DE60011756T2 - Methoden und reagentien zur bestmmung der enzym-substatspezifität und damit verbundene anwendungen - Google Patents

Methoden und reagentien zur bestmmung der enzym-substatspezifität und damit verbundene anwendungen Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Mechanismus, nach dem Enzyme eine Reaktion katalysieren, z.B. eine Peptidhydrolyse, wird häufig im Rahmen der Übergangszustand-Theorie beschrieben. Bei der Anwendung der Übergangszustand-Theorie auf eine chemische Reaktion werden die Reaktanten-Kollisionsvorgänge ignoriert und nur der Grundzustand der Reaktanten und die instabilste Spezies des Reaktionsweges, der Übergangszustand, werden berücksichtigt. Der Übergangszustand tritt am Peak im Reaktionskoordinatendiagramm auf; vergl. 1. Im Reaktionsprofil stellt der Übergangszustand den Zustand des oder der Reaktanten dar, wenn die chemischen Bindungen gerade aufgebrochen oder gebildet werden. Aus der Energiedifferenz zwischen dem Übergangszustand und dem Grundzustand lässt sich die Reaktionsgeschwindigkeit ableiten. Die durch eine Enzymkatalyse einer Reaktion erreichte Erhöhung der Geschwindigkeit, verglichen mit der spontanen Reaktionsgeschwindigkeit, ergibt sich aus der Fähigkeit des Enzyms, die Aktivierungsenergie der Reaktion zu verringern.
  • Diesbezüglich handelt es sich bei einem Enzym im Wesentlichen um eine flexible molekulare Matrize, die sich durch Evolution so entwickelt hat, dass sie genau komplementär zu den Reaktanten in ihrer aktivierten Übergangszustand-Geometrie ist, im Unterschied zu ihrer Grundzustand-Geometrie. Somit bindet ein Enzym stark an den Übergangszustand und erhöht dessen Konzentration und beschleunigt die Reaktion proportional dazu. Diese Beschreibung der enzymatischen Katalyse wird nunmehr üblicherweise als Übergangszustand-Stabilisierung bezeichnet.
  • Jedoch lieferte in seiner ursprünglichen Form das Übergangszustand-Bindungsmodell keine Antwort auf ein offensichtliches Paradoxon: zahlreiche Enzyme weisen eine stark erhöhte Aktivität gegen erweiterte Substrate auf, z.B. gegen Substrate mit größeren Aminosäureseitenketten oder mit zusätzlichen Aminosäureresten oder Zuckerresten auf beiden Seiten oder in einem gewissen Abstand von der zu hydrolysierenden Peptid- oder Glycosidbindung, verglichen mit kleineren Substraten. Das Problem war Folgendes: eine erhöhte Aktivität zeigt sich üblicherweise mehr durch einen Anstieg des kcat-Werts als durch eine Abnahme des Km-Werts, d.h. durch einen Anstieg der maximalen Geschwindigkeit und weniger durch einen Anstieg der Substratbindung (mit steigender Substratbindungsaffinität nimmt Km tendenziell ab). Bei Berücksichtigung des allgemeinen Auftretens dieser Erscheinung kam man dazu, das Konzept der "induzierten Anpassung" ("induced fit") einzuführen, wonach distale Teile des Enzyms in wesentlichem Umfang zur Gesamtbindung des Übergangszustands, jedoch nicht des Grundzustands beitragen.
  • Kürzlich haben die Anmelderin und andere Autoren den Nachweis für einen Mechanismus der modifizierten induzierten Anpassung geliefert, bei dem ein Bindungsoptimum des Übergangszustands eine mitwirkende Erscheinung darstellt. Dies bedeutet, dass zahlreiche individuelle Bindungswechselwirkungen zwischen dem Übergangszustand und dem Enzym synergistisch sind. Die Wechselwirkung der Spezifitätsnebenzentren des Enzyms mit dem Substrat induziert eine Konformationsänderung im aktiven Zentrum, wobei die neue Konformation für eine Stabilisierung des oder der Übergangszustand-Zwischenprodukte geeigneter ist. Dieses Zusammenwirken lässt sich als eine Strategie zur Verstärkung der Enzymspezifität ansehen: eine geringe Störung der chemischen Struktur eines Substrats kann eine starke Ab nahme der Bindung seines Übergangszustands hervorrufen; vergl. z.B. Tsilikounas et al., Biochemistry, Bd. 32 (1993), S. 12651; Tsilikounas et al., Biochemistry, Bd. 31 (1992), S. 12839; Bone et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7600; Farr-Jones et al., PNAS, Bd. 86 (1989), S. 6922; Smith et al., Science, Bd. 244 (1989), S. 961; Kettner et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 7682; Bachovchin et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 7689; und Bachovchin, Biochemistry, Bd. 25 (1986), S. 7751.
  • WO-98/11251 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren eines Substrats für ein Liganden entfernendes Enzym. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein Ligand, der durch das Liganden entfernende Enzym entfernt werden kann, in eine partiell degenerierte Peptidbibliothek an einer Nichtdegenerationsposition eingebaut. Die Peptidbibliothek wird sodann mit dem Liganden entfernenden Enzym behandelt, um ein Gemisch von Peptiden, bei denen der Ligand intakt ist, sowie von Peptiden, bei denen der Ligand gespalten ist, zu erzeugen. Das Gemisch wird sodann mit einem proteolytischen Enzym behandelt, das bevorzugt ligandenfreie Peptide im Gemisch spaltet. Diese 1igandenfreien Peptide werden sodann sequenziert, um optimale Substrate für das Liganden entfernende Enzym zu identifizieren.
  • WO-91/17762 beschreibt einen Peptidinhibitor von retroviraler Proteinase, der eine Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat der Proteinase aufweist (d.h. nicht degeneriert ist) und durch die Formel (Z)nX-Y(Z)m wiedergegeben wird, worin X eine beliebige, natürlich auftretende Aminosäure (z.B. Tyrosin oder Phenylalanin) oder eine modifizierte Aminosäure bedeutet; Y eine α-Iminosäure mit einer 4-, 6-, 7- oder 8-gliedrigen Ringstruktur bedeutet; Z eine α-Aminosäure bedeutet; und n und m unabhängig voneinander einen Wert von 0 bis 7 haben. Y kann ferner durch funktionelle Gruppen substituiert sein, die das Peptid in einen fest bindenden Inhibitor oder einen kovalenten Inhibitor umwandeln. Diese Anmeldung beschreibt keine Bibliotheken derartiger Peptide und beschreibt nicht ein Screening auf retrovirale Proteinase-Aktivität unter Verwendung einer Bibliothek derartiger Peptide.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung eines Substrats, z.B. eines bevorzugten Aminosäuresequenz-Motivs, das bevorzugt durch das aktive Zentrum eines Enzyms und assoziierte Spezifitätsnebenzentren gebunden wird, bereitgestellt. Ein derartiges Sequenzmotiv lässt sich ableiten, indem man für eine Wechselwirkung einer orientierten, degenerierten Bibliothek von Peptiden, Peptidanalogen, Peptidomimetika oder anderen kleinen Molekülen mit einem gegebenen Enzym sorgt, feststellt, welche Mitglieder der Bibliothek vom Enzym bevorzugt werden, und die bevorzugten Mitglieder sequenziert, um die Präferenzen der verschiedenen Spezifitätsnebenzentren des Enzyms zu bestimmen. Zu Beispielen für Enzyme, die für die erfindungsgemäße Verwendung in Betracht kommen, gehören unter anderem Proteasen, Phosphatasen und Kinasen.
  • Beschreibung der Zeichnung
  • 1 zeigt ein Reaktionskoordinatenschema.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • (A) Überblick
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der Substratspezifität von Enzymen, die an der Protein/Peptid-Prozessierung beteiligt sind, z.B. von Proteasen, Kinasen, Phosphatasen und dergl. Allgemein stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das die Identifizierung eines Aminosäuresequenz-Motivs ermöglicht, welches die optimale Substratspezifität eines speziellen Enzyms definiert, ohne dass native Substrate des Enzyms identifiziert, isoliert und verglichen werden müssen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Auswahl eines oder mehrerer spezieller Peptidyl-Inhibitoren aus einer degenerierten Bibliothek von Inhibitoren. Insbesondere verwendet der vorliegende Test Bibliotheken von Inhibitoren, die jeweils individuell folgendes umfassen: (i) einen Peptidylbereich, der in der Sequenz degeneriert ist, um der Inhibitorbibliothek eine vielfältige Beschaffenheit zu verleihen; und (ii) eine funktionelle Gruppe, die ein kovalentes Addukt oder einen anderen fest gebundenen Komplex mit dem Enzym in einer Art und Weise oder mit einer Affinität bilden kann, die von der Fähigkeit des Peptidylbereiches des Inhibitors zur Wechselwirkung mit bestimmten Spezifitätsnebenzentren des Enzyms abhängen. Ein Rest, der eine derartige funktionelle Gruppe trägt, wird nachstehend als eine aktive Untereinheit bezeichnet. In bevorzugten Ausführungsformen wird die aktive Untereinheit so gewählt, dass die Mitglieder der Bibliothek langsam bindende Inhibitoren des Enzyms darstellen. Die Inhibitorbibliothek wird mit einem Zielenzym unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen Enzym-Inhibitor-Komplexe entstehen können. Diese Mitglieder der Bibliothek, die feste Komplexe oder kovalente Bindungen mit dem Enzym bilden, werden identifiziert und/oder aus der Bibliothek isoliert. Dies bedeutet, dass der Test Inhibitoren auswählt, die eine Konformationsänderung am aktiven Zentrum des Enzyms in einer Art und Weise, die von der Sequenz des Peptidylbereiches des Inhibitors abhängig ist, hervorrufen. In bevorzugten Ausführungsformen weisen die ausgewählten Inhibitoren Dissoziationskonstanten (kd) von weniger als 10–6 M und vorzugsweise von weniger als 10–7 M, 10–8 M oder sogar 10–9 M auf.
  • Wie vorstehend beschrieben, wurde zu Illustrationszwecken gezeigt, dass bestimmte Peptidylboronsäuren eine langsam bindende Hemmkinetik unter anderem für Serin-proteinasen aufweisen; vergl. Morrison et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., Bd. 61 (1988), S. 202. Diese Tendenz korreliert mit der Frage, ob es sich beim Inhibitor um ein Substratanaloges handelt oder nicht. Sogenannte "gute" Substratanaloge, z.B. Inhibitoren, deren Peptidylbereich komplementär mit Spezifitätsnebenzentren des Enzyms sind, tendieren zu einer langsam bindenden Kinetik. Außerdem bildeten diese Boronsäure-Inhibitoren tetraedrische Addukte mit dem Serin im aktiven Zentrum, wie auf der Grundlage der Tatsache zu erwarten war, dass ein tetraedrisches Boronsäure-Serin-Addukt ein gutes Übergangszustandsanaloges eines tetraedrischen Amid-Serin-Komplexes, des nativen Substrats für die Protease, darstellt. Jedoch können z.B. einfache Alkyl- und Arylboronsäuren, die insofern als "schlechte" Substratanaloge gelten, als sie die Spezifitätnebenzentren nicht ausfüllen, kovalente Addukte mit der Protease bilden. Diese Addukte, z.B. mit dem Histidin im aktiven Zentrum, unterscheiden sich tatsächlich von dem Typ von Addukten, die durch "gute" Substratanaloge gebildet werden. Dies bedeutet, dass das bloße Vorliegen eines Übergangszustandsanalogen allein nicht ausreicht, um das aktive Zentrum auf ähnliche Weise wie das native Substrat zu involvieren.
  • Ferner wurde festgestellt, dass zahlreiche Enzyme eine stark erhöhte Aktivität gegen erweitere Substrate, verglichen mit kleineren Substraten, aufweisen, was sich mehr durch einen Anstieg der maximalen Geschwindigkeit (kcat) als durch einen Anstieg der Substratbindung (Km) zeigt.
  • Diese und andere Feststellungen haben die Anmelderin dazu veranlasst, ein induziertes Distortionsmodell für die Katalyse vorzuschlagen; vergl. beispielsweise Bachovchin et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 7689. Bei diesem Modell wird das Konzept der "induzierten Anpassung" (bei dem distale Bereiche des Enzyms im Wesentlichen zur Gesamtbindung des Übergangszustands, jedoch nicht des Grundzustands beitragen) so modifiziert, dass ein Synergismus zwischen dem katalytischen Zentrum des Enzyms und den Spezifitätnebenzentren erkannt wird. Kurz zusammengefasst, bringt anstelle einer bloßen Schloss- und Schlüssel-Anpassung eine Besetzung der Spezifitätsnebenzentren, z.B. durch einen günstigen Kontakt mit dem Peptid, das Enzym dazu, eine Struktur um das katalytische Zentrum herum anzunehmen, die stärker komplementär zum Übergangszustand ist. Bei diesem modifizierten Modell der induzierten Anpassung der Enzym-Substrat-Bindung handelt es sich bei der Gestalt des aktiven Zentrums des ungebundenen Enzyms nicht um das genaue komplementäre Passstück für das Substrat. Nachdem die Bindung des Enzyms an das Substrat eingeleitet ist, erfolgt eine Konformationsänderung der Gestalt des aktiven Zentrums. Somit kann ein Kontakt zwischen dem Peptidsubstrat und Spezifitätnebenzentren des Enzyms, die sich distal vom aktiven Zentrum befinden, trotzdem tiefgreifende Einflüsse auf die katalytische Aktivität des Enzyms gegenüber dem Substrat ausüben.
  • Für Enzyme, die über einen Mechanismus, der einen Synergismus zwischen Spezifitätsnebenzentren und dem aktiven Zentrum erfordert, arbeiten, können bei den Bindungstests des Stands der Technik, die eine Bindung von einzelnen Peptiden aus einer Peptidbibliothek erfassen (vergl. z.B. Ladner et al., US-Patent 5 223 409 und Roberts et al., Gene, Bd. 121 (1992), S. 9–15) optimale Substrate fehlen. Da der Synergismus zwischen dem aktiven Zentrum und den Spezifitätsnebenzentren weitgehend durch eine Erhöhung des Kcat-Werts anstelle einer Abnahme des Km-Werts erklärt wird, kann eine Peptidbibliothek, die nicht das aktive Zentrum erfasst, möglicherweise derartige Substratbindungserfordernisse nicht erkennen, obgleich diese Wechselwirkungen für die Konzeption von Substrat und Inhibitor kritisch sein können.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist dagegen so konzipiert, dass durch Berücksichtigung eines derartigen Synergismus die optimale Substratspezifität bestimmt wird.
  • Eine langsam bindende Kinetik ist eine Erscheinung, die nicht auf Proteasen beschränkt ist. Ein derartiges kinetisches Verhalten, das einen Kontakt mit einem Peptidsubstrat und eine Induktion von Konformationsänderungen am aktiven Zentrum erfordert, wurde in einem breiten Bereich von Enzymen, die Proteine und andere natürliche Polymere, wie Nucleinsäuren und Kohlenhydrate, modifizieren, beobachtet. Somit kommt es speziell in Betracht, dass das vorliegende Verfahren auch zur Bestimmung der Substratspezifität von Enzymen, wie Proteinkinasen und Protein-phosphatasen, herangezogen werden kann.
  • Bei dem Verfahren wird die Inhibitorbibliothek mit dem Enzym unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen Addukte unter Beteiligung des Enzyms entstehen können, wenn geeignete Spezifitätsnebenzentren des Enzyms in produktiver Weise gefüllt werden. Diese gebundenen Inhibitoren mit zumindest einem gewissen Schwellen-Ki-Wert werden von den ungebundenen Inhibitoren und von den gebundenen Inhibitoren, die nicht die minimale Wirkungsstärke aufweisen, abgetrennt, wodurch man eine Unterpopulation von Inhibitoren isoliert, die Peptidsequenzen aufweisen, die optimale Substrate für das Enzym darstellen.
  • In bestimmten Ausführungsformen besteht die Inhibitorbibliothek aus Peptidyl-Inhibitoren, die durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden: (Xaa)n-Yaa-(Xaa)m worin Yaa eine aktive Untereinheit darstellt, die zur Wechselwirkung mit einem Bereich eines aktiven Zentrums eines Enzyms befähigt ist,
    Xaa eine beliebige Aminosäure oder ein Aminosäureanaloges bedeutet und
    n und m ganze Zahlen mit Werten von 0 bis einschließlich 10 sind, wobei die Summe von m und n mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 4 beträgt.
  • Die Bibliothek ist an einer oder mehreren Aminosäurepositionen degeneriert, wodurch sich eine vielfältig abgeänderte Inhibitorbibliothek ergibt.
  • Yaa kann beispielsweise ein Übergangszustandanaloges einer Peptidgerüstbindung oder einen Aminosäurerest, an den an der Seitenkette ein Übergangszustandanaloges gebunden ist, bedeuten. Beim Übergangszustandanalogen kann es sich um eine funktionelle Gruppe handeln, die im Zusammenhang mit einer geeigneten Wechselwirkung zwischen dem Peptidylbereich des Inhibitors und den Spezifitätsnebenzentren des Zielenzyms ein kovalentes Addukt oder einen fest assoziierten Komplex mit dem Enzym bilden kann.
  • In bevorzugten Ausführungsformen weist der Peptidylbereich der Bibliothek eine Länge von 2 bis 50 Resten, vorzugsweise von 4 bis 20 Resten und insbesondere von 4 bis 10 Resten auf. Beispielsweise kann der Peptidylbereich eine Länge von 4, 5, 6, 7 oder 8 Aminosäureresten aufweisen.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden die Inhibitoren der Bibliothek durch eine der folgenden Formeln wiedergegeben:
    Figure 00100001
    worin Yaa die vorstehend definierte Bedeutung hat und Xaa1 und Xaa2 unabhängig vom jeweiligen Auftreten einen Aminosäurerest oder ein Aminosäureanaloges bedeuten und n und m jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 10 sind, wobei die Summe von m und n mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 4 beträgt.
  • Nach Isolierung der Unterpopulation von Inhibitoren werden die Inhibitoren sequenziert und die relative Häufigkeit der einzelnen Aminosäurereste an den einzelnen Degenerationspositionen der Peptide wird bestimmt. Ein Aminosäuresequenz-Motiv, das die optimale Substratspezifität des Enzyms repräsentiert, lässt sich aus den häufigsten Aminosäureresten an den jeweiligen Degenerationspositionen der Peptide ermitteln. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es zur Bestimmung der Substratspezifität für beliebige Enzyme, die Proteine und Peptide verändern, herangezogen werden kann, unabhängig davon, ob native Substrate für das Enzym identifiziert worden sind.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen können die Konsensus-Sequenz(en) für ein gegebenes Enzym dazu herangezogen werden, selektive Inhibitoren des Enzyms, unter Einschluss von Peptiden, Peptidomimetika und anderen niedermolekularen Inhibitoren, zu entwickeln. Derartige Inhibitoren können in vitro, z.B. als Zellkulturadditive oder bei anderen gewerblichen Verfahren, oder in vivo, z.B. für die Human- oder Veterinärtherapie, verwendet werden.
  • Bei weiteren Ausführungsformen, die auf dem durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmten Aminosäuresequenz-Motiv beruhen, können Peptide hergestellt werden, die Substrate für dieses spezielle Enzym, z.B. eine spezielle Protease, darstellen. Peptide, die die bevorzugtesten Aminosäurereste eines Sequenzmotivs umfassen, stellen optimale Substrate für das Enzym dar. Beispielsweise können die vorliegenden Substrate, wie nachstehend ausgeführt, für Forschungs- und Diagnoseanwendungen eingesetzt werden, z.B. um ein spezielles Enzym nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen. In bestimmten Fällen kann das Substrat als Ersatz für das native Substrat herangezogen werden, insbesondere wenn das native Substrat nicht bekannt ist, und zwar bei Tests, die zum Identifizieren beispielsweise von niedermolekularen Inhibitoren des Enzyms entwickelt werden.
  • (B) Definitionen
  • Aus Zweckmäßigkeitsgründen werden bestimmte Ausdrücke, die in der Beschreibung, den Beispielen und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, hier zusammenfassend erläutert. Die International Union of Biochemistry and Molecular Biology (1984) hat den Ausdruck "Peptidase" für die Untergruppe von Peptidbindungshydrolasen (Unterklasse E. C. 3.4.) empfohlen.
  • Der weit verbreitete Ausdruck Protease stellt ein Synonym für den Ausdruck Peptidase dar. Die Peptidasen umfassen zwei Gruppen von Enzymen: die Endopeptidasen und die Exopeptidasen. Endopeptidasen spalten Peptidbindungen an Stellen innerhalb eines Proteins und Exopeptidasen entfernen sequenziell Aminosäuren vom N- oder vom C-Terminus.
  • Der Ausdruck "Proteinase" wird auch als Synonym für den Ausdruck Endopeptidase verwendet. Proteinasen werden entsprechend ihren katalytischen Mechanismen klassifiziert. Von der International Union of Biochemistry and Molecular Biology werden vier mechanistische Klassen anerkannt: Serinproteinasen, Cystein-proteinasen, Aspartat-proteinasen und Metalloproteinasen.
  • Es wurde empfohlen, diese Klassifikation von katalytischen Typen durch eine Klassifikation von Familien aufgrund der Evolutionszusammenhänge von Proteasen zu erweitern (N. D. Rawlings und A. J. Barrett, Biochem. J., Bd. 290 (1993), S. 205–218). Diese Klassifikation ist auch in der SwissProt-Datenbank verfügbar.
  • Zusätzlich zu diesen vier mechanistischen Klassen gibt es einen Abschnitt der Enzymnomenklatur, dem Proteasen mit einem nicht-identifizierten Katalysemechanismus zugeordnet werden. Dies stellt einen Hinweis dafür dar, dass der Katalysemechanismus nicht identifiziert worden ist und die Möglichkeit bleibt, dass neuartige Typen von Proteasen existieren.
  • Die Klasse von "Serin-proteinasen" umfasst zwei getrennte Familien: die Chymotrypsin-Familie, die die Säugetierenzyme, wie Chymotrypsin, Trypsin, Elastase oder Kallikrein, umfasst und die Subtilisin-Familie, die bakterielle Enzyme, wie Subtilisin, umfasst. Die allgemeine dreidimensionale Struktur ist in diesen beiden Familien unterschiedlich, sie weisen jedoch die gleiche Geometrie des aktiven Zentrums auf und die Katalyse läuft über den gleichen Mechanismus ab. Die Serinproteinasen weisen unterschiedliche Substratspezifitäten auf, die mit den Aminosäuresubstitutionen in den verschiedenen Enzym-Nebenzentren (vergl. die Nomenklatur von Schechter und Berger), die mit den Substratresten in Wechselwirkung treten, zusammenhängen. Drei Reste, die die katalytische Triade bilden, sind für den katalytischen Vorgang wesentlich: His-57, Asp-102 und Ser-195 (Chymotrypsinogen-Nummerierung).
  • Die Familie der "Cystein-proteinasen" umfasst die Pflanzenproteasen, wie Papain, Actinidin oder Bromelain, mehrere lysosomale Säugetier-Cathepsine, die Cytosol-Calpaine (calcium-aktiviert) und mehrere Parasiten-Proteasen (z.B. Trypanosoma, Schistosoma). Papain ist die Urform und stellt das bestuntersuchte Mitglied der Familie dar. Wie bei den Serin-proteinasen verläuft die Katalyse über die Bildung eines kovalenten Zwischenprodukts, wobei ein Cystein- und ein Histidinrest beteiligt sind. Die wesentlichen Reste Cys-25 und His-159 (Papain-Nummerierung) spielen die gleiche Rolle wie Ser-195 bzw. His-57. Der nukleophile Bestandteil ist ein Thiolation und nicht eine Hydroxylgruppe. Das Thiolation wird durch die Bildung eines Ionenpaars mit einer benachbarten Imidazoliumgruppe von His-159 stabilisiert. Beim angreifenden nukleophilen Bestandteil handelt es sich bei beiden Schritten um das Thiolat-Imidazolium-Ionenpaar, wobei ein Wassermolekül nicht erforderlich ist.
  • Die meisten "Aspartat-proteinasen" gehören zur Pepsin-Familie. Die Pepsin-Familie umfasst Verdauungsenzyme, wie Pepsin und Chymosin, sowie lysosomale Cathepsine D, prozessierende Enzyme, wie Renin und bestimmte Pilzproteasen (Penicillopepsin, Rhizopuspepsin, Endothiapepsin). Eine zweite Familie umfasst virale Proteinasen, wie die Protease des AIDS-Virus (HIV), die auch als Retropepsin bezeichnet wird. Im Gegensatz zu Serin- und Cystein-proteinasen ist bei der Katalyse durch Aspartat-proteinasen kein kovalentes Zwischenprodukt beteiligt, obgleich ein tetraedrisches Zwischenprodukt existiert. Der nukleophile Angriff wird durch zwei gleichzeitige Protonenübertragungen erreicht: Eine von einem Wassermolekül auf die Diade der beiden Carboxylgruppen und eine zweite von der Diade auf den Carbonylsauerstoff des Substrats unter gleichzeitiger Spaltung der CO-NH-Bindung. Diese allgemeine Säure-Base-Katalyse, die als "Stoß-Zug"-Mechanismus bezeichnet werden kann, führt zur Bildung eines nicht-kovalenten neutralen tetraedrischen Zwischenprodukts.
