DE60008077T2

DE60008077T2 - Matrixproteinzusammensetzungen um Apoptose zu induzieren

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Publication number: DE60008077T2
Application number: DE60008077T
Authority: DE
Inventors: Petter Stale LYNGSTADAAS; Lars Hammarström; Stina Gestrelius
Original assignee: Biora BioEx AB
Current assignee: Institut Straumann AG
Priority date: 1999-03-10
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: EP1162985A1; WO2000053196A1; DE60008077D1; AU2821000A; ES2215027T3; DK1162985T3; ATE258801T1; JP2002538211A; EP1162985B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Schmelzmatrix, Schmelzmatrixderivaten und/oder Schmelzmatrixproteinen oder -peptiden für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel zum Induzieren von programmiertem Zelltod in malignen oder benignen Neoplasmen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Schmelzmatrixproteine, z. B. die, die in der Schmelzmatrix vorliegen, sind am besten als Vorläufer für Zahnschmelz bekannt. Von Schmelzproteinen und Schmelzmatrixderivaten wurde früher in der Patentliteratur beschrieben, dass sie die Bildung von hartem Gewebe induzieren (d. h. die Schmelzbildung, siehe U.S. Patent Nr. 4,672,032 (Slavkin)) oder eine Bindung zwischen harten Geweben induzieren (EP-B-0 337 967 und EP-B-0 263 086). In neueren Tieruntersuchungen unter Verwendung von Schmelzmatrixproteinen zur Regeneration der Zahnbefestigung wurde beobachtet, dass eine Regeneration und Heilung mit minimalen Anzeichen epithelialer Interferenz fortschreitet. Dies steht im Gegensatz zu allen anderen regenerativen Therapien des Periodontium, bei denen ein epitheliales Wachstum von der Mundhöhle in die Läsion nach unten eine gängige Komplikation ist. Um mögliche restriktive Wirkungen von Schmelzmatrixproteinen auf das Epithelzellwachstum zu untersuchen, wurden Epithelzellen in Gegenwart von Schmelzmatrixproteinen kultiviert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass epitheliale Krebszellen (HeLa-Zellen), die keine Ameloblasten sind und die nicht in der periodontalen Umgebung gefunden werden und nicht an der Zahnentwicklung beteiligt sind, einer Apoptose (programmierter oder induzierter Zelltod) unterliegen, wenn sie in Gegenwart von Schmelzmatrix, Schmelzmatrixderivaten und/oder Schmelzmatrixproteinen (im Folgenden zusammenfassend als "aktive Schmelzsubstanz" bezeichnet) kultiviert werden. Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Induktion von Apoptose zur Prävention und Behandlung oder Krebs.
Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prävention oder Behandlung von malignen oder benignen Neoplasmen.
Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von Krebs.
Apoptose (programmierter oder induzierter Zelltod) ist bei der fokalen Eliminierung bestimmter Zellen während einer normalen Entwicklung und beim Turnover von Zellen in gesunden Erwachsenengeweben involviert. Beispiele, bei denen festgestellt wurde, dass eine Apoptose beteiligt ist, sind in der Organogenese während des embryonalen Lebens, z. B. die Trennung der Finger während der Entwicklung der Extremitäten, die Cuspis- und Wurzel-Bildung während der Zahnentwicklung, Eliminierung von verbrauchten Zellen im Dünndarm und klonale Eliminierung von Lymphozyten, die ansonsten mit "Eigen"-Antigenen reagieren könnten.
Eine jüngere Klärung legt nahe, dass eine Apoptose gleichermaßen beim Verständnis der Karzinogese und zur Entwicklung neuer Therapien für verschiedene neoplastische Krankheiten von Bedeutung sein kann. So wurde gezeigt, dass die Apoptose dabei involviert ist, zu verhindern, dass eine Genominstabilität sich in Zellen entwickelt, in denen der Zellzyklus gestört wurde; sie wurde mit schädigenden Stimuli, wie z. B. therapeutische Bestrahlung und cytotoxische Arzneimittel, die zur Behandlung von malignen Neoplasmen eingesetzt werden, in Verbindung gebracht.
Die Apoptose ist ein genregulierter Prozess, der die Synthese von einigen Proteinen, die eine Apoptose begünstigen, und von anderen, die gegen diese schützen, beinhaltet. Das Vorliegen des Tumorsuppressorgens p53 ist für die Initiierung von Apoptose als Resultat einer Zellschädigung, insbesondere einer Schädigung, die durch Brechen des DNA-Doppelstrangs verursacht wird, verantwortlich. Bei der Behandlung von humanem Krebs ist dies äußerst wichtig, da Tumorzellen, denen p53 fehlt, keine Apoptose durchmachen, wenn sie ionisierender Strahlung ausgesetzt sind. Außerdem führt das Fehlen von p53 wahrscheinlich zum Überleben von Zellen, in denen DNA-Mutationen aufgetreten sind, und damit zu einer Erhöhung des Risikos der Krebsentwicklung. Bestimmte Zellen, denen wachstumsfördernde Faktoren fehlen oder deren Wachstum mit cytotoxischen Arzneimitteln angehalten wurde, werden durch Expression des Proto-Onkogens c-myc für eine Apoptose empfänglich gemacht. Dieses Gen kodiert für einen essentiellen Teil der proliferativen Maschinerie der Zelle und eine Deregulierung der Expression dieses Gens ist bei den meisten Neoplasmen beteiligt. Bestimmte Genprodukte schützen Zellen vor Apoptose. Beispiele für solche Genprodukte umfassen die des bc1-2-Gens, des Proto-Onkogens c-ab1 und des LMP-1-Gens des Epstein-Barr-Virus.
Es wurde eine Reihe von Wegen zur Induktion von Apoptose gezeigt. Gamma-Strahlung wirkt direkt auf die Chromosomen, indem es DNA-Strangbrüche verursacht. Bestimmte Hormone, wie z. B. Glucokortikoide, induzieren eine Apoptose in Thymozyten, vermutlich über einen Glucokortikoidrezeptorkomplex. Ein dritter Induktionsweg ist über einen direkten Kontakt mit der Plasmamembran der Zielzellen. Ein Beispiel dafür ist die Wirkung von Granzym B, das als Teil der Wechselwirkung von cytotoxischen T-Zellen mit einer Zielzelle freigesetzt wird.
Es wurde festgestellt, dass Apoptose in Epithelzellen stattfindet, wenn eine Zelladhäsion an extrazelluläre Matrix durch Fibronectin und andere extrazelluläre Proteine blockiert wird. In einer immortalisierten Schilddrüsenzelllinie scheint es, dass Adhäsion, Ausbreitung und Cytoge rüstorganisation von einer Integrin-Fibronectin-Wechselwirkung abhängig sind. Es wurde gezeigt, dass Zellen apoptotisch werden, wenn Peptide, die das RGD (Arg-Gly-Asp)-Motiv enthalten, eine Bindung von Fibronectin an Integrinrezeptoren inhibieren (siehe M. Vitale et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83 (10), 1998, S. 3673–3680). Ähnliche Feststellungen werden für normale Zellen, z. B. Z. Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(13), 1995, S. 6161–6165; HJ Kim et al., Am. J. Physiol. 271(2 pt. 1), 1996, S. L277–286; G McGill et al., J. Cell Biol. 138(4), 1997, S. 901–911 beschrieben. Eine Adhäsionsinhibierung, die zum Zelltod führt, tritt nicht nur bei normalen (nicht-transformierten) Zellen auf, sondern wurde auch für Melanomzellen gezeigt. So beschreiben MD Mason et al., J. R. Soc. Med. 89(7), 1996, S. 393–395, dass ein Verlust der durch eine Integrin-vermittelte Signalgebung induzierten Apoptose in Melanomzellen innerhalb einer 3-tägigen Behandlung mit einem Peptid, das das RGD-Motiv enthält, das alpha-v-beta-3-Integrin blockiert, auftritt. Außerdem wurde gezeigt, dass das RDG-Motiv ein Integrin-Erkennungsmotiv ist, und dass Peptide, die RDG enthalten, eine Apoptose durch Aktivierung von Caspase-3 induzieren, welche ein Enzym ist, das in einer Kaskade beteiligt ist, die zu einem Zerfall der Zelle führt [siehe CD Buckley et al., Nature 397, Feb. 1999, S. 534–539).
Ohne eine Beschränkung auf eine besondere Hypothese eingehen zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, dass die aktive Schmelzsubstanz ihre Apoptose-induzierende Wirkung entweder durch Bindung an Zelloberflächenrezeptoren in ähnlicher Weise wie RDG, um so die Stelle zu blockieren, die für eine zelluläre Adhäsion an extrazelluläre Matrix benötigt wird, oder durch Binden an Zelloberflächenstrukturen, wie z. B. CD44 oder Integrine, um dadurch direkt Caspase 3 zu aktivieren und den apoptotischen Weg, der von Buckley et al., supra, beschrieben wurde, auszulösen, ausübt.
