translation der codierten Proteine sicherstellen.
Geeignete Expressionsvektoren sind im Stand der Technik für Säugerzellen
und insbesondere für
humane Zellen, bekannt. Die verwendeten Promotoren können konstitutiv
oder reguliert vorliegen. Die Expressionseinheiten für das Apoptose-induzierende
Protein und das pathogene Antigen können auf einem oder zwei verschiedenen
Molekülen
vorliegen.
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Liposome
sind im Stand der Technik gut bekannt. Jede beliebige Technik kann
nach Wahl des Fachmanns zur Herstellung der Liposome verwendet werden.
Die Liposome können
zwei verschiedene Expressionsvektoren oder einen Vektor, der sowohl für das pathogene
Antigen als auch das Apoptose-induzierende Protein codiert, parallel
einkapseln.
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Applikationsformen
in den Säuger
oder Patienten können
beliebiger herkömmlicher
Art sein. Sie schließen
ein, beschränken
sich aber nicht auf, subcutane, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale,
orale, intranasale, intrabronchiale Art und Skarifizierung. Während man
vermutet, daß das
vorliegende Verfahren direkt über
in vivo-Aufnahme der DNA von Antigen-präsentierenden
Zellen arbeitet, ist es möglich,
daß andere
Zellen, wie beispielsweise Muskelzellen, ebenso DNA aufnehmen.
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Nanokügelchen
sind üblicherweise
Koazervate aus einem positiv geladenem und einem negativ geladenen
Polymer. Nanokügelchen,
welche Nukleinsäuren
als negativ geladenes Polymer aufweisen, können beispielsweise Gelatin,
Chitosan oder deren Derivate als positiv geladenes Polymer aufweisen. Die
Nanokügelchen
sind vorzugsweise kleiner als 5 μm
und besonders bevorzugt kleiner als 3μm. Eine Nanokügelchenpopulation
kann klassiert werden. Während
die Größe der Population
etwas variieren kann, kann die Größe von mindestens 50%, 75%, 85%
oder 90% der Population zur Charakterisierung der Population verwendet
werden.
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Die
obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein.
Ein vollständigeres
Verständnis
kann mit Hilfe der folgenden speziellen Beispiele erhalten werden,
welche hierin nur zu Illustrationszwecken zur Verfügung gestellt
werden und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
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BEISPIEL 1
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Injektion
von LacZ/FasL-Nanopartikeln in Mäuse
Es wurde gezeigt, daß die
Immunisierung von Mäusen
mit Gelatinnanopartikeln, die β-gal,
das für den
p43-cLacZ-Vektor codiert, enthalten, eine Antigen-spezifische Immunreaktion
in Mäusen
hervorrufen. Proteinmoleküle
wie beispielsweise Cytokine, die auf das Immunsystem wirken, können ebenfalls mit
den DNA-Vektornanopartikeln zusammen verkapselt und parallel zugeführt werden,
was zu einer Umschaltung der Immunantwort zu Th1- oder Th2-Ausrichtung
hin führt.
Da unser theoretisches Modell für
eine Antigen-spezifische Deletion von T-Zellen erforderte, daß einzelne
Zellen mit sowohl für
ein Antigen codierende, als auch für Fas-Liganden codierende Vektoren parallel
transfiziert werden, testeten wir die Wirkung auf das Immunsystem
injizierter Mäuse
mit LacZ/FasL-Nanopartikeln im Vergleich zu LacZ-Nanopartikeln allein.