  • Die "Metalloproteinasen" treten in Bakterien, Pilzen sowie in höheren Organismen auf. Sie unterscheiden sich stark in ihren Sequenzen und ihren Strukturen, wobei aber der Großteil der Enzyme ein Zinkatom, das katalytisch aktiv ist, enthält. In einigen Fällen kann Zink durch ein anderes Metall, wie Kobalt oder Nickel, ersetzt werden, ohne dass ein Aktivitätsverlust eintritt. Bakterielles Thermolysin ist gut charakterisiert. Seine kristallographische Struktur zeigt, dass Zink durch zwei Histidinreste und einen Glutaminsäurerest gebunden ist. Zahlreiche Enzyme enthalten die Sequenz HEXXH, die zwei Histidinliganden für das Zink bereitstellt, während es sich beim dritten Liganden entweder um Glutaminsäure (Thermolysin, Neprilysin, Alanyl-aminopeptidase) oder um Histidin (Astacin) handelt. Weitere Familien weisen eine abweichende Art der Bindung des Zn-Atoms auf. Der katalytische Mechanismus führt zur Bildung eines nicht-kovalenten, tetraedrischen Zwischenprodukts im Anschluss an den Angriff eines an Zink gebundenen Wassermoleküls auf die Carbonylgruppe der spaltbaren Bindung. Dieses Zwischenprodukt wird durch Übertragung des Glutaminsäureprotons auf die austretende Gruppe zersetzt.
  • Bei der Erörterung der Wechselwirkungen von Peptiden mit Proteinasen, z.B. Serin und Cystein-proteinasen und dergl., bedient sich die vorliegende Anmeldung der Nomenklatur von Schechter und Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 27 (1967), S. 157–162). Die individuellen Aminosäurereste eines Substrats oder Inhibitors werden mit P1, P2 und dergl. bezeichnet. Die entsprechenden Unterzentren des Enzyms werden mit S1, S2 und dergl. bezeichnet. Die spaltbare Bindung des Substrats wird mit S1-S1' bezeichnet.
  • Die Bindungsstelle für ein Peptidsubstrat besteht aus einer Reihe von "Spezifitätsnebenzentren" die über die Enzymoberfläche verteilt sind. Der Ausdruck "Spezifitätsnebenzentrum" bezieht sich auf eine Tasche oder eine andere Stelle am Enzym, die zu einer Wechselwirkung mit einem Teil eines Substrats für das Enzym befähigt sind.
  • Der Ausdruck "Substrat" bezieht sich auf ein Substrat eines Enzyms, auf das eine katalytische Einwirkung durch das Enzym und eine chemische Umwandlung in ein oder mehrere Produkte erfolgt.
  • Der Ausdruck "Oxyanion-Loch" bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste eines Enzyms, die eine Oxyanion-Spezies eines Übergangszustand-Zwischenprodukts stabilisieren. Röntgenkristallstrukturen und chemische Daten stützen das Vorliegen eines tetraedrischen Übergangszustand-Zwischenprodukts beim Katalysemechanismus von Chymotrypsin. Dieser erfolgt durch den Angriff der Hydroxylgruppe von Ser-195 auf das Carbonylkohlenstoffatom der spaltbaren Bindung. Die C=O-Bindung wird zu einer Einfachbindung, wobei eine negative Ladung am O-Atom zurückbleibt (ein Oxyanion), während die vierte Valenz des Kohlenstoffatoms durch eine Bindung mit dem Serin Oγ besetzt ist. Das Oxyanion bildet Wasserstoffbrückenbindungen mit zwei Hauptkettenamiden der Reste 193 (Gly) und 195 (Ser). Diese Bindungsstelle in Chymotrypsin stellt ein Beispiel für ein Oxyanion-Loch dar.
  • Der Ausdruck "Peptid" bezieht sich auf ein Oligomeres, bei dem es sich bei den Monomeren um Aminosäuren (üblicherweise α-Aminosäuren) handelt, die miteinander über Amidbindungen verbunden sind. Peptide weisen eine Länge von zwei oder mehr Aminosäuremonomeren auf, häufiger aber von 5 bis 10 Aminosäuremonomeren und sogar noch mehr, d.h. bis zu 20 Aminosäuren oder mehr, so dass Peptide mit mehr als 20 Aminosäuren in Betracht kommen.
  • Der Ausdruck "Protein" ist aus dem Stand der Technik bekannt und bezieht sich üblicherweise auf ein sehr großes Polypeptid oder auf einen Satz von assoziierten, homologen oder heterologen Polypeptiden, der eine bestimmte biologische Funktion aufweist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Polypeptid" und "Protein" in austauschbarer Weise verwendet.
  • Der Ausdruck "willkürliche Peptidbibliothek" bezieht sich auf einen Satz von willkürlichen oder halbwillkürlichen Peptiden sowie auf Sätze von Fusionsproteinen mit einem Gehalt an derartigen willkürlichen Peptiden (sofern anwendbar).
  • Der Ausdruck "synthetisch" bezieht sich auf eine chemische in vitro-Synthese oder auf eine enzymatische Synthese.
  • Die Ausdrücke "individuell selektive Weise" und "individuell selektive Bindung" in Bezug auf die Bindung eines Testinhibitors an ein Zielenzym bezieht sich auf eine Bindung, die für die molekulare Identität des Protein-Enzyms und den Peptidylteil des Inhibitors spezifisch und von dieser abhängig ist.
  • Die Ausdrücke "D-Aminosäure" und "L-Aminosäure" bezeichnen jeweils eine absolute Konfiguration, die durch Konvention für die möglichen Stereoisomeren von Glycerinaldehyd festgelegt ist. Somit werden sämtliche Stereoisomeren, die stereochemisch mit L-Glycerinaldehyd verwandt sind, als "L-" und sämtliche Isomere, die mit D-Glycerinaldehyd verwandt sind, als "D-" bezeichnet, unabhängig von der Richtung, in der die Ebene von polarisiertem Licht durch das gegebene Isomere gedreht wird. Im Fall von Threonin und Isoleucin gibt es zwei stereochemische Zentren, d.h. die Cα- und die Cβ-Atome. Die hier verwendeten D-Threonin und D-Isoleucin weisen vorzugsweise an beiden chiralen Zentren eine stereochemische Beschaffenheit auf, die entgegengesetzt (enantiomer) zur stereochemischen Beschaffenheit der L-Enantiomeren dieser Aminosäuren ist, d.h. sie verhalten sich vollkommen spiegelbildlich. Glycin ist die einzige üblicherweise auftretende achirale Aminosäure. Wenn demzufolge ein Peptid als D- oder L-Enantiomeres bezeichnet wird, ist darunter zu verstehen, dass im Wesentlichen sämtliche chiralen Aminosäurereste, die ein derartiges Peptid umfasst, die angegebene Chiralität aufweisen. Die Anwesenheit von achiralen Aminosäureresten, wie Glycin, beeinflusst nicht die Bezeichnung der Chiralität für ein Peptid. Bei sämtlichen chiralen Aminosäuren in Proteinen, die in der Natur auftreten, handelt es sich um L-Aminosäuren.
  • Der Ausdruck "Stereoisomere" bezieht sich auf Verbindungen mit identischer chemischer Konstitution, die sich aber bezüglich der räumlichen Anordnung der Atome oder Gruppen unterscheiden. Insbesondere bezieht sich der Ausdruck "Enantiomere" auf zwei Stereoisomere einer Verbindung, bei denen es sich um nicht zur Deckung zu bringende Spiegelbilder handelt. Der Ausdruck "Diastereomere" betrifft andererseits Stereoisomere mit zwei oder mehr Asymmetriezentren, deren Moleküle zueinander sich nicht spiegelbildlich verhalten. In Bezug auf die Nomenklatur eines chiralen Zentrums werden die Ausdrücke "D"- und "L"-Konfiguration gemäß der Definition nach den IUPAC-Empfehlungen verwendet. Die Ausdrücke Diastereomere, Razemate und Enantiomere werden im normalen Zusammenhang zur Beschreibung der stereochemischen Beschaffenheit von Peptidpräparaten verwendet.
  • Gleichermaßen beziehen sich die Ausdrücke "enantiomer angereichert" und "nicht-razemisch", die hier in austauschbarer Weise für Präparate eines Moleküls verwendet werden, auf Präparate einer chiralen Verbindung, bei denen eines der Enantiomeren in wesentlichem Umfang fehlt. Beispielsweise bezieht sich bei Bezugnahme auf Peptide der Ausdruck "enantiomer angereichert" auf ein Präparat, bei dem die enantiomeren L- oder D-Seitenketten an einer bestimmten Position im Peptid angereichert sind.
  • Der Ausdruck "degenerierte Peptidbibliothek" dient zur Beschreibung von Populationen von Peptiden, bei denen verschiedene Aminosäurereste an der gleichen Position in verschiedenen Peptiden innerhalb der Bibliothek vorliegen. Beispielsweise würde es sich bei einer Population von Peptiden mit einer Länge von 10 Aminosäuren, bei denen der Aminosäurerest in Position 5 der Peptide ein beliebiger Rest der 20 Aminosäuren sein kann, um eine degenerierte Peptidbibliothek handeln. Eine Position innerhalb der Peptide, die durch verschiedene Aminosäuren in verschiedenen Peptiden besetzt wird, wird hier als "degenerierte Position" bezeichnet. Eine Position innerhalb der Peptide, die in verschiedenen Peptiden durch die gleiche Aminosäure besetzt wird, wird hier als "nicht-degenerierte Position" bezeichnet. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete "orientierte, degenerierte Peptidbibliothek" ist aus Peptiden zusammengesetzt, die eine funktionelle Gruppe aufweisen, die ein Addukt mit einem Zielenzym an einer fixierten, nicht-degenerierten Position bilden kann. Dies bedeutet, dass die innerhalb der Bibliothek enthaltenen Peptide alle die gleiche funktionelle Gruppe an der gleichen Position innerhalb der Peptide enthalten.
  • Der hier verwendete Ausdruck "vielfältig variiert" bezieht sich auf die Tatsache, dass eine Population von Peptiden dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Peptidsequenz aufweist, die sich von einem Mitglied der Bibliothek zum nächsten Mitglied unterscheidet. Beispielsweise wird in einer gegebenen Peptidbibliothek mit einer Länge von n Aminosäuren die Gesamtzahl von unterschiedlichen Peptidsequenzen in der Bibliothek durch das Produkt ν1 × ν2 × .....νn–1 × νn, wobei νn die Anzahl der verschiedenen Aminosäurereste, die an jeder Position n des Peptids auftreten, bedeutet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ergibt das Peptidsortiment gemeinsam eine Peptidbibliothek mit mindestens 96 bis 107 verschiedenen Peptiden, so dass verschiedene Peptide gleichzeitig auf ihre Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem Zielprotein getestet werden können.
  • Der Ausdruck "Alkyl" ist aus dem Stand der Technik bekannt und bezieht sich auf gesättigte, aliphatische Gruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, einschließlich geradkettigen Alkylgruppen, verzweigten Alkylgruppen, Cycloalkylgruppen (alicyclischen Gruppen), alkylsubstituierten Cycloalkylgruppen und cycloalkylsubstituierten Alkylgruppen. Derartige Kohlenwasserstoffreste können an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen beispielsweise durch ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Aminogruppe oder eine Nitrogruppe substituiert sein. Im Fall von Cycloalkylresten können derartige Substituenten zusätzlich Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkylamino, Alkylcarboxyl, Nitro, Hydroxyl, -CF3, -CN oder dergl. umfassen. Sofern die Anzahl an Kohlenstoffatomen nicht anderweitig definiert ist, bedeutet der hier verwendete Ausdruck "nieder-Alkyl" eine Alkylgruppe gemäß der vorstehenden Definition, die aber 1 bis 6 Kohlenstoffatome anstelle von 1 bis 10 Kohlenstoffatom aufweist. Gleichermaßen haben "nieder-Alkenyl" und "nieder-Alkinyl" ähnliche Kettenlängen.
  • Repräsentativ für derartige Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, 2-Chlorpropyl, n-Butyl, sec.-Butyl, 2-Aminobutyl, Isobutyl, tert.-Butyl, 3-Thiopentyl und dergl. Zu weiteren beispielhaften "Alkylresten" gehören CH2Cl, CH2F, CHF2 und CF3. Der hier verwendete Ausdruck "Amino" bedeutet – NH2. Der Ausdruck "Nitro" bedeutet -NO2. Der Ausdruck "Halogen" bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I. Der Ausdruck "Thiol" bedeutet SH. Der Ausdruck "Hydroxyl" bedeutet -OH. Somit bedeutet der hier verwendete Ausdruck "Alkylamino" eine Alkylgruppe gemäß der vorstehenden Definition mit einer daran gebundenen Aminogruppe. Der Ausdruck "Alkylthio" bezieht sich auf eine Alkylgruppe gemäß der vorstehenden Definition mit einer daran gebundenen Sulfhydrylgruppe. Der hier verwendete Ausdruck "Alkylcarboxyl" bedeutet eine Alkylgruppe gemäß der vorstehenden Definition mit einer daran gebundenen Carboxylgruppe. Der hier verwendete Ausdruck "Alkoxy" bedeutet eine Alkylgruppe gemäß der vorstehenden Definition mit einem daran gebundenen Sauerstoffatom. Zu repräsentativen Alkoxygruppen gehören Methoxy, Ethoxy, Propoxy, tert.-Butoxy und dergl.
  • Die Ausdrücke "Alkenyl" und "Alkenyl" beziehen sich auf ungesättigte aliphatische Gruppen, die analog zu den Alkylgruppen sind, die aber mindestens eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Aryl" umfasst 4-, 5- und 6-gliedrige aromatische Gruppen mit einem einzigen Ring, die 1 bis 4 Heteroatome enthalten können, z.B. Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyrrolidin, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin und dergl. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen beispielsweise durch Halogen, nieder-Alkyl, nieder-Alkenyl, nieder-Alkoxy, nieder-Alkylthio, nieder-Alkylamino, nieder-Alkylcarboxyl, Nitro, Hydroxyl, -CF3, -CN oder dergl. substituiert sein.
  • Der Ausdruck "Heterocyclus" oder "heterocyclische Gruppe" bezieht sich auf 4-, 5- und 6-gliedrige alicyclische Gruppen mit einem einzigen Ring, die 1 bis 4 Heteroatome aufweisen können. Zu heterocyclischen Gruppen gehören Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Imidazol, Oxazol, Piperidin, Piperazin und Morpholin. Der alicyclische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen beispielsweise durch Halogen, nieder-Alkyl, nieder-Alkenyl, nieder-Alkoxy, nieder-Alkylthio, nieder-Alkylamino, nieder-Alkylcarboxyl, Nitro, Hydroxyl, -CF3, -CN oder dergl. substituiert sein.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Heteroatom" bedeutet ein Atom eines beliebigen Elementes, das sich von Kohlenstoff oder Wasserstoff unterscheidet. Bevorzugte Heteroatome sind Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Selen.
  • Die Ausdrücke "Aminosäurerest" und "Peptidrest" bedeuten ein Aminosäure- oder Peptidmolekül ohne die OH-Gruppe der Carboxylgruppe. Im Allgemeinen beruhen die hier verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Schutzgruppen auf den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (vergl. Biochemistry, Bd. 11 (1972), S. 1726–1732). Beispielsweise bedeuten Met, Ile, Leu, Ala und Gly die "Reste" von Methionin, Isoleucin, Leucin, Alanin bzw. Glycin. Unter der Bezeichnung "Rest" ist ein Rest zu verstehen, der sich von der entsprechenden α-Aminosäure durch Entfernen des OH-Teils der Carboxylgruppe und des H-Teils der α-Aminogruppe ergibt. Der Ausdruck "Aminosäureseitenkette" bezeichnet den Teil einer Aminosäure ohne den -CH(NH2)COOH-Teil gemäß der Definition von K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York und Amsterdam, 1966, S. 2 und 33. Zu Beispielen für derartige Seitenketten der gebräuchlichen Aminosäuren gehören -CH2CH2SCH3 (die Seitenkette von Methionin), -CH2(CH3)-CH2CH3 (die Seitenkette von Isoleucin), -CH2CH(CH3)2 (die Seitenkette von Leucin) oder H- (die Seitenkette von Glycin).
  • Größtenteils handelt es sich bei den in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Aminosäuren um natürlich auftretende Aminosäuren, die in Proteinen vorkommen, oder um natürlich auftretende anabole und katabole Produkte derartiger Aminosäuren, die Amino- und Carboxylgruppen enthalten. Besonders geeignete Aminosäureseitenketten sind die Seitenketten, die sich von folgenden Aminosäuren ableiten: Glycin, Alanin, Valin, Cystein, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Methionin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutamin, Asparagin, Lysin, Arginin, Prolin, Histidin, Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sowie Aminosäuren und Aminosäureanaloge, die als Bestandteile von Peptidylglycan-Bakterienzellwänden identifiziert worden sind.
  • Der Ausdruck Aminosäurerest umfasst ferner Analoge, Derivate und verwandte Produkte von beliebigen hier erwähnten speziellen Aminosäuren sowie C-terminal oder N-terminal geschützte Aminosäurederivate (z.B. mit einer N-terminalen oder C-terminalen Schutzgruppe modifiziert). Beispielsweise kommt erfindungsgemäß die Verwendung von Aminosäureanalogen in Frage, bei denen eine Seitenkette verlängert oder verkürzt ist, während immer noch eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe oder eine andere reaktive funktionelle Vorläufergruppe für die Cyclisierung bereitgestellt wird, sowie Aminosäureanaloge mit varianten Seitenketten mit geeigneten funktionellen Gruppen. Beispielsweise kann die Verbindung der Erfindung ein Aminosäureanaloges umfassen, wie Cyanoalanin, Canavanin, Djenkolsäure, Norleucin, 3-Phosphoserin, Homoserin, Dihydroxyphenylalanin, 5-Hydroxytryptophan, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin, Diaminopimelinsäure, Ornithin oder Diaminobuttersäure. Weitere natürlich auftretende Aminosäuremetaboliten oder Vorläufer mit Seitenketten, die geeignet sind, sind dem Fachmann geläufig und fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Ferner fallen darunter die (D)- und (L)-Stereoisomeren derartiger Aminosäuren, wenn die Struktur der Aminosäure stereoisomere Formen erlaubt. Die Konfiguration der Aminosäuren und der Aminosäurereste wird hier durch die entsprechenden Symbole (D), (L) oder (DL) bezeichnet. Wenn die Konfiguration nicht angegeben ist, kann die Aminosäure oder der Rest die Konfiguration (D), (L) oder (DL) aufweisen. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Struktur einiger der erfindungsgemäßen Verbindungen asymmetrische Kohlenstoffatome enthält. Demzufolge fallen Isomere, die sich aus einer derartigen Asymmetrie ergeben, unter den Umfang der Erfindung. Derartige Isomere können in im Wesentlichen reiner Form durch klassische Trenntechniken und durch stereochemisch gesteuerte Synthese erhalten werden. Für die Zwecke dieser Anmeldung soll eine bezeichnete Aminosäure (sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben wird) sowohl das (D)-als auch das (L)-Stereoisomere umfassen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Schutzgruppe" bedeutet Substituenten, die die reaktive funktionelle Gruppe vor unerwünschten chemischen Reaktionen schützen. Zu Beispielen für derartige Schutzgruppen gehören Ester von Carbonsäuren und Boronsäuren, Ether von Alkoholen und Acetalen und Ketale von Aldehyden und Ketonen. Beispielsweise können die hier verwendeten Ausdrücke "N-terminale Schutzgruppe" oder "Aminoschutzgruppe" verschiedene Aminoschutzgruppen bedeuten, die zum Schutz des N-Terminus einer Aminosäure oder eines Peptids vor unerwünschten Reaktionen während der synthetischen Vorgänge verwendet werden können. Zu Beispielen für geeignete Gruppen gehören Acylschutzgruppen, wie Formyl, Dansyl, Acetyl, Benzoyl, Trifluoracetyl, Succinyl und Methoxysuccinyl; aromatische Urethanschutzgruppen, wie Benzyloxycarbonyl (Cbz); und aliphatische Urethanschutzgruppen, wie tert.-Butoxycarbonyl (Boc) oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC).
  • Aminoderivatgruppen, die am N-Terminus eines Peptidsubstrats vorhanden sein können, umfassen (ohne dass vom Schutzumfang der Erfindung abgewichen wird) Epoxysuccinyl-, Cholesteryl-, Aryl-, Aralkyl- und Acylderivate. Carboxyderivatgruppen, die am C-Terminus eines Peptidsubstrats vorhanden sein können (ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen) umfassen Alkohol-, Aldehyd-, Epoxysuccinat-, Säurehalogenid-, Carbonyl-, Halogenmethan- und Diazomethanderivate.
  • Wie vorstehend erwähnt, können bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen in speziellen geometrischen oder stereoisomeren Formen vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfasst alle diese Verbindungen, einschließlich die cis- und trans-Isomeren, R- und S-Enantiomeren, Diastereomeren, (D)-Isomeren, (L)-Isomeren, die razemischen Gemische davon und andere Gemische, die alle unter den Schutzumfang der Erfindung fallen. Zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome können in einem Substituenten, z.B. einer Alkylgruppe, vorliegen. Alle derartigen Isomeren sowie Gemische davon fallen unter die Erfindung.
  • Wenn beispielsweise ein spezielles Enantiomeres einer erfindungsgemäßen Verbindung angestrebt wird, kann dieses durch asymmetrische Synthese oder durch Derivatbildung mit einem chiralen Hilfsstoff erreicht werden, wobei das erhaltene diastereomere Gemisch abgetrennt und die Hilfsgruppe abgespalten wird, um die angestrebten reinen Enantiomeren bereitzustellen. Alternativ werden dann, wenn das Molekül eine basische funktionelle Gruppe, z.B. eine Aminogruppe, oder eine saure funktionelle Gruppe, z.B. eine Carboxylgruppe, enthält, diastereomere Salze mit einer geeigneten, optisch aktiven Säure oder Base gebildet, wonach die Aufrennung der auf diese Weise gebildeten Diastereomeren durch fraktionierende Kristallisation oder chromatographische Maßnahmen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, sowie hierauf die Gewinnung der reinen Enantiomeren folgt. Alle diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Der Ausdruck "Boronsäure" ist bekannt und bezieht sich auf ein organisches Molekül mit der funktionellen Gruppe -B(OH)2. Boronsäureester, bei denen es sich um Analoge von Boronsäuren handelt, bei denen eine oder alle beide Hydroxylreste durch Alkoxygruppen ersetzt sind, lassen sich leicht unter Frei setzung der entsprechenden Boronsäure hydrolysieren. Sie fallen daher unter den hier verwendeten Ausdruck Boronsäure.
  • Der Ausdruck "Aldehyd" stellt einen bekannten Ausdruck zur Bezeichnung eines organischen Moleküls mit der funktionellen Gruppe -CHO dar.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Trifluormethylketon" bezeichnet beliebige organische Verbindungen mit der funktionellen Gruppe -C(=O)CF3, wobei diese funktionelle Gruppe an ein Kohlenstoffatom des Moleküls gebunden ist.
  • Der Ausdruck "alpha-Ketocarbonsäurederivat" ist bekannt und bezeichnet organische Verbindungen mit der funktionellen Gruppe -C(=O)C(=O)X, wobei diese funktionelle Gruppe an ein Kohlenstoffatom des Moleküls gebunden ist und X ein substituiertes oder unsubstituiertes Heteroatom bedeutet, einschließlich substituierte und unsubstituierte Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatome.
  • Der Ausdruck "Halogenmethylketon" umfasst Strukturen, die beispielsweise eine C(=O)CH2X-Gruppe umfassen, wobei X Halogen gemäß der vorstehenden Definition bedeutet. Strukturen mit mehr als einem Halogenatom (und entsprechend weniger als 2 Wasserstoffatomen) an dieser funktionellen Gruppe fallen unter den Ausdruck "Halogenmethylketon". Beispielsweise handelt es sich bei einem "Trihalogenmethylketon" um einen Rest, bei dem die Methylgruppe durch drei Halogenatome substituiert ist, die beispielsweise unter Br, Cl, F oder I ausgewählt sind, wobei die Halogenatome gleich oder unterschiedlich sein können.
  • (C) Beispielhafte Ausführungsformen
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu herangezogen werden, die Spezifität einer Vielzahl von unterschiedlichen Enzymen zu bestimmen, einschließlich Proteinasen, Kinasen, Phosphatasen, Lipasen und dergl. Bei den Enzymen kann es sich um Produkte von Tieren, Insekten, Pflanzen oder Mikroorganismen handeln. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Spezifität einer Peptidase herangezogen, z.B. eines Enzyms, das von der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (1984) in die Unterklasse EC 3.4.-.- eingeordnet wird. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Spezifität einer Aminopeptidase (EC 3.4.11.-), einer Dipeptidase (EC 3.4.13.-), einer Dipeptidyl-peptidase oder Tripeptidyl-peptidase (EC 3.4.14.-), einer Peptidyldipeptidase (EC 3.4.15.-), einer Carboxypeptidase vom Serintyp (EC 3.4.16.-), einer Metallocarboxypeptidase (EC 3.4.17.-), einer Carboxypeptidase vom Cysteintyp (EC 3.4.18.-), einer Omegapeptidase (EC 3.4.19.-), einer Serin-proteinase (EC 3.4.21.-), einer Cystein-proteinase (EC 3.4.22.-), einer Aspartat-proteinase (EC 3.4.23.-), einer Metalloproteinase (EC 3.4.24.-) oder einer Proteinase mit unbekanntem Mechanismus (EC 3.4.99.-) verwendet werden. Zu Beispielen für Peptid-hydrolyasen gehören:
    • 3.4.11.1 Leucyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.2 Membran-alanin-aminopeptidase.
    • 3.4.11.3 Cystinyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.4 Tripeptid-aminopeptidase.
    • 3.4.11.5 Prolyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.6 Aminopeptidase B.
    • 3.4.11.7 Glutamyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.9 Xaa-Pro-aminopeptidase.
    • 3.4.11.10 Bakterielle Leucyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.13 Clostridielle Aminopeptidase.
    • 3.4.11.14 Cytosol-Alanyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.15 Lysyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.16 Xaa-Trp-aminopeptidase.
    • 3.4.11.17 Tryptophanyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.18 Methionyl-aminopeptidase.
    • 3.4.11.19 D-stereospezifische Aminopeptidase.
    • 3.4.11.20 Aminopeptidase Ey.
    • 3.4.11.22 Vakuoläre Aminopeptidase I.
    • 3.4.13.3 Xaa-His-dipeptidase.
    • 3.4.13.4 Xaa-Arg-dipeptidase.
    • 3.4.13.5 Xaa-Methyl-His-dipeptidase.