Bei der Entwicklung von Zähnen wird der Schmelz durch eine Schicht Epithelzellen, als Ameloblasten bezeichnet, gebildet. Diese wiederum werden von einer anderen Schicht Epithelzellen gestützt, die die Ameloblasten mit Wachstumsfaktoren und Nährstoffen versorgen, welche für ihre andauernde Existenz und Funktion erforderlich sind. Die Ameloblasten synthetisieren und sezernieren Schmelzmatrixproteine, die zusammen mit Mineralien und Wasser die Schmelzmatrix bilden, welche eine frühe Entwicklungsstufe von Zahnschmelz ist. Schmelzmatrixproteine liegen hauptsächlich während der sekretorischen Stufe der Schmelzbildung vor. Nach ihrer anfänglichen Abscheidung werden sie allmählich abgebaut und gehen verloren, wenn die Schmelzentwicklung fortschreitet. Auch während einer Schmelzentwicklung wird in Epithelzellen in der Nähe der Schmelzmatrix eine Apoptose beobachtet. Diesem apoptotischem Event geht eine Translokation von Schmelzmatrix-Abbauprodukten aus der Entwicklung von Schmelz in das Schmelzorgan voraus, welches aus Epithelzellen besteht. Die aktive Schmelzsubstanz, die als in der vorliegenden Erfindung nützlich betrachtet wird, besteht aus einer Reihe von Proteinen und Peptiden, die solche Abbauprodukte enthalten. Diese Beobachtungen werden auch durch Studien an Meerschweinchen-Backenzähnen gestützt, die zeigen, dass eine Verarbeitung von Schmelzproteinen an die Verringerung der Anzahl umgebender Epithelzellen gebunden ist (siehe Beispiel 1 unten).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Apoptose hat für die potentielle Behandlung von Krebs und Neoplasmen beachtliches Interesse auf sich gezogen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise beobachtet, dass, wenn humane Epithelkrebszellen (HeLa-Zellen) in Gegenwart der aktiven Schmelzsubstanz kultiviert wurden, sie einer Apoptose unterlagen (siehe Beispiel 2 unten). Zum Vergleich wurden humane Bindegewebszellen (Fibroblasten), die unter ähnlichen Bedingungen in Gegenwart der aktiven Schmelzsubstanz kultiviert wurden, zu Wachstum stimuliert. Auf der Basis dieser Resultate gehen die Erfinder der vorliegenden Erfindung davon aus, dass die aktive Schmelzsubstanz für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die (selektive) Induktion von Apoptose in neoplastischen Zellen spezifisch in der Behandlung, z. B. topischen Behandlung, von bestimmten Krebstypen und benignen, halb-malignen (d. h. lokal invasiv) oder malignen Neoplasmen eingesetzt werden kann.
Es wird derzeit angenommen, dass die aktive Schmelzsubstanz besonders zur Verwendung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von epithelial abgeleiteten Krebsarten oder Neoplasmen günstig sein kann, da die derzeit verfügbaren Resultate zu zeigen scheinen, dass die aktive Schmelzsubstanz ihre apoptotische Wirkung spezifisch auf Epithelzellen ausübt. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist es daher bevorzugt, die Zusammensetzung, die die aktive Schmelzsubstanz umfasst, topisch bei oder auf beeinträchtigtes Gewebe, das einen wesentlichen Anteil an Epithelzellen umfasst, anzuwenden. Derartiges Gewebe umfasst insbesondere Haut oder Schleimhautgewebe. Schleimhautgewebe, das vorteilhafterweise mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die aktive Schmelzsubstanz umfasst, behandelt werden kann, umfasst ein Gewebe, das eine geeignete Oberfläche zur topischen Anwendung der Zusammensetzung, die die aktive Schmelzsubstanz umfasst, natürlicherweise oder nach chirurgischem Einschnitt, aufweist. Beispiele für solche Schleimhautoberflächen sind Mundschleimhhaut, die Schleimhaut des gastrointestinalen Trakts, des Atemtrakts (z. B. Lunge), zervikale oder abdominale Schleimhaut.
Andere Gewebe, die einen bedeutenden Anteil an Epithelzellen umfassen, sind Drüsengewebe, z. B. Gewebe der Brustdrüse, des Pankreas, der Leber, der Schilddrüse, der Blase, des Eierstocks, der Prostata, der Schweißdrüsen, der Speicheldrüsen oder der Hypophyse.
Es wurde allerdings festgestellt, dass Krebszellen, die aus anderen Geweben als epithelialem oder mucosalem Gewebe stammen, oder andere Gewebe, die eine deutliche Anzahl von Epithelzellen aufweisen, auch eine deutliche Erhöhung der Apoptose aufweisen, wenn sie mit der Zusammensetzung, die eine Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz gemäß der Erfindung umfasst, behandelt werden (siehe Beispiel 3 unten).
Bei chirurgischer Entfernung eines Tumors ist es wichtig, das Risiko, dass Tumorzellen von der Operationsstelle in einen andere Teil des Körpers wandern, zu verringern. In einer spezi fischen Ausführungsform der Erfindung wird daher die Zusammensetzung, die aktive Schmelzsubstanz umfasst, an einer Tumorstelle oder auf einer Tumorstelle vor, während oder nach der chirurgischen Entfernung eines Tumors oder eines neoplastischen Gewebes angewendet um das Risiko post-chirurgischer Metastasenbildung wesentlich zu verringern und/oder das Wiederauftreten des Tumors an der Operationsstelle zu verhindern. Es wird insbesondere in Betracht gezogen, dass die Zusammensetzung, die die Zubereitung aus aktiver Schmelzsubstanz umfasst, als Adjuvans einer Krebstherapie angewendet werden kann, z. B. in Verbindung mit einer herkömmlichen Strahlungstherapie. Es wird derzeit entsprechend den Feststellungen der Erfindung angenommen, dass eine derartige Adjuvanstherapie unter Verwendung der aktiven Schmelzsubstanz sowohl das Risiko einer Tumorzellenmigration (d. h. Metastasenbildung) reduzieren kann als auch zur Heilung von Wunden, die oft aus einer Strahlungstherapie resultieren, beitragen kann, da auch festgestellt wurde, dass die aktive Schmelzsubstanz wundheilende Eigenschaften aufweist (siehe z. B. WO 99/43344).
Schmelzmatrix, Schmelzmatrixderivate und Schmelzmatrixproteine
Schmelzmatrix ist eine Vorstufe für Schmelz und kann aus einer beliebigen relevanten natürlichen Quelle erhalten werden, z. B. von einem Säuger, bei dem die Zähne in der Entwicklung sind. Eine geeignete Quelle sind sich entwickelnde Zähne von Schlachttieren, z. B. Kälber, Schweine oder Lämmer. Eine andere Quelle ist z. B. Fischhaut.
Schmelzmatrix kann aus sich entwickelnden Zähnen hergestellt werden, wie es früher beschrieben wurde (EP-B-0 337 967 und EP-B-0 263 086). Die Schmelzmatrix wird abgeschabt und Schmelzmatrixderivate werden hergestellt, z. B. durch Extraktion mit wässriger Lösung, z. B. einem Puffer, einer verdünnten Säure oder Base oder einem Wasser-Lösungsmittel, gefolgt von Größenausschluss, Entsalzung oder anderen Reinigungsschritten, gegebenenfalls gefolgt von Gefriertrocknung. Enzyme können durch Behandlung mit Wärme oder Lösungsmitteln desaktiviert werden, wobei die Derivate ohne Gefriertrocknung in flüssiger Form gelagert werden können.
Im vorliegenden Kontext sind Schmelzmatrixderivate Derivate der Schmelzmatrix, die ein oder mehrere Schmelzmatrixproteine oder Teile solcher Proteine umfassen, die natürlicherweise durch alternierendes Spleißen oder Verarbeiten oder entweder durch enzymatische oder chemische Spaltung eines Proteins einer natürlichen Länge oder durch Synthese von Polypeptiden in vitro oder in vivo (DNA-Rekombinationsverfahren oder Kultivierung von diploiden Zellen) hergestellt werden. Schmelzmatrixproteinderivate umfassen auch mit Schmelzmatrix verwandte Polypeptide oder Proteine. Die Polypeptide oder Proteine können an ein geeignetes biologisch abbaubares Trägermolekül, z. B. Polyaminosäuren oder Polysaccharide oder Kombinationen davon, gebunden sein. Darüber hinaus umfasst der Ausdruck Schmelzmatrixderivate auch synthetische analoge Substanzen.
Proteine sind biologische Makromoleküle, die durch Aminosäurereste, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind, gebildet werden. Proteine als lineare Polymere von Aminosäuren werden auch Polypeptide genannt. Typischerweise haben Proteine 50 bis 800 Aminosäurereste und haben daher Molekulargewichte im Bereich von etwa 6000 bis etwa mehreren 100.000 Dalton oder mehr. Kleine Proteine werden Peptide oder Oligopeptide genannt.
