DE4419024C1 - Coimmobilisatschicht - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Coimmobilisatschicht, die aus einer Polymermatrix besteht, wobei diese Polymer­ matrix Dehydrogenasen und/oder Reduktasen mit ihren Cofaktoren bzw. deren Komplexe gebunden an einen po­ lymeren Spacer enthält. Die Erfindung betrifft wei­ terhin ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Schicht sowie deren Verwendung für Enzymsensoren.

In den letzten zwei Dekaden wurden eine Reihe ver­ schiedener Untersuchungen auf den Gebieten der Enzym­ technologie und Biosensorik vorgenommen, die zum Ziel hatten, die Notwendigkeit der Cofaktorzugabe oder -nachführung beim Arbeiten mit Bioreaktoren und -sen­ soren mit Dehydrogenasen zu umgehen.

So wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt, die die Kopplung des Cofaktors an das Apoenzym zum Ziel hatten, um sogenannte "semisynthetische Holo-Dehydro­ genasen" zu erhalten. Stellvertretend seien hier die Arbeiten von Mansson et al. (Meth. Enzymol. 89, 457-468) genannt, die ein NAD-Derivat an Leberalkohol-Dehydrogenase koppelten. Üblicherweise sind derartige Methoden mit einem hohen präparativem Aufwand verbun­ den. Zur Anbindung aktivierter Cofaktoranaloga ist eine modifizierbare Gruppe in der Nähe der Cofaktor-Bin­ dungsstelle erforderlich, wie sie Persson et al. (Biotechnology 9 (1991) 280-284) an Glycosedehydroge­ nase genetisch erzeugten, um sodann aktiviertes Thiol-NAD über eine Disulfidbindung anzubinden. An­ dernfalls ist man auf geeignete reaktive Gruppen im nativen Enzym angewiesen, so daß eine Optimierung des Spacers zwischen Enzym und Cofaktor erforderlich ist. Allerdings kann durch die mit jeder Modifizierung einhergehende strukturelle Veränderung des Enzyms dessen Aktivität beeinträchtigt werden. Weiterhin sollten hier die Untersuchungen von Yomo et al. (Eur. J. Biochem. 200 (1991) 759-766; Eur. J. Biochem. 203 (1992) 533-542) erwähnt werden, die mit Polyethylen­ glykol (PEG) als Spacer aktive Konjugate aus Media­ tor, Cofaktor und Enzym darstellten. Auch hier ist die Herstellung mit aufwendigen Aufreinigungen der modi­ fizierten Enzyme verbunden. Zudem stellt sich gerade bei Verwendung von PEG als relativ langem Spacer die Frage, ob hier nicht besser auf die Anbindung an das Enzym verzichtet werden sollte und statt dessen Enzyme wie Cofaktor z. B. kovalent auf einem Träger fixiert werden sollten. Somit würde die für die meisten bio­ technologischen und biosensorischen Anwendungen ohne­ hin erforderliche Immobilisierung gleichzeitig vor­ genommen, ohne daß eine zusätzliche strukturelle Be­ einträchtigung durch die Cofaktorfixierung in Kauf genommen werden müßte.

Derartigen Verfahren ist gemeinsam, daß die Enzym- und Cofaktor-Modifizierungen relativ aufwendig sind und für jedes Enzym die Methoden einzeln optimiert werden müssen. Zudem ist für viele Anwendungen, ins­ besondere in der Biosensorik, eine Immobilisierung der so erhaltenen Holoenzyme erforderlich, die deren Aktivität weiter beeinträchtigen könnte. Daher ist sowohl die Entwicklung als auch die Produktion von Dehydrogenasen/Reduktasen-basierenden stoffwandelnden Katalysesystemen bzw. Biosensoren auf Basis solcher Methoden aufwendig und katalytisch wenig effizient.

Ein anderer Ansatz besteht in einer Immobilisierung von Enzym und Coenzym nebeneinander unter Ermögli­ chung ihrer Wechselwirkung. Hierbei wird gleichzeitig die Immobilisierung der Biokomponente bewerkstelligt, was für die meisten Anwendungen ein bedeutender Vor­ teil ist. Coimmobilisierungen auf der Basis von kova­ lenter Anbindung von Dehydrogenase und modifiziertem Cofaktor an einem gemeinsamen Träger wurden von Mosbach et al. (Meth. Enzymol. 89, 457-468) beschrie­ ben. Als Träger diente Agarose. Die Präparationen zeigten enzymatische Aktivität, die jedoch in Lösung mit gelöstem freien Cofaktor noch erheblich anstieg. Offensichtlich garantierte die Coimmobilisierung also nicht die Präsenz der für maximale Aktivität erfor­ derlichen Mengen Cofaktor. Eine Regeneration des ge­ bundenen Cofaktors mittels eines organischen Farb­ stoffes war nicht möglich. Damit ist diese Methode zum Einsatz in amperometrischen Biosensoren mit medi­ ierter NADH-Detektion ungeeignet.