    • 3.4.13.6 Cys-Gly-dipeptidase.
    • 3.4.13.7 Glu-Glu-dipeptidase.
    • 3.4.13.8 Pro-Xaa-dipeptidase.
    • 3.4.13.9 Xaa-Pro-dipeptidase.
    • 3.4.13.12 Met-Xaa-dipeptidase.
    • 3.4.13.17 Nicht-stereospezifische Dipeptidase.
    • 3.4.13.18 Nicht-spezifische Cytosol-dipeptidase.
    • 3.4.13.19 Membran-dipeptidase.
    • 3.4.13.20 Beta-Ala-His-dipeptidase.
    • 3.4.14.1 Dipeptidyl-peptidase I.
    • 3.4.14.2 Dipeptidyl-peptidase II.
    • 3.4.14.4 Dipeptidyl-peptidase III.
    • 3.4.14.5 Dipeptidyl-peptidase IV.
    • 3.4.14.6 Dipeptidyl-dipeptidase.
    • 3.4.14.9 Tripeptidyl-peptidase I
    • 3.4.14.10 Tripeptidyl-peptidase II.
    • 3.4.14.11 Xaa-Pro-dipeptidyl-peptidase.
    • 3.4.15.1 Peptidyl-dipeptidase A.
    • 3.4.15.4 Peptidyl-dipeptidase B.
    • 3.4.15.5 Peptidyl-dipeptidase Dcp.
    • 3.4.16.2 Lysosomale Pro-X-carboxypeptidase.
    • 3.4.16.4 D-Ala-D-Ala-carboxypeptidase vom Serintyp.
    • 3.4.16.5 Carboxypeptidase C.
    • 3.4.16.6 Carboxypeptidase D.
    • 3.4.17.1 Carboxypeptidase A.
    • 3.4.17.2 Carboxypeptidase B.
    • 3.4.17.3 Lysine-(arginin)-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.4 Gly-X-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.6 Alanin-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.7 übertragen in 3.4.19.10.
    • 3.4.17.8 Muramoylpentapeptid-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.10 Carboxypeptidase H.
    • 3.4.17.11 Glutamat-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.12 Carboxypeptidase M.
    • 3.4.17.13 Muramoyltetrapeptid-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.14 Zink-D-Ala-D-Ala-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.15 Carboxypeptidase A2.
    • 3.4.17.16 Membran-Pro-X-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.17 Tubulinyl-Tyr-carboxypeptidase.
    • 3.4.17.18 Carboxypeptidase T.
    • 3.4.17.19 Thermostabile Carboxypeptidase I.
    • 3.4.17.20 Carboxypeptidase U.
    • 3.4.17.21 Glutamat-carboxypeptidase II.
    • 3.4.17.22 Metallocarboxypeptidase D.
    • 3.4.18.1 Carboxypeptidase vom Cysteintyp.
    • 3.4.19.1 Acylaminoacyl-peptidase.
    • 3.4.19.2 Peptidyl-glycinamidase.
    • 3.4.19.3 Pyroglutamyl-peptidase I.
    • 3.4.19.5 beta-Aspartyl-peptidase.
    • 3.4.19.6 Pyroglutamyl-peptidase II.
    • 3.4.19.7 N-Formylmethionyl-peptidase.
    • 3.4.19.8 Pteroylpoly-gamma-glutamat-carboxypeptidase.
    • 3.4.19.9 gamma-Glutamyl-hydrolase.
    • 3.4.19.11 gamma-D-Glutamyl-meso-diaminopimelat-peptidase I.
    • 3.4.21.1 Chymotrypsin.
    • 3.4.21.2 Chymotrypsin C.
    • 3.4.21.3 Metridin.
    • 3.4.21.4 Trypsin
    • 3.4.21.5 Thrombin
    • 3.4.21.6 Koagulationsfaktor Xa.
    • 3.4.21.7 Plasmin.
    • 3.4.21.8 übertragen in 3.4.21.34 und 3.4.21.35.
    • 3.4.21.9 Enteropeptidase.
    • 3.4.21.10 Acrosin.
    • 3.4.21.11 übertragen in 3.4.21.36 und 3.4.21.37.
    • 3.4.21.12 alpha-lytische Endopeptidase.
    • 3.4.21.19 Glutamyl-endopeptidase.
    • 3.4.21.20 Cathepsin G.
    • 3.4.21.21 Koagulationsfaktor VIIa.
    • 3.4.21.22 Koagulationsfaktor IXa.
    • 3.4.21.25 Cucumisin.
    • 3.4.21.26 Prolyl-oligopeptidase.
    • 3.4.21.27 Koagulationsfaktor XIa.
    • 3.4.21.32 Brachyurin.
    • 3.4.21.34 Plasma-kallikrein.
    • 3.4.21.35 Gewebe-kallikrein.
    • 3.4.21.36 Pankreatische Elastase
    • 3.4.21.37 Leukozytenelastase.
    • 3.4.21.38 Koagulationsfaktor XIIa.
    • 3.4.21.39 Chymase.
    • 3.4.21.41 Komplementkomponente CIr.
    • 3.4.21.42 Komplementkomponente CIs.
    • 3.4.21.43 C3/C5-Convertase des klassischen Komplementwegs.
    • 3.4.21.45 Komplementfaktor I.
    • 3.4.21.46 Komplementfaktor D.
    • 3.4.21.47 C3/C5-Convertase des alternativen Komplementwegs.
    • 3.4.21.48 Cerevisin.
    • 3.4.21.49 Hypodermin C.
    • 3.4.21.50 Lysyl-endopeptidase.
    • 3.4.21.53 Endopeptidase La.
    • 3.4.21.54 gamma-Renin.
    • 3.4.21.55 Venombin AB.
    • 3.4.21.57 Leucyl-endopeptidase.
    • 3.4.21.59 Tryptase.
    • 3.4.21.60 Scutelarin.
    • 3.4.21.61 Kexin.
    • 3.4.21.62 Subtilisin.
    • 3.4.21.63 Oryzin.
    • 3.4.21.64 Proteinase K.
    • 3.4.21.65 Thermomycolin.
    • 3.4.21.66 Thermitase.
    • 3.4.21.67 Endopeptidase So.
    • 3.4.21.68 T-Plasminogen-Aktivator.
    • 3.4.21.69 Protein C (aktiviert).
    • 3.4.21.70 pankreatische Endopeptidase E.
    • 3.4.21.71 pankreatische Elastase II.
    • 3.4.21.72 IgA-spezifische-Serin-endopeptidase.
    • 3.4.21.73 U-Plasminogen-Aktivator.
    • 3.4.21.74 Venombin A.
    • 3.4.21.75 Furin.
    • 3.4.21.76 Myeloblastin.
    • 3.4.21.77 Semenogelase.
    • 3.4.21.78 Granzym A.
    • 3.4.21.79 Granzym B.
    • 3.4.21.80 Streptogrisin A.
    • 3.4.21.81 Streptogrisin B.
    • 3.4.21.82 Glutamyl-endopeptidase II.
    • 3.4.21.83 Oligopeptidase B.
    • 3.4.21.84 Limulus Gerinnungsfaktor C
    • 3.4.21.85 Limulus Gerinnungsfaktor B.
    • 3.4.21.86 Limulus Gerinnungsenzym.
    • 3.4.21.87 Omptin.
    • 3.4.21.88 Repressor lexA.
    • 3.4.21.89 Signal-peptidase I.
    • 3.4.21.90 Togavirin.
    • 3.4.21.91 Flavirin.
    • 3.4.21.92 Endopeptidase Clp.
    • 3.4.21.93 Proprotein-convertase 1.
    • 3.4.21.94 Proprotein-convertase 2.
    • 3.4.21.95 Schlangengift-Faktor V-Aktivator.
    • 3.4.21.96 Lactocepin.
    • 3.4.22.1 Cathepsin B.
    • 3.4.22.2 Papain.
    • 3.4.22.3 Ficain.
    • 3.4.22.6 Chymopapain.
    • 3.4.22.7 Asclepain.
    • 3.4.22.8 Clostripain.
    • 3.4.22.10 Streptopain.
    • 3.4.22.14 Actinidain.
    • 3.4.22.15 Cathepsin L.
    • 3.4.22.16 Cathepsin H.
    • 3.4.22.17 Calpain.
    • 3.4.22.24 Cathepsin T.
    • 3.4.22.25 Glycyl-endopeptidase.
    • 3.4.22.26 Krebs-Prokoagulans.
    • 3.4.22.27 Cathepsin S.
    • 3.4.22.28 Picomain 3C.
    • 3.4.22.29 Picomain 2A.
    • 3.4.22.30 Caricain.
    • 3.4.22.31 Ananain.
    • 3.4.22.32 Stamm-bromelain.
    • 3.4.22.33 Frucht-bromelain.
    • 3.4.22.34 Legumain.
    • 3.4.22.35 Histolysain.
    • 3.4.22.36 Caspase-1.
    • 3.4.22.37 Gingipain R.
    • 3.4.22.38 Cathepsin K.
    • 3.4.23.1 Pepsin A.
    • 3.4.23.2 Pepsin B.
    • 3.4.23.3 Gastricsin.
    • 3.4.23.4 Chymosin.
    • 3.4.23.5 Cathepsin D.
    • 3.4.23.12 Neopenthesin.
    • 3.4.23.15 Renin.
    • 3.4.23.16 Retropepsin.
    • 3.4.23.17 Pro-opiomelanocortin-Converting-Enzym.
    • 3.4.23.18 Aspergillopepsin I.
    • 3.4.23.19 Aspergillopepsin II.
    • 3.4.23.20 Penicillopepsin.
    • 3.4.23.21 Rhizopuspepsin.
    • 3.4.23.22 Endothiapepsin.
    • 3.4.23.23 Mucoropepsin.
    • 3.4.23.24 Candidapepsin.
    • 3.4.23.25 Saccharopepsin.
    • 3.4.23.26 Rhodotorulapepsin.
    • 3.4.23.27 Physaropepsin.
    • 3.4.23.28 Acrocylindropepsin.
    • 3.4.23.29 Polyporopepsin.
    • 3.4.23.30 Pycnoporopepsin.
    • 3.4.23.31 Scytalidopepsin A.
    • 3.4.23.32 Scytalidopepsin B.
    • 3.4.23.33 Xanthomonapepsin.
    • 3.4.23.34 Cathepsin E.
    • 3.4.23.35 Barriere-pepsin.
    • 3.4.23.36 Signal-peptidase II.
    • 3.4.23.37 Pseudomonapepsin.
    • 3.4.23.38 Plasmepsin I.
    • 3.4.23.39 Plasmepsin II.
    • 3.4.23.40 Phytepsin.
    • 3.4.24.1 Atrolysin A.
    • 3.4.24.3 Mikrobielle Collagenase.
    • 3.4.24.6 Leucolysin.
    • 3.4.24.7 Interstitielle Collagenase.
    • 3.4.24.11 Neprilysin.
    • 3.4.24.12 Envelysin.
    • 3.4.24.13 IgA-spezifische Metalloendopeptidase.
    • 3.4.24.14 Procollagen N-endopeptidase.
    • 3.4.24.15 Thimet-oligopeptidase.
    • 3.4.24.16 Neurolysin.
    • 3.4.24.17 Stromelysin I.
    • 3.4.24.18 Meprin A.
    • 3.4.24.19 Procollagen C-endopeptidase.
    • 3.4.24.20 Peptidyl-Lys-metalloendopeptidase.
    • 3.4.24.21 Astacin.
    • 3.4.24.22 Stromelysin 2.
    • 3.4.24.23 Matrilysin.
    • 3.4.24.24 Gelatinase A.
    • 3.4.24.25 Aeromonolysin.
    • 3.4.24.26 Pseudolysin.
    • 3.4.24.27 Thermolysin.
    • 3.4.24.28 Bacillolysin.
    • 3.4.24.29 Aureolysin.
    • 3.4.24.30 Coccolysin.
    • 3.4.24.31 Mycolysin.
    • 3.4.24.32 beta-lytische Metalloendopeptidase.
    • 3.4.24.33 Peptidyl-Asp-metalloendopeptidase.
    • 3.4.24.34 Neutrophilen-collagenase.
    • 3.4.24.35 Gelatinase B.
    • 3.4.24.36 Leishmanolysin.
    • 3.4.24.37 Saccharolysin.
    • 3.4.24.38 Autolysin.
    • 3.4.24.39 Deuterolysin.
    • 3.4.24.40 Serralysin.
    • 3.4.24.41 Atrolysin B.
    • 3.4.24.42 Atrolysin C.
    • 3.4.24.43 Atroxase.
    • 3.4.24.44 Atrolysin E.
    • 3.4.24.45 Atrolysin F.
    • 3.4.24.46 Adamalysin.
    • 3.4.24.47 Horrilysin.
    • 3.4.24.48 Ruberlysin.
    • 3.4.24.49 Bothropasin.
    • 3.4.24.50 Bothrolysin.
    • 3.4.24.51 Ophiolysin.
    • 3.4.24.52 Trimerelysin I.
    • 3.4.24.53 Trimerelysin II.
    • 3.4.24.54 Mucrolysin.
    • 3.4.24.55 Pitrilysin.
    • 3.4.24.56 Insulysin.
    • 3.4.24.57 O-Sialoglycoprotein-endopeptidase.
    • 3.4.24.58 Russellysin.
    • 3.4.24.59 Mitochondrielle intermediäre Peptidase.
    • 3.4.24.60 Dactylysin.
    • 3.4.24.61 Nardilysin.
    • 3.4.24.62 Magnolysin.
    • 3.4.24.63 Meprin B.
    • 3.4.24.64 Mitochondrielle prozessierende Peptidase.
    • 3.4.24.65 Macrophagen-elastase.
    • 3.4.24.66 Choriolysin L.
    • 3.4.24.67 Choriolysin H.
    • 3.4.24.68 Tentoxilysin.
    • 3.4.24.69 Bontoxilysin.
    • 3.4.24.70 Oligopeptidase A.
    • 3.4.24.71 Endothelin-Converting-Enzym I.
    • 3.4.24.72 Fibrolase.
    • 3.4.24.73 Jararhagin.
    • 3.4.24.74 Fragilysin.
    • 3.4.99.46 Multikatalytischer Endopeptidase-Komplex.
  • i) Synthetische Peptidbibliotheken
  • Bei Peptidbibliotheken handelt es sich um Systeme, die gleichzeitig eine hochgradig unterschiedlich und zahlenmäßig große Sammlung von Peptiden darstellen, und zwar in einer Form, die eine Wechselwirkung mit einem Zielprotein ermöglicht. Bei bevorzugten Ausführungsformen weisen die Kombinationspolypeptide eine Länge im Bereich von 3 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens 5 bis 50 und insbesondere von mindestens 10, 13, 15, 20 oder 25 Aminosäureresten auf. Es ist ersichtlich, dass die Länge des Kombinationspeptids keine fremden Sequenzen berücksichtigt, die vorhanden sein können, um die Reinigung zu erleichtern oder dergl.
  • Bei einem bevorzugten Typ einer orientierten, degenerierten Peptidbibliothek zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine lösliche synthetische Peptidbibliothek. Der Ausdruck "lösliche synthetische Peptidbibliothek" bedeutet eine Population von Peptiden, die durch eine chemische in vitro-Synthese konstruiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines automatisierten Peptidsynthesegeräts, und die nicht an einen festen Träger, z.B. an ein Kügelchen oder eine Zelle, gebunden sind. Standardtechniken zur chemischen in vitro-Synthese von Peptiden sind bekannt. Beispielsweise lassen sich Peptide durch (Benzotriazolyloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat (BOP)/1-Hydroxybenzotriazol-Kupplungsverfahren synthetisieren. Automatisierte Peptidsynthesegeräte sind im Handel erhältlich (z.B. Milligen/Biosearch 9600).
  • Im Gegensatz zu rekombinanten Verfahren, die für bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung herangezogen werden können, bietet eine chemische in vitro-Synthese ein Verfahren zur Erzeugung von Bibliotheken von Verbindungen (ohne die Verwendung von lebenden Organismen), die auf ihre Fähigkeit zur Bindung an ein Zielprotein abgesucht werden können. Obgleich in vitro-Verfahren schon seit einiger Zeit in der pharmazeutischen Industrie zur Identifizierung von potentiellen Arzneistoffen verwendet werden, haben sich die in letzter Zeit entwickelten Verfahren auf ein rasches und wirksames Erzeugen und Screening einer großen Anzahl von Verbindungen konzentriert und sind insbesondere zur Erzeugung von Peptidbibliotheken mit nicht-natürlichen funktionellen Gruppen zur Verwendung im vorliegenden Verfahren geeignet. Die verschiedenen Wege zur gleichzeitigen Herstellung und Analyse einer großen Anzahl von synthetischen Peptiden (hier als "Mehrfachpeptidsynthese" oder "MPS" bezeichnet) beruhen jeweils auf dem Grundkonzept der Synthese an einem festen Träger, das im Jahre 1963 von Merrifield eingeführt wurde (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Bd. 85 (1963), S. 2149-2154 und die dort im Abschnitt I genannten Literaturstellen). Im Allgemeinen sind diese Techniken nicht von der verwendeten Schutzgruppe oder der eingesetzten chemischen Aktivierung abhängig, obgleich die meisten Bearbeiter derzeit die ursprüngliche tBoc/Bzl-Merrifield-Strategie zu Gunsten der sanfteren Fmoc/tBu-Chemie und von wirksamen Kupplungsmitteln auf der Basis von Hydroxybenzotriazol vermeiden. Zahlreiche Typen von festen Matrices wurden erfolgreich bei der MPS eingesetzt. Die Ausbeuten der synthetisierten individuellen Peptide variieren stark in Abhängigkeit von der angewandten Technik (z.B. Nanomol bis Millimol).
  • a) Multipin-Synthese
  • Eine Form der Peptidbibliothek des vorliegenden Verfahrens kann sich des Multipin-Bibliothekformats bedienen. Kurz zusammengefasst, Geysen und Mitarbeiter (Geysen et al., PNAS, Bd. 81 (1984), S. 3998–4002) führten ein Verfahren zur Erzeugung von Peptiden durch eine parallele Synthese an im Mikrotiterplattenformat angeordneten Stäbchen aus mit Polyacrylsäure gepfropftem Polyethylen ein. Bei den ursprünglichen Experimenten wurden etwa 50 nmol einer einzelnen Peptidsequenz kovalent mit dem kugelförmigen Kopf eines jeden Stäbchens verknüpft und Wechselwirkungen der einzelnen Peptide mit einem Rezeptor oder Antikörper konnten in einem direkten Bindungstest bestimmt werden. Die Geysen-Technik kann zur Synthese und zum Screening von Tausenden von Peptiden pro Woche unter Anwendung des Multipin-Verfahrens herangezogen werden. Die gebundenen Peptide können in zahlreichen Tests wiederverwendet werden. In anschließenden Arbeiten wurde das Ausmaß der Peptidbeladung auf den einzelnen Stäbchen auf 2 umol/Stäbchen erhöht, indem man entweder größere Mengen an funktionalisierten Acrylatderivaten auf lösbare Stäbchenköpfe pfropfte, und die Größe der Peptidbibliothek wurde erhöht (Valerio et al., Int. J. Pept. Protein Res., Bd. 42 (1993) S. 1–9). Geeignete Linkerreste wurden ferner an den Stäbchen angebracht, so dass die Peptide nach der Synthese von den Trägern abgespalten werden können, um eine Bestimmung der Reinheit und eine Bewertung der kompetitiven Bindung oder funktionelle biologische Tests durchzuführen (Bray et al., Tetrahedron Lett., Bd. 31 (1991), S. 5811–5814; Valerio et al., Anal. Biochem., Bd. 197 (1991), S. 168–177; Bray et al., Tetrahedron Lett., Bd. 32 (1991), S. 6163–6166).
  • Neuere Anwendungen des Multipin-Verfahrens von MPS haben den Vorteil der Strategie mit spaltbaren Linkern zur Herstellung von löslichen Peptiden ausgenützt (Maeji et al., J. Immunol. Methods, Bd. 134 (1990), S. 23–33; Gammon et al., J. Exp. Med., Bd. 173 (1991), S. 609–617; Mutch et al., Pept. Res., Bd. 4 (1991), S. 132–137).
  • b) Teilung-Kupplung-Rekombination
  • Bei einer weiteren Ausführungsform lässt sich eine vielfach variierte Bibliothek von Peptiden auf einem Satz von Kügelchen unter Anwendung der Strategie "Teilung-Kupplung-Rekombination" bereitstellen (vergl. beispielsweise Houghten, PNAS, Bd. 82 (1985), S. 5131–5135; und US-Patente 4 631 211, 5 440 016 und 5 480 971). Kurz zusammengefasst, werden, wie der Name besagt, bei jeder Synthesestufe, bei der eine Degeneration in die Bibliothek eingeführt wird, die Kügelchen in eine so große Anzahl von getrennten Gruppen unterteilt, dass sie der Anzahl an unterschiedlichen Aminosäureresten, die an dieser Position zu addieren sind, entspricht. Die verschiedenen Reste werden in getrennten Reaktionen gekuppelt und die Kügelchen werden in der nächsten Stufe zu einem einzigen Pool vereinigt.
  • In einer Ausführungsform kann die Strategie der Teilung-Kupplung-Rekombination unter Anwendung des sogenannten "Teebeutel"-MPS-Verfahrens durchgeführt werden, das erstmals von Houghten entwickelt wurde. Die Peptidsynthese erfolgt an einem Harz, das im Innern von porösen Polypropylenbeuteln eingeschlossen ist (Houghten et al., PNAS, Bd. 82 (1986), S. 5131–5135). Aminosäuren werden an die Harze gekuppelt, indem man die Beutel in Lösungen der entsprechenden individuellen aktivierten Monomeren bringt, wobei sämtliche üblichen Stufen, wie das Waschen des Harzes und die Schutzgruppenentfernung an der α-Aminogruppe, gleichzeitig in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Am Syntheseende enthalten die einzelnen Beutel eine einzige Peptidsequenz. Die Peptide können von den Harzen unter Verwendung einer Mehrfachspaltungsvorrichtung freigesetzt werden (Houghten et al., Int. J. Pept. Protein Res., Bd. 27 (1986), S. 673–678). Diese Technik bietet Vorteile in Bezug auf eine erhebliche Syntheseflexibilität und wurde partiell automatisiert (Beck-Sickinger et al., Pept. Res., Bd. 4 (1991), S. 88–94). Außerdem lassen sich gegebenenfalls lösliche Peptide mit einer Länge von mehr als 15 Aminosäuren in für die Reinigung und vollständige Charakterisierung ausreichenden Mengen (>500 μmol) herstellen.
  • Die Mehrfachpeptidsynthese unter Anwendung des Teebeutel-Verfahrens eignet sich für die Herstellung einer Peptidbibliothek (wenngleich von begrenzter Größe) für Screeningvorgänge des vorliegenden Verfahrens, wie durch dessen Anwendung bei einer Reihe von Molekülerkennungsproblemen dargelegt wird, einschließlich Antikörper-Epitop-Analyse (Houghten et al., PNAS, Bd. 82 (1986), S. 5131–5135), Peptid-Hormonstruktur-Funktionsuntersuchungen (Beck-Sickinger et al., Int. J. Pept. Protein Res., Bd. 36 (1990), S. 522–530; Beck-Sickinger et al., Eur. J. Biochem., Bd. 194 (1990), S. 449–456) und Protein-Konformationskartierung (Zimmerman et al., Eur. J. Biochem., Bd. 200 (1991), S. 519–528).
  • Nachstehend wird eine beispielhafte Synthese eines Satzes von gemischten Peptiden mit äquimolaren Mengen der 20 natürlichen Aminosäurereste erläutert. Aliquotanteile von 5 g (4,65 mmol) p-Methylbenzhydrylamin-hydrochlorid-Harz (MBHA) werden in 20 poröse Polypropylenbeutel gegeben. Diese Beutel werden in einen gemeinsamen Behälter gebracht und 3-mal mit 1,0 Liter CH2Cl2 gewaschen (jeweils 3 Minuten) und sodann erneut 3-mal (jeweils 3 Minuten) mit 1,0 Liter 5 % DIEA/CH2Cl2 (DIEA = Diisopropylethylamin; CH2Cl2 = DCM) gewaschen. Anschließend werden die Beutel mit DCM gespült und in getrennte Reaktionsgefäße gegeben, die jeweils 50 ml (0,56 M) der entsprechenden t-BOC-Aminosäure/DCM enthalten. N,N-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI, 25 ml, 1,12 M) wird in jeden Behälter als Kupplungs mittel gegeben. 20 Aminosäurederivate werden ge-trennt an das Harz in 50/50 (Vol./Vol.) DMF/DCM gekuppelt. Nach 1-stündigem heftigem Schütteln wird der Gisen-Picrinsäuretest (Gisen, Anal. Chem. Acta, Bd. 58 (1972), S. 248–249) durchgeführt, um die Vollständigkeit der Kupplungsreaktion festzustellen. Nachdem die Vollständigkeit der Reaktion festgestellt worden ist, werden sämtliche Harzpäckchen mit 1,5 Liter DMF gewaschen und weitere 2-mal mit 1,5 Liter CH2Cl2 gewaschen.
  • Nach dem Spülen werden die Harze aus ihren getrennten Päckchen entnommen und in einem gemeinsamen Beutel zu einem Pool vermischt. Das erhaltene Harzgemisch wird sodann getrocknet und gewogen, wieder in 20 gleiche Teilmengen (Aliquotmengen) aufgeteilt und in 20 weitere Polypropylenbeutel gegeben (verschlossen).
  • In einem gemeinsamen Reaktionsgefäß werden die folgenden Stufen durchgeführt: (1) eine Schutzgruppenentfernung an den verschlossenen Aliquotanteilen wird 30 Minuten mit 1,5 Liter 55 % TFA/DCM durchgeführt; und 2) eine Neutralisation wird mit drei Waschflüssigkeiten von jeweils 1,5 Liter 5 DIEA/DCM durchgeführt. Die einzelnen Beutel werden in getrennte Lösungen eines aktivierten t-BOC-Aminosäurederivats gegeben und die Kupplungsreaktion wird auf die vorstehend angegebene Weise bis zum Ende durchgeführt. Sämtliche Kupplungsreaktionen werden unter Anwendung des vorstehenden quantitativen Picrinsäuretests überwacht.