Schmelzmatrixproteine sind Proteine, die normalerweise in der Schmelzmatrix vorliegen, d. h. die Vorstufen für Schmelz (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Ergänz. 1: 282–91) oder Proteine, die durch Spaltung solcher Proteine erhalten werden können. Im Allgemeinen haben solche Proteine ein Molekulargewicht von unter 120.000 Daltons und umfassen Amelogenine, Nicht-Amelogenine, Prolin-reiche Nicht-Amelogenine, Ameline (Ameloblastin, Sheathlin) und Tufteline.
Beispiele für Proteine zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind Amelogenine, Prolin-reiche Nicht-Amelogenine, Tuftelin, Tuftproteine, Serumproteine, Speichelproteine, Amelin, Schmelz, Ameloblastin, Shethlin und Derivate davon und Gemische davon. Eine Zubereitung, die eine aktive Schmelzsubstanz zur Verwendung gemäß der Erfindung umfasst, kann auch mindestens zwei der vorstehend genannten proteinartigen Substanzen enthalten. Ein handelsübliches Produkt, das Amelogenine und möglicherweise andere Schmelzmatrixproteine umfasst, ist als EMDOGAIN^® (Biora AB) auf dem Markt.
Im Allgemeinen sind die Hauptproteine von Schmelzmatrix als Amelogenine bekannt. Sie bilden etwa 90 Gew.-% der Matrixproteine. Die restlichen 10 Gew.-% umfassen prolinreiche Nicht-Amelogenine, Tuftelin, Tuftproteine, Serumproteine und mindestens ein Speichelprotein; es können allerdings auch andere Proteine vorliegen, z. B. Amelin (Ameloblastin, Sheathlin), die in Verbindung mit Schmelzmatrix identifiziert wurden. Darüber hinaus können die verschiedenen Proteine synthetisiert werden und/oder zu verschiedenen unterschiedlichen Größen (d. h. unterschiedlichen Molekulargewichten) verarbeitet werden. So wurde festgestellt, dass die dominierenden Proteine in der Schmelzmatrix, Amelogenine, in verschiedenen unterschiedlichen Größen vorliegen, die zusammen supramolekulare Aggregate bilden. Sie sind deutlich hydrophobe Substanzen, die unter physiologischen Bedingungen Aggregate bilden. Sie können andere Proteine oder Peptide tragen oder können Träger für diese sein.
Es werden auch andere Proteinsubstanzen als zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet angesehen. Beispiele umfassen Proteine, z. B. prolinreiche Proteine, und Polyprolin. Andere Beispiele für Substanzen, die zur Verwendung gemäß der Erfindung als geeignet angesehen werden, sind Aggregate solcher Proteine, Schmelzmatrixderivate und/oder Schmelzmatrixproteine, wie auch Metaboliten der Schmelzmatrix, der Schmelzmatrixderivate und Schmelzmatrixproteine. Die Metaboliten können eine beliebige Größe haben, die von der Größe von Proteinen bis zu der kurzer Peptide reicht.
Wie oben erwähnt wurde, haben die Proteine, Polypeptide oder Peptide zur Verwendung gemäß der Erfindung typischerweise ein Molekulargewicht von höchstens etwa 120 kDa, z. B. höchstens 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa oder 60 kDa, bestimmt durch SDS-Page-Elektrophorese. Wie oben beschrieben wurde, wird angenommen, dass Epithelzellen, die mit Ameloblasten assoziiert sind, durch Abbauprodukte, die während der Zahnschmelzentwicklung aus der Schmelzmatrix wandern, induziert werden, eine Apoptose durchzumachen. Solche Abbauprodukte, die im Allgemeinen ein Molekulargewicht zwischen etwa 3 kDa und 25 kDa, z. B. zwischen 5 kDa und 20 kDa, haben, können zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung besonders wirksam sein.
Die Proteine zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form einer Zubereitung präsentiert, worin der Proteingehalt der aktiven Schmelzsubstanz in der Zubereitung in einem Bereich von etwa 0,05 Gew.-% bis 100 Gew.-%, z. B. etwa 5 bis 99 Gew.-%, etwa 10 bis 95 Gew.-%, etwa 15 bis 90 Gew.-%, etwa 20 bis 90 Gew.-%, etwa 30 bis 90 Gew.-%, etwa 40 bis 85 Gew.-%, etwa 50 bis 80 Gew.-%, etwa 60 bis 70 Gew.-%, etwa 70 bis 90 Gew.-% oder etwa 80 bis 90 Gew.-% liegt.
Eine Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch ein Gemisch von Proteinen unterschiedlichen Molekulargewichten enthalten.
Die Proteine einer Schmelzmatrix können in einen Teil mit hohem Molekulargewicht und einen Teil mit niedrigem Molekulargewicht eingeteilt werden, und es wurde festgestellt, dass eine gut definierte Fraktion von Schmelzmatrixproteinen wertvolle Eigenschaften bezüglich einer Behandlung periodontaler Defekte (d. h. periodontaler Wunden) besitzt. Diese Fraktion enthält mit Essigsäure extrahierbare Proteine, die allgemein als Amelogenine bezeichnet werden, und bildet den Teil einer Schmelzmatrix mit niedrigem Molekulargewicht (siehe EP-B-0 337 967 und EP-B-0 263 086).
Wie oben diskutiert wurde, hat der Teil einer Schmelzmatrix mit niedrigem Molekulargewicht eine geeignete Aktivität zur Induzierung einer Bindung zwischen haben Geweben in periodontalalen Defekten. Im vorliegenden Kontext sind die aktiven Proteine allerdings nicht auf den Teil einer Schmelzmatrix mit niedrigem Molekulargewicht beschränkt. Derzeit umfassen bevorzugte Proteine Schmelzmatrixproteine, z. B. Amelogenin, Amelin, Tuftelin usw., mit Molekulargewichten (in vitro gemessen mit SDS-PAGE) von unter etwa 60.000 Dalton, allerdings haben Proteine mit einem Molekulargewicht von über 60.000 Dalton auch vielversprechende Eigenschaften als Kandidaten zur Wundheilung, als antibakterielle und/oder antiinflammatorische Mittel.
Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass die aktive Schmelzsubstanz zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ein Molekulargewicht von bis zu etwa 40.000, z. B. ein Molekulargewicht zwischen etwa 5000 und etwa 25.000, hat.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen auch Peptide, wie sie in WO 97/02730 beschrieben werden, d. h. Peptide, die mindestens ein Sequenzelement umfassen, das aus der Gruppe bestehend aus den Tetrapeptiden DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) und DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) ausgewählt ist, und die außerdem eine Aminosäuresequenz, aus der eine fortlaufende Folge von 20 Aminosäuren zu einem Grad von mindestens 80% mit einer Folge von Aminosäuren mit derselben Länge, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz und einer Sequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 103 von SEQ ID NO: 1 und den Aminosäuren 6 bis 324 von SEQ ID NO: 2, die in WO 97/02730 dargestellt sind, identisch ist, umfassen.
Mit dem Ausdruck "Sequenzidentität" ist gemeint, dass die Identität in der Aminosäuresequenz bezüglich Identität und Position der Aminosäuren der Peptide übereinstimmt. Ein Zwischenraum wird als Nicht-Identität bezüglich einer Aminosäure oder mehreren Aminosäuren, wie es passt, gezählt.
Solche Peptide können 6 bis 300 Aminosäuren, z. B. mindestens 20 Aminosäuren, mindestens 30 Aminosäuren, z. B. mindestens 60 Aminosäuren, mindestens 90 Aminosäuren, mindestens 120 Aminosäuren, mindestens 150 Aminosäuren oder mindestens 200 Aminosäuren, umfassen.
Ein Verfahren zur Isolierung von Schmelzmatrixproteinen beinhaltet Extraktion der Proteine und Entfernung von Calcium- und Phosphationen aus solubilisiertem Hydroxyapatit durch ein geeignetes Verfahren, z. B. Gelfiltration, Dialyse oder Ultrafiltration (siehe z. B. Janson, J-C & Rydén, L. (Herausg.), Protein purification, VCH Publishers 1989 und Harris, ELV & Angal, S., Protein purification methods – A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).
Eine typische lyophilisierte Proteinzubereitung kann hauptsächlich oder ausschließlich bis zu 70 bis 90% Amelogenine mit einem Molekulargewicht (MG) zwischen 40.000 und 5000 Dalton enthalten, wobei die 10 bis 30% aus kleineren Peptiden, Salzen und Restwasser bestehen. Die Hauptproteinbanden sind bei 20 kDa, 12 bis 14 kDa und etwa 5 kDa.
Durch Abtrennen der Proteine, z. B. durch Präzipitation, Ionenaustauschchromatographie, präparative Elektrophorese, Gelpermeationschromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder Affinitätschromatographie, können die Amelogenine mit unterschiedlichem Molekulargewicht gereinigt werden.