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Wir
haben festgestellt, daß eine
normale Immunantwort auf das β-gal-Protein erzeugt wird,
wenn die Mäuse
mit dem LacZ-Vektor allein oder mit LacZ in einem Bein und dem Fas-Liganden
im anderen Bein immunisiert werden (1). Wenn
die parallel verkapselten LacZ und Fas-Ligand injiziert werden, wird
die Immunreaktion auf β-gal
auf eine Untergrundreaktivität
abgesenkt, ähnlich
wie bei der Gruppe, die mit Saline allein injiziert wurde. Eine
Injektion von Fas-Ligand-Nanopartikeln allein zeigte keine Wirkung
auf die Immunantwort. Folglich führt
die Parallel-Zuführung
eines Fas-Ligand-Expressionsvektors
und eines für
ein Antigen codierenden Vektors zur Aufhebung der CTL-Antwort auf
das Antigen.
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Verfahren: DNA-Vektoren
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Der
p43-cLacZ-Vektor, der für
das E.coli β-Galactosidasegen
codiert, wurde bereits beschrieben [26]. Die Fas-Ligand-mRNA-Sequenz
wurde durch PCR aus dem pCI-FasL-Vektor erhalten, der von Dr. Berry
Burns großzügig geschenkt
wurde. Primer für
die PCR der Gensequenz, sense 5'---3' und antisense 5'--3', enthielten EcoRI-Linker.
Der p43-FasL-Vektor, der für
die C57B/6-Maus-mRNA-Sequenz codiert, wurde durch Ligation des DNA-Fragments in die
EcoRI-Restriktionsschnittstelle des p43-DNA-Vektors konstruiert, und
das entstehende Konstrukt wurde von der Einrichtung Biochemistry
Core sequenziert, um die Wiederholungsfestigkeit der Sequenz sicherzustellen. Beide
Vektoren wurden in DH5-Zellen vermehrt und mit Hilfe des Qiagen
EndoFree Plasmid-Kits gereinigt. Die gereinigte Plasmid-DNA wurde
auf eine bakterielle LPS-Kontamination untersucht.
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Materialien: Mäuse
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6–8 Wochen
alte BALB/c-Mäuse
wurden vom Charles Rivers-Labor erworben. Alle Protokolle der Verwendung
von Tieren wurden bestätigt.
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Verfahren: Immunisierung
der Tiere
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Gelatinnanopartikel
wurden, wie [24, 25] beschrieben, hergestellt und DNA-Ladungsmenge
wurde nach einem Verdau mit 2,5% Trypsin zur Freisetzung der DNA
aus dem Gelatin mittels Fluorimetrie quantifiziert. Die Mäuse wurden
durch intramuskuläre
Injektion von nackter DNA oder Gelatinnanopartikeln, die in steriler
Salinelösung
suspendiert wurden, in den vorderen Schienbeinmuskel der Hinterbeine immunisiert.
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Verfahren: Untersuchung
cytotoxischer T-Zellen
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Lymphknoten
und Milze wurden aus den Mäusen
geerntet und die über
Nicht-Adhäsion
an Nylonwolle, wie vorher beschrieben, isolierten T-Zellen wurden
durch Untersuchung der Chromfreisetzung; wie
vorher beschrieben [27] [25], auf Antigen-spezifische Toxizität untersucht.
Die Chromfreisetzung wurde mit einem Packard TopCount NXT quantifiziert und
die Ergebnisse als counts × min–1 (cpm)
angegeben.
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BEISPIEL 2
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Systemische Aufhebung
der T-Zellaktivität
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Obwohl
aktivierte APCs durch Herunterregulierung des Fas-Rezeptors gegen
Apoptose und insbesondere gegen Fas-Liganden-vermittelte Apoptose
unempfindlich werden, wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen,
daß die
Expression des Fas-Liganden auf der Oberfläche der transfizierten APCs eine
Auto-Apoptose der APC induziert, dabei die APC abtötet und
inaktiviert, bevor diese in der Lage ist, mit T-Zellen wechselzuwirken,
sie dabei daran hindert, jemals eine Immunreaktion auf das Antigen zu
induzieren. Um diese Möglichkeit
auszuschließen, wurde
eine hohe Dosis nacktes p43-cLacZ in ein Bein und LacZ/FasL-Nanopartikel
in das andere Bein in Mäuse
injiziert (2). Unsere Schlußfolgerung war
die, daß,
wenn die Fas-Ligand-Expression einfach eine Auto-Apoptose der transfizierten
Zellen verursachte, die im anderen, mit nacktem p43-cLacZ injizierten
Bein erzeugte Immunantwort nicht davon betroffen wäre. Andererseits
sollte die Expression des Antigens und des Fas-Liganden durch einzelne ACP
und Muskelzellen, die den T-Zellen sowohl ein aktivierendes Antigen
als auch AICD-induzierende Fas-Liganden präsentieren, zur systemischen
Deletion β-gal-reaktiver
T-Zellen führen.