  • Sodann werden die Beutel geöffnet. Die erhaltenen t-BOCgeschützten Dipeptidharze werden zu einem Pool vermischt. Aus dem Pool werden Aliquotmengen gebildet und diese Aliquotmengen werden verschlossen. Nach Schutzgruppenentfernung werden weitere Reaktionen durchgeführt. Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden, wobei bei jeder Stufe eine äquimolare Wiedergabe der angestrebten Anzahl an Amino säureresten in der Peptidkette erfolgt. Die Hauptverfahrensstufen werden zweckmäßigerweise als Synthese unter Teilung-Kupplung-Rekombination bezeichnet.
  • Nachdem eine angestrebte Anzahl an derartigen Kupplungs- und Mischvorgängen durchgeführt worden ist, werden die Polypropylenbeutel getrennt, so dass sich 20 Sätze mit dem aminoterminalen Rest als einzigem, vorbestimmten Rest ergeben, wobei beispielsweise die Positionen 2–4 von äquimolaren Mengen der 20 Reste besetzt sind. Zur Herstellung von Sätzen, die den einzelnen, vorbestimmten Aminosäurerest an Positionen, der vom Aminoterminus abweicht, enthalten, wird der Inhalt der Beutel nach Zugabe eines Restes an der angestrebten, vorbestimmten Position nicht vermischt. Statt dessen wird der Inhalt von jedem der 20 Beutel in 20 Aliquotmengen getrennt, einer Schutzgruppenentfernung unterzogen und sodann getrennt mit den 20 Aminosäurederivaten umgesetzt. Der Inhalt der einzelnen Sätze von 20 Beuteln, die auf diese Weise erzeugt worden sind, wird anschließend vermischt und auf die vorstehend beschriebene Weise behandelt, bis die angestrebte Oligopeptidlänge erreicht ist.
  • c) Mehrfachpeptidsynthese durch Kupplung von Aminosäuregemischen
  • sEine gleichzeitige Kupplung von Gemischen von aktivierten Aminosäuren an einen einzigen Harzträger wurde bei verschiedenen Gelegenheiten als Mehrfachpeptid-Synthesestrategie herangezogen (Geysen et al., Mol. Immunol., Bd. 23 (1986), S. 709–715; Tjoeng et al., Int. J. Pept. Protein Res., Bd. 35 (1990), S. 141–146; Rutter et al., (1991), US-Patent 5 010 175; Birkett et al., Anal. Biochem., Bd. 196 (1991), S. 137–143; Petithory et al., PNAS, Bd. 88 (1991), S. 11510–11514) und kann beim vorliegenden Verfahren angewandt werden. Beispielsweise wurden 4 bis 7 Analoge von Magainin-2- und Angiotensinogen-Peptiden mit Erfolg synthetisiert und in einer HPLC-Reinigung nach Kupplung eines Gemisches von Aminosäuren an einer einzigen Position in jeder Sequenz aufgetrennt (Tjoeng et al., Int. J. Pept. Protein Res., Bd. 35 (1990), S. 141–146). Dieser Weg wurde auch zur Herstellung von degenerierten Peptidgemischen für die Definition der Substratspezifität von endoproteolytischen Enzymen herangezogen (Birkett et al., Anal. Biochem., Bd. 196 (1991), S. 137–143; Petithory et al., PNAS, Bd. 88 (1991), S. 11510–11514). Bei diesen Versuchen wurde eine Reihe von Aminosäuren an einer einzigen Position innerhalb der Substratsequenz substituiert. Nach Proteolyse wurde ein Edman-Abbau durchgeführt, um die Ausbeute an einzelnen Aminosäurekomponenten im Hydrolyseprodukt quantitativ zu bestimmen und dadurch die relativen kcat/Km-Werte für jedes Substrat im Gemisch zu ermitteln.
  • Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Einfachheit der Durchführung der Synthese von zahlreichen Peptiden durch Kupplung von Monomergemischen durch die Schwierigkeit bei der Steuerung der Zusammensetzung der Produkte wettgemacht wird. Diese Produktverteilung widerspiegelt die individuellen Geschwindigkeitskonstanten für die konkurrierenden Kupplungsreaktionen, wobei aktivierte Derivate von sterisch gehinderten Resten, wie Valin oder Isoleucin, mit einer erheblich langsameren Geschwindigkeit addiert werden als aktivierte Derivate beispielsweise von Glycin oder Alanin. Ferner beeinflusst die Art der harzgebundenen Komponente der Acylierungsreaktion die Additionsgeschwindigkeit. Die relativen Geschwindigkeitskonstanten für die Bildung von 400 Dipeptiden aus den 20 genetisch kodierten Aminosäuren wurden von Rutter und Santi bestimmt (Rutter et al., (1991), US-Patent 5 010 175). Diese Reaktionsgeschwindigkeiten können dazu herangezogen werden, die Auswahl von geeigneten relativen Konzentrationen an Aminosäuren im Gemisch zu steuern, um äquimolare Kupplungsausbeuten besser zu begünstigen.
  • d) Mehrfachpeptidsynthese an nicht-traditionellen festen Trägern
  • Die Suche nach innovativen Verfahren der Mehrfachpeptidsynthese hat zur Erforschung von polymeren Trägern als Alternative zu der ursprünglich von Merrifield populär gemachten Polystyrol-Divinylbenzol-Matrix geführt. Cellulose, entweder in Form von Papierscheiben (Blankemeyer-Menge et al., Tetrahedron Lett., Bd. 29 (1988), S. 5871–5874; Frank et al., Tetrahedron, Bd. 44 (1988), S. 6031–6040; Eichler et al Collect. Czech Chem. Commun., Bd. 54 (1989), S. 1746-1752; R. Frank, Bioorg. Med. Chem. Lett., Bd. 3 (1993), S. 425–430) oder Wattefragmenten (Eichler et al., Pept. Res., Bd. 4 (1991), S. 296–307; Schmidt et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., Bd. 3 (1993), S. 441–446), wurde in erfolgreicher Weise für die Peptidsynthese funktionalisiert. Typische Beladungen von Cellulosepapapier betrugen 1 bis 3 μmol/cm2. Die HPLC-Analyse von Material, das aus diesen Trägern abgespalten worden ist, zeigt eine vernünftige Qualität der synthetisierten Peptide. Alternativ lassen sich Peptide auf Cellulosefolien über nicht-spaltbare Linker synthetisieren und anschließend bei Bindungsuntersuchungen auf der Basis von ELISA verwenden (R. Frank, Tetrahedron, Bd. 48 (1992), S. 9217–9232). Die poröse, polare Natur dieses Trägers kann dazu beitragen, unerwünschte, nicht-spezifische Proteinbindungseffekte zu unterdrücken. Durch Kontrollieren des Volumens von aktivierten Aminosäuren und anderen Reagenzien, die auf das Papier aufgetragen werden, lässt sich die Anzahl von synthetisierten Peptiden an einzelnen Positionen auf dem Träger leicht variieren. Gemäß einer zweckmäßigen Konfiguration werden die Aufsetzflecken in einem 8 × 12-Mikrotiterplattenformat vorgenommen. Frank hat diese Technik dazu herangezogen, die dominanten Epitope eines Antiserums gegen ein humanes Zytomegalovirus-Protein zu kartieren, wonach die überlappende Peptid-Screening-Strategie (Pepscan) von Geysen herangezogen wurde (R. Frank, Tetrahedron, Bd. 48 (1992), S. 9217–9232). Zu weiteren membranartigen Trägern, die für eine Mehrfach-Festphasensynthese verwendet werden können, gehören mit Polystyrol gepfropfte Polyethylenfolien (Berg et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 111 (1989), S. 8024–8026).
  • e) Kombinationsbibliotheken durch lichtgesteuerte, räumlich adressierbare, parallele chemische Synthese
  • Ein Schema einer Kombinationssynthese, bei der die Identität einer Verbindung aufgrund von deren Positionen an einem Synthesesubstrat angegeben wird, wird als räumlich adressierbare Synthese bezeichnet. Bei einer Ausführungsform wird das Kombinationsverfahren durchgeführt, indem man die Zugabe eines chemischen Reagenz zu bestimmten Positionen auf einem festen Träger steuert (Dower et al., Annu. Rep. Med. Chem, Bd. 26 (1991), S. 271–280; S. P. A. Fodor, Science, Bd. 251 (1991), S. 767; Pirrung et al., (1992), US-Patent 5 143 854; Jacobs et al., Trends Biotechnol., Bd. 12 (1994), S. 19–26). Diese Technik kombiniert zwei gut entwickelte Verfahrensweisen: die Chemie der Festphasen-Peptidsynthese und die Photolithographie. Die hohen Kupplungsausbeuten der Merrifield-Chemie erlauben eine effiziente Peptidsynthese, wobei die räumliche Auflösung der Photolithographie eine Miniaturisierung ermöglicht. Das Vereinigen dieser beiden Techniken wird durch Anwendung von photolabilen Aminoschutzgruppen beim Merrifield-Syntheseverfahren durchgeführt.
  • Die Schlüsselstellen dieser Technik werden von Gallop et al., J. Med. Chem., Bd. 37 (1994), S. 1233–1251, erläutert. Ein Synthesesubstrat wird für die Aminosäurekupplung durch kovalentes Binden von photolabilen, mit Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC) geschützten Aminolinkern hergestellt. Licht wird dazu verwendet, selektiv eine spezifische Region des Syntheseträgers für die Kupplung zu aktivieren. Die Entfernung der photolabilen Schutzgruppen durch Licht (Schutzgruppenentfernung) führt zur Aktivierung von ausgewählten Bereichen. Nach der Aktivierung wird die gesamte Oberfläche einem ersten Satz von Aminosäuren, die jeweils eine photolabile Schutzgruppe am Aminoterminus tragen, ausgesetzt. Eine Aminosäurekupplung erfolgt nur in den Regionen, die in der vorhergehenden Stufe durch Licht adressiert worden sind. Die Lösung der Aminosäure wird entfernt und das Substrat erneut durch eine zweite Maske belichtet, die eine unterschiedliche Region zur Umsetzung mit einem zweiten geschützten Baustein aktiviert. Das Muster der Masken und die Sequenz der Reaktanten definieren die Produkte und ihre Positionen. Da sich das Verfahren photolithographischer Techniken bedient, ist die Anzahl von Verbindungen, die synthetisiert werden können, nur durch die Anzahl von Synthesestellen, die mit geeigneter Auflösung adressiert werden können, begrenzt. Die Position der einzelnen Verbindungen ist genau bekannt. Daher lassen sich Wechselwirkungen mit anderen Molekülen direkt bestimmen. Das Zielprotein kann mit einer fluoreszierenden Reportergruppe markiert werden, um die Identifizierung von speziellen Wechselwirkungen mit individuellen Mitgliedern der Matrix zu erleichtern.
  • Bei einer lichtgesteuerten chemischen Synthese hängen die Produkte vom Belichtungsmuster und von der Reihenfolge der Zugabe der Reaktanten ab. Durch Variation der lithographischen Muster lassen sich unterschiedliche Sätze von Testpeptiden in der gleichen Anzahl von Stufen synthetisieren. Dies führt zur Bildung von zahlreichen unterschiedlichen Maskierungsstrategien.
  • f) Kodierte Kombinationsbibliotheken
  • In einer weiteren Ausführungsform bedient sich das vorliegende Verfahren einer Peptidbibliothek, die durch ein kodiertes Markierungssystem bereitgestellt wird. Eine neuere Verbesserung der Identifizierung von aktiven Verbindungen aus Kombinationsbibliotheken bedient sich chemischer Indexierungssysteme unter Verwendung von Markierungen, die in besonderer Weise für die Reaktionsstufen, denen ein Kügelchen unterzogen worden ist, und infolgedessen für die Struktur, die es aufweist, kodieren. Vom Konzept her ahmt diese Vorgehensweise die vorerwähnten Phagen-Darstellungsbibliotheken nach, bei denen die Aktivität von exprimierten Peptiden stammt, bei denen aber die Strukturen der aktiven Peptide von der entsprechenden genomischen DNA-Sequenz abgeleitet sind. Die erste Kodierung von synthetischen Kombinationsbibliotheken bediente sich einer DNA als Code. Es wurde über zwei Formen von Kodierungen berichtet: Kodierung mit sequenzierbaren Biooligomeren (z.B. Oligonucleotide und Peptide) und binäre Kodierung mit nicht-sequenzierbaren Markierungen.
  • 1) Markierung mit sequenzierbaren Biooligomeren
  • Das Prinzip der Verwendung von Oligonucleotiden zur Kodierung von synthetischen Kombinationsbiblioteken wurde im Jahre 1992 (Brenner et al., PNAS, Bd. 89 (1992), S. 5381–5383) beschrieben. Ein Beispiel für eine derartige Bibliothek erschien im darauffolgenden Jahr (Needles et al., PNAS, Bd. 90 (1993), S. 10700–10704). Eine Kombinationsbibliothek aus nominal 77 (= 823 543) Peptiden, die aus sämtlichen Kombinationen von Arg, Gln, Phe, Lys, Val, D-Val und Thr (dreibuchstabiger Aminosäurecode), die jeweils durch ein spezifisches Dinucleotid kodiert werden (TA, TC, CT, AT, TT, CA bzw. AC), umfasste, wurde in einer Reihe von abwechselnden Runden der Peptid- und Oligonucleotidsynthese an einem festen Träger hergestellt. Bei dieser Arbeit wurde die aminverknüpfende Funktionalität am Kügelchen spezifisch in Bezug auf die Peptid- oder Oligonucleotid-Synthese differenziert, indem man gleichzeitig die Kügelchen mit Reagenzien vorinkubierte, die geschützte OH-Gruppen für die Oligonucleotid-Synthese und geschützte NH2-Gruppen für die Peptid-Synthese erzeugten (hier in einem Verhältnis von 1:20). Nach Beendigung lagen die Markierungen jeweils in 69-merer Form vor, von denen 14 Einheiten den Code trugen. Die an die Kügelchen gebundene Bibliothek wurde mit einem fluoreszierend markierten Antikörper inkubiert und Kügelchen, die gebundenen, stark fluoreszierenden Antikörper enthielten, wurden durch eine mittels Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) geerntet. Die DNA-Markierungen wurden durch PCR verstärkt und sequenziert. Die vorhergesagten Peptide wurden synthetisiert. Bei Einhaltung derartiger Techniken lassen sich Peptidbibliotheken zur Verwendung im vorliegenden Verfahren ableiten und unter Verwendung des D-Enantiomeren des Zielproteins einem Screening unterwerfen.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass ein alternativer Weg, der sich zur Erzeugung von Nucleotid-kodierten, synthetischen Peptidbibliotheken eignet, eines verzweigten Linkers bedient, der selektiv geschützte OH- und NH2-Gruppen enthält (Nielsen et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 115 (1993), S. 9812–9813; und Nielsen et al., Methods Compar. Methods Enzymol., Bd. 6 (1994), S. 361–371). Diese Vorgehensweise macht es erforderlich, dass äquimolare Mengen eines Testpeptids und einer Markierung gemeinsam vorliegen, obgleich dies potentiell die Bestimmung der biologischen Aktivität komplizierter gestaltet, insbesondere bei Zielen auf der Basis von Nucleinsäuren.
  • Die Verwendung von Oligonucleotidmarkierungen ermöglicht eine besonders empfindliche Markierungsanalyse. Dennoch erfordert das Verfahren eine sorgfältige Wahl von orthogonalen Sätzen von Schutzgruppen, die für eine abwechselnde Kosynthese der Markierung und des Bibliotheksmitglieds erforderlich sind. Ferner begrenzt möglicherweise die chemische Labilität der Markierung, insbesondere der Phosphatverknüpfungen und anomeren Zuckerverknüpfungen, die Wahl der Reagenzien und der Bedingungen, die für die Synthese bei nicht-oligomeren Bibliotheken verwendet werden können. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden in den Bibliotheken Linker verwendet, die eine selektive Ablösung des Testpeptid-Bibliothekmitglieds für den biologischen Test ermöglichen, teilweise (wie nachstehend ausgeführt) aufgrund der Tatsache, dass Tests, bei denen Kügelchen verwendet werden, die Wahl der Ziele beschränken, und teilweise aufgrund der Tatsache, dass die Markierungen möglicherweise gegenüber einem biologischen Abbau empfindlich sind.
  • Peptide selbst wurden als Markierungsmoleküle für Kombinationsbibliotheken verwendet. Zwei beispielhafte Vorgehensweisen sind im Stand der Technik beschrieben, wobei bei beiden Möglichkeiten verzweigte Linker an einer festen Phase verwendet werden, an der Kodierungs- und Ligandenstränge abwechselnd ausgebildet werden. Bei der ersten Vorgehensweise (J. M. Kerr et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 115 (1993), S. 2529–2531) wird die Orthogonalität der Synthese durch Anwendung eines säurelabilen Schutzes für den Kodierungsstrang und eines baselabilen Schutzes für den Ligandenstrang erreicht.
  • Bei einer alternativen Vorgehensweise (Nikolaiev et al., Pept. Res., Bd. 6 (1993), S. 161–170) werden verzweigte Linker verwendet, so dass die Kodierungseinheit und das Testpeptid jeweils an der gleichen funktionellen Gruppe am Harz gebunden werden. Bei einer Ausführungsform kann ein Linker zwischen der Verzweigungsstelle und dem Kügelchen angebracht werden, so dass die Spaltung ein Molekül freisetzt, das sowohl den Code als auch den Liganden enthält (Ptek et al., Tetrahedron Lett., Bd. 32 (1991), S. 3891-3894). Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Linker so platziert werden, dass das Testpeptid selektiv vom Kügelchen abgetrennt werden kann, wobei der Code zurückbleibt. Dieses letztgenannte Konstrukt ist von besonderem Wert, da es ein Screening des Testpeptids ohne eine mögliche Störung oder einen biologischen Abbau der Kodierungsgruppen ermöglicht. Beispiele aus dem Stand der Technik für eine unabhängige Spaltung und Sequenzierung von Mitgliedern von Peptidbibliotheken und ihren entsprechenden Markierungen haben bestätigt, dass die Markierungen eine genaue Vorhersage der Peptidstruktur ermöglichen.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass Peptidmarkierungen gegenüber einer Zersetzung während der Ligandensynthese beständiger sind als Oligonucleotidmarkierungen, dass sie aber in Molverhältnissen verwendet werden müssen, die nahezu denen des Liganden an typischen 130 μm-Kügelchen entsprechen, um eine erfolgreiche Sequenzierung zu ermöglichen. Wie bei der Oligonucleotid-Kodierung erfordert die Verwendung von Peptiden als Markierungen komplizierte chemische Maßnahmen bei der Einführung/Entfernung von Schutzgruppen.
  • 2) Nicht-sequenzierbare Markierung: Binäre Markierung
  • Eine alternative Form der Kodierung der Testpeptid-Bibliothek bedient sich eines Satzes von nicht-sequenzierbaren elektrophoren Markierungsmolekülen, die als binärer Code verwendet werden können (Ohlmeyer et al., PNAS, Bd. 90 (1993), S. 10922–10926). Beispiele für Markierungen sind halogenaromatische Alkylether, die als Tetramethylsilylether in Konzen-trationen von weniger als 10–15 M durch Elektroneneinfang-Gaschromatographie (ECGC) nachweisbar sind. Variationen der Länge der Alkylkette sowie der Natur und die Position der aromatischen Halogenidsubstituenten erlauben die Synthese von mindestens 40 derartigen Markierungen, die im Prinzip für 240 (z.B. bis zu 1012) unterschiedliche Moleküle kodieren können. Bei der ursprünglichen Arbeit (Ohlmeyer et al., a.a.O.) wurden die Markierungen an etwa 1 % der verfügbaren Amingruppen einer Peptidbibliothek über einen photospaltbaren O-Nitrobenzyllinker gebunden. Diese Vorgehens-weise ist zweckmäßig bei der Herstellung von Kombinationsbibliotheken von Peptiden oder anderen aminhaltigen Molekülen. Es wurde jedoch ein vielseitigeres System entwickelt, das eine Kodierung von im Wesentlichen beliebigen Kombinationsbibliotheken ermöglicht. Dabei wird der Ligand über den photospaltbaren Linker an den festen Träger gebunden und die Markierung wird durch einen Katechinether-Linker über eine Carben-Einführung in die Kügelchenmatrix gebunden (Nestler et al., J. Org. Chem., Bd. 59 (1994), S. 4723–4724). Diese orthogonale Bindungsstrategie ermöglicht die selektive Ablösung von Bibliotheksmitgliedern für eine biologische Bestimmung in Lösung und eine anschließende Dekodierung durch ECGC nach oxidativer Ablösung der Markierungssätze.
  • Eine binäre Kodierung mit elektrophoren Markierungen war besonders wertvoll bei der Definition von selektiven Wechsel wirkungen von Substraten mit synthetischen Rezeptoren (Borchardt et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 116 (1994), S. 373-374) und bei Modellsystemen zur Aufklärung der Bindung und der Katalyse von Biomolekülen. Auch bei Anwendung einer ausführlichen Molekül-Modellbildung war zur Identifizierung der Selektivitätspräferenzen für synthetische Rezeptoren die manuelle Synthese von Dutzenden von möglichen Substraten erforderlich. Die Verwendung von kodierten Bibliotheken ermöglicht es, rasch sämtliche Mitglieder eines potentiellen Bindungssatzes zu prüfen. Die Verwendung von binär kodierten Bibliotheken hat die Bestimmung von Bindungsselektivitäten so leicht gemacht, dass in einer einzigen Mitteilung über die strukturelle Selektivität von vier neuartigen synthetischen makrobicyclischen und -tricyclischen Rezeptoren unter Anwendung der vorerwähnten kodierten Bibliothek berichtet werden konnte (Wennemers et al., J. Org. Chem , Bd. 60 (1995), S. 1108–1109; und Yoon et al., Tetrahedron Lett., Bd. 35 (1994), S. 8557–8560). Ein ähnlicher einfacher Sachverhalt bei der Definition der Spezifität von Wechselwirkungen ist für zahlreiche andere Biomoleküle zu erwarten.
  • Obgleich die verschiedenen, amidverknüpften Bibliotheken gemäß dem Stand der Technik sich einer binären Kodierung mit den elektrophoren Trägern, die an die Amingruppen gebunden sind, bedienen, liefert die Bindung dieser Markierungen direkt an der Kügelchenmatrix eine größere Vielseitigkeit der Strukturen, die in kodierten Kombinationsbibliotheken hergestellt werden können. Bei einer Bindung auf diese Weise sind die Markierungen und ihre Linker nahezu ebenso wenig reaktiv wie die Kügelchenmatrix selbst. Es wurde über zwei binär kodierte Kombinationsbibliotheken berichtet, bei denen die elektrophoren Markierungen direkt an die feste Phase gebunden sind (Ohlmeyer et al., PNAS, Bd. 92 (1995), S. 6027–6031) und eine Richtschnur für die Erzeugung der in Frage stehenden Peptidbibliothek liefern. Beide Bibliotheken wurden unter Verwendung einer orthogonalen Bindungsstrategie konstruiert, wobei das Bibliothekmitglied über einen photolabilen Linker mit dem festen Träger verknüpft wurde und die Markierungen über einen Linker gebunden wurden, der nur durch heftige Oxidation abspaltbar war. Da die Bibliotheksmitglieder wiederholt partiell vom festen Träger durch Photoelution gewonnen werden können, können Bibliotheksmitglieder in mehrfachen Tests eingesetzt werden. Eine sukzessive Photoelution ermöglicht auch eine wiederholte Screening-Strategie mit sehr hohem Durchsatz: 1) mehrere Kügelchen werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen platziert; 2) Liganden werden partiell abgelöst und auf Testplatten übertragen; 3) ein biologischer Test identifiziert die aktiven Vertiefungen; 4) die entsprechenden Kügelchen werden einzeln einer Neuanordnung in frischen Mikrotiterplatten unterzogen; 5) einzelne aktive Verbindungen werden identifiziert; und 6) die Strukturen werden dekodiert.
  • Die vorstehende Vorgehensweise wurde beim Screening auf die Bindung von Carboanhydrase (CA) herangezogen. Es wurden Verbindungen identifiziert, die nanomolare Affinitäten für CA aufweisen. Im Gegensatz zu einer sequenzierbaren Markierung lässt sich eine große Anzahl von Strukturen rasch aus binär kodierten Bibliotheken dekodieren (eine einzige ECGC-Vorrichtung kann pro Tag 50 Strukturen dekodieren). Somit können binär kodierte Bibliotheken zur raschen Analyse von Struktur-Aktivität-Beziehungen und zur Optimierung sowohl von Wirkungsstärke als auch von Selektivität einer aktiven Serie herangezogen werden. Die Synthese und das Screening von großen, unbeeinflussten, binär kodierten Peptidbibliotheken für die richtungsweisende Identifizierung, gefolgt von einer Herstellung und Analyse von kleiner fokussierten Bibliotheken für die richtungsweisende Optimierung, bietet eine besonders wirkungsvolle Möglichkeit zum Auffinden von Arzneistoffen unter Anwendung des vorliegenden Verfahrens.
  • Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass die vorstehenden Verfahren auf die Synthese von stark diversifizierten Peptidbibliotheken ausgerichtet sind. Der Einbau einer aktiven Untereinheit, die zur Nachahmung einer Übergangszustandsspezies konzipiert ist, die mit dem aktiven Zentrum eines Enzymes in Wechselwirkung tritt, kann die Aufnahme einer Untereinheit erforderlich machen, bei der es sich nicht um eine übliche Aminosäure handelt. Die vorstehenden Verfahren lassen sich zu diesem Zweck leicht einer Anpassung unterziehen.