Die Kombination von Amelogeninen verschiedenen Molekulargewichts kann variiert werden, und zwar von einer dominierenden Verbindung mit 20 kDa bis zu einem Aggregat von Amelogeninen mit verschiedenen Molekulargewichten zwischen 40 und 5 kDa und zu einer dominierenden 5 kDa-Verbindung. Andere Schmelzmatrixproteine, z. B. Amelin, Tuftelin oder proteolytische Enzyme, die normalerweise in Schmelzmatrix gefunden werden, können zugesetzt werden und durch das Amelogenin-Aggregat getragen werden.
Als alternative Quelle der Schmelzmatrixderivate oder -proteine kann man auch allgemein anwendbare Synthesewege, die dem Fachmann gut bekannt sind, verwenden oder kultivierte Zellen oder Bakterien, die durch DNA-Rekombinationstechniken modifiziert wurden, verwenden (siehe z. B. Sambrook, J. et al.; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Physikalisch-chemische Eigenschaften von Schmelzmatrix, Schmelzmatrixderivaten und Schmelzmatrixproteinen
Im Allgemeinen sind die Schmelzmatrix, Schmelzmatrixderivate und Schmelzmatrixproteine hydrophobe Substanzen, d. h. in Wasser, speziell bei erhöhten Temperaturen, wenig löslich. Im Allgemeinen sind diese Proteine bei nicht-physiologischen pH-Werten und bei niedriger Temperatur, z. B. etwa 4 bis 20°C, löslich, während sie bei Körpertemperatur (35 bis 37°C) und neutralem pH aggregieren und präzipitieren.
Mindestens ein Teil der aktiven Schmelzsubstanz kann in Form von Aggregaten vorliegen oder ist nach Anwendung in vivo fähig, Aggregate zu bilden. Die Partikelgröße der Aggregate liegt in einem Bereich von etwa 20 nm bis etwa 1 μm.
Es wird davon ausgegangen, dass die Löslichkeitseigenschaften der aktiven Schmelzsubstanz in Verbindung mit der prophylaktischen und therapeutischen Aktivität der Substanz von Bedeutung sind. Wenn eine Zusammensetzung, die die aktive Schmelzsubstanz enthält, z. B. einem Menschen verabreicht wird, werden die Proteinsubstanzen infolge des pH, der normalerweise unter physiologischen Bedingungen vorherrscht, präzipitieren. Auf diese Weise wird an der Anwendungsstelle eine Schicht aus aktiver Schmelzsubstanz gebildet und diese Schicht (die auch eine molekulare Schicht in Fällen sein kann, in denen Aggregate gebildet wurden) ist unter physiologischen Bedingungen schwer abzuspülen. Infolge der bioadhäsiven Eigenschaften der Substanzen (siehe unten) wird darüber hinaus die präzipitierte Schicht auch an der Grenze zwischen der präzipitierten Schicht und dem Gewebe fest an das Gewebe gebunden. Die proteinhaltige bzw. proteinartige Schicht bedeckt somit das Gewebe, auf das die aktive Schmelzsubstanz oder Zusammensetzungen davon aufgebracht wurden; die aktiven Schmelzsubstanzen werden für einen längeren Zeitraum in situ gehalten, d. h. es ist nicht notwendig, die aktive Schmelzsubstanz (die aktiven Schmelzsubstanzen) in kurzen Intervallen zu verabreichen. Darüber hinaus kann die in situ gebildete Schicht fast mit einem okklusiven Verband verglichen werden, d. h. die gebildete Schicht schützt das Gewebe, auf dem die Schicht gebildet ist, vor der Umgebung.
Um es möglich zu machen, dass eine proteinhaltige Schicht in situ nach Aufbringung gebildet wird, kann es vorteilhaft sein, eine geeignete Puffersubstanz in eine pharmazeutische Zusammensetzung der aktiven Schmelzsubstanz einzuarbeiten; der Zweck einer solchen Puffersubstanz könnte es sein, die Auflösung der aktiven Schmelzsubstanz an der Anwendungsstelle zu verhindern.
Es wurde auch (von den Erfindern der vorliegenden Erfindung) beobachtet, dass die aktive Schmelzsubstanz bioadhäsive Eigenschaften besitzt, d. h. sie hat die Fähigkeit, an Haut- oder Mucosa-Oberflächen anzuheften. Diese Eigenschaften sind in Verbindung mit einer therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung zumindest aus den folgenden Gründen äußerst wertvoll:

– die prophylaktisch und/oder therapeutisch aktive(n) Substanzen) können für einen längeren Zeitraum an der Auftragungsstelle gehalten werden (d. h. i), die Verabreichungsfre quenz kann reduziert werden, ii) ein Effekt der kontrollierten Freisetzung der aktiven Substanz ist erreichbar und/oder iii) eine lokale Behandlung an der Auftragungsstelle ist verbessert)
– die aktive Schmelzsubstanz kann selbst als Vehikel für prophylaktisch oder therapeutisch aktive Substanzen geeignet sein, da ein Vehikel, das die aktive Schmelzsubstanz enthält, als bioadhäsives Vehikel formuliert sein kann (d. h. ein neues bioadhäsives Arzneimittel-Abgabesystem auf der Basis der bioadhäsiven Eigenschaften der aktiven Schmelzsubstanz).

Pharmazeutische Zusammensetzungen
Für die Verabreichung an ein Individuum (ein Tier oder ein Mensch) wird/werden die aktive Schmelzsubstanz und/oder eine Zubereitung davon vorzugsweise zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, die die aktive Schmelzsubstanz und gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipientien enthalten.
Die Zusammensetzungen können in Form von z. B. festen, halbfesten oder flüssigen Zusammensetzungen sein, wie z. B.
bioabsorbierbare Pflaster, Umschläge, Verbände, Hydrogelverbände, Hydrokolloidverbände, Filme, Schäume, Folien, Bandagen, Pflaster, Abgabevorrichtungen, Implantate;
Pulver, Körner, Granulate, Kapseln, Agarose- oder Chitosanperlen, Tabletten, Pillen, Pellets, Mikrokapseln, Mikrokügelchen, Nanopartikel;
Sprays, Aerosole, Inhalationsvorrichtungen;
Gele, Hydrogele, Pasten, Salben, Cremes, Seifen, Suppositorien, Vagitorien;
Lösungen, Dispersionen, Suspensionen, Emulsionen, Gemische, Lotionen, Klistiere;
Kits, die z. B. zwei getrennte Behälter enthalten, wobei der erste der Behälter die aktive Schmelzsubstanz, beispielsweise in Pulverform oder gefriergetrockneter Form, gegebenenfalls mit einer anderen aktiven Arzneimittelsubstanz (mit anderen Arzneimittelsubstanzen) und/oder pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien vermischt, enthält und der zweite Behälter das geeignete Medium enthält, das dazu bestimmt ist, dem ersten Behälter vor Verwendung zugesetzt zu werden um eine gebrauchsfertige Zusammensetzung zu erhalten;
und in anderen geeigneten Formen, z. B. Implantaten oder einem Überzug für Implantate oder in einer geeigneten Form zur Verwendung in Verbindung mit einer Implantation oder Transplantation.
In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur Auftragung auf die Haut oder die Schleimhaut als am wichtigsten angesehen. Somit kann eine Zusammensetzung, die die zu verabreichende aktive Schmelzsubstanz umfasst, zur Verabreichung auf einem beliebigen Wege, z. B. durch topische (dermale), orale, bukkale, nasale, aurale, rektale oder vaginale Verabreichung oder durch Verabreichung in eine Körperhöhle, wie z. B. die orale, gastrointestinale, Lungen- oder abdominale Höhle, angepasst ein. Darüber hinaus kann eine Zusammensetzung für eine Verabreichung in Verbindung mit einer Operation, z. B. in Verbindung mit dem Herausschneiden von Tumoren oder neoplastischem Gewebe oder in Verbindung mit einer Strahlungstherapie, angepasst sein.
Wie oben beschrieben wurde, kann eine Zusammensetzung der aktiven Schmelzsubstanz zur Verwendung während einer Operation geeignet sein, beispielsweise zur topischen Anwendung in Form eines Gels, Films oder trockenen Pellets oder als Spüllösung oder zur Behandlung mit einer Paste oder Creme auf Gewebe oder Oberflächen Die Zusammensetzungen können nach herkömmlicher pharmazeutischer Praxis formuliert werden; siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" und "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", herausgegeben von Swarbrick, J. & J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine aktive Schmelzsubstanz umfasst, dient als Arzneimittel-Abgabesystem. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Arzneimittel-Abgabesystem" eine pharmazeutische Zusammensetzung (eine pharmazeutische Formulierung oder eine Dosierungsform), die nach Verabreichung die aktive Substanz dem Körper eines Menschen oder eines Tiers präsentiert. Somit umfasst der Ausdruck "Arzneimittel-Abgabesystem" normale pharmazeutische Zusammensetzungen, wie z. B. Cremes, Salben, Flüssigkeiten, Pulver, Tabletten usw., wie auch kompliziertere Formulierungen, wie Sprays, Pflaster, Bandagen, Verbände, Vorrichtungen usw.