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Mäuse, denen
nacktes p43-cLacZ allein injiziert wurde, entwickelten starke CTL-Antworten
auf β-gal,
während
bei denen, die mit nacktem p43-cLacZ
in einem Bein und LacZ/FasL-Nanopartikeln im anderen Bein nur leicht
höhere
Antworten entwickelten, als die in der Gruppe, der nur Saline injiziert
worden war. Die Parallel-Zuführung
von Fas-Ligand- und LacZ-codierenden Vektoren führt daher zur systemischen
Aufhebung der Immunantwort durch einen Mechanismus, der anders als
die Induktion von Apoptose in transfizierten APCs ist.
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BEISPIEL 3
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Aufhebung der T-Zellaktivität in Mäusen, die
vor oder nach der Tolerierung mit dem Antigen immunisiert wurden.
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LacZ/FasL-Nanopartikel
heben systemisch die β-gal-spezifische
Immunantwort auf, wenn die gleichzeitig als Immunisierung injiziert
werden, da sie einen deutlichen Einfluß auf die Entwicklung einer Immunantwort haben.
Die Effektivität
gegen bereits bestehende T-Zellen oder gegen Antigen-spezifische Vorläufer-T-Zellen
war jedoch nicht bekannt. Um diese Fragen zu beantworten, wurden
Mäuse vor
oder nach der Injektion von LacZ/FasL-Nanopartikeln dreimal mit
p43-cLacZ-Nanopartikeln immunisiert.
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BEISPIEL 4
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Antigen-spezifische Induktion
der T-Zell-Toleranz
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Nachdem
wir gezeigt haben, daß LacZ/FasL-Tolerierungsnanopartikel
("Tol-Nanokügelchen") sowohl die lokale
als auch die systemische Immunreaktion auf β-gal aufheben, haben wir uns
als nächstes
die Frage gestellt, ob die Tolerierungsinjektion die Immunantwort
auf ein zweites Antigen, das an einer anderen Stelle injiziert wurde,
beeinflussen würde.
Mäusen
wurde der pcHA-Vektor in ein Bein und LacZ/FasL-Nanopartikel in
das andere Bein injiziert. Während
die Parallel-Zuführung
von LacZ und Fas-Ligand
zur Aufhebung der β-gal-spezifischen
Immunantwort führte
(3A), wurde die Immunantwort auf Influenza-Hämagglutinin
(HA) nicht beeinflußt
(3B). Diese Daten zeigen, daß die Deletion von
T-Zellen, die von den LacZ/FasL-Nanopartikeln induziert wird, Antigen-spezifisch
ist und daß dieses Phänomen keine
sekundären
Antigene, die nicht parallel zum Fas-Liganden exprimiert werden,
beeinflußt.
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BEISPIEL 5
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Anforderung an die parallele
Vektor-Zuführung
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Unser
Modell für
das Tolerierungssystem legt nahe, daß ein System zur Parallel-Zuführung notwendig
ist, um eine Parallel-Expression des Antigens und des Fas-Liganden
in den einzelnen Zellen sicherzustellen. Um zu testen, ob tatsächlich eine
Parallel-Zuführung
erforderlich war (4) wurden Mäusen nacktes p43-cLacZ (50 μg), nacktes p43-cLacZ
(50 μg)
und LacZ/FasL-Nanopartikel (2 μg),
nacktes p43-cLacZ (50 mg) oder eine Mischung aus nacktem p43-cLacZ
(50 μg)
und p43-FasL (50 μg)
injiziert. Die geernteten Zellen wurden auf CTL-Aktivität gegen β-gal untersucht.