  • Beispielsweise lässt sich für den Fall, dass eine eine Boronsäure tragende Untereinheit in eine Peptidbibliothek eingebaut werden soll, eine Peptidbibliothek gemäß einem der vorstehenden Verfahren herstellen, wobei der C-Terminus freigesetzt werden kann, um die Carbonsäure aufzudecken, und eine aktive Untereinheit beispielsweise der allgemeinen Formel H2N-CH(R)-B(OH)2, wobei R eine beliebige funktionelle Gruppe bedeutet, die in diese Untereinheit eingebaut werden soll, einschließlich substituierte und unsubstituierte Alkyl- und Arylreste, kann daran durch ein übliches Verfahren der Peptidkupplung gekuppelt werden.
  • Eine weitere Möglichkeit besteht darin, eine erste Aminosäure über den N-Terminus an ein Harz anzubringen und die Peptidbibliothek in Richtung von N nach C zu synthetisieren. Obgleich eine Peptidsynthese in dieser Richtung problematischer und weniger üblich als die Synthese in der Richtung C nach N ist, bedient sich dieses Verfahren der gleichen grundlegenden Methodik und ermöglicht die Synthese einer Peptidbibliothek und die anschließende gleichmäßige oder degenerierte Kupplung an eine oder mehrere Bor enthaltende Untereinheiten, z.B. eine aktive Untereinheit mit der im vorstehenden Absatz dargestellten Formel oder eine aktive Untereinheit mit einer beliebigen anderen Funktionalität, die möglicherweise erwünscht ist. Harze, die für das Anbringen über den N-Terminus geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Eine dritte Möglichkeit besteht darin, eine Boronsäure enthaltende Untereinheit gemäß der vorstehend dargelegten allgemeinen Formel an ein Harz, z.B. ein PerSeptiv-Gerüstamid-Linker (BAL)-Harz, mittels der Stickstoff-Funktionalität anzubringen. Die verbleibenden Reste der Peptidbibliothek können sodann gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren an den N-Terminus der Boronsäure enthaltenden Untereinheit angebracht werden und die Bibliothek kann vom Harz abgespalten werden, z.B. unter Verwendung von 85 % TFA für den Fall, dass es sich beim Harz um ein BAL-Harz handelt. Allgemeiner ausgedrückt, kann eine derartige, auf Stickstoff basierende Verknüpfung gebildet werden, indem man ein Harz, das einen Aldehyd enthält, mit einer Stickstoff enthaltenden Untereinheit in Gegenwart eines Hydrid-Reduktionsmittels (z.B. NaBH4 und Varianten davon) unter Bedingungen zur reduktiven Aminierung des Harzes behandelt. Derartige reduktive Aminierungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Alternativ kann ein Boronsäure enthaltender Rest direkt an das Harz über die Boronsäure-Funktionalität angebracht werden. Beispielsweise kann ein Harz mit einer vicinalen Diol-Funktionalität (HO-C-C-OH) zur Bildung eines cyclischen Boronsäureesters mit der Boronsäure der ausgewählten Untereinheit verwendet werden. Dies hat den doppelten Nutzen, dass die Boronsäure-Funktionalität während der verbleibenden Bibliotheksynthese geschützt wird, während ferner eine spaltbare Verknüpfung mit dem festen Träger erzielt wird. Somit weist die Peptidbibliothek bei der Freisetzung vom Harz, z.B. durch Säurehydrolyse, den Boronsäurerest an sämtlichen Mitgliedern der Bibliotheken auf. Ferner ermöglicht es dieses Verfahren durch Anbringen einer Vielzahl von Boronsäure-Untereinheiten mit verschiedenen Seitenketten am Harz, dass die Position, die die Boronsäure trägt, ebenfalls degeneriert wird. Eine ähnliche Strategie kann für aldehydhaltige aktive Untereinheiten herangezogen werden, die durch Bildung einer Acetalverknüpfung an ein diolhaltiges Harz gebunden werden können.
  • Man schätzt, dass vermutlich etwa 9 bis 12 Aminosäuren eines Substratpeptids in Kontakt mit dem aktiven Zentrum und mit damit verbundenen Unterzentren der Substratspezifität eines Enzyms in Kontakt stehen, was auf Mutageneseuntersuchungen bekannter Consensus-Motive für Phosphorylierungszentren für bestimmte Kinasen und auf röntgenkristallographischen Untersuchungen von an Kinasen gebundenen Peptiden beruht. Demzufolge kann eine orientierte, degenerierte Peptidbibliothek verwendet werden, bei der die degenerierten Reste die Region umfassen, die vermutlich mit dem aktiven Zentrum und Spezifitätsunterzentren des gewählten Enzyms in Kontakt stehen. Die Anzahl an Aminosäureresten, die den Rest eines Substrats umgeben, der in das aktive Zentrum, das die Substratspezifität eines Enzyms beeinflusst, eintritt, unterscheidet sich vermutlich für verschiedene Enzyme. Somit ist zu erwarten, dass orientierte, degenerierte Peptidbibliotheken, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, nur die geringe Anzahl von zwei degenerierten Aminosäureresten aufweisen können, die an die aktive Untereinheit, die als Übergangszustand-Analoges wirkt, kovalent gebunden sind. Für einige Enzyme ist es bevorzugt, dass beide Aminosäuren auf der gleichen Seite der Untereinheit gebunden werden, während es bei anderen Enzymen bevorzugt ist, dass eine Aminosäure auf jeder Seite der aktiven Untereinheit gebunden ist, was jeweils von den Eigenschaften des Enzyms abhängt. Die bevorzugte Anzahl von degenerierten Resten, die an die aktive Untereinheit zu binden ist, beträgt mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 4. Es kann eine gleiche Anzahl von degenerierten Resten auf jeder Seite der aktiven Untereinheit vorliegen oder es können ungleiche Anzahlen von degenerierten Resten auf beiden Seiten der aktiven Untereinheit vorliegen (z.B. ein Rest auf einer Seite und drei Reste auf der anderen Seite und dergl.). Die Mannigfaltigkeit der Peptidbibliothek (z.B. die Anzahl von verschiedenen Peptiden, die in der Bibliothek enthalten sind) stellt eine Funktion der Anzahl von degenerierten Resten dar; je größer die Anzahl an degenerierten Resten ist, desto größer ist die Unterschiedlichkeit. Beispielsweise würde eine Bibliothek, in der nur zwei Positionen degeneriert sind und beliebige Aminosäuren sich an diesen degenerierten Positionen befinden können, 400 spezielle Peptide (202) aufweisen, während eine Bibliothek, bei der 8 Positionen degeneriert sind und sich beliebige Aminosäuren an diesen Positionen befinden können, etwa 2,5 × 1010 spezielle Peptide (208) umfassen würde.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek aus Peptiden der folgenden Formel zusammengesetzt (Xaa)n-Yaa-(Xaa)m (SEQ ID NO: 1) wobei Yaa eine aktive Untereinheit bedeutet, die so ausgewählt ist, dass sie mit einem Teil eines aktiven Zentrums eines Enzyms in Wechselwirkung tritt, z.B. durch Bildung einer kovalenten Bindung, Xaa eine beliebige Aminosäure oder ein beliebiges Aminosäureanaloges bedeutet und n und m ganze Zahlen mit Werten von 0 bis einschließlich 10 sind, wobei die Summe von m und n mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 4 beträgt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der aktiven Untereinheit an der fixierten, nichtdegenerierten Position um den einzigen Rest im Peptid, der beispielsweise in kovalente Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms treten kann. Es lassen sich Peptidbibliotheken konstruieren, bei denen der Typ des oder der Aminosäurereste, die vermutlich mit dem aktiven Zentrum des gewählten Enzyms in Wechselwirkung treten, an der oder den degenerierten Positionen weggelassen wird. Gleichermaßen können bestimmte Aminosäuren, die funktionelle Gruppen aufweisen, die vermutlich mit der aktiven Untereinheit in Wechselwirkung treten, z.B. Serin, wenn es sich bei der aktiven Untereinheit um eine Boronsäure handelt, gleichermaßen an allen oder sämtlichen degenerierten Positionen weggelassen werden. Demzufolge stellt die Erfindung orientierte, degenerierte Peptidbibliotheken bereit, die aus Peptiden der Formel (Xaa)n-Yaa-(Xaa)m zusammengesetzt sind, wobei bestimmte Aminosäuren von der oder den degenerierten Positionen weggelassen sind.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, zusätzliche Aminosäurereste an einem oder beiden Enden der degenerierten Region(en) der Peptide anzufügen. Nichtdegenerierte Aminosäurereste in N-terminaler Position zur degenerierten Region der Peptide können zur Sicherstellung dienen, dass Peptide aus dem Peptidgemisch einwandfrei sequenziert werden, und sie können zur quantitativen Bestimmung der vorhandenen Peptide herangezogen werden. Gleichermaßen können nicht-degenerierte Aminosäurereste, die C-terminal zur degenerierten Region der Peptide stehen, für quantitative Bestimmungen herangezogen werden. Die Addition eines Polylysin-Schwanzes an das C-terminale Ende der Peptide der Bibliothek kann ein Auswaschen der Peptide während der automatisierten Sequenzierung verhindern und die Löslichkeit des Peptidgemisches verbessern.
  • Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Peptidbibliothek ermöglicht die spezifische Addition von nichtdegenerierten Aminosäuren an den N-terminalen und/oder C-terminalen Enden der degenerierten Region der Peptide. Bei dieser Ausführungsform umfasst die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek Peptide der Formel Z1-(Xaa)n-Yaa-(Xaa)m-Z2 (SEQ ID NO: 2) wobei
    Yaa eine nicht-degenerierte aktive Untereinheit gemäß der vorstehenden Definition bedeutet,
    Xaa eine beliebige Aminosäure oder ein beliebiges Aminosäureanaloges bedeutet,
    n und m ganze Zahlen mit einem Wert von 0 bis einschließlich 10 sind, wobei die Summe von m und n mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 4 beträgt,
    Z1 Wasserstoff oder ein Peptid der Formel (Xaa)a bedeutet, wobei Xaa eine beliebige nicht-degenerierte Aminosäure oder Aminosäureanaloges bedeutet und a eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis einschließlich 15 ist und
    Z2 Wasserstoff oder ein Peptid der Formel (Xaa)b bedeutet, wobei Xaa eine beliebige nicht-degenerierte Aminosäure oder Aminosäureanaloges bedeutet und b eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis einschließlich 15 ist. Diese Bibliothek umfasst Peptide mit einer Länge bis zu 51 Aminosäuren. Alternativ können a und b ganze Zahlen mit einem Wert von 1 bis einschließlich 10 sein. Diese Bibliothek umfasst Peptide mit einer Länge bis zu 41 Aminosäuren. Alternativ können a und b ganze Zahlen mit einem Wert von 1 bis einschließlich 5 sein. Diese Bibliothek umfasst Peptide mit einer Länge bis zu 31 Aminosäuren.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß eine orientierte, degenerierte Peptidbibliothek bereitgestellt, die Peptide der folgenden Formel umfasst
    (SEQ ID NO: 3): Met-Ala-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Yaa-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Ala-Lys-Lys-Lys wobei Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7 und Xaa8 beliebige Aminosäurereste bedeuten und Yaa eine aktive Untereinheit gemäß den vorstehenden Ausführungen bedeutet.
  • Die aktive Untereinheit kann so gewählt werden, dass sie eine Funktionalität umfasst, die es Mitgliedern der Peptidbibliothek ermöglicht, als langsam bindende Inhibitoren des Zielenzyms zu wirken. Wenn es sich beispielsweise beim Zielenzym um eine Serin-Protease handelt, wurde gezeigt, dass Boronsäuren, Aldehyde, Trifluormethylketone, α-Ketocarbonsäurederivate, wie α-Ketoamide, Perhalogenalkyle oder Perfluoralkyle, wie Pentafluorethyl und funktionelle Phosphingruppen neben anderen eine langsam bindende Hemmung von Serin-proteinasen bewirken. Eine zur Bestimmung eines bevorzugten Aminosäuresequenz-Motivs für eine Serin-proteinase konzipierte degenerierte Peptidbibliothek kann so konzipiert werden, dass sie eine dieser funktionellen Gruppen an der aktiven Untereinheit umfasst. Die aktive Untereinheit kann sich am C-Terminus, am N-Terminus oder im Innern der Mitglieder der Peptidbibliothek befinden. Langsam bindende Inhibitoren zahlreicher anderer Klassen sind bekannt. Die Einverleibung ähnlicher aktiver Untereinheiten in die erfindungsgemäßen degenerierten Peptidbibliotheken liegt im Bereich der Möglichkeiten des Fachmanns.
  • Um aus einer degenerierten Peptidbibliothek der vorstehend beschriebenen Art solche Sequenzen auszuwählen, die das aktive Zentrum und die damit verbundenen Sequenzspezifität-Unterzentren mit hoher Affinität binden, wird die Peptidbibliothek mit einer solchen Menge eines Enzyms behandelt, dass wesentlich weniger Enzymmoleküle als Peptidmoleküle vorliegen. Beispielsweise kann die Anzahl der Enzymmoleküle als Peptide nicht mehr als 20 %, möglicherweise weniger als 10 %, 5 %, 1 % oder sogar weniger als 1 % betragen. Nach Ablauf einer Zeitspanne, die es dem Enzym ermöglicht, Mitglieder der Peptidbibliothek zu binden und vorzugsweise einen Gleichgewichtszustand zu erreichen, wird das Enzym frei von ungebundenem Peptid gewaschen. Anschließend können die gebundenen Peptide aus dem Enzym freigesetzt und gewonnen werden. Ihre Sequenzen können beispielsweise durch eine chemische Sequenzierungstechnik, Nachweis oder Charakterisierung einer Markierung und dergl. bestimmt werden. Die Freisetzung der gebundenen Peptide kann durch Veränderung des pH-Werts, der Salzkonzentration, der Temperatur, der Verdünnung oder anderer Eigenschaften des Mediums, das die Enzym/Peptid-Komplexe enthält, erleichtert werden.
  • Bei einem im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Enzym kann es sich um ein gereinigtes natives Enzym, das beispielsweise aus einer biologischen Quelle gereinigt worden ist, handeln. Derartige gereinigte Enzyme sind im Handel erhältlich (z.B. von der Fa. Sigma Chemical Co.). Alternativ kann es sich bei einem im erfindungsgemäßen Verfahren ver wendeten Enzym um ein durch rekombinante Technik hergestelltes Enzym handeln. Zahlreiche Enzyme wurden molekular geklont und charakterisiert und können somit durch übliche Techniken rekombinant exprimiert werden. Ein auf rekombinante weise erzeugtes Enzym, das seine einwandfreie enzymatische Funktion behält, kann im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Wenn es sich beim zu prüfenden rekombinanten Enzym um ein eukaryontisches Enzym handelt, ist es bevorzugt, dass das Enzym in einem eukaryontischen Expressionssystem rekombinant exprimiert wird, um eine einwandfreie posttranslationale Modifikation des Enzyms sicherzustellen. Zahlreiche eukaryontische Expressionssysteme (z.B. Baculovirus- und Hefe-Expressionssysteme) sind aus dem Stand der Technik bekannt und übliche Verfahren können zur rekombinanten Expression eines Enzyms herangezogen werden. Bei einem auf rekombinante Weise erzeugten Enzym kann es sich auch um ein Fusionsprotein handeln (d.h. das aus dem Enzym und einem zweiten Protein oder Peptid zusammengesetzt ist, z.B. eine Protease, die mit Glutathion-S-transferase (GST)) fusioniert ist), so lange das Fusionsprotein die katalytische Aktivität der nicht-fusionierten Form des Enzyms behält. Ferner soll der Ausdruck "Enzym" Teile von nativen Enzymen, die die katalytische Aktivität behalten, umfassen. Beispielsweise kann eine Untereinheit einer Protease mit zahlreichen Untereinheiten, die die katalytische Domäne der Protease enthält, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.
  • Anschließend werden die gebundenen Peptide von den Enzymen getrennt, wonach sich die Aminosäuresequenzen der Peptide bestimmen lassen. Vorzugsweise handelt es sich bei der verwendeten orientierten, degenerierten Peptidbibliothek um eine lösliche synthetische Peptidbibliothek und die Peptide werden als Gesamtpopulation unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Sequenziergeräts sequenziert (alter nativ kann eine manuelle Sequenzierung durchgeführt werden, z.B. unter Anwendung von Edman-Techniken). Dieser Weg liefert Informationen über die Menge eines jeden Aminosäurerestes bei einem gegebenen Zyklus in der Sequenz des Peptidgemisches, wobei die Informationen über die degenerierten Positionen von besonderer Bedeutung sind. Für jede degenerierte Position in den Peptiden der Bibliothek kann sodann ein relativer Häufigkeitswert berechnet werden, indem man die Häufigkeit eines speziellen Aminosäurerestes an dieser Position nach dem Screening der Bibliothek (d.h. nach Peptid-Bindung-Freisetzung und Abtrennung) durch die Häufigkeit des gleichen Aminosäurerestes an dieser Position in der Ausgangsbibliothek dividiert. Somit lässt sich die relative Häufigkeit (RA) eines Aminosäurerestes Xaa an einer degenerierten Position in einem Peptid folgendermaßen definieren:
  • Figure 00630001
  • Die relative Häufigkeit kann auf eine Hintergrundverunreinigung korrigiert werden, wobei man sich bekannter Techniken bedient. Aminosäurereste, die in der Population von Peptiden, die bevorzugt am Enzym binden (d.h. bevorzugte Peptide), weder angereichert noch abgereichert sind, weisen eine relative Häufigkeit von 1,0 auf. Die Aminosäurereste, die an einer bestimmten degenerierten Position bevorzugt sind (d.h. Reste, die an dieser Position in den bevorzugten Peptiden angereichert sind), weisen eine relative Häufigkeit von mehr als 1,0 auf. Die Aminosäurereste, die nicht bevorzugt sind (d.h. Reste, die an dieser Position in den bevorzugten Peptiden abgereichert sind) weisen eine relative Häufigkeit von weniger als 1,0 auf. Auf der Grundlage der Werte für die relative Häufigkeit der einzelnen Aminosäurereste an einer degenerierten Position lassen sich bevorzugte Aminosäurereste, d.h. Aminosäurereste mit einer relativen Häufigkeit von mehr als 1,0, an dieser Position identifizieren.
  • Wie vorstehend erörtert, muss bei Verwendung einer Bibliothek, die an einen festen Träger vom Typ eines Kügelchens gebunden ist, jedes Isolat individuell sequenziert werden. Dies erfordert die Sequenzierung einer großen Anzahl von Isolaten und liefert mutmaßlich nur eine Schätzung über die relative Häufigkeit der einzelnen Aminosäurereste an einer degenerierten Position. Wenn man alternativ ein Verfahren anwendet, bei dem eine räumlich adressierbare Peptidbibliothek, wie sie beispielsweise vorstehend im Abschnitt "e" beschrieben wurde, kann das Enzym mit einem nachweisbaren Marker markiert, die Bibliothek mit einer Menge des Enzyms behandelt und anschließend die Bibliothek geprüft werden, um festzustellen, welche der gebundenen Peptide vom Enzym bevorzugt werden. Wenn beispielsweise der Marker fluoreszierend ist, kann die Bibliothek unter Bedingungen geprüft werden, die eine Fluoreszenz des Markers hervorrufen. Durch Bestimmung der relativen Leuchtkraft von Regionen von denen bekannt ist, dass sie spezielle Peptidsequenzen aufweisen, kann die relative Häufigkeit einer speziellen Aminosäure an einer beliebigen Position der Peptidsequenz näherungsweise ermittelt werden. Die Genauigkeit der Näherung entspricht der Genauigkeit der Messung der Intensität des Markers, so dass eine auf Fluoreszenz basierende Technik gemäß der vorstehenden Darlegung im gewissen Ausmaß eine qualitative Bestimmung darstellt. Es ist darauf hinzuweisen, dass bei Anwendung dieses Verfahrens die Peptidbibliothek aktive Untereinheiten umfassen kann, die irreversibel an das Enzym binden, z.B. Halogenmethylketone, Sulfonylfluoride und dergl., vorausgesetzt, dass die Peptidbibliothek aus langsam bindenden Inhibitoren besteht.
  • Weitere Verfahren zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinitäten eines Enzyms an eine Bibliothek von Verbindungen sind aus dem Stand der Technik bekannt und können zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung leicht angepasst werden, ohne dass man vom Geist der Erfindung abweicht.
  • Die Sequenzierung von Peptidsequenzen, die eine aktive Untereinheit aufweisen, bei der es sich nicht um eine Aminosäure handelt, kann zusätzliche Manipulationen bei der Vorbereitung der Sequenzierung erfordern: Wenn beispielsweise das Peptid endständig einen Aldehyd aufweist, kann es erstrebenswert sein, die Aldehydfunktion in eine Carbonsäurefunktion, eine für Peptide native Funktion, nach beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, z.B. durch Behandlung mit Natriumchlorit, umzuwandeln. Das Verfahren soll vorzugsweise so gewählt werden, dass Schwefelatome, die in einer Aminosäure an einer degenerierten Position vorliegen können, nicht oxidiert werden. Wenn das Peptid eine endständige Boronsäure aufweist, kann die Boronsäure in eine Carbonsäure umgewandelt werden oder sie kann in einen Aldehyd umgewandelt und dann auf die vorstehend beschriebene Weise weiter behandelt werden (H. C. Brown et al., Pure and Appl. Chem., Bd. 63 (1991), S. 307–316). Wenn in der Mitte einer Kette eine funktionelle Borongruppe vorliegt, z.B. anstelle einer Carbonylfunktion eines natürlichen Peptids, so lassen sich derartige funktionelle Gruppen leicht unter Bildung von zwei Fragmenten hydrolysieren: ein C-terminales Peptidfragment und ein N-terminales Boronsäurefragment, das auf die vorstehend beschriebene Weise verarbeitet werden kann. Für die Zwecke der Erfindung ist es nicht erforderlich, ein spezifisches C-terminales Peptidfragment in Korrelation mit dem N-terminalen Fragment, mit dem es während des Tests assoziiert ist, zu bringen. Es reicht aus, lediglich die relative Häufigkeit von Aminosäuren an bestimmten Positionen zu kennen. In diesem Beispiel lassen sich die N-terminalen und C-terminalen Fragmente auf der Grundlage unterscheiden, dass der N-terminale Satz Boronsäurereste enthält, die bei den C-terminalen Fragmenten fehlen. weitere Verfahren zur Umwandlung von Boronsäuregruppen in funktionelle Gruppen, die sich zur Peptidsequenzierung eignen, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Je nach der Art und der Position der aktiven Untereinheit können bestimmte Verfahren zur Herstellung der Sequenz für die automatische Sequenzierung herangezogen werden. Beispielsweise kann beim vorstehenden Fall, bei dem ein Boronsäurerest eine Carboxylgruppe in der Mitte einer Peptidkette ersetzt, eine Hydrolyse vorgenommen werden, um die Peptide an dieser Bindung zu spalten. Die N-terminalen Boronsäureteile können dann von den C-terminalen Peptidteilen abgetrennt werden, z.B. auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Azidität oder ihrer unterschiedlichen Affinität für ein chromatographisches Substrat. Sodann können die beiden Teile der Probe mit einem automatischen Sequenziergerät sequenziert werden.
  • In Fällen, bei denen die aktive Untereinheit nicht degeneriert ist, ist es möglicherweise nicht erforderlich, die aktive Untereinheit selbst zu sequenzieren. Möglicherweise sind nur die Sequenzen der übrigen Reste erforderlich. Ein Edman-Abbau, der üblicherweise in automatischen Peptid-Sequenziergeräten herangezogen wird, ist zur Sequenzierung von Peptiden vom N-Terminus (N-terminale Sequenzierung) befähigt, unabhängig von der funktionellen Gruppe am C-Terminus. Somit können Peptide mit einer aktiven Unterein heit, die beispielsweise eine funktionelle Aldehyd- oder Boronsäuregruppe enthält, am C-Terminus immer noch unter Verwendung eines automatischen Sequenziergeräts sequenziert werden. Verfahren zur C-terminalen Sequenzierung sind aus dem Stand der Technik bekannt (vergl. US-Patent 5 432 092 (Bailey et al.) und US-Patent 5 049 507 (Hawke et al.) und werden in automatischen Peptid-Sequenziergeräten eingesetzt. Somit können Peptide mit einer nicht-degenerierten aktiven Untereinheit am N-Terminus immer noch unter Verwendung eines automatischen Peptid-Sequenziergeräts sequenziert werden. Ferner kennt man automatische Peptid-Sequenziergeräte, die zur Durchführung sowohl einer C-terminalen als auch einer N-terminalen Peptidsequenzierung an der gleichen Probe befähigt sind (z.B. Hewlett Packard HP 1100 Series LC, N- und C-terminales Protein-Sequenziergerät). Somit kann eine Peptidbibliothek, die im Innern des Peptids eine aktive Untereinheit aufweist, von beiden Enden her sequenziert werden, um die relativen Häufigkeiten der Reste an bestimmten Positionen davon zu bestimmen.