Außer der aktiven Schmelzsubstanz kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung pharmazeutisch annehmbare Exzipientien umfassen.
Ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens ist eine Substanz, die für das Individuum, dem die Zusammensetzung zu verabreichen ist, im Wesentlichen unschädlich ist. Ein solches Exzipiens genügt normalerweise den Anforderungen, die von den nationalen Gesundheitsbehörden gestellt werden. Offizielle Pharmakopöen, wie z. B. die britische Pharmakopöe, die U.S.-Pharmakopöe und die europäische Pharmakopöe stellen Standards für pharmazeutisch annehmbare Exzipientien auf.
Ob ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet ist, hängt im Allgemeinen von der Dosierungsform, die zur Verwendung für eine besondere Art einer Wunde gewählt wird, ab. Im Folgenden werden Beispiele für geeignete pharmazeutisch annehmbare Exzipientien zur Verwendung in verschiedenen Arten von Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung aufgeführt.
Im Folgenden wird eine Übersicht über relevante pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung gegeben. Die Übersicht basiert auf dem besonderen Verabreichungsweg. Allerdings wird klar sein, dass in solchen Fällen, in denen ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens in verschiedenen Dosierungsformen oder Zusammensetzungen verwendet werden kann, die Anwendung eines besonderen pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens nicht auf eine besondere Dosierungsform oder eine besondere Funktion des Exzipiens beschränkt ist.
Die Auswahl eines pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens (pharmazeutisch annehmbarer Exzipientien) in einer Zusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung und die optimale Konzentration davon kann im Allgemeinen nicht vorhergesagt werden und muss auf der Basis einer experimentellen Beurteilung der Endzusammensetzung bestimmt werden. Allerdings kann ein Fachmann auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung Leitlinien beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, 1990, finden.
Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion
Zur systemischen, nicht-topischen Verabreichung kann die Zusammensetzung, die die aktive Schmelzsubstanz umfasst, in einer Form vorliegen, die für eine sytemische Injektion oder Infusion geeignet ist, und kann als solche mit sterilem Wasser oder einer isotonischen Kochsalz- oder Glucoselösung formuliert werden. Die Zusammensetzung kann durch herkömmliche Sterilisationstechniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, sterilisiert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung abgepackt werden oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor Verabreichung mit der sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzung kann pharmazeutisch annehmbare Exzipientien, wie sie zur Annäherung an physiologische Bedingungen notwendig sind, enthalten, z. B. Puffer, die Tonizität einstellende Mittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw.
Topische Zusammensetzungen
Zur Anwendung (bzw. Auftragung) auf die Schleimhaut oder die Haut können die Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung herkömmlicherweise nichttoxische pharmazeutisch annehmbare Träger und Exzipientien, einschließlich Mikrokügelchen und Liposome, enthalten.
Die Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung umfassen alle Arten fester, halbfester und flüssiger Zusammensetzungen. Zusammensetzungen besonderer Relevanz sind z. B. Pasten, Salben, hydrophile Salben, Cremes, Gele, Hydrogele, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Lotionen, Liniments, Shampoos, Gelees, Seifen, Stifte, Sprays, Pulver, Filme, Schäume, Pads, Schwämme (z. B. Collagen-Schwämme), Pads, Verbände (z. B. absorbierende Wundverbände), Arzneitrank, Bandagen, Pflaster und transdermale Abgabesysteme.
Die pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien können Lösungsmittel, Puffer, Konservierungsmittel, Feuchthaltemittel, Chelatbildner, Antioxidantien; Stabilisatoren, Emulgatoren, Suspendiermittel, Gelbildner, Salbengrundlagen, Penetrationsverstärker, Parfums und Hautschutzmittel umfassen.
Beispiele für Lösungsmittel sind z. B. Wasser, Alkohole, pflanzliche oder marine Öle (z. B. Speiseöle, wie Mandelöl, Castoröl, Kakaobutter, Kokosnussöl, Maisöl, Baumwollsamenöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Palmöl, Erdnussöl, Mohnsamenöl, Rapssamenöl, Sesamöl, Sojabohnen öl, Sonnenblumenöl und Teesamenöl), Mineralöle, Fettöle, flüssiges Paraffin, Polyethylenglykole, Propylenglykole, Glycerin, flüssige Polyalkylsiloxane und Gemische davon.
Beispiele für Puffer sind z. B. Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Milchsäure, Hydrogenphosphorsäure, Diethylamin usw..
Geeignete Beispiele für Konservierungsmittel zur Verwendung in Zusammensetzungen sind Parabene, z. B. Methyl-, Ethyl-, Propyl-p-hydroxybenzoat, Butylparaben, Isobutylparaben, Isopropylparaben, Kaliumsorbat, Sorbinsäure, Benzoesäure, Methylbenzoat, Phenoxyethanol, Bronopol, Bronidox, MDM-Hydantoin, Iodpropinylbutylcarbamat, EDTA, Benzalkoniumchlorid und Benzylalkohol oder Gemische von Konservierungsmitteln.
Beispiele für Feuchthaltemittel sind Glycerin, Propylenglykol, Sorbit, Milchsäure, Harnstoff und Gemische davon.
Beispiele für Chelatbildner sind Natrium-EDTA und Citronensäure.
Beispiele für Antioxidantien sind butyliertes Hydroxyanisol (BHA), Ascorbinsäure und Derivate davon, Tocopherol und Derivate davon, Cystein und Gemische davon.
Beispiele für Emulgiermittel sind natürlich vorkommende Gummis, z. B. Akaziengummi oder Tragacanthgummi; natürlich vorkommende Phosphatide, z. B. Sojabohnenlecithin; Sorbitanmonooleatderivate; Wollfette; Wollalkohole; Sorbitanester; Monoglyceride; Fettalkohole; Fettsäureester (z. B. Triglyceride von Fettsäuren) und Gemische davon.
Beispiele für Suspendiermittel sind z. B. Cellulosen und Cellulosederivate, wie z. B. Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Carraghenan, Akaziengummi, Gummi arabicum, Tragacanthgummi und Gemische davon.
Beispiele für Gelgrundlagen, Mittel zur Erhöhung der Viskosität oder Komponenten, die fähig sind, Wundexsudat aufzunehmen, sind: flüssiges Paraffin, Polyethylen, Fettöle, kolloidales Siliciumdioxid oder Aluminium, Zinkseifen, Glycerin, Propylenglykol, Tragacanth, Carboxyvinylpolymere, Magnesium-Aluminium-Silicate, Carbopol^®, hydrophile Polymere, wie z. B. Stärke- oder Cellulosederivate, beispielsweise Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und andere Cellulosederivate, mit Wasser quellbare Hydrokolloide, Carragenane, Hyaluronate (z. B. Hyaluronatgel, das gegebenenfalls Natriumchlorid enthält) und Alginate, wie Propylenglykolalginat.
Beispiele für Salbengrundlagen sind z. B. Bienenwachs, Paraffin, Cetanol, Cetylpalmitat; pflanzliche Öle, Sorbitanester von Fettsäuren (Span), Polyethylenglykole und Kondensationsprodukte zwischen Sorbitanestern von Fettsäuren und Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween).
Beispiele für hydrophobe oder wasseremulgierende Salbengrundlagen sind Paraffine, pflanzliche Öle, Tierfette, synthetische Glyceride, Wachse, Lanolin und flüssige Polyalkylsiloxane.
Beispiele für hydrophile Salbengrundlagen sind feste Makrogole (Polyethylenglykole).
Andere Beispiele für Salbengrundlagen sind Triethanolaminseifen, sulfatierter Fettalkohol und Polysorbate.
Beispiele für Pulverkomponenten sind: Alginat, Collagen, Lactose, Pulver, das fähig ist, ein Gel zu bilden, wenn es auf eine chirurgische Wunde aufgetragen wird (Flüssigkeit/Wundexsudat absorbiert). Normalerweise müssen Pulver, die zur Anwendung auf große offene Wunden bestimmt sind, steril sein und die vorliegenden Partikel müssen mikronisiert sein.
Beispiele für andere Exzipientien sind Polymere, wie z. B.: Carmelose, Natriumcarmelose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Pectin, Xanthangummi, Johannisbrotgummi, Akaziengummi, Gelatine, Carbomer, Emulgatoren, wie Vitamin E, Glycerylstearate, Cetanylglucosid, Collagen, Carrageenan, Hyaluronate und Alginate und Chitosane.