Ebenfalls bekannt ist die "site-to-site"-Coimmobili­ sierung zweier Enzyme mit NAD mit einem gemeinsamen Cofaktormolekül. So beschreiben z. B. Jun et al. (Dyues and Pigments 16 (1991) 11-17) die Coimmobili­ sierung von Alkoholdehydrogenase, Lactatdehydrogenase und NAD, die ein enzymatisches Regenerieren von NAD erlaubt.

Mazid und Laidler (Biotechnol. Bioeng. 24 (1982) 2087-2097) beschreiben die Anbindung von Alkoholdehy­ drogenase und einem Cofaktoranalog nebeneinander auf Nylon. Die erhaltene Präparation wies enzymatische Aktivität auf und der gebundene Cofaktor konnte auch mittels eines organischen Farbstoffes regeneriert werden. Wie bei allen kovalenten Immobilisierungen ist mit dieser auf Nylon als Substrat beschränkten Methode jedoch weder eine lokal begrenzte Immobili­ sierung noch eine beliebige Steigerung der Menge im­ mobilisierten Enzyms möglich.

Versuche, bei der Quervernetzung von Dehydrogenasen mit Glutaraldehyd und gegebenenfalls BSA auch NAD mit zu vernetzen, beschreiben Blaedel und Jenking (Anal. Chem. 48 (1976) 1240-1246) sowie Legoy et al. (Bio­ chemie 62 (1980) 341-345). Bei der chemischen Anbin­ dung des NAD an das Enzym durch Verknüpfung von Ami­ nofunktionen ist jedoch ein erheblicher Aktivitäts­ verlust zu erwarten. Die gemessene Aktivität könnte auch durch im quervernetzten Gel lose eingeschlosse­ nen oder adsorbierten Cofaktor bedingt sein. Zudem ist eine Immobilisierung durch Quervernetzung sehr problematisch, und die Methode als solche erfordert relativ große Mengen an Enzym bei oftmals deutlichem Aktivitätsverlust.

Yabuki et al. versuchten, Dehydrogenasen, einen Me­ diator und NAD(P) in elektrochemisch erzeugtes Poly­ pyrrol einzuschließen. Wenngleich man ein Auswaschen des Cofaktors erwarten sollte, gelang hiermit die Detektion der Substrate Ethanol und Glutamat. Aller­ dings wiesen die Sensoren relativ lange Einstellzei­ ten sowie eine mangelhafte Sensitivität auf, die auf eine schlechte Wechselwirkung zwischen Enzym und Co­ faktor hinweisen. Im Gegensatz zu anderen Methoden erlaubt die Immobilisierung durch Elektropolymerisa­ tion jedoch eine Kontrolle der Enzymmenge, der Schichtdicke der Immobilisatschicht und eine lokal definierte Immobilisierung etwa auf einzelnen aktiven Flächen von Elektrodenarrays.

Die Adsorption von Alkoholdehydrogenase und NAD an PVC-Membranen und anschließendes Abdecken mit einer weiteren Membran wurde von Gotoh und Karube (Anal. Lett. 27 (2) (1994) 273-284) zur Herstellung eines Alkoholsensors ausgenutzt. Jedoch waren die erhalte­ nen Signale äußerst gering. Die Methode ermöglicht offenbar keine spezifische Immobiliserung hinreichen­ der Mengen an Cofaktoren.

Den Einschluß von Enzym in ein radikalisch polymeri­ sierbares Polyacrylamidgel beschreiben Yamazaki und Maeda (Biotechnol. Bioeng. 24 (1982) 1915-1918). Ne­ ben der aufwendigen Präparation der zur kovalenten Anbindung an das Einschlußpolymer entsprechend modi­ fizierten Cofaktoren ist vor allem zu nennen, daß die kovalente Anbindung an die nichtlösliche Immobilisie­ rungsmatrix eine optimale Wechselwirkung Cofaktor/En­ zym räumlich beeinträchtigen dürfte.