Die Saline- und p43-FasL-Immunisierungsgruppen zeigten keine β-gal-spezifische
Lyseaktivität.
Die p43-cLacZ-Gruppe entwickelte eine starke Antwort auf β-gal.
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Die
LacZ/FasL (Tol-Nanoküglechen)
mit p43-cLacZ-Nanopartikeln führten
zu einer Aufhebung der Antwort. Die Gruppe, der nackte LacZ- und FasL-Vektoren injiziert
wurden, zeigte nur eine kleine Absenkung der Immunantwort verglichen
mit der Absenkung, die bei der Nanopartikelgruppe beobachtet wurde.
Obwohl eine kleine Absenkung der Immunantwort nach der Injektion
nackter Vektoren beobachtet wurde, stellt die Parallel-Zuführung daher
eine Anforderung der Aufhebung einer Immunantwort auf ein Antigen
dar.
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Bei
dieser Untersuchung haben wir versucht, eine periphere Toleranz
von T-Lymhozyten zu induzieren, indem wir den Vorteil des Phänomens des
Aktivierungsinduzierten Zelltods nutzten, bei dem aktivierte T-Zellen
für eine
Induktion der Apoptose durch den Fas-Liganden empfänglich werden.
Eine Immunantwort auf ein Antigen wird initiiert, wenn ein APC-exprimierendes
Antigen in an der Oberfläche gebundenen
Molekülen
der MHC-Klasse mit CD4+-T-Helfer-Lymphozyten wechselwirkt. Die CD4+-Zelle
wird inaktiviert und zur gleichen Zeit tritt der CD40-Ligand (CD154)
auf, der die APC vollständig
aktiviert. Die APC ist anschließend
in der Lage, CD8+ cytotoxische T-Lymphozyten
durch Antigenpräsentation
auf den auf der Oberfläche
gebundenen Molekülen
der MHC-Klasse zu aktivieren. Wird haben vermutet, daß die Parallel-Expression
von Antigen und Fas-Ligand in einzelnen Zellen eine Antigen-spezifische
Aktivierung von T-Zellen und die Induktion von AICD durch Wechselwirkung
mit CD95L verursachen könnte.
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Wir
verkapselten parallel zwei verschiedene DNA-Vektoren in Gelatinnanopartikeln,
von denen der eine CD95L und der andere β-Galactosidase-Modellantigen codierten.
Gelatinnanopartikel sind Koazervate aus DNA und Gelatin, die, wie
bereits gezeigt wurde, eine Verwendung in der Impfstoffzuführung und
bei gentechnischen Anwendungen aufweisen. Siehe U.S. Seriennr. 08/657,913,
eingereicht am 7. Juni 1996, 60/071,679, eingereicht am 16. Januar 1998,
und 60/071,746, eingereicht am 16. Januar 1998, auf die hierin vollinhaltlich
Bezug genommen wird. Unsere Theorie der CD95L-induzierten Toleranz
erfordert, daß sowohl
das Antigen als auch die CD95-L-Gene parallel in einzelnen Zellen
exprimiert werden. Wir testeten Nanopartikel auf die Fähigkeit, zwei
verschiedene Nukleinsäurekonstrukte
der gleichen Zelle ohne das Erfordernis komplizierte, generationswechselnde
DNA-Konstrukte aufzubauen, zuzuführen.
-
Wir
haben gezeigt, daß mit
einem spezifischen Antigen reaktive T-Zellen in Mäusen deletiert werden,
denen Nanopartikel, die sowohl für
das spezifische Antigen als auch ein Apoptose-induzierendes Oberflächenmolekül codieren,
injiziert wurden.