  • Ein weiteres Verfahren, das sich zur Sequenzierung von Peptiden eignet, ist die Massenspektrometrie. Die Massenspektrometrie, insbesondere die Elektrospray-Massenspektrometrie kann zur Bestimmung von Fragmentierungsmustern für Peptidmoleküle herangezogen werden. Da die Fragmentierung vorwiegend an einer Peptidbindung erfolgt, liefert ein Fragmentierungsmuster typischerweise Atommassen von Fragmenten, wobei Fragmente von abnehmender Masse einen Hinweis auf den aufeinanderfolgenden Verlust von Aminosäureresten in einer Peptidsequenz darstellen. Um die C-terminale Spaltung von der N-terminalen Spaltung zu unterscheiden, ist es besonders geeignet, dass für die Mitglieder einer Peptidbibliothek die Aminosäure am C-Terminus und/oder am N-Terminus mit einem charakteristischen Isotopenmuster markiert ist. Bei einem charakteristischen Isotopenmuster kann es sich um ein Muster handeln, das einen Hinweis auf die Anwesenheit eines Elements darstellt, das natürlicherweise in Form von mindestens zwei Isomeren in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:10 und vorzugsweise von 1:1 bis 1:5 vorkommt. Zu Elementen, die diese Eigenschaft besitzen, gehören Chlor, Brom, Bor und Selen. Somit sind Peptidbibliotheken vom Boronsäuretyp, bei denen die Boronsäure an einem der Enden vorliegt, für diesen Typ von Analyse gut geeignet. Alternativ oder zusätzlich kann eines der Atome in einem terminalen Rest von Peptiden in der Bibliothek im Wesentlichen vollständig oder vorzugsweise teilweise angereichert sein, so dass Peptidfragmente, die den angereicherten Terminus umfassen, in einem Massenspektrum ein charakteristisches Isotopenmuster aufweisen. So kann beispielsweise die terminale Carboxylgruppe einer Peptidbibliothek mit 13C angereichert sein, das α-Proton kann mit 2H angereichert sein und dergl. Im Ergebnis weisen die Massenspektren für derartige Verbindungen eine Reihe von Fragmenten auf, die jeweils ein leicht identifizierbares, charakteristisches Isotopenmuster besitzen. Durch Bestimmung der Massendifferenz zwischen aufeinanderfolgenden Peaks lässt sich die bei jeder Fragmentierung verlorene Aminosäure bestimmen, was die Sequenzierung von winzigen Mengen eines Peptids erlaubt. Ein Beispiel für eine Peptidsequenzierung unter Anwendung dieser Technik wurde von M. Geysen, Abstracts of Papers of the American Chemical Society, Bd. 218, Teil 1 (22. August 1999), S. 144-Anyl, vorgelegt. Ferner lassen sich massenspektrometrische Techniken auf enzymgebundene Substrate sowie auf Substrate, die vom gebundenen Enzym getrennt worden sind, anwenden.
  • Außerdem lässt sich eine LC/MS zur Durchführung einer chromatographischen Trennung einer Bibliothek von Peptiden anwenden, wonach eine Massenspektroskopie folgt, um die ein zelnen Peptide bei ihrer Elution zu sequenzieren, wie vorstehend beschrieben wurde. Alternativ kann ein Massenspektrometer gemäß einer bekannten Vorgehensweise so konfiguriert werden, dass ein kombiniertes Massenspektrum für ein Gemisch von Verbindungen bestimmt wird, die Moleküle aufgrund ihrer Masse getrennt werden und die Fragmentierungsmuster für jede der getrennten Einheiten bestimmt werden. Auf diese Weise lassen sich individuelle Peptidsequenzen bestimmen, anstelle von relativen Häufigkeiten für jede Position in einem Satz von Peptidsequenzen.
  • Auf der Grundlage der relativen Häufigkeit von verschiedenen Aminosäureresten an jeder degenerierten Position innerhalb der Population von gebundenen und sequenzierten Peptiden lässt sich ein bevorzugtes Aminosäuresequenz-Motiv für ein aktives Zentrum des Enzyms bestimmen. Das Aminosäuresequenz-Motiv umfasst die degenerierte Region der Peptide. Bei den speziellen Aminosäureresten, die für das Motiv an jeder degenerierten Position ausgewählt sind, handelt es sich um die Reste, die an jeder Position besonders häufig sind. Somit können einer oder mehrere Aminosäurereste mit einem relativen Häufigkeitswert von mehr als 1,0 an einer speziellen Position als der oder die Aminosäurereste an dieser Position innerhalb des Aminosäuresequenz-Motivs gewählt werden. Alternativ kann ein höherer relativer Häufigkeitswert als Grundlage für die Aufnahme eines Aminosäurerestes herangezogen werden, um ein noch bevorzugteres Aminosäuresequenz-Motiv für ein Enzym zu schaffen. Beispielsweise können einer oder mehrere Aminosäurereste mit einem relativen Häufigkeitswert von 1,5 oder mehr an einer speziellen Position als der oder die Aminosäurereste an dieser Position innerhalb des Aminosäuresequenz-Motivs gewählt werden.
  • Peptide, die aus Aminosäureresten zusammengesetzt sind, die einem der möglichen Reste entsprechen, die durch das Aminosäuresequenz-Motiv eines Enzyms vorgeschrieben sind, lassen sich so synthetisieren, dass ein Peptidsubstrat für das Enzym geschaffen wird. Peptide, die aus den besonders bevorzugten Aminosäureresten des Motivs zusammengesetzt sind (d.h. Aminosäurereste mit der höchsten relativen Häufigkeit an jeder degenerierten Position), lassen sich als optimale Peptidsubstrate für das Enzym synthetisieren.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass es möglich sein kann, Aminosäuresubstitutionen in einem erfindungsgemäßen Substratpeptid vorzunehmen, ohne die Affinität des Peptids für ein Enzym wesentlich zu verändern. Beispielsweise können Aminosäuresubstitutionen an einer Position innerhalb des Peptids möglich sein, die relativ unempfindlich gegenüber Variationen von Aminosäureresten in dieser Position ist. Gleichermaßen können Aminosäuresubstitutionen an einer Position möglich sein, die in breitem Umfang spezielle Typen von Aminosäuren (z.B. hydrophobe oder hydrophile Aminosäuren) aufnimmt. Die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek, die zur Bestimmung eines erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz-Motivs verwendet wird, repräsentiert Peptide mit jeder möglichen Aminosäuresubstitution an jeder degenerierten Position und die aus dem Bibliothek-Screening bestimmten Sequenzen liefern Informationen bezüglich des Einflusses der Substitution einer speziellen Aminosäure an jeder degenerierten Position, die ein aktives Zentrum umgibt. Somit sind Positionen, an denen Substitutionen des definierten Motivs möglich sein können, leicht aus den Daten identifizierbar, die aus den sequenzierten, gebundenen Peptiden der Bibliothek erhalten worden sind (d.h. aus den Werten der relativen Häufigkeit für die einzelnen Aminosäurereste an jeder degenerierten Position). Beispielsweise weist eine Position, die relativ unempfindlich gegenüber Variationen der Aminosäurereste ist, zahlreiche Aminosäurereste an dieser Position mit Werten der relativen Häufigkeit um 1,0 auf (d.h. sie sind im Wesentlichen beim Bibliothek-Screening weder bevorzugt noch benachteiligt). Obgleich einer oder mehrere Aminosäurereste an dieser Position einen RA-Wert von mehr als 1,0 aufweisen können (der für die Aufnahme in einem erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz-Motiv festgelegte Wert), kann es möglich sein, diesen Rest durch eine Aminosäure mit einem RA-Wert von 1,0 oder geringfügig unter 1 an dieser Position zu substituieren, ohne dass die Affinität des Peptidsubstrats für die Protease wesentlich beeinträchtigt wird. Beispielsweise kann für die Kinasen der src-Familie die Position –4 relativ zur phosphorylierten Stelle (in Position 0) zahlreiche Aminosäurereste mit relativen Häufigkeitswerten um 1,0 aufweisen, was zeigt, dass diese Position zahlreiche verschiedene Aminosäuren aufnehmen kann. Gleichermaßen weist eine Position, die beispielsweise in breitem Umfang einen hydrophoben Rest aufnehmen kann, zahlreiche hydrophobe Reste an dieser Position mit RA-Werten um 1,0 auf, obgleich nur einer oder wenige Reste den bevorzugten RA-Wert von mehr als 1,0 besitzen.
  • Demzufolge umfasst die Erfindung ein Peptidsubstrat für ein Enzym mit einer im Wesentlichen gleichen Affinität für das Enzym als ein Peptidsubstrat, das ein bevorzugtes Aminosäuresequenz-Motiv, das nach den hier vorgestellten Verfahren bestimmt worden ist, umfasst. Der Ausdruck "im Wesentlichen gleiche Affinität" bedeutet, dass das Peptid eine Affinität für das Enzym besitzt, die so beschaffen ist, dass das Peptid im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie ein Peptid mit einem bevorzugten Aminosäuresequenz-Motiv gemäß den hier gemachten Ausführungen wirken kann (z.B. kann das Peptid in kompetitiver Weise die Aktivität eines Enzyms gegenüber einem weiteren Substrat hemmen, das annähernd gleichwertig mit einem Peptid ist, das ein bevorzugtes Aminosäuresequenz-Motiv, das durch die hier vorgelegten Verfahren bestimmt worden ist, aufweist). Eine Affinität eines Peptids für ein Enzym kann als ein Ki-Wert (d.h. Konzentration eines Peptids, die zur Hemmung der Aktivität gegenüber einem anderen Substrat um 50 % erforderlich ist) durch Konkurrenz mit anderen Substraten definiert werden. Vorzugsweise weist ein Peptid mit einer im Wesentlichen gleichen Affinität für ein Enzym als Peptidsubstrat, das ein bevorzugtes Aminosäuresequenz-Motiv gemäß den hier, gemachten Ausführungen umfasst, einen Ki-Wert auf, der nicht mehr als 2-fache des Ki-Werts des Peptids mit dem Aminosäuresequenz-Motiv beträgt. Weitere Verfahren zur Bestimmung der Affinitäten von Substraten für Enzyme sind aus der Literatur bekannt und können auf die Erfindung angewandt werden, ohne deren Schutzumfang zu verlassen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptidsubstrate können in ein größeres Protein eingebaut werden, um eine bevorzugte Bindungsstelle für ein Enzym innerhalb des Proteins zu schaffen. Der Einbau des bevorzugten Aminosäuresequenz-Motivs für ein Enzym in ein Protein lässt erwarten, dass sich am Protein eine Stelle für eine Bindung dieses Enzyms mit hoher Affinität ergibt. Wenn es sich beispielsweise bei dem Enzym um eine Protease handelt, kann ein bevorzugtes Aminosäuresequenz-Motiv für diese Protease in ein Protein eingebaut werden. Dieses bevorzugte Aminosäuresequenz-Motiv liefert eine Stelle an dem Protein, von der zu erwarten ist, dass sie durch diese Protease leicht und bevorzugt gespalten wird.
  • Das bevorzugte Aminosäuresequenz-Motiv der Spezifitätsunterzentren eines Enzyms, das erfindungsgemäß bestimmt worden ist, kann auch zur Herstellung von Pseudosubstraten für das Enzym verwendet werden. In bestimmten Fällen vereinigt das Pseudosubstrat die aktive Untereinheit mit dem bevorzugten Aminosäuresequenz-Motiv. Im speziellen Fall von Proteasen können Pseudosubstrate Peptide mit Aminosäuresequenzen umfassen, die dem Aminosäuresequenz-Motiv entsprechen, bei denen aber die spaltbare Bindung, die üblicherweise durch die Protease gespalten wird, durch eine nichtspaltbare Bindung ersetzt ist. Veränderungen, die die spaltbare Bindung zu einer nicht-spaltbaren Bindung machen, umfassen die Methylierung des Stickstoffatoms des Amids, den Ersatz der Carbonylgruppe des Amids durch -CH2, den Ersatz des Stickstoffatoms durch -CH2- und weitere Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Analoge Veränderungen, die sich zur Verwendung bei anderen Enzymklassen eignen, sind aus dem Stand der Technik bekannt und können auf die Erfindung angewandt werden, ohne deren Geist und Schutzumfang zu verlassen.
  • Peptidanaloge, Peptidomimetika und weitere kleine Moleküle, die als Pseudosubstrate klassifiziert werden können, können ebenfalls auf der Grundlage der erfindungsgemäß bereitgestellten Aminosäuresequenz-Motive konzipiert werden. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Aminosäuresequenz-Motive können zur Konstruktion von derartigen Analogen der erfindungsgemäßen Substrate herangezogen werden. Es wurde allgemein festgestellt, dass bei Addition von Peptiden an intakte Zellen oder bei in vivo-Verabreichung deren Aufnahme ineffizient ist und/oder diese abgebaut werden. Somit ist es in Situationen, bei denen man eine Modulation des Signalübertragungsweges (z.B. für therapeutische in vivo-Zwecke) wünscht, erstrebenswert, ein Peptidanaloges anstelle eines Peptids zu verwenden. Der hier verwendete Ausdruck "Peptidanaloges" soll Moleküle umfassen, die die chemische Struktur eines Peptids nachahmen, wobei die biologischen Eigenschaften des Peptids erhalten bleiben, wobei die Moleküle aber durch die Zellmemebran hindurchtreten können. Der Ausdruck "Peptidanaloges" soll auch Moleküle umfassen, die die chemische Struktur eines Peptids nachahmen, wobei die biologischen Eigenschaften des Peptids erhalten bleiben, diese Moleküle aber stabiler als das Peptid sind (z.B. weniger empfindlich gegenüber einem Abbau entweder in vivo im Kreislauf oder intrazellulär). Im Fall von Peptidanalogen der erfindungsgemäßen Peptidsubstrate behält das Peptidanaloge die biologische Eigenschaft der Fähigkeit zur Bindung an das Enzym (d.h. es besetzt das katalytische Zentrum des Enzyms). Vorzugsweise wird das Peptidanaloge durch das Enzym nicht verändert, obgleich auch ein veränderbares Peptidanaloges geeignet sein kann. Wege zur Konstruktion von Peptidanalogen sind aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise P. S. Farmer Drug Design (Hrsg. E. J. Ariens), Academic Press, New York, Bd. 10 (1980), S. 119–143; J. B. Ball und P. F. Alewood, J. Mol. Recognition, Bd. 3 (1990), S. 55; B. A. Morgan und J. A. Gainor, Ann. Rep. Med. Chem., Bd. 24 (1989), S. 243; und R. M. Freidinger, Trends Pharmacol. Sci., Bd. 10 (1989), S. 270.
  • Bei einem Typ eines Peptidanalogen der erfindungsgemäßen Peptidsubstrate, der hergestellt werden kann, handelt es sich um ein Peptid, das methylierte Amidbindungen aufweist. Es wurde festgestellt, dass diese Modifikation des Peptids die Membranpermeabilität des Peptids und dessen Stabilität erhöht. Ferner lässt sich die Steifigkeit des Peptids erhöhen, was die Affinität des Peptidanalogen für das katalytische Zentrum des Enzyms im Vergleich zum unmodifizierten Peptidsubstrat erhöhen kann.
  • Alternativ können Retro-Inverso-Peptide bei den hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Retro-Inverso-Peptide lassen sich in Analogie zum folgenden Beispiel herstellen. Wenn es sich beim bevorzugten Aminosäuresequenz-Motiv um H2N-(L)Arg-(L)Ala-(L)Lys-CO2-handelt, so handelt es sich beim entsprechenden Retro-Inverso-Peptid um -O2C-(D)Arg-(D)Ala-(D)Lys-NH2. Vom Konzept her handelt es sich bei derartigen Sequenzen um die Umkehr der Ausgangssequenz (Retro) und um die Verwendung von Aminosäuren, die zur Ausgangssequenz enantiomer (Inverso) sind. Ein Vorteil der Retro-Inverso-Peptide besteht darin, dass sie gegenüber einer enzymatischen Aktivität beständig sind, obgleich sie an Enzyme mit ähnlichen Affinitäten wie die Ausgangssequenzen binden. Dieses Merkmal macht sie als Inhibitoren der Enzyme, an die sie binden, geeignet. Ferner eignen sich derartige Retro-Inverso-Peptide in pharmazeutischen Zubereitungen, da sie gegenüber einem enzymatischen Abbau, der bei üblichen Peptiden zu kurzen Halbwertszeiten im Körper führt, beständig sind.
  • Kleine Nichtpeptidylmoleküle können sich als erfindungsgemäße Inhibitoren eignen. Derartige kleine Moleküle lassen sich rational auf der Grundlage der bekannten Struktur eines bevorzugten Aminosäure-Bindungsmotivs und durch gezielte Beeinflussung der strukturellen Eigenschaften des kleinen Moleküls zur Erzielung einer analogen Beschaffenheit zu den strukturellen Eigenschaften dieses Motivs konzipieren. Alternativ können derartige kleine Moleküle durch Kombination erzeugt werden und den Tests, die vorstehend für Peptidsubstrate beschrieben worden sind, unterworfen werden. Weitere Verfahren, die zur Ermittlung von erfindungsgemäß geeigneten, kleinen Molekülsubstraten herangezogen werden können, fallen unter den Umfang der Erfindung.
  • Die erfindungsgemäßen Peptidsubstrate und Pseudosubstrate können zur Hemmung der Aktivität eines Enzyms eingesetzt werden. Die Bindung eines Substrats durch ein bestimmtes Enzym kann durch Kontaktieren des Enzyms mit einer hemmenden Menge eines Peptidsubstrats oder Pseudosubstrats für das Enzym, das erfindungsgemäß bereitgestellt wird, gehemmt werden. Die Hemmung eines Enzyms kann bei in vitro-Untersuchungen oder bei therapeutischen in vivo-Behandlungen wertvoll sein. Enzyme spielen eine Rolle bei praktisch sämtlichen Signalübertragungswegen, einschließlich solche, die bei der Zellzyklussteuerung, bei immunologischen Reaktionen, bei der transkriptionalen Aktivierung und bei der Zellentwicklung beteiligt sind. Außerdem spielen Enzyme eine Rolle bei der Zelltransformation. Die Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität von Enzymen bietet somit ein Mittel, mit dem eine Vielzahl von zellulären Reaktionen moduliert werden kann. Neuartige therapeutische Mittel, die aus den erfindungsgemäßen Peptidsubstraten, Pseudosubstraten und Peptidanalogen zusammengesetzt sind oder auf diesen beruhen, finden Anwendungsmöglichkeiten bei einer Vielzahl von Krankheitssituationen. In einigen Fällen kann es erstrebenswert sein, die Aktivität eines Enzyms zu hemmen, um einen Signalübertragungsweg zu modulieren. Beispielsweise ist VanX eine D-Ala-D-Ala-Dipeptidase, die für die Vancomycin-Resistenz bei Enterococcus faecium wesentlich ist. Eine Hemmung dieser Dipeptidase kann sich bei der Umgehung der Vancomycin-Resistenz bei Bakterien, die ansonsten eine Infektion gegenüber bekannten antibakteriellen pharmazeutischen Mitteln immun machen würden, als wertvoll erweisen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptidsubstrate eignen sich in vitro für den Nachweis und die quantitative Bestimmung der Aktivität von Enzymen. Beispielsweise kann eine Lösung mit einem erfindungsgemäßen Substrat in Kontakt gebracht werden, um die Anwesenheit eines bestimmten Enzyms in der Lösung nachzuweisen. Beispielsweise kann es sich bei der Lösung um einen Zellextrakt oder eine Säulenfraktion eines partiell gereinigten Enzyms handeln. Für in vitro-Tests kann das Peptidsubstrat an einem festen Träger (z.B, einem Kügelchen) immobilisiert werden, um eine leichte Trennung des Peptids von anderen Reaktionskomponenten (z.B. [γ-32P]-ATP) zu ermöglichen.
  • Beispielsweise ist die Fähigkeit zum raschen Nachweis und zur raschen Hemmung von Proteasen bei der Aufrechterhaltung der Stabilität von Proteinlösungen wichtig. Wenn verunreinigende Proteasen nicht nachgewiesen und gehemmt werden, kann eine Proteolyse zu verminderten Ausbeuten während der Reinigung und zu einer Instabilität während einer Langzeitlagerung führen. Winzige Mengen einer Protease reichen aus, um einen Abbau herbeizuführen.
  • Gemäß einem Aspekt, umfasst die Bibliothek von Peptidyl-Inhibitoren Verbindungen der allgemeinen Formel I
    Figure 00770001
    wobei
    W BY1Y2, Perhalogenalkyl /z.B. Perfluoralkyl) oder C(=O)R5 bedeutet;
    R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 00770002
    bedeutet;
    R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet;
    R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 00780001
    bedeutet oder
    R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können;
    oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können;
    Y1 und Y2 unabhängig voneinander oder zusammen Hydroxyl oder eine Gruppe, die zu einer Hydroxylgruppe hydrolysiert werden kann, bedeuten, einschließlich cyclische Derivate, wobei Y1 und Y2 über einen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur gebunden sind,
    R5 H, Halogenmethyl, Trifluormethyl, Amido, Ester, Keton, Carboxyl, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7 oder -CH2O-R10 bedeutet,
    R6 Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-(CH2)m-R7, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-Alkyl, -(CH2)m-S-Alkenyl, -(CH2)m-S-Alkinyl, -(CH2)m-S-(CH2)m-R7,
    Figure 00790001
    bedeutet;
    R7 Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Heterocyclyl bedeutet;
    R8 und R9 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, -(CH2)m-R7, -C(=O)-Alkyl, -C(=O)-Alkenyl, -C(=O)-Alkinyl oder -C(=O)-(CH2)m-R7 bedeuten
    oder R8 und R9 zusammen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen;
    R10 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 00800001
    bedeutet;
    m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist; und
    n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen bedeutet W eine Boronsäure (einschließlich Boronsäureester), einen Aldehyd, Perhalogenalkyl oder Perfluoralkyl (z.B. Trifluormethyl, Pentafluorethyl), Trifluormethylketon, Halogenmethylketon (z.B. -C(=O)CX3, -C(=O)CHX2 oder -C(=O)CH2X, wobei X unabhängig vom jeweiligen Auftreten F, Cl oder Br bedeutet), ein α-Ketoester, ein α-Diketon, ein α-Ketoamid oder eine α-Ketosäure.
  • In einer bestimmten Ausführungsform bedeuten R2 und R4 jeweils H und R3 bedeutet unabhängig vom jeweiligen Auftreten in der Verbindungsbibliothek eine natürlich vorkommende Aminosäure-Seitenkette.
  • Als Äquivalente werden ferner angesehen beliebige Verbindungen, die hydrolytisch in eine beliebige der vorerwähnten Verbindungen umgewandelt werden können, einschließlich Boronsäureester und Halogenide, sowie Carbonyläquivalente, einschließlich Acetale, Hämiacetale, Ketale und Hämiketale und cyclische Dipeptidanaloge.
  • Bei bestimmten weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Inhibitoren um Boronsäureanaloge von Aminosäuren. Zu beispielhaften, von Boronsäure abgeleiteten Bibliotheken zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren gehören eine Mehrzahl von Inhibitoren der allgemeinen Formel II
    Figure 00810001
    wobei
    R1, R2, R3 und R4 die vorstehend definierten Bedeutungen haben und X11 unabhängig für jedes Auftreten Wasserstoff, Alkyl oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeutet oder beide Reste X11 zusammen mit den O-B-O-Atomem, an die sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen.
  • Bei weiteren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Inhibitorbibliothek Aldehydanaloge. Beispielhafte erfindungsgemäße, von Aldehyd abgeleitete Inhibitoren werden durch die allgemeine Formel III dargestellt
    Figure 00810002
    wobei
    R1, R2, R3 und R4 die vorstehend definierten Bedeutungen haben.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst die vorliegende Inhibitorenbibliothek Inhibitoren der allgemeinen Formel IIIa
    Figure 00820001
    wobei
    R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 00820002
    bedeutet;
    R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet;
    R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 00820003
    Figure 00830001
    bedeutet; oder
    R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können;
    oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; und
    R5 Halogenmethyl, Trifluormethyl, Amido, Ester, Keton oder Carboxyl bedeutet.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Inhibitorbibliothek Halogenmethylketonanaloge. Zu beispielhaften Inhibitoren für diese Klasse gehören Verbindungen der allgemeinen Formel IV
    Figure 00830002
    wobei
    R1, R2, R3 und R4 die vorstehend definierten Bedeutungen haben und
    X1, X2 und X3 jeweils Wasserstoff oder Halogen bedeuten.
  • In weiteren Ausführungsformen umfassen die vorliegenden Analogen einen modifizierten Tyrosinrest. Derartige Analoge eignen sich insbesondere als Kinase- und Phosphatase-Inhibitoren. Demzufolge stellt die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt einen Boronophenylalaninrest in einem breiten Bereich von Verbindungen, die beispielsweise in den US- Patenten 5 776 902 und 5 580 979 beschrieben sind, bereit. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich beim Analogen um ein Boronophenylalanin (BoronoF) oder um ein Phosphonophenylalanin (PhosphonoF) der allgemeinen Formel V
    Figure 00840001
    wobei Y' eine Substitution an einer der meta-, ortho- oder para-Positionen des Phenylrestes bedeutet, wobei Y' eine Boronogruppe der allgemeinen Formel
    Figure 00840002
    oder eine Phosphonogruppe der allgemeinen Formel
    Figure 00840003
    bedeutet,
    wobei R15 und R16 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Niederalkyl oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeuten oder R15 und R16 zusammen mit den O-B-O- oder O-P-O-Atomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen;
    R'14 abwesend ist oder einen oder mehrere Substituenten an den restlichen Ringpositionen bedeutet, wobei die Substituenten unter Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7, -CF3, -CN oder dergleichen ausgewählt sind;
    M (unabhängig für jedes Auftreten) eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe, z.B. CH2, CHOH, CHF, CHMe, CHNH2 und dergl und vorzugsweise CH2 oder CHOH, bedeutet;
    X8 und X9 jeweils unabhängig voneinander Methylen, Ethylen, Acetylen, Amin, Carbonyl, Phosphonyl, Schwefel, Sauerstoff oder Selen bedeuten;
    R'17 abwesend ist oder Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7 bedeutet oder R'17 einen mit X8 kondensierten Aminosäurerest oder Peptid bedeutet;
    R'3 abwesend ist oder Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7 bedeutet oder R'3 einen mit X9 kondensierten Aminosäurerest oder Peptid bedeutet;
    R7 Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Heterocyclyl oder Polycyclyl bedeutet;
    m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 bedeutet; und
    n 1, 2 oder 3 ist.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen weisen die Verbindungen der Formel V mindestens eine Methylengruppe zwischen dem Phenylring und dem Rest Y' auf, z.B. m=1 oder m=2. Bei bevorzugten Ausführungsformen hat n den Wert 1. Bei bestimmten Ausführungsformen ist Y' in para-Position des Phenylrings gebunden.