Eine Reihe anderer in der Literatur beschriebener Sensoren auf Basis NAD(P)-abhängiger Dehydrogenasen bedienen sich aufgrund der geschilderten Problematik einer Versorgung mit NAD aus verschieden gearteten Reservoirs. Dabei wird der Cofaktor z. B. aus dem Elektrodenmaterial selbst (Biosensors & Bioelectro­ nics 6 (1991) 681-687) freigesetzt. Es handelt sich nicht um einen reagenzlosen Meßfühler, vielmehr wird ein Reagenz von "Sensor" selbst stetig freigesetzt. Ein Nachteil solcher Systeme liegt vor allem darin, daß - abgesehen von der Kontamination der Probe - hierfür hohe Mengen Cofaktor, also auch Enzym, im Reservoir bzw. in der Elektrodenmatrix erforderlich sind (z. B. 28 Gew.-% und 14 Gew.-% NAD in obengenannter Literatur), so daß damit der Kostenvorteil eines Sen­ sors im Vergleich z. B. zu einer FIA-Anordnung mit Cofaktor-Versorgung nicht mehr gegeben ist. Es han­ delt sich hier also nicht um eine Immobilisierung im eigentlichen Sinne.

Die geschilderten Verfahren führten trotz einiger Teilerfolge nicht zu allgemein etablierten Methoden, die die Enzymklasse der Dehydrogenasen ähnlich attraktiv für Biosensorik und Enzymtechnologie mach­ ten wie die Oxidasen, die keinen Cofaktor benötigen.

Aufgrund der Problematik der oben geschilderten Un­ tersuchungen wurden alternativ sogenannte Membranre­ aktoren untersucht. Hierbei werden bioaktive Moleküle hinter Dialysemembranen eingeschlossen, welche ein Substrat passieren kann. Solche Reaktoren können dann prinzipiell anstelle von Immobilisatschichten verwen­ det werden. Bereits Blaedel und Jenkins (Anal. Chem. 48 (1976) 1240-1246) hatten festphasengebundenes Co­ enzym zusammen mit einer Enzymlösung hinter einer Dialysemembran fixiert. Durch Ankopplung von akti­ viertem NAD an verschiedene wasserlösliche Polymere gelingt die Synthese von makromolekularen Cofaktoren, die nur eine geringfügige Beeinträchtigung der Dehy­ drogenasen-Aktivität im Vergleich zum freien Cofaktor mit sich bringen. Solche polymermodifizierten Cofak­ toren lassen sich leicht hinter Dialysemembranen zu­ rückhalten. Dabei hat Polyethylenglykol-modifiziertes NAD die größte Bedeutung erlangt. Membranreaktoren mit Dehydrogenasen und PEG-NAD können vor Elektroden fixiert werden, um so reagenzlose Enzymelektroden zu erhalten (GBF Monogr. 13, 93-98). Ein Mediator kann in der Meßlösung gelöst oder auch an der Elektroden­ oberfläche adsorbiert vorliegen. Das einfache Grund­ prinzip erlaubt die Verwendung für die verschieden­ sten NAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen. Als Nachteile dieser Systeme ist vor allem die mangelnde Langzeit­ stabilität zu nennen. Sie ist leicht zu erklären, da Enzyme wie modifizierter Cofaktor gelöst vorliegen. Zudem ist die Präparation solcher Membranreaktoren aufwendig; die Reaktoren mit der wäßrigen Enzym/PEG-NAD-Lösung müssen im Gegensatz zu lagerstabilen Coim­ mobilisatschichten vor der Messung frisch vorbereitet werden. Weiterhin weisen sie relativ hohe Ansprech­ zeiten auf. Dieser Effekt wird durch die verlangsamte Diffusion des makromolekularen NAD-Derivates erklärt (Sens. Act. B, 13-14 (1993) 366-371).

Aus CA 100 : 990 96 d ist eine Coimmobilisatschicht bekannt in die Dehydrogenase und NAD eingeschlossen ist. Das Enzym ist dabei mit dem Matrixmaterial ver­ knüpft.

Allen bekannten Verfahren ist gemeinsam, daß die re­ sultierenden Coimmobilisate bei relativ aufwendiger Herstellung für reale Anwendungen nur eine unzurei­ chende Stabilität und vergleichsweise geringe enzyma­ tische Aktivitäten aufweisen.

Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Coimmobilisatschicht anzugeben, die eine hohe Stabilität und eine gleichzeitig gegenüber dem Stand der Technik erhöhte enzymatische Aktivität aufweist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1, hinsicht­ lich des Verfahrens durch die kennzeichnenden Merkma­ le des Anspruches 10 und in bezug auf die Verwendung durch Patentanspruch 15. Die Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die Dehydrogenase und/oder Reduktase mit ihren Cofaktoren bzw. deren Komplexen in eine Polymermatrix einzuschließen, wobei der Cofaktor an einen polymeren Spacer mit einem Mo­ lekulargewicht zwischen 2000 und 20 000 gekoppelt ist. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß durch diese Maßnahme eine gegenüber dem Stand der Technik deutlich erhöhte Stabilität und gleichzeitig eine erhöhte enzymatische Aktivität erreicht werden. Als polymere Matrix dient dabei ein polymeres Netzwerk, bevorzugt aus Polyacrylat, Polyvinylalkohol, Polysul­ fonsäureester, Polysaccharid, Polypeptid, querver­ netztes Polypeptid, Polyurethan, Polypyrrol, Polyani­ lin, Poly-o-phenylendiamin, Polyphenol oder Polyphe­ nothiazin. Die Aufgabe des Polymers ist dabei aus­ schließlich, das Enzym bzw. die Enzyme und den Cofak­ tor bzw. dessen Komplex schonend und stabilisierend physikalisch einzuschließen. Bevorzugt ist vorgese­ hen, daß der Cofaktor NAD(P) oder NAD(P)H ist. Erfin­ dungswesentlich ist es, daß diese Cofaktoren an einen polymeren Spacer mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und 20 000 gekoppelt sind. Dadurch wird einer­ seits das Austreten des niedermolekularen Cofaktors aus der Polymermatrix verhindert, und andererseits nimmt der so modifizierte Cofaktor seine Spacer-Funk­ tion wahr. Die polymere Spacerkomponente ist bevor­ zugt ausgewählt aus Polyethylenglykol, Polypeptid oder Polysaccharid. Durch die eintretende Komplexbil­ dung zwischen Enzym und Cofaktor wird erreicht, daß der Cofaktor auch in der Polymerstruktur noch zum korrespondierenden aktiven Zentrum hin orientiert ist. Auf diese Weise liegt der Cofaktor für das akti­ ve Zentrum in einer sehr effizienten Konzentration vor.

Erfindungsgemäß umschließt die Coimmobilisatschicht alle an und für sich aus dem Stand der Technik be­ kannten Dehydrogenasen bzw. Reduktasen. Ein Überblick ist z. B. in P.D. Boyer (Ed.): The Enzymes, Vol. XI, Academic Press, San Francisco, London, 1975, angege­ ben. Bevorzugt ist die Reduktase bzw. Dehydrogenase NAD- bzw. NADP-abhängig.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform (Patentan­ spruch 7) schlägt vor, daß die Polymermatrix zusätz­ lich Redoxmediatoren enthält. Diese Ausführungsform ist besonders bevorzugt, wenn die Coimmobilisat­ schichten für die Herstellung von Elektropolymeren vorgesehen sind. Beispiele für Redoxmediatoren sind Phenazine, Phenoxazine, Phenothiazine oder Chinone.

Die beschriebenen Coimmobilisatschichten weisen be­ vorzugt eine Dicke von 0,5 bis 50 µm auf. Ganz beson­ ders bevorzugt ist eine Dicke von 0,5 bis 25 µm.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend be­ schriebenen Coimmobilisatschicht. Dabei wird erfin­ dungsgemäß so vorgegangen, daß zuerst eine wäßrige Lösung der Dehydrogenase und/oder Reduktase mit ihren Cofaktoren hergestellt wird und diese Lösung in eine wäßrige Lösung eines polymerisierbaren Monomeren oder in eine Präpolymer- bzw. Polymerlösung eingebracht wird. Erfindungsgemäß wird dabei so vorgegangen, daß 0,5 bis 30 mg Enzymprotein (Enzym + Cofaktor) pro 10 µl wäßrige Pufferlösung eingesetzt wird. Als wäß­ rige Pufferlösung kann z. B. 0,1 molare KCl dienen. Zur Herstellung der Polymermatrix ist es bevorzugt, die vorstehend beschriebene Lösung in eine wäßrige Pufferlösung eines polymerisierbaren Monomers oder in eine wäßrige Präpolymerlösung einzubringen. Als Mo­ nomere kommen dabei alle Ausgangsverbindungen in Fra­ ge, die sich zu den vorstehend erwähnten polymeren Netzwerken vernetzen lassen. Bevorzugt ist hierbei Pyrrol.

Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von was­ serlöslichen Präpolymeren wie z. B. wasserlösliches Urethan. Möglich ist auch, Polymer anzulösen und die erhaltene Lösung einzusetzen. Wäßrige Präpolymerlö­ sungen der vorstehend beschriebenen Polymere sind kommerziell erhältlich, z. B. bei Sigma, Deisenhofen.

Aus stofflicher Sicht umfaßt die Erfindung insbeson­ dere alle Dehydrogenasen und/oder Reduktasen, die NAD- bzw. NADP-abhängig sind. Es wird hierbei bevor­ zugt 1 Molekül Cofaktor pro Untereinheit des Enzyms eingesetzt. Sollte das Enzym z. B. vier Untereinheiten (Subunit) aufweisen, können bis zu vier Moleküle Co­ faktor eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die so herge­ stellte Lösung vernetzt wird. Es kann so vorgegangen werden, daß die Lösung auf den zu beschichtenden Ge­ genstand aufgebracht wird, z. B. auf eine Elektroden­ oberfläche, ein semipermeables Membran oder ein iner­ tes Trägermaterial, und daß dann die Vernetzung er­ folgt.

Das Aufbringen kann im Prinzip durch alle aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren wie Aufsprühen, Aufschleudern oder auch Tauchen erfolgen. Die Polyme­ risierung kann durch alle bekannten Verfahren wie physikalische Prozesse, chemische, photochemische, radikalchemische oder elektrochemische Reaktionen erfolgen. Die Dauer und Verfahrensparameter richten sich nach dem ausgewählten Verfahren und sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Bei Elektropolymerisierung wird so vorgegangen, daß der zu beschichtende Gegenstand in die Lösung einge­ taucht wird und die Vernetzung z. B. durch Anlegen einer Spannung erfolgt.

Letztlich betrifft die vorliegende Erfindung die Ver­ wendung der vorstehend beschriebenen Schichten für Sensoren, bevorzugt für Enzymsensoren. Für diesen Anwendungsfall sind die vorstehend beschriebenen Co­ immobilisatschichten besonders geeignet.

Für Sensor-Anwendungen bei Elektropolymeren ist der gleichzeitige Einschluß von Elektronenmediatoren vor­ teilhaft, insbesondere aus der Gruppe der bereits vorstehend erwähnten Phenazine, Phenoxazine, Phenot­ hiazine oder Chinone, um eine Regenerierung des Co­ faktors amperometrisch zu ermöglichen. Die enzymati­ sche Stoffwandlungen in Reaktoren erfolgt durch die Coimmobilisierung einer Dehydrogenase und einer Re­ duktase durch die Regenerierung des polymermodifi­ zierten NAD(P)/NAD(P)H.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausfüh­ rungsbeispieles und der Fig. 1 und 2 näher erläu­ tert. Es zeigen:

Fig. 1 das Ansprechverhalten einer Polypyrrol-Co­ immobilisat-beschichteten Platinelektro­ de, und

Fig. 2 die Kalibrierung des enzymatischen Ethanol­ sensors durch Auswertung der Aufstockung unterschiedlicher Ethanolkonzentrationen unter Batch-Bedingungen.

Eine wäßrige Lösung von 1 mg Moldola Blau, ca. 2 mg Polyethylenglykol-nNAD(H) und 3 mg Alkoholdehydroge­ nase aus Hefe in 2 ml 0,1 m KCl wurde mit Stickstoff entgast. Nach Zugabe von 25 µl Pyrrol wurde eine po­ lierte Platinelektrode eingetaucht und für eine Minu­ te auf 700 mV vs. Ag/AgCl (3 M KCl) polarisiert. Die auf der Elektrodenoberfläche abgeschiedene Polymer­ schicht wird nach gründlicher Spülung mit destillier­ tem Wasser in Puffer gelagert. Zur Messung wird sie in eine PBS-Pufferlösung getaucht und gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode mit einer Polarisationsspan­ nung von 300 mV versehen. Das Ansprechverhalten der Elektrode ist in Fig. 1 dargestellt. Die Ansprechzeit (90%) nach Zugabe von 6,8 mM Ethanol beträgt ca. 8 Sekunden. Die Abhängigkeit des Sensorsignals (Steady­ state-Strom) von der Ethanolkonzentration ist in Fig. 2 dargestellt. Die gezeigten Ergebnisse wurden am dritten Tag nach der Elektrodenpräparation erhalten.

Die erfindungsgemäße Schicht erlaubt somit langzeit­ stabile Immobilisierungsschichten, die sowohl eine optimale Enzym-Cofaktor- als auch Cofaktor-Mediator-Wech­