Verbände und/oder Bandagen sind ebenfalls wichtige Abgabesysteme für die aktive Schmelzsubstanz. Wenn Verbände als Dosierungsform verwendet werden, kann die aktive Schmelzsubstanz vor oder während der Herstellung des Verbandes mit den anderen Ingredientien vermischt werden oder die aktive Schmelzsubstanz kann auf bestimmte Weise auf den Verband aufgetragen werden, z. B. durch Eintauchen des Verbandes in eine Lösung oder Dispersion der aktiven Schmelzsubstanz oder durch Aufsprühen einer Lösung oder Dispersion der aktiven Schmelzsubstanz auf den Verband. Alternativ kann die aktive Schmelzsubstanz in Form eines Pulvers auf den Verband aufgetragen werden. Verbände können in Form absorbierender Wundverbände zur Anwendung auf exsudierende Wunden vorliegen. Verbände können auch in Form von Hydrogelverbänden (z. B. vernetzte Polymere, wie z. B. Intrasite^®, das Carboxymethylcellulose, Propylenglykol oder Polysaccharid, Disaccharid und Proteine enthält) oder in Form von okklusiven Verbänden vorliegen, z. B. Verbände auf der Basis von beispielsweise Alginaten, Chitosan, hydrophilem Polyurethanfilm, Collagenfolien, Platten, Pulvern, Schäumen oder Schwämmen, Schäumen (z. B. Polyurethan oder Silikon), Hydrokolloiden (z. B. Carboxymethylcellulose, CMC), Collagen und Hyaluronsäure, einschließlich Kombinationen der genannten.
Die oben genannten Zusammensetzungen für eine topische Verabreichung sind für ein Aufbringen direkt auf Wunden äußerst geeignet oder sie können zur Anwendung auf oder zur Einführung in eine relevante Öffnung (relevante Öffnungen) des Körpers geeignet sein, z. B. für rektale, urethrale, vaginale, orale, nasale oder orale Öffnungen.
Die Zusammensetzung kann in einfacher Weise auf den zu behandelnden Teil direkt aufgebracht werden, z. B. auf die Schleimhaut, oder kann durch einen beliebigen zweckdienlichen Verabreichungsweg angewendet werden.
Zusammensetzungen, die sich in Verbindung mit einer topischen Anwendung als von Bedeutung erwiesen haben, sind solche, die thixotrope Eigenschaften haben, d. h. die Viskosität der Zusammensetzung wird z. B. durch Schütteln oder Rühren beeinflusst, so dass die Viskosität der Zusammensetzung zur Zeit der Verabreichung verringert werden kann, und wenn die Zu sammensetzung angewendet wurde, nimmt die Viskosität zu, so dass die Zusammensetzung an der Anwendungsstelle bleibt.
Zusammensetzungen zur Anwendung (bzw. zum Auftragen) auf Schleimhaut oder Haut
Geeignete Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung können auch in Form von Suspensionen, Emulsionen oder Dispersionen präsentiert werden. Solche Zusammensetzungen enthalten die aktive Schmelzsubstanz im Gemisch mit einem Dispergier- oder Netzmittel, Suspendiermittel und/oder einem oder mehreren Konservierungsmitteln und anderen pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien. Solche Zusammensetzungen können auch zur Verwendung bei der Abgabe der aktiven Schmelzsubstanz, z. B. an eine intakte oder geschädigte Schleimhaut, wie z. B. die orale, bukkale, nasale, rektale oder vaginale Schleimhaut, oder zur Verabreichung an intakte oder geschädigte Haut oder Wunden geeignet sein.
Geeignete Dispergier- oder Netzmittel sind z. B. natürlich vorkommende Phosphatide, z. B. Lecithin oder Sojalecithin; Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit z. B. einer Fettsäure, einem langkettigen aliphatischen Alkohol oder einem Partialester, der von Fettsäuren und einem Hexitol oder einem Hexitolanhydrid abgeleitet ist, z. B. Polyoxyethylensstearat, Polyoxyethlyensorbitolmonooleat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat usw.
Geeignete Suspendiermittel sind z. B. natürlich vorkommende Gummis, z. B. Akaziengummi, Xanthangummi oder Tragacanthgummi; Cellulosen, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, mikrokristalline Cellulose (z. B. Avicel^® RC 591, Methylcellulose); Alginate und Chitosane, wie z. B. Natriumalginat usw.
Geeignete Beispiele für Konservierungsmittel zur Verwendung in Zusammensetzungen gemäß der Erfindung sind dieselben wie die oben aufgeführten.
Rektale und/oder vaginale Zusammensetzungen
Zur Anwendung auf die rektale oder vaginale Mucosa umfassen geeignete Zusammensetzungen gemäß der Erfindung Suppositorien (vom Emulsions- oder Suspensionstyp), Klistiere und rektale Gelatinekapseln (Lösungen oder Suspensionen). Geeignete pharmazeutisch annehmbare Suppositoriengrundlagen umfassen Kakaobutter, veresterte Fettsäuren, glycerinierte Gelatine und verschiedene wasserlösliche oder dispergierbare Grundlagen, wie Polyethylenglykole und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester. Es können verschiedene Additive, wie z. B. Enhancer oder oberflächenaktive Mittel, eingearbeitet sein.
Nasale oder pulmonäre Zusammensetzungen
Für die Anwendung auf die nasale oder pulmonale Schleimhaut (wie auch auf die orale Schleimhaut) sind Sprays und Aerosole zur Inhalation geeignete Zusammensetzungen gemäß der Erfindung. In einer typischen Zusammensetzung liegt die aktive Schmelzsubstanz in Form einer teilchenförmigen Formulierung, gegebenenfalls in einem geeigneten Vehikel dispergiert, vor. Die pharmazeutisch annehmbaren Vehikel und Exzipientien und gegebenenfalls andere pharmazeutisch annehmbare Materialien, die in der Zusammensetzung vorliegen, z. B. Verdünnungsmittel, Enhancer, Aromastoffe, Konservierungsmittel usw., werden alle entsprechend der herkömm lichen pharmazeutischen Praxis in einer Weise, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Formulierung von Pharmazeutika geläufig ist, ausgewählt.
Dosierungen von Schmelzmatrix, Schmelzmatrixderivaten und Schmelzmatrixproteinen
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung liegt eine aktive Schmelzsubstanz im Allgemeinen in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 99,9 Gew.-% vor. Die angewendete Menge der Zusammensetzung wird normalerweise zu einer Menge an Gesamtprotein pro cm²-Fläche befallenen Gewebe, die von etwa 0,01 mg/cm² bis etwa 20 mg/cm², z. B. von etwa 0,1 mg/cm² bis etwa 15 mg/cm², entspricht, führen.
Die angewendete Menge der Zusammensetzung hängt von der Konzentration der aktiven Schmelzsubstanz in der Zusammensetzung und von der Freisetzungsrate der aktiven Schmelzsubstanz aus der Zusammensetzung ab, liegt aber im Allgemeinen in einem Bereich, der höchstens etwa 15 bis 20 mg/cm² entspricht.
In den Fällen, in denen die Zusammensetzung, die die aktive Schmelzsubstanz umfasst, in Form einer flüssigen Zusammensetzung verabreicht wird, liegt die Konzentration der aktiven Schmelzsubstanz in der Zusammensetzung in einem Bereich, der von etwa 0,01 bis etwa 50 mg/ml liegt. Höhere Konzentrationen sind in einigen Fällen wünschenswert und können auch erhalten werden, z. B. eine Konzentration von mindestens etwa 100 mg/ml.
Die Konzentration der aktiven Schmelzsubstanz in einer pharmazeutischen Zusammensetzung hängt von der spezifischen Schmelzsubstanz, ihrer Wirksamkeit, der Schwere der Krankheit, die zu verhindern oder zu behandeln ist, und dem Alter und dem Zustand des Patienten ab. Verfahren, die anwendbar sind, um relevante Konzentrationen der aktiven Schmelzsubstanz in der pharmazeutischen Zusammensetzung auszuwählen, sind dem Fachmann gut bekannt und können nach eingeführten Richtlinien für eine gute klinische Praxis (good clinical practice = GCP) oder Bestimmungen der Investigational New Drug Exemption ("IND"), wie sie z. B. in International Standard ISO/DIS 14155 Clinical investigation of medical devices, 1994 und ICH (International Committee for Harmonisation): Harmonised tripartite guideline for good clinical practice, Brookwood Medical Publications, Ltd. Surrey, UK, 1996) durchgeführt werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird unter Verwendung der in den Standardwerken, Richtlinien und Bestimmungen, wie sie oben angegeben sind, beschriebenen Verfahren sowie des allgemeinen Fachwissens auf dem Gebiet fähig sein, den genauen Dosierungsplan für irgendeine aktive Schmelzsubstanz und/oder andere aktive Substanzen und die Dosierungsform unter ausschließlicher Verwendung von Routine-Experimentierungsverfahren auszuwählen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Anwendung der aktiven Schmelzsubstanz auf Tumorgewebe geeigneterweise mit anderen Formen der Tumorbehandlung, z. B. Operation, Verabreichung chemotherapeutischer Mittel und/oder Strahlungstherapie des betroffenen Gewebes, kombiniert werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die in keiner Weise den Rahmen der Erfindung, wie sie beansprucht wird, beschränken sollen, näher beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen näher beschrieben:
1 ist ein Diagramm, das die Dichte humaner Epithelzellen (HeLa) zeigt, die in Gegenwart und Abwesenheit von EMD gewachsen sind;
2 ist ein Diagramm, das die Produktion von intrazellulärem cAMP durch HeLa-Zellen zeigt, die in Gegenwart oder Abwesenheit von EMD gewachsen sind; und
3 ist ein Diagramm, das den induzierten Zelltod von HeLa-Zellen zeigt, die in Gegenwart von EMD gewachsen sind, im Vergleich zu HeLa-Zellen, die in Abwesenheit von EMD gewachsen sind, und zwar indem der Apoptose-Level durch spezifische Nukleinsäure-Abbauprodukte gemessen wurde.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben, die in keiner Weise dazu bestimmt sind, den Umfang der Erfindung, wie sie beansprucht ist, zu beschränken.