  • Wie oben können die Substitutionen der Formel V so gewählt werden, dass sich ein Vernetzungsmittel für eine kovalente oder nicht-kovalente Immobilisierung des Mimetikums an einer unlöslichen Matrix ergibt, um beispielsweise Protein-kinasen und -phosphatasen, z.B. Tyrosin-kinasen, Tyrosin-phosphatase und dergl., zu reinigen. Die Substituenten können ferner eine nachweisbare Markierung z.B. eine radioaktive oder fluoreszierende Markierung, Biotin, Streptavidin oder dergl., bereitstellen, um die Anwesenheit des Mimetikums nachzuweisen.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung der Formel V als ein Peptid oder Peptidanaloges bereitgestellt, das in der Größe einem Dipeptid oder einem größeren Produkt entspricht, wobei es sich beispielsweise bei der Verbindung um ein Peptid oder Peptidanaloges mit zwei oder mehr Aminosäuren oder Aminosäureanalogen handelt. Vorzugsweise liegt die Länge des Peptids oder Peptidanalogen im Bereich von 2 bis 30 Aminosäureresten, insbesondere von 2 bis 20 oder 4 bis 20 Resten und ganz besonders von 4 bis 10 Resten.
  • Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, lassen sich nicht-hydrolysierbare Peptidanaloge herstellen, bei denen die Verbindung der Formel V eingebaut ist. Für erläuternde Zwecke lassen sich erfindungsgemäße Peptidanaloge herstellen, indem man neben den vorstehend beschriebenen Benzodiazepinen folgende Produkte verwendet: substituierte γ-Lactamringe (Garvey et al., Peptides: Chemistry and Biology, Hrsg. G. R. Marshall, ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, (1988), S. 123), C-7-Mimetika (Huffman et al., Peptides: Chemistry and Biology, Hrsg. G. R. Marshall, ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, (1988), S. 105), Ketomethylen-Pseudopeptide (Ewenson et al., J. Med. Chem., Bd. 29 (1986), S. 295; und Ewenson et al., Peptides: Structure and Function (Proceedings on the 9th American Peptide Symposium), Pierce Chemical Co., Rockland, IL, (1985)), Dipeptidkerne mit β-Drehung (Nagai et al., Tetrahedron Lett., Bd. 26 (1985), S. 647; und Sato et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., Bd. 1 (1986), S. 1231), β-Aminoalkohole (Gordon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 126 (1985), S. 419; und Dann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 134 (1986), S. 71), Diaminoketone (Natarajan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 124 (1984), S. 141) und mit Methylenaminogruppen modifizierte Produkte (Roark et al., Peptides: Chemistry and Biology, Hrsg. G. R. Marshall, ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, (1988), S. 134). Verwiesen wird allgemein auf "Session III: Analytic and synthetic methods", in Peptides: Chemistry and Biology, Hrsg. G. R. Marshall, ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, (1988)).
  • In analoger Weise kann man auf Phosphatasen und Kinasen, die natürlicherweise Serin- oder Threoninreste modifizieren, abzielen, indem man in ein Peptidanaloges ein durch Borono- oder Phosphonogruppen modifiziertes Serin- oder Threoninanaloges einbaut, z.B. einen Rest der Formel VI
    Figure 00870001
    worin X8, X9, R'3, R'17, Y', m, M und n die vorstehend definierten Bedeutungen haben,
    j eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist und
    R'10 die Bedeutung H, OH, NH2, Halogen oder Niederalkyl hat und vorzugsweise H oder Me bedeutet.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen hat m den Wert 1 oder 2 und vorzugsweise den Wert 1. Bei bestimmten Ausführungsformen hat j den Wert 0 oder 1 und vorzugsweise den Wert 0.
  • Bei einer beispielhaften Ausführungsform kann es sich bei einem Peptidomimetikum um ein Retro-Inverso-Peptid handeln. Zur Erläuterung lässt sich ein BoronoF-EEI-Peptid als ein Retro-Inverso-Analoges herstellen:
  • Figure 00880001
  • Derartige Retro-Inverso-Analoge lassen sich gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren herstellen, beispielsweise gemäß Sisto et al., US-Patent 4 522 752. Zum Beispiel lässt sich das dargestellte Retro-Inverso-Analoge auf die nachstehend angegebene Weise herstellen. Das geminale Diamin, das dem Boronophenylalanin-Analogen entspricht, wird synthetisiert, indem man ein boronogeschütztes (z.B. als 2,6-Dichlorbenzylether) N-Boc-L-BoronoPhe mit Ammoniak unter HOBT-DCC-Kupplungsbedingungen behandelt, wodurch man N-Boc-L-Boronophenylalaninamid erhält. Anschließend wird eine Umlagerung vom Hofmann-Typ mit 1,1-Bis-(trifluoracetoxy)-iodbenzol (TIB) gemäß Radhakrishna et al., J. Org. Chem., Bd. 44 (1979), S. 1746, durchgeführt. Das als Produkt gebildete Aminsalz wird anschließend mit einem in der Seitenkette geschützten (z.B. als Benzylester) N-Fmoc-D-Glu-Rest unter üblichen Bedingungen gekuppelt, wodurch man das Pseudo dipeptid erhält. Die Fmoc-Gruppe (Fluorenylmethoxycarbonyl) wird mit Piperidin in Dimethylformamid entfernt. Das erhaltene Amin wird mit Bistrimethylsilylacetamid (BSA) trimethylsilyliert, wonach eine Kondensation mit einem in geeigneter Weise alkylierten, in der Seitenkette geschützten Derivat von Meldrum-Säure gemäß US-Patent 5 061 811 (Pinori et al.) durchgeführt wird, wodurch man das Retro-Inverso-Tripeptidanaloge erhält. Das Pseudotripeptid wird sodann mit L-Ile unter üblichen Bedingungen gekuppelt, wodurch man das geschützte Tetrapeptidanaloge erhält. Die Schutzgruppen werden entfernt, um das Endprodukt freizusetzen, das dann durch HPLC gereinigt wird.
  • Gemäß einer weiteren beispielhaften Ausführungsform lässt sich das Peptidomimetikum als ein Retro-Enantio-Analoges des Peptids ableiten, z.B. das beispielhafte Retro-Enantio-Peptidanaloge:
  • Figure 00890001
  • Retro-Enantio-Analoge dieser Art lassen sich unter Verwendung von D-Enantiomeren der vorliegenden Borono-Analogen oder Phosphono-Analogen und von handelsüblichen D-Aminosäuren und unter Anwendung üblicher Peptidsynthesetechniken in fester Phase oder in Lösungsphase synthetisieren. Beispielsweise wird bei einem bevorzugten Festphasen-Syntheseverfahren ein in geeigneter Weise an der Aminogruppe geschützter (tert.-Butyloxycarbonyl, Boc) D-Boronophenylalaninrest kovalent an einen festen Träger, z.B. ein Chlormethylharz, gebunden. Die Boronylgruppe kann beispielsweise gemäß den Angaben in den nachstehenden Beispielen geschützt werden. Das Harz wird mit Dichlormethan (DCM) gewaschen und die BOC-Schutzgruppe wird durch Behandlung mit TFA in DCM entfernt. Sodann wird das Harz gewaschen und neutralisiert. Die nächste BOC-geschützte D-Aminosäure (D-Glu; das an der Seitenkette befindliche Carboxylat wird beispielsweise als Benzylester geschützt) wird durch Kupplung mit Diisopropylcarbodiimid eingeführt. Das Harz wird erneut gewaschen. Der Zyklus wird für jede der restlichen Aminosäuren (D-Glu, D-Met) jeweils wiederholt. Wenn die Synthese des geschützten Retro-Enantio-Peptids vollständig ist, werden die Schutzgruppen entfernt und das Peptid wird vom festen Träger durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure/Anisol/Dimethylsulfid/Thioanisol gespalten. Das Endprodukt wird durch HPLC gereinigt, wodurch man das reine Retro-Enantio-Analoge erhält.
  • Bei einer weiteren beispielhaften Ausführungsform lassen sich trans-Olefinderivate mit den vorliegenden Analogen herstellen, indem man beispielsweise PhosphonoF- oder BoronoF-Reste einbaut. Ein beispielhaftes Olefinanaloges ist nachstehend dargestellt:
  • Figure 00900001
  • Das trans-Olefinanaloge eines Boronophenylalanin enthaltenden Peptids lässt sich gemäß dem Verfahren von Y. K. Shue et al., Tetrahedron Letters, Bd. 28 (1987), S. 3225, herstellen. Ein entsprechendes Schema ist in Fig. 8 von US-Patent 5 776 902 dargestellt. Variationen des Verfahrens können entsprechend der Natur der verwendeten Reagenzien und der Struktur der Zielverbindung erforderlich sein, wobei jedoch alle derartigen Variationen der Routine entsprechen und für den Fachmann offensichtlich sind.
  • Ferner ist es möglich, die gemäß dem vorstehenden Verfahren synthetisierten Peptidanalogen an andere Peptidanaloge zu kuppeln, um Peptidanaloge mit mehreren olefinischen funktionellen Gruppen anstelle von funktionellen Amidgruppen herzustellen. Beispielsweise lassen sich Pseudodipeptide entsprechend pTyr-Glu und Glu-Ile herstellen und sodann nach üblichen Techniken miteinander kuppeln, wodurch man ein Analoges des Tetrapeptids pYEEI erhält, das zwei olefinische Bindungen zwischen den Resten aufweist.
  • Eine weitere Klasse von peptidomimetischen Boronophenylalanin- und Phosphonophenylalaninderivaten umfasst Phosphonatderivate, z.B.
  • Figure 00910001
  • Die Synthese derartiger Phosphonatderivate kann unter entsprechender Anpassung gemäß bekannten Syntheseschemata erfolgen; vergl. z.B. Loots et al., Peptides: Chemistry and Biology, (Escom Science Publishers, Leiden, (1988), S. 118); Petrillo et al., Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, Pierce Chemical Co., Rockland, IL, 1985).
  • Die hier verwendeten Definitionen für die einzelnen Ausdrücke, z.B. Alkyl, m, n und dergl., sollen dann, wenn sie mehr als einmal in einer beliebigen Struktur auftreten, unabhängig von den anderen Definitionen in der gleichen Struktur sein. Die Erfindung ist nicht dadurch beschränkt, dass Substitutionen in den vorstehend aufgeführten Verbindungen vorgenommen werden, wenn derartige Substitutionen funktionelle Gruppen umfassen, von denen aus dem Stand der Technik bekannt ist, dass sie für den Einbau in Verbindungen der vorstehend aufgeführten Art geeignet sind.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Enzyminhibitoren (die beispielsweise durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert worden sind) oder Peptidomimetika davon umfassen, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen (Additiven) und/oder Verdünnungsmitteln zur Verwendung bei der Behandlung eines medizinischen Zustands zubereitet werden. Wie nachstehend ausführlich beschrieben, können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen speziell für die Verabreichung in fester oder flüssiger Form zubereitet werden, wozu Zubereitungen für die folgenden Verabreichungsformen gehören: (1) orale Verabreichung, z.B. ein Arzneitrank (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Boli, Pulver, Granalien, Pasten für die Anwendung auf der Zunge; (2) parenterale Verabreichung, z.B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion beispielsweise einer sterilen Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, z.B. als Creme, Salbe oder Sprühmittel, die auf die Haut aufgetragen werden; oder (4) intravaginal oder intrarektal, beispielsweise als Pessar, Creme oder Schaum.
  • Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", der hier verwendet wird, bedeutet die Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Enzyminhibitor enthalten, durch die eine gewisse angestrebte therapeutische Wirkung durch Hemmung der Wirkung eines bestimmten Enzyms erreicht wird.
  • Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" wird hier zur Bezeichnung von solchen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen verwendet, die sich inner-halb eines vernünftigen medizinischen Beurteilungsrahmens zur Verwendung im Kontakt mit Geweben von Menschen und Tieren eignen, ohne dass übermäßige toxische, irritative oder allergische Reaktionen oder andere Probleme oder Komplikationen in Übereinstimmung mit einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis auftreten.
  • Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger" bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, Zusammensetzung oder Träger, z.B. eine Flüssigkeit oder einen festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, Exzipiens, Lösungsmittel oder Verkapselungsmaterial, die beim Transport des peptidomimetischen Mittels von einem Organ oder Körperteil zu einem anderen Organ oder Körperteil beteiligt sind. Jeder Träger muss in dem Sinn "verträglich" sein, dass er mit den übrigen Bestandteilen der Zubereitung verträglich ist und für den Patienten nicht schädlich ist. Zu einigen Beispielen für Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, gehören: (1) Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und deren Derivate, z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) pulverisiertes Traganth; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talcum; (8) Exzipientien, wie Kakaobutter und Suppositoriumswachse; (9) Öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Saffloröl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; (10) Glykole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol; (12) Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Pufferungsmittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) phosphatgepufferte Lösungen; und (21) weitere nicht-toxische verträgliche Substanzen, die in pharmazeutischen Zubereitungen Anwendung finden.
  • Wie vorstehend dargelegt, können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Enzyminhibitoren eine basische funktionelle Gruppe, z.B. eine Amino- oder Alkylaminogruppe, enthalten, so dass sie sich zur Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen mit pharmazeutisch verträglichen Säuren eignen. Der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in dieser Hinsicht auf relativ nicht-toxische Salze von Enzyminhibitoren mit anorganischen und organischen Säuren. Diese Salze lassen sich in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Peptide, Peptidomimetika oder anderen kleinen Moleküle herstellen oder indem man ein erfindungsgemäßes gereinigtes Peptid, Peptidomimetikum oder ein anderes kleines Molekül in Form der freien Base mit einer geeigneten organischen oder an organischen Säure umsetzt und das auf diese Weise gebildete Salz isoliert. Zu repräsentativen Salzen gehören Hydrobromide, Hydrochloride, Sulfate, Bisulfate, Phosphate, Nitrate, Acetate, Valerate, Oleate, Palmitate, Stearate, Laurate, Benzoate, Lactate, Tosylate, Citrate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Napthylate, Mesylate, Glucoheptonate, Lactobionate und Laurylsulfonate und dergl. (vergl. z.B. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., Bd. 66 (1977), S. 1–19).
  • In anderen Fällen können die erfindungsgemäßen Verbindungen eine oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und somit zur Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen mit pharmazeutisch verträglichen Basen geeignet sein. Diesbezüglich bedeutet der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze" relativ nicht-toxische Additionssalze eines Enzyminhibitors mit einer anorganischen und organischen Base. Diese Salze können gleichermaßen in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der Peptide oder Peptidomimetika oder durch getrennte Umsetzung der gereinigten Verbindung in Form ihrer freien Säure mit einer geeigneten Base, z.B. dem Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Zu repräsentativen Alkali- oder Erdalkalimetallsalzen gehören Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergl. Zu repräsentativen organischen Aminen, die sich zur Zubereitung von Basenadditionssalzen eignen, gehören Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergl.; vergl. z.B. Berge et al., a.a.O.
  • Netzmittel, Emulgatoren und Gleitmittel, wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie farbgebende Mittel, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßungsmittel, Aroma- und Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel können in den Zusammensetzungen ebenfalls vorhanden sein.
  • Zu Beispielen für pharmazeutisch verträgliche Antioxidationsmittel gehören: (1) wasserlösliche Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit und dergl.; (2) öllösliche Antioxidationsmittel, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, alpha-Tocopherol und dergl.; und (3) Metall-Chelatbildungsmittel, wie Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergl.
  • Zu erfindungsgemäßen Zubereitungen gehören solche für die orale, nasale, topische (einschließlich bukkale und sublinguale), rektale, vaginale und/oder parenterale Verabreichung. Die Zubereitungen können zweckmäßigerweise in Dosiseinheitsform dargereicht und nach beliebigen, auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Menge des Wirkstoffes, der mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer einzelnen Dosierungsform vereinigt wird, hängt von dem zu behandelnden Wirt und vom speziellen Verabreichungsweg ab. Bei der Wirkstoffmenge, die mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer einzelnen Dosierungsform vereinigt werden kann, handelt es sich im Allgemeinen um die Menge des Enzyminhibitors, die einen therapeutischen Effekt hervorruft. Im Allgemeinen beträgt diese Menge, bezogen auf 100 %, etwa 1 bis etwa 99 %, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 70 % und insbesondere etwa 10 bis etwa 30 % Wirkstoff.
  • Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen oder Zusammensetzungen umfassen eine Stufe, bei der eine erfindungsgemäße Verbindung mit dem Träger und gegebenenfalls einem oder mehreren weiteren Bestandteilen in Kontakt gebracht wird. Im Allgemeinen werden die Zubereitungen hergestellt, indem man ein erfindungsgemäßes Peptid oder Peptidomimetikum mit flüssigen Trägern und/oder fein verteilten festen Trägern gleichmäßig und innig vereinigt und gegebenenfalls eine Formgebung des Produkts vornimmt.
  • Erfindungsgemäße Zubereitungen, die sich für die orale Verabreichung eignen, können in Form von Kapseln, Säckchen, Pillen, Tabletten, Pastillen (unter Verwendung einer aromatisierten Grundlage, üblicherweise Saccharose und Gummi arabicum oder Traganth), Pulvern, Granalien oder in Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder einer flüssigen Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion oder als Elixier oder Sirup oder in Form von Pastillen (unter Verwendung einer inerten Base, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Gummi arabicum) und/oder als Mundspülmittel und dergl., vorliegen, die jeweils eine vorbestimmte Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung als Wirkstoff enthalten. Ein erfindungsgemäßes Peptid, Peptidomimetikum oder kleines Molekül kann auch in Form eines Bolus, Electuariums oder Paste verabreicht werden.
  • Bei erfindungsgemäßen festen Dosierungsformen für die orale Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granalien und dergl.) wird der Wirkstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen, wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder einem der folgenden Bestandteile vermischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel, z.B. Carboxymethyl cellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Gummi arabicum; (3) Feuchthaltemittel, z.B. Glycerin; (4) Sprengmittel, z.B. Agar-agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiocastärke, Alginsäure, bestimmte Silicate und Natriumcarbonat; (5) Auflösungsverzögerungsmittel, wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumverbindungen; (7) Netzmittel, z.B. Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorptionsmittel, wie Kaolin und Bentonitton; (9) Gleitmittel, wie Talcum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; (10) farbgebende Mittel. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch Pufferungsmittel enthalten. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können ebenfalls als Füllstoffe in weichen und harten, gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden, wobei man Exzipientien, wie Lactose oder Milchzucker, sowie hochmolekulare Polyethylenglykole und dergl. verwendet.
  • Eine Tablette lässt sich durch Verpressen oder Formgebung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, herstellen. Verpresste Tabletten lassen sich unter Verwendung eines Bindemittels (z.B. Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), eines Gleitmittels, eines inerten Verdünnungsmittels, eines Konservierungsmittels, eines Sprengmittels (z.B. Natriumstärkeglycolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), eines oberflächenaktiven Mittels oder eines Dispergiermittels herstellen. Geformte Tabletten lassen sich durch Formgebung in einer geeigneten Maschine aus einem Gemisch des pulverisierten Peptids, Peptidomimetikums oder kleinen Moleküls, das mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel befeuchtet ist, herstellen.
  • Die Tabletten und andere feste Dosierungsformen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granalien, können gegebenenfalls gekerbt oder mit Überzügen und Schalen, wie erst im Darm löslichen Überzügen und anderen Überzügen, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Zubereitung bekannt sind, hergestellt werden. Sie können auch so zubereitet werden, dass sich eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffes ergibt, wozu man beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen zur Bereitstellung des angestrebten Freisetzungsprofils, weitere polymere Matrices, Liposomen und/oder Mikrokügelchen verwendet. Die Produkte können sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter oder durch Einverleiben von Sterilisationsmitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder in anderen sterilen injizierbaren Medien unmittelbar vor der Verwendung gelöst werden können. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls auch Trübungsmittel enthalten und so zusammengesetzt sein, dass sie gegebenenfalls den oder die Wirkstoffe nur im Magendarmtrakt oder vorzugsweise in einem bestimmten Bereich in verzögerter Weise freisetzen. Zu Beispielen für einbettende Zusammensetzungen, die verwendet werden können, gehören polymere Substanzen und Wachse. Der Wirkstoff kann gegebenenfalls auch in mikroverkapselter Form zusammen mit einem oder mehreren der vorerwähnten Exzipientien vorliegen.
  • Zu flüssigen Dosierungsformen für die orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen gehören pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere. Neben dem Wirkstoff können die flüssigen Dosierungsformen folgendes enthalten: auf dem einschlägigen Gebiet üblicherweise verwendete inerte Verdün nungsmittel, wie Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Öle (insbesondere Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maisöl, Keimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon.
  • Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe, wie Netzmittel, Emulgiermittel und Suspendiermittel, Süßungsmittel, Aromastoffe, farbgebende Mittel, Geruchsstoffe und Konservierungsmittel enthalten.
  • Suspensionen können neben dem oder den aktiven GGPTase-Inhibitoren Suspendiermittel, wie ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-agar und Traganth sowie Gemische davon enthalten.
  • Zubereitungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen für die rektale oder vaginale Verabreichung können als Suppositorien dargereicht werden, die durch Vermischen von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren geeigneten nicht-reizenden Exzipientien oder Trägern, z.B. Kakaobutter, Polyethylenglykol, Suppositoriumswachs oder Salicylat hergestellt werden, wobei die Suppositorien bei Raumtemperatur fest, jedoch bei Körptertemperatur flüssig sind und daher im Rektum oder in der Vaginahöhle schmelzen und den aktiven Inhibitor freisetzen.
  • Zu erfindungsgemäßen Zubereitungen, die sich für die vaginale Verabreichung eignen, gehören auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schaumprodukte oder Sprühzubereitungen, die derartige Träger, wie sie aus dem Stand der Technik als geeignet bekannt sind, enthalten.
  • Dosierungsformen für die topische oder transdermale Verabreichung eines Peptids, Peptidomimetikums oder kleinen Moleküls gemäß der Erfindung umfassen Pulver, Sprühmittel, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalationsmittel. Der Wirkstoff kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und mit etwaigen Konservierungsmitteln, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, vermischt werden.
  • Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben einem aktiven GGPTase-Inhibitor Exzipientien, wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Traganth, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talcum und Zinkoxid oder Gemische davon, enthalten.
  • Pulver und Sprühmittel können neben einer erfindungsgemäßen Verbindung Exzipientien, wie Lactose, Talcum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen, enthalten. Sprühmittel können zusätzlich herkömmliche Treibmittel, wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, wie Butan und Propan, enthalten.
  • Transdermale Pflaster haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie für eine kontrollierte Abgabe einer erfindungsgemäßen Verbindung an den Körper sorgen. Derartige Dosierungsformen können hergestellt werden, indem man das Peptid, Peptidomimetikum oder kleine Molekül im geeigneten Medium löst oder dispergiert. Ferner können Absorptionsverstärker verwendet werden, um den Fluss des Arzneistoffes durch die Haut zu verstärken. Die Geschwindigkeit eines derartigen Flusses lässt sich steuern, indem man entweder eine geschwindigkeitskontrollierende Membran vorsieht oder das Peptid, Peptidomimetikum oder kleine Molekül in einer polymeren Matrix oder einem Gel dispergiert.
  • Opthalmische Zubereitungen, Augensalben, Pulver, Lösungen und dergl. fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung.
  • Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich für die parenterale Verabreichung eignen, umfassen ein oder mehr Peptide, Peptidomimetika oder kleine Moleküle der Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Bestandteilen, nämlich sterilen isotonischen wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pulvern, die unmittelbar vor der Verwendung zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen rekonstituiert werden können, wobei diese Produkte Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Bestandteile, die die Zubereitung mit Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch machen, oder Suspendier- oder Verdickungsmittel enthalten können.
  • Zu Beispielen für geeignete wässrige oder nicht-wässrige Trägerstoffe, die in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, gehören Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergl.) und geeignete Gemische davon, pflanzliche Öle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Eine geeignete Fluidität kann aufrechterhalten werden, indem man beispielsweise Beschichtungsmaterialien, wie Lecithin, verwendet, im Fall von Dispersionen die erforderliche Teilchengröße aufrechterhält und oberflächenaktive Mittel einsetzt.
  • Diese Zusammensetzungen können ferner Adjuvantien enthalten, z.B. Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel. Eine Einwirkung von Mikroorganismen kann verhindert werden, indem man verschiedene antibakterielle oder antimykotische Mittel zusetzt, wie Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergl. Ferner kann es erwünscht sein, isotonische Mittel, wie Zucker, Natriumchlorid und dergl., den Zusammensetzungen hinzuzufügen. Außerdem kann eine verlängerte Resorptionsdauer der injizierbaren pharmazeutischen Darreichungsform durch Zusatz von Mitteln, die die Resorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine, erreicht werden.
  • In einigen Fällen ist es zur Erzielung einer längeren Wirkung eines Arzneistoffes erstrebenswert, die Resorption des Arzneistoffes bei subkutaner oder intramuskulärer Injektion zu verlangsamen. Dies kann durch Verwendung einer flüssigen Suspension von kristallinem oder amorphem Material mit geringer Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Resorptionsgeschwindigkeit des Arzneistoffes hängt sodann von der Auflösungsgeschwindigkeit ab, die wiederum von der Kristallgröße und der kristallinen Form abhängen kann. Alternativ lässt sich eine verzögerte Resorption einer parenteral verabreichten Arzneistoffform durch Lösen oder Suspendieren des Arzneistoffes in einem Ölträger erreichen.