-
BEISPIEL 6
-
Multiple Sklerose-Antigene:
Myelinbasisprotein
-
Ein
ausgezeichnetes MS-Modell existiert mit dem SJL/J-Stamm von Mäusen, der
die humane Erkrankung sowohl in ihrer Pathologie als auch in ihren immunologischen
Eigenschaften widerspiegelt. Dieses Erkrankungsmodell, experimentelle
allergische Encephalomyelitis (EAE) genannt, wird zur Charakterisierung
der Tolerierungstechnik für
die Verhindern und Behandlung von Multipler Sklerose verwendet.
-
Die
mRNA-Sequenz des Myelinbasisproteins von der SJL/J-Maus wurde durch
RT-PCR in Expressionsvektoren von Säugern kloniert. Es wurde anschließend in
einen tPA-TmC chimären
Expressionsvektor von Säugern
kloniert.
-
Die
Expression des Myelinbasisproteins mit dem Fas-Liganden wird zur
Deletion der murinen T-Zellen, die mit dem Myelinbasisprotein reaktiv
sind, wie oben für β-Galactosidase
beschrieben, verwendet.
-
BEISPIEL 7
-
Hemmung der CTL-Aktivität vorher
oder nachher immunisierter Mäuse
-
LacZ/FasL-DNA-Nanopartikel
hemmen systemisch die β-gal-spezifische
CTL-Antwort, wenn sie gleichzeitig mit der Applikation der immunisierenden DNA
in Mäuse
injiziert werden. Wir haben auch die Effektivität des Tolerierungsverfahrens
in Mäusen
mit T-Zellen, die schon von einer vorhergehenden Antigenexposition
oder gegen eine erneute Antigenexposition nach der Tolerierungsinjektion
vorliegen, getestet (5). Den Mäusen wurde entweder 2 Wochen vor
oder 2 Wochen nachdem sie dreimal mit 1 μg p43-cLacZ-Nanopartikeln immunisiert
wurden, zweimal LacZ/FasL-DNA-Nanopartikel (2 μg DNA) injiziert. Bei Mäusen, denen
vor der Immunisierung mit nur p43-cLacZ-DNA enthaltenden Nanopartikeln zweimal
LacZ/FasL-Nanopartikel injiziert wurden, zeigte sich keine signifikante
CTL-Antwort, wodurch eine
T-Zell-Reaktivität
erreicht wurde, die derjenigen von nur mit Saline injizierten Mäusen ähnlich war. Mäusen, die
dreimal mit p43-cLacZ-Nanopartikeln immunisiert
wurden und denen anschließend
7 bis 14 Tage nach der letzten Immunisierung LacZ/FasL-Nanopartikeln
injiziert wurden, zweigten einen starken Abfall, aber keine vollständige Aufhebung,
der T-Zell-Reaktivität
im Vergleich zu Mäusen,
denen 1 μg
p43-cLacZ-Nanopartikel
oder 50 μg
nacktes p43-cLacZ injiziert wurde. Im Rahmen dieses Experiments
verhinderte die Injektion der LacZ/FasL-Nanopartikel die Entwicklung
einer β-gal-spezifischen T-Zellantwort
auf eine Antigenexposition nach Tolerierungseinstellung der Mäuse. Die
LacZ/FasL-Nanopartikel waren auch in der Lage, die T-Zell-Reaktivität auf ein
Antigen, die durch Immunisierung vor Applikation der Tolerierungsinjektionen
erzeugt wurde, merklich gesenkt, aber nicht vollständig aufgehoben.
-
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) von Mäusen injiziert und nach zwei Wochen erneut injiziert. T-Zellen wurden aus der Milz und den Lymphknoten der Mäuse isoliert und auf β-gal-spezifische Cytotoxizität untersucht.