EXPERIMENTELLER ABSCHNITT
Schmelzmatrixderivat, EMDOGAIN^®, von BIORA AB, S-205 12 Malmö, Schweden, das 30 mg gefriergetrocknetes Schmelzmatrixprotein (im Folgenden als EMD abgekürzt) und 1 ml Vehikellösung (Propylenglykolalginat) enthielt, die vor Anwendung vermischt wurden, es sei denn das Protein und das Vehikel wurden getrennt getestet. Das Gewichtsverhältnis war etwa 85/5/10 zwischen den Hauptproteinpeaks bei 20, 14 bzw. 5 kDa.
Beispiel 1
Apoptose bei Meerschweinchen-Zahnepithelium
Gewebepräparation
Zwei Meerschweinchen mit 200 bis 250 g wurden durch Kohlendioxid anästhesiert und enthauptet. Auf beiden Seiten wurden Maxilla und Mandibula sezerniert und mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, bei 4°C fixiert. Nach Fixierung wurden die Proben mit neutraler 10%iger EDTA entkalkt, mit absolutem Ethanol dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Es wurden Schnitte (7 μm) in folgende Richtungen gemacht: sagittale (mesio-distale) Schnitte um Information über Veränderungen im Schmelzepithel in Verbindung mit der Bildung von Zementperlen zu erhalten, welche an der Schmelzoberfläche gebildet werden; bukko-linguale Schnitte, um Informationen über Veränderungen in der Epithel-Wurzelhülle zu erhalten, die stattfinden, wenn Dentin und Cementum am apikalen Ende der Backenzähne gebildet werden; horizontale Schnitte um die Verteilung des Epithels um die Backenzähne zu verfolgen. Diese Schnitte wurden für eine immunohistochemische Demonstration der Epithelzellen und ihrer Basallamina, wie auch des möglichen Auftretens von Apoptose verwendet. Einige Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt.
Immunhistochemische Detektion von Laminin und Keratin
Die Schnitte wurden mit 2% Wasserstoffperoxid vorbehandelt um endogene Peroxidase zu verringern, mit 0,1% Protease (Sigma, St. Louis, USA) für 15 min inkubiert und eine nichtspezifische Reaktion wurde mit 4% normalem Ziegenserum (Dako, Kopenhagen, Dänemark) blockiert. Dann wurden sie mit Kaninchen-Anti-Laminin-Antikörper (1 : 1000, Dako, Kopenhagen, Dänemark) oder monoclonalem Maus-Anti-Cytokeratin-Antikörper (1 : 100, Boehringer, Mannheim, Deutschland) bei 4°C über Nacht inkubiert, mit TBS (50 mmol Tris-Puffer-Kochsalzlösung, pH 7,4) gespült, mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper mit HRP (Dako, Kopenhagen, Dänemark) oder Ziegen-Anti-Maus-Antikörper mit HRP 1 : 100 verdünnt (Dako, Kopenhagen, Dänemark), bei Raumtemperatur für 60 min inkubiert. Die Immunreaktion wurde mit 0,1% DAB (Diaminobenzidin) sichtbar gemacht, TBS wurde für die primären Antikörper in TUNEL-Kontrollverfahren zur Visualisierung von Apoptose eingesetzt.
Die Schnitte wurden mit Xylol von Paraffin befreit, mit klassifiziertem Ethanol rehydratisiert und mit PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), 50 mM Natriumphosphat, 200 mM NaCl, pH 7,4) gespült. Die Schnitte wurden mit Proteinase K (20 μg/ml in PBS, pH 7,4, Sigma, St. Louis, USA) für 15 min bei 37°C inkubiert um die DNA-Stränge freizulegen, und mit PBS gespült. Endogene Peroxidase wurde durch 2,0% Wasserstoffperoxid in PBS für 5 min bei Raumtemperatur blockiert. Eine Lösung von mit DIG markiertem dUTP (Desoxyuridintriphosphat) und TdT (terminale Desoxynukleotidyltransferase) wurden vermischt um ein TUNEL-Gemisch herzustellen (Oncor, Gaithersburg, MD). Die Schnitte wurden für 60 min bei 37°C mit TUNEL-Gemisch inkubiert. Eine Lösung von mit DIG markiertem dUTP ohne TdT (terminale Desoxynukleotidyltransferase) wurde als negative Kontrolle verwendet. Nach Inkubation wurden die Proben mit PBS gespült und mit Anti-Digoxigeninperoxidase für 30 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktion wurde durch 0,1% DAB mit 0 bis 0,2% Wasserstoffperoxid in PBS bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Als positive Kontrollen wurden ein Backenzahn und eine Rattenmilz in der gleichen Weise beobachtet. Apoptotische Zellen wurden zum Teil in Schneidezahn-Ameloblasten der Übergangsstufe und zum Teil in abgetrenntem Schmelzepithel auf FIRS in Rattenbackenzähnen verteilt. Apoptotische Zellen wurden in der Milz einer Ratte verstreut.
Resultate
Die Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Keratin zeigte die Epithelzellen in allen Positionen, wo sie mit Hilfe normaler Lichtmikroskopie identifiziert werden konnten. Außerdem war es möglich, Epithelzellen in Bereichen zu unterscheiden, in denen Zellen des Schmelzorgans oder der Epithelwurzelhülle mit mesenchymalen Zellen des Zahnfollikels vermengt waren. Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Laminin zeigte, dass die Epithelstrukturen in einigen Bereichen mit einer Basalmembran verbunden waren und dass in anderen Bereichen eine Basalmembran fehlte. Das TUNEL-Verfahren machte apoptotische Körper in spezifischen Regionen der angrenzend wachsenden Zähne sichtbar.
Es wurde beobachtet, dass Ameloblasten in einer sehr frühen sekretorischen Stufe, Übergangsstufe, Reifungsstufe und der epithelialen Stufe mit verringertem Schmelz einer Apoptose unterliegen. Eine Apoptose im Reifungszustand und im epithelialen Zustand mit verringertem Schmelz schien mit der Bildung von Zementperlen verbunden zu sein. Im apikalen Bereich des knorpelartigen Zements wurde das Schmelzorgan beobachtet, das ein großes sternenförmiges Retikulum hat, und dem eine ausgeprägte Grenze des äußeren Schmelzepithels fehlte. Eine Apoptose des Schmelzepithels wurde in denselben Teilen wie die von Zementperlen beobachtet. Auf der Basis dieser Resultate wird davon ausgegangen, dass Apoptose eine wichtige Rolle bei der Reduktion, Transformation, Evakuierung und Migration von Schmelzepithel spielt, was einen wichtigen Schritt zur Bildung von Zement während der Zahnentwicklung darstellt.
Beispiel 2
Wachstum von humanen Epithelzellen in Gegenwart und Abwesenheit von EMD
Materialien und Verfahren
Humane Epithelzellen (HeLa; eine humane zervikale Krebszelllinie) wurden von Bio-Whittaker, HeLa 07-229c, Charge #8c2720 erhalten. Die Zellen wurden in modifiziertem Egle's-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, wachsen gelassen. EMD wurde durch Oberflächenbeschichtung von Kulturschalen mit einer 0,1% EMD-Lösung in 0,1% HAc und durch Ergänzen des Kulturmediums mit 100 μg EMD pro ml Medium zugeführt. HeLa-Zellen, die unter ähnlichen Bedingungen in Abwesenheit von EMD aktiviert worden waren, wurden als Kontrollen verwendet. Alle Experimente wurden mit 50.000 Zellen pro ml Kulturmedium initiiert.
Resultate

(a) HeLa-Zellen wurden für 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden in Kulturen wachsen gelassen. Die Kulturen wurden dann mit PBS gewaschen und die Zellen wurden im Mikroskop unter Verwendung eines fixierten Gitters gezählt. Fünf verschiedene Bereiche wurden in jeder von sechs parallelen Kulturen zu jedem Zeitpunkt gezählt. Wie aus 1 ersichtlich ist, zeigen HeLa-Zellen eine deutliche Verringerung bei der Zelldichte ab 48 Stunden, wenn sie in Gegenwart von EMD wachsen gelassen wurden.
(b) HeLa-Zellen wurden für 24 oder 120 Stunden kultiviert, zweimal mit PBS gewaschen und zentrifugiert. 100 μl Zellen aus jeder Kultur (n = 6 bei jedem Zeitpunkt/Experiment) wurden dann lysiert und freigesetztes intrazellulares cAMP wurde durch einen kompetitiven Enzymimmunassay (EIA) unter Verwendung eines Amersham Pharmacia Biotech "Biotrak cAMP EIA"-Kits (Katalog Nr. RPN 225) nach den Anweisungen des Herstellers gemessen. Im Vergleich zu Kontrollen zeigen HeLa-Zellen nach 24 Stunden Wachstum in Gegenwart von EMD eine deutliche Zunahme beim intrazellulären cAMP (2). Diese Zunahme konnte noch nach 120 Stunden Kultur beobachtet werden. Die Zunahme beim intrazellulären cAMP legt nahe, dass Zellen, die in Gegenwart von EMD gewachsen sind, ein inneres Signal (innere Signale) erzeugen, das/die Teil von Wegen zur Wachstumsregulation und Differenzierung sein kann/können.
(c) HeLa-Zellen wurden nach 24, 48, 72, 96 oder 120 Stunden (n = 5 zu jedem Zeitpunkt/Experiment) aus Kulturen geerntet, mit PBS gewaschen und zentrifugiert. 200 μl Zellen wurden lysiert und der Level an Apoptose-spezifischen Nukleinsäureabbauprodukten (Histon-assoziierte DNA-Fragmente) wurde durch Sandwich-ELISA quantitativ bestimmt, wobei ein Boehringer Mannheim "Cell Death Detection ELISA"-Kit (Katalog Nr. 1774425) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die Resultate sind als Verhältnis zwischen EMD-behandelten Zellen und unbehandelten Zellen angegeben. Demnach geben Werte über 1 einen induzierten Zelltod an, während Werte unter 1 ein verlängertes Zellüberleben angeben. Aus Tabelle 3 geht hervor, dass die HeLa-Zellen eine deutliche Zunahme beim induzierten Zelltod zeigen, wenn EMD in den Kulturen vorliegt (Werte über 1), wobei eine Spitze 72 Stunden nach Zugabe von EMD auftritt.

Auf der Basis dieser Resultate wird geschlossen, dass das Epithelzellwachstum in Gegenwart von EMD schlechter ist und dass das Vorliegen von EMD in Kulturen den programmierten Zelltod um mehr als das Zweifache erhöht.
Beispiel 3
Wachstum von humanen Krebszellen in Gegenwart von EMD
Materialien und Verfahren
Humane Krebszellen wurden von Zellkulturbanken erhalten, wobei diese aus Tumorgeweben von Patienten stammten, die sich einer Krebsbehandlung im norwegischen Krebskrankenhaus in Oslo, Norwegen, unterzogen hatten. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, (Osteosarkomzellen) oder in Eagle's modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, (vom Epithelium stammende Zellen) wachsen gelassen. EMD wurde durch Oberflächenbeschichtung von Kulturschalen mit einer 0,5 mg/ml EMD-Lösung in 0,01% HAc und durch Ergänzen des Kulturmediums mt 100 μg EMD pro ml Medium zugeführt. Alle Experimente wurden mit 50.000 Zellen/ml Kulturmedium initiiert.
Resultate
Die Zellen wurden 72 und 120 Stunden (n = 3 × 3 jedes Mal) aus den Kulturen geerntet. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und zentrifugiert und 200 μl Zellen aus jeder Probe wurden lysiert und der Level an Apoptose-spezifischen Nukleinsäureabbauprodukten (Histon-assoziierte DNA-Fragmente) wurde durch Sandwich-ELISA quantitativ bestimmt, wobei ein Boehringer Mannheim "Cell Death Detection ELISA"-Kit (Katalog Nr. 1 774 425) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die Resultate sind als das Verhältnis zwischen EMD-behandelten Zellen und unbehandelten Zellen angegeben. Demnach geben Werte über 1 einen induzierten Zelltod an, während Werte unter 1 ein verlängerte Zellüberleben wiedergeben.
Aus der folgenden Tabelle 1 wird klar, dass humane Krebszellen eine deutliche Zunahme (Werte über 1) bei induziertem Zelltod in Gegenwart von EMD in den Zellkulturen zeigen, wobei eine Spitze bei 72 bis 120 Stunden nach Zugabe von EMD auftritt.
Tabelle 1

Claims

Verwendung einer Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von malignen oder benignen Neoplasmata.
Verwendung einer Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von Krebs.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–2, wobei die Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz bei oder auf Gewebe anzuwenden ist, das einen wesentlichen Anteil epithelialer Zellen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Gewebe Haut- oder Schleimhaut-Gewebe umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Schleimhaut-Gewebe orale Schleimhaut, gastrointestinale Schleimhaut, Schleimhaut der Atemwege (wie Lungenschleimhaut), Zervixschleimhaut oder Abdomen-Schleimhaut umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Gewebe Drüsengewebe ist, z. B. Milchdrüsen-, Pankreas-, Leber-, Schilddrüsen-, Blasen-, Prostata-, Schweißdrüsen-, Speicheldrüsen- oder Hypophysen-Gewebe.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–2 zur topischen Behandlung von Krebs oder Neoplasmata.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Krebs oder das Neoplasma ausgewählt ist aus epithelial abgeleiteten Krebsarten oder Neoplasmata.
Verwendung nach Anspruch 7 zur Anwendung bei oder an einer Tumorstelle vor, während oder nach einer Tumoroperation, um das Risiko postoperativer Metastasen wesentlich zu verringern oder um das Wiederauftreten des Tumors im Wesentlichen zu verhindern.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die aktive Schmelzsubstanz Schmelzmatrix, Schmelzmatrix-Derivate und/oder Schmelzmatrixproteine ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die aktive Schmelzsubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enamelinen, Amelogeninen, non-Amelogeninen, Prolin-reichen non-Amelogeninen, Amelinen (Ameloblastin, Sheathlin), Tuftelinen, und deren Derivaten und Gemischen daraus.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die aktive Schmelzsubstanz ein Molekulargewicht von höchstens ungefähr 120 kDa hat, wie bspw. höchstens 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa oder 60 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE-Elektrophorese.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zubereitung der aktiven Schmelzsubstanz ein Gemisch aus aktiven Schmelzsubstanzen mit unterschiedlichen Molekulargewichten enthält.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz mindestens zwei Substanzen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amelogeninen, Prolin-reichen non-Amelogeninen, Enamelinen, Tuftelin, Haarproteinen, Serumproteinen, Speichelproteinen, Amelin, Ameloblastin, Sheathlin und deren Derivaten.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die aktive Schmelzsubstanz ein Molekulargewicht von bis zu ungefähr 40 000 hat.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die aktive Schmelzsubstanz ein Molekulargewicht von zwischen ungefähr 5 000 und ungefähr 25 000 hat.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Hauptteil der aktiven Schmelzsubstanz ein Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa hat.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Teil der aktiven Schmelzsubstanz in Form von Aggregaten vorliegt oder nach der Anwendung in vivo dazu in der Lage ist, Aggregate zu bilden.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Aggregate eine Partikelgröße von ungefähr 20 nm bis ungefähr 1 μm haben.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Proteingehalt der aktiven Schmelzsubstanz in der Zubereitung in einem Bereich von ungefähr 0,05% Gew./Gew. bis 100 Gew./Gew. liegt, wie bspw. ungefähr 5–99% Gew./Gew., ungefähr 10–95% Gew./Gew., ungefähr 15–90% Gew./Gew., ungefähr 20–90% Gew./Gew., ungefähr 30–90% Gew./Gew., ungefähr 40–85% Gew./Gew., ungefähr 50–80% Gew./Gew., ungefähr 60–70% Gew./Gew., ungefähr 70–90% Gew./Gew. oder ungefähr 80–90% Gew./Gew.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein pharmazeutisch annehmbares Exzipienz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das pharmazeutisch annehmbare Exzipienz Propylenglycolalginat ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das pharmazeutisch annehmbare Exzipienz Hyaluronsäure ist oder Salze oder Derivate davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–23, wobei die Zubereitung einer aktiven Schmelzsubstanz a) 30 mg gefriergetrocknetes Schmelzmatrixprotein und eine Trägerlösung, bestehend aus 1 ml Propylenglycolalginat, welche vor der Anwendung gemischt werden und wobei das Gewichtsverhältnis der Hauptproteinpeaks bei 20, 14 und 5 kDa ungefähr 85/5/10 ist, oder b) irgendwelche Proteine oder Peptide, die in a) enthalten sind, enthält.