  • Injizierbare Depotformen werden hergestellt, indem man mikroverkapselte Matrices der vorliegenden Peptide, Peptidomimetika oder kleinen Moleküle in biologisch abbaubaren Polymeren, wie Polylactid-polyglycolid, herstellt. Je nach dem Verhältnis des Arzneistoffes zum Polymeren und je nach der Art des speziellen verwendeten Polymeren lässt sich die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung steuern. Zu Beispielen für weitere biologisch abbaubare Polymere gehören Poly-(orthoester) und Poly-(anhydride). Injizierbare Depotpräparate können auch hergestellt werden, indem man den Arzneistoff in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit dem Körpergewebe verträglich sind, einschließt.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als pharmazeutische Präparate an Menschen und Tiere verabreicht werden, können sie als solche oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die beispielsweise 0,1 bis 99,5 % (vorzugsweise 0,5 bis 90 %) Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff enthält, verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Präparate können oral, parenteral, topisch oder rektal verabreicht werden. Sie werden selbstverständlich in Formen gegeben, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise werden sie in Form von Tabletten oder Kapseln, als Injektionspräparate, Inhalationspräparate, Augenlotionen, Salben, Suppositorien und dergl. durch Injektion, Infusion oder Inhalation, topisch in Form von Lotionen oder Salben und rektal in Form von Suppositorien verabreicht. Eine orale Verabreichung wird bevorzugt.
  • Die Ausdrücke "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht", die hier verwendet werden, bedeuten Verabreichungsarten, die sich von einer enteralen oder topischen Verabreichung unterscheiden, üblicherweise durch Injektion. Sie umfassen ohne Beschränkung hierauf eine intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoide, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion.
  • Die Ausdrücke "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht", die hier verwendet werden, bedeuten die Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneistoffes oder eines anderen Materials in einer von einer direkten Verabreichung abweichenden Art in das Zentralnervensystem, so dass das Produkt in das System des Patienten gelangt und somit dem Stoffwechsel oder anderen ähnlichen Vorgängen unterliegt, z.B. durch subkutane Verabreichung.
  • Unabhängig vom gewählten Verabreichungsweg können die erfindungsgemäß geeigneten Enzyminhibitoren im vorliegenden Verfahren in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden und/oder die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden nach herkömmlichen, dem Fachmann geläufigen Verfahren zu pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen zubereitet.
  • Die tatsächlichen Dosierungsniveaus der Wirkstoffe in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können so variiert werden, dass man eine Menge des Wirkstoffes erzielt, die zur Erreichung der angestrebten therapeutischen Reaktion bei einem speziellen Patienten, einer speziellen Zusammensetzung und einem speziellen Verabreichungsweg sich als wirksam erweist, ohne dass die Menge für den Patienten toxisch ist.
  • Das gewählte Dosierungsniveau hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, wozu die Aktivität des speziellen verwendeten Enzyminhibitors oder des Esters, Salzes oder Amids davon, der Verabreichungsweg, der Verabreichungszeitpunkt, die Ausscheidungsgeschwindigkeit der verwendeten speziellen Verbindung, die Behandlungsdauer, andere Arzneistoffe, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit dem verwendeten speziellen Inhibitor eingesetzt werden, das Alter, das Geschlecht, das Gewicht, der Zustand, die allgemeine Gesundheit und die vorherige medizinische Geschichte des behandelten Patienten und ähnliche Faktoren, die auf dem medizinischen Gebiet bekannt sind, gehören.
  • Ein Arzt oder Tierarzt mit allgemeinem Fachwissen kann die erforderliche wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung leicht bestimmen und verschreiben. Beispielsweise kann der Arzt oder Tierarzt mit Dosen der in den pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten erfindungsgemäßen Verbindungen starten, die unter den zur Erzielung der angestrebten therapeutischen Wirkung erforderlichen Dosen liegen, und allmählich die Dosierung steigern, bis die erwünschte Wirkung erreicht ist.
  • Im Allgemeinen handelt es sich bei einer geeigneten täglichen Dosis eines wirkungsstarken Enzyminhibitors, der beispielsweise einen EC50-Wert im Bereich von 1 mM bis subnanomolar aufweist, um die Menge der Verbindung, die die geringste Dosis, die eine therapeutische Wirkung erzielt, darstellt. Eine derartige wirksame Dosis hängt im Allgemeinen von den vorstehend beschriebenen Faktoren ab. Im Allgemeinen liegen intravenöse, intrazerebroventrikuläre und subkutane Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen für einen Patienten bei Verwendung für die angestrebten Wirkungen im Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 1 000 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise 0,5 bis 300 mg pro Kilogramm.
  • Gegebenenfalls kann die wirksame tägliche Dosis des aktiven Inhibitors in zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr unterteilte Dosen getrennt in geeigneten, über den gesamten Tag verteilten Dosen, gegebenenfalls in Dosiseinheitsformen, verabreicht werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Mittel für die orale Verabreichung zubereitet, z.B. in Form einer festen Tablette, Pille, Kapsel, "Caplet" oder dergl. (nachstehend zusammengefasst als "Tablette" bezeichnet) oder in Form einer wässrigen Lösung oder Suspension zubereitet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Tablettenform des Mittels werden die Tabletten vorzugsweise so zubereitet, dass die Menge des Wirkstoffes (oder der Wirkstoffe), die in 20 Tabletten zusammen bereitgestellt wird, eine Dosis ergibt, die mindestens der mittleren wirksamen Dosis (ED50) entspricht, z.B. der Dosis, bei der mindestens 50 % der Individuen die mengenmäßige Hemmwirkung der Enzymwirkung zeigten (z.B. eine statistisch signifikante Aktivitätsverringerung). Insbesondere werden die Tabletten so zubereitet, dass die Gesamtmenge des Wirkstoffes (oder der Wirkstoffe), die in 10, 5, 2 oder 1 Tablette mindestens eine ED50-Dosis bei einem Patienten (humaner oder nicht-humaner Säuger) ergeben. Bei anderen Ausführungsformen ergibt die Menge des Wirkstoffes (oder der Wirkstoffe) in 20, 10, 5 oder 2 Tabletten zusammen innerhalb einer 24-stündigen Zeitdauer eine Dosierung, die im Mittel eine durchschnittliche Plasmakonzentration des oder der Mittel ergibt, die mindestens der ED50-Konzentration (die Konzentration, die 50 % der maximalen Wirkung, beispielsweise der Hemmung des Zellwachstums, ergibt) entspricht, obgleich sie vorzugsweise weniger als das 100-fache der ED50-Dosis und insbesondere weniger als das 10- oder das 5-fache der ED50-Dosis entspricht. Bei bevorzugten Ausführungsformen stellt eine einzelne Dosis von Tabletten (1 bis 20 Tabletten) etwa 0,25 mg bis 1 250 mg eines oder mehrerer Wirkstoffe bereit.
  • Gleichermaßen können die Mittel für die parenterale Zubereitung zubereitet werden, z.B. für eine subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, wobei beispielsweise das Mittel in einer sterilen Lösung oder Suspension (nachstehend zusammenfassend als "injizierbare Lösung" bezeichnet) bereitgestellt werden kann. Die injizierbare Lösung wird vorzugsweise so zubereitet, dass die Menge des Wirkstoffes (oder der Wirkstoffe), die in 200 cm3 einer Bolusinjektion bereitgestellt wird, eine Dosis ergibt, die mindestens der mittleren wirksamen Dosis entspricht, obgleich die Dosis vorzugsweise weniger als dem 100-fachen der ED50-Dosis und insbesondere weniger als dem 10- oder 50-fachen der ED50-Dosis entspricht. Insbesondere wird die injizierbare Lösung so zubereitet, dass die Gesamtmenge des Mittels (oder der Mittel) die in 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 oder 1 cm3 Injektionsflüssigkeit eine ED50-Dosis bei einem Patienten und vorzugsweise weniger als das 100-fache der ED50-Dosis und ganz besonders weniger als das 10- oder 5-fache der ED50-Dosis ergeben. Bei weiteren Ausführungsformen ergibt die Menge des Wirkstoffes (oder der Wirkstoffe), die in einem Gesamtvolumen von 100, 50, 25, 5 oder 2 cm3 bei mindestens 2-maliger Injektion innerhalb von 24 Stunden zu injizieren sind, eine Dosierung, die im Mittel eine durchschnittliche Plasmakonzentration des oder der Mittel von mindestens der ED50-Konzentration ergibt, vorzugsweise weniger als das 100-fache des ED50-Werts und insbesondere weniger als das 10- oder 5-fache des ED50-Werts. Bei bevorzugten Ausführungsformen ergibt eine einzelne Injektionsdosis etwa 0,25 mg bis 1 250 mg des Wirkstoffes.
  • Für eine kontinuierliche intravenöse Infusion, z.B. Eintropfen oder Stoßen, kann der Wirkstoff in einer sterilen verdünnten Lösung oder Suspension bereitgestellt werden (nachstehend zusammenfassend als "intravenös injizierbare Lösung" bezeichnet). Die intravenös injizierbare Lösung wird vorzugsweise so zubereitet, dass die Menge des Wirkstoffes (oder der Wirkstoffe), die in 1 Liter Lösung bereitgestellt wird, eine Dosis ergibt, die bei Verabreichung innerhalb von 15 Minuten oder weniger mindestens die mittlere wirksame Dosis erreichen lässt, vorzugsweise weniger als das 100-fache des ED50-Werts und insbesondere weniger als das 10- oder 5-fache des ED50-Werts. Insbesondere wird die intravenös injizierbare Lösung so zubereitet, dass die Gesamtmenge des Mittels (oder der Mittel) in 1 Liter Lösung bei Verabreichung innerhalb von 60, 90, 120 oder 240 Minuten eine ED50-Dosis für einen Patienten ergibt, wobei vorzugsweise weniger als das 100-fache des ED50-Werts und insbesondere weniger als das 10- oder 5-fache des ED50-Werts bevorzugt wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen ergibt ein einzelner intravenöser "Beutel" etwa 0,25 mg bis 5 000 mg Wirkstoff pro Liter der intravenösen Lösung, vorzugsweise 0,25 mg bis 2 500 mg und insbesondere 0,25 mg bis 1 250 mg.
  • Wie vorstehend erörtert, ergibt das bevorzugte pharmazeutische Präparat bei Injektion oder oraler Verabreichung (oder bei einem anderen Verabreichungsweg) eine Dosis von weniger als dem ED50-Wert für die Modulation der Enzymaktivität im Wirt, vorzugsweise um mindestens eine Größenordnung weniger und insbesondere um mindestens 2, 3 oder 4 Größenordnungen weniger.
  • Eine ED50-Dosis für einen Menschen beruht auf einem Körpergewicht von 10 bis 250 lb und vorzugsweise für einen Erwachsenen im Bereich von 100 bis 250 lb.
  • Beispielteil
  • Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen darstellen, erläutert. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass diese Ausführungsformen lediglich beispielhaften Charakter aufweisen und die Erfindung in keiner Weise beschränken sollen. Herstellung von löslichen Peptid-Boronsäure-Bibliotheken für die LC-MS-Analyse
    Figure 01100001
    2-Chlortritylchlorid-Harz
    Figure 01100002
    Oxim-Harz X-boroPro
    Stufe 1: BocX(boc) ---- {Oxim-Harz}
    Stufe 2: BocX(boc)-boroPro (freigesetzt durch boroPro)
    Stufe 3: Entfernung sämtlicher Schutzgruppen = > X-boroPro
    X-X-boroPro
    Stufe 1: Fmoc-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 2: BocX(boc)-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 3: BocX(boc)-X(boc) (1*TFA-Spaltung)
    Stufe 4: BocX(boc)-X(boc)----{Oxim-Harz}
    Stufe 5 : BocX(boc)-X(boc)-boroPro (freigesetzt durch boroPro)
    Stufe 6: Entfernung sämtlicher Schutzgruppen = > X-X-boroPro
    X-X-X-boroPro
    Stufe 1: Fmoc-X (boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 2: FmocX(boc)-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 3: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 4: BocX(boc)-X(boc)-X(boc) (1 %TFA Spaltung)
    Stufe 5: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)----{Oxim-Harz}
    Stufe 6: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)-boroPro (freigesetzt durch boroPro)
    Stufe 7: Entfernung sämtlicher Schutzgruppen = > X-X-X-boroPro
    X-X-X-X-boroPro
    Stufe 1: Fmoc-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 2: FmocX(boc)-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 3: FmocX(boc)-X(boc)-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 4: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)-X(boc)----{2-ClTrt-Harz}
    Stufe 5: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)-X(boc) (Spaltung)
    Stufe 6: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)-X(boc)----{Oxim-Harz}
    Stufe 7: BocX(boc)-X(boc)-X(boc)-X(boc)-boroPro (freigesetzt durch boroPro)
    Stufe 8: Entfernung sämtlicher Schutzgruppen = > X-X-X-X-boroPro
  • Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen dienen nur Beispielzwecken und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.

Claims (37)

  1. Verfahren zur Bestimmung eines bevorzugten Aminosäuresequenz-Motivs für ein aktives Zentrum eines Enzyms, umfassend folgende Stufen: a) man bringt das Enzym mit einer orientierten, degenerierten Peptidbibliothek, die eine aktive Untereinheit an einer fixierten, nicht-degenerierten Position umfasst, unter Bedingungen in Kontakt, die es der aktiven Untereinheit ermöglichen, mit dem aktiven Zentrum des Enzyms in Wechselwirkung zu treten; b) man lässt das Enzym Peptide innerhalb der orientierten, degenerierten Peptidbibliothek binden; c) man trennt die Population von ungebundenen Peptiden von Peptid/Enzym-Komplexen; d) man setzt die gebundenen Peptide vom Enzym frei; e) man bestimmt die Aminosäuresequenzen der Population von gebundenen Peptiden; und f) man bestimmt ein bevorzugtes Aminosäuresequenz-Motiv für ein aktives Zentrum des Enzyms auf der Grundlage der relativen Häufigkeit von verschiedenen Aminosäureresten an jeder degenerierten Position innerhalb der Population von gebundenen Peptiden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der orientierten, degenerierten Peptidbibliothek um eine lösliche synthetische Peptidbibliothek handelt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der orientierten, degenerierten Peptidbibliothek um eine an einen festen Träger gebundene Bibliothek handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek Peptide der Formel (Xaa)n-Yaa-(Xaa)m umfasst, wobei Yaa eine aktive Untereinheit bedeutet, die zur Bildung eines kovalenten Addukts oder eines fest gebundenen Addukts mit einem Bereich eines aktiven Zentrums eines Enzyms befähigt ist; Xaa eine Aminosäure oder ein Aminosäureanaloges bedeutet; und n und m ganze Zahlen mit Werten von 0 bis einschließlich 10 sind, wobei die Summe von m und n mindestens 2 beträgt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die aktive Untereinheit an der fixierten, nicht-degenerierten Position der Peptide der orientierten, degenerierten Peptidbibliothek die einzige aktive Untereinheit in den Peptiden darstellt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Enzym um eine Protease handelt und die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek Peptide der Formel (Xaa)n-Yaa-(Xaa)m umfasst, wobei Yaa eine aktive Untereinheit bedeutet, die eine funktionelle Gruppe umfasst, die zur Bildung eines kovalenten Addukts oder eines fest gebundenen Addukts mit einer nukleophilen Substanz befähigt ist; Xaa eine Aminosäure oder ein Aminosäureanaloges bedeutet; und n und m ganze Zahlen mit Werten von 0 bis einschließlich 10 sind, wobei die Summe von m und n mindestens 2 beträgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei Yaa eine aus folgender Gruppe ausgewählte funktionelle Gruppe umfasst: funktionelle Aldehyd-, Borsäure-, Halogenmethylketon-, Trifluormethylketon-, alpha-Ketocarbonsäurederivat- und Phosphongruppen.
  8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Enzym um eine Protease handelt.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek Peptide der Formel Z1-(Xaa)n-Yaa-(Xaa)m-Z2 umfasst, wobei Yaa eine aktive Untereinheit bedeutet, die zur Bildung eines kovalenten Addukts oder eines fest gebundenen Addukts mit einem Bereich eines aktiven Zentrums eines Enzyms befähigt ist; Xaa eine Aminosäure oder ein Aminosäureanaloges bedeutet; und n und m ganze Zahlen mit Werten von 0 bis einschließlich 10 sind, wobei die Summe von n und m mindestens 2 beträgt; Z1 ein Wasserstoffatom oder ein Peptid der Formel (Xaa)a bedeutet, wobei Xaa eine beliebige nichtdegenerierte Aminosäure oder Aminosäureanaloges bedeutet und a eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis einschließlich 15 ist; und Z2 ein Wasserstoffatom oder ein Peptid der Formel (Xaa)b bedeutet, wobei Xaa eine beliebige nichtdegenerierte Aminosäure oder Aminosäureanaloges bedeutet und b eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis einschließlich 15 ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei a und b ganze Zahlen mit einem Wert von 1 bis einschließlich 10 sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei a und b ganze Zahlen mit einem Wert von 1 bis einschließlich 5 sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die orientierte, degenerierte Peptidbibliothek Peptide der Formel Xaa1-[Xaa1]n-Xaa1-Yaa umfasst, wobei Xaa1 (unabhängig für jedes Auftreten) eine beliebige Aminosäure oder Aminosäureanaloges bedeutet; n eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 20 ist; und Yaa eine aktive Untereinheit bedeutet, die zur Bildung eines kovalenten Addukts oder eines fest gebundenen Addukts mit einem Bereich eines aktiven Zentrums eines Enzyms befähigt ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei n eine ganze Zahl mit einem Wert zwischen 0 und 10 ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die aktive Untereinheit mindestens eine kovalente Bindung oder einen fest gebundenen Komplex mit einem Bereich des aktiven Zentrums des Enzyms bildet.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim Enzym um eine Protein-phosphatase handelt.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das bevorzugte Aminosäuresequenz-Motiv für das aktive Zentrum des Enzyms bestimmt wird, indem man einen Wert für die relative Häufigkeit (RA) für jeden Aminosäurerest (Xaa) an jeder degenerierten Position berechnet, wobei RA durch die folgende Formel bestimmt wird:
    Figure 01150001
    und Aminosäurereste auswählt, die einen relativen Häufigkeitswert von mehr als 1,0 an einer degenerierten Position aufweisen, zur Einbeziehung an einer Position, die der degenerierten Position im bevorzugten Aminosäuresequenz-Motiv entspricht.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Herstellen eines Peptidomimetikums, das dem ermittelten, bevorzugten Aminosäuresequenz-Motiv entspricht.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bibliothek eine aktive Untereinheit mit einer Struktur der Formel I
    Figure 01160001
    umfasst, wobei W BY1Y2, Perhalogenalkyl oder C(=O)R5 bedeutet; R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 01160002
    bedeutet; R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet; R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure öder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 01160003
    bedeutet oder R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; Y1 und Y2 unabhängig voneinander oder zusammen Hydroxyl oder eine Gruppe, die zu einer Hydroxylgruppe hydrolysiert werden kann, bedeuten, einschließlich cyclische Derivate, wobei Y1 und Y2 über einen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur gebunden sind, oder Y1 und/oder Y2 eine Bindung an eine Aminogruppe eines Aminosäurerestes bedeuten, R5 H, Halogenmethyl, Trifluormethyl, Amido, Ester, Keton, Carboxyl, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7 oder -CH2O-R10 bedeutet, R6 Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-(CH2)m-R7, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-Alkyl, -(CH2)m-S-Alkenyl, -(CH2)m-S-Alkinyl, -(CH2)m-S-(CH2)m-R7,
    Figure 01170001
    bedeutet; R7 Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Heterocyclyl bedeutet; R8 und R9 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, -(CH2)m-R7, -C(=O)-Alkyl, -C(=O)-Alkenyl, -C(=O)-Alkinyl oder -C(=O)-(CH2)m-R7 bedeuten oder R8 und R9 zusammen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R10 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 01180001
    bedeutet; m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei W eine Boronsäure, ein Aldehyd, ein Perhalogenalkyl oder Perfluoralkyl, ein Trifluormethylketon, ein Halogenmethylketon, einen alpha-Ketoester, ein alpha-Diketon, ein alkpha-Ketoamid oder eine alpha-Ketosäure bedeutet.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei R2 und R4 beide H bedeuten und R3 (unabhängig von jedem Auftreten in der Verbindungsbibliothek) eine natürlich vorkommende Aminosäureseitenkette bedeutet.
  21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei W BY1Y2 bedeutet und Y1 und Y2 unabhängig voneinander oder zusammen Hydroxyl oder eine Gruppe, die zu einer Hydroxylgruppe hydrolysiert werden kann, bedeuten, einschließlich cyclische Derivate, wobei Y1 und Y2 über einen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur verbunden sind.
  22. Verfahren nach Anspruch 18, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges bedeutet und R2 H bedeutet.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bibliothek eine Mehrzahl von Peptiden der allgemeinen Formel II
    Figure 01190001
    umfasst, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 01190002
    bedeutet; R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet; R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, – (CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 01190003
    Figure 01200001
    bedeutet oder R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; und R11 (unabhängig für jedes Auftreten) Wasserstoff, Alkyl oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeutet, oder beide Reste R11 zusammen mit den O-B-O-Atomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei R11 in beiden Fällen H bedeutet.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges bedeutet und R2 H bedeutet.
  26. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptidbibliothek Peptide der allgemeinen Formel III
    Figure 01200002
    umfasst, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder ein Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 01200003
    bedeutet; R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet; R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 01210001
    bedeutet; oder R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges bedeutet und R2 H bedeutet.
  28. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptidbibliothek Peptide der allgemeinen Formel IIIa
    Figure 01220001
    umfasst, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 01220002
    bedeutet; R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet; R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 01220003
    bedeutet; oder R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; und R5 Halogenmethyl, Trifluormethyl, Amido, Ester, Keton oder Carboxyl bedeutet.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei R1 einen c-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges bedeutet und R2 H bedeutet.
  30. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptidbibliothek Verbindungen der allgemeinen Formel IV
    Figure 01230001
    umfasst, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges oder ein C-terminal verknüpftes Peptid oder Peptidanaloges oder
    Figure 01230002
    bedeutet; R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-Alkyl, -(CH2)m-O-Alkenyl, -(CH2)m-O-Alkinyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkyl, -(CH2)m-O-C(=O)-Alkenyl oder -(CH2)m-O-C(=O)-Alkinyl-(CH2)m-O-C(=O)-(CH2)m-R7 bedeutet; R3 und R4 jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-Alkyl, -(CH2)n-O-Alkenyl, -(CH2)n-O-Alkinyl, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-Alkyl, -(CH2)n-S-Alkenyl, -(CH2)n-S-Alkinyl, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, eine α-Kohlenstoff-verknüpfte Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogen,
    Figure 01240001
    bedeutet; oder R2 und R3 zusammen einen Ring mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; oder vorausgesetzt, dass R2 und R3 nicht zusammen einen Ring bilden, R3 und R4 zusammen einen Ring mit 3 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen können; und X1, X2 und X3 jeweils Wasserstoff oder Halogen bedeuten.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei R1 einen C-terminal verknüpften Aminosäurerest oder Aminosäureanaloges bedeutet und R2 H bedeutet.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei X1, X2 und X3 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, Br oder I bedeuten oder X1, X2 und X3 alle F bedeuten.
  33. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bibliothek eine aktive Untereinheit der allgemeinen Formel V
    Figure 01240002
    umfasst, wobei Y' eine Substitution an einer der meta, ortho- oder para-Positionen des Phenylrestes bedeutet, wobei Y' eine Boronogruppe der allgemeinen Formel
    Figure 01250001
    oder eine Phosphonogruppe der allgemeinen Formel
    Figure 01250002
    bedeutet, wobei R15 und R16 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Niederalkyl oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeuten oder R15 und R16 zusammen mit den O-B-O- oder O-P-O-Atomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R'14 abwesend ist oder einen oder mehrere Substituenten an den restlichen Ringpositionen bedeutet, wobei die Substituenten unter Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7, -CF3, -CN oder dergleichen ausgewählt sind; M (unabhängig für jedes Auftreten) eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe bedeutet; X8 und X9 jeweils unabhängig voneinander Methylen, Ethylen, Acetylen, Amin, Carbonyl, Phosphonyl, Schwefel, Sauerstoff oder Selen bedeuten; R'17 abwesend ist oder Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7 bedeutet oder R'17 einen mit X8 kondensierten Aminosäurerest oder Peptid bedeutet; R'3 abwesend ist oder Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7 bedeutet oder R'3 einen mit X9 kondensierten Aminosäurerest oder Peptid bedeutet; R7 Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Heterocyclyl oder Polycyclyl bedeutet; m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 bedeutet; und n 1, 2 oder 3 ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bibliothek eine aktive Untereinheit mit einem Rest der Formel VI
    Figure 01260001
    umfasst, wobei Y' eine Substitution an einer der meta-, ortho- oder para-Positionen des Phenylrestes bedeutet, wobei Y' eine Boronogruppe der allgemeinen Formel
    Figure 01260002
    oder eine Phosphonogruppe der allgemeinen Formel
    Figure 01260003
    bedeutet, wobei R15 und R16 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Niederalkyl oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeuten oder R15 und R16 zusammen mit den O-B-O- oder O-P-O-Atomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R'14 abwesend ist oder einen oder mehrere Substituenten an den restlichen Ringpositionen bedeutet, wobei die Substituenten unter Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7, -CF3, -CN oder dergleichen ausgewählt sind; M (unabhängig für jedes Auftreten) eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe bedeutet; X8 und X9 jeweils unabhängig voneinander Methylen, Ethylen, Acetylen, Amin, Carbonyl, Phosphonyl, Schwefel, Sauerstoff oder Selen bedeuten; R'17 abwesend ist oder Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7 bedeutet oder R'17 einen mit X8 kondensierten Aminosäurerest oder Peptid bedeutet; R'3 abwesend ist oder Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Thioether, Sulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R7 oder R'3 einen mit X9 kondensierten Aminosäurerest oder Peptid bedeutet; R7 Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Heterocyclyl oder Polycyclyl bedeutet; m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist; j eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 bedeutet; und R'10 H, OH, NH2, Halogen oder Niederalkyl und vorzugsweise H oder Me bedeutet.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die aktive Untereinheit irreversibel an das Enzym bindet.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4, 6, 9, 12, 16, 22, 25, 27, 29, 32 oder 33, wobei es sich bei den Mitgliedern der Bibliothek um langsam bindende Inhibitoren des Enzyms handelt.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6, 7, 9 oder 12, wobei Yaa eine eine Boronsäure aufweisende aktive Untereinheit bedeutet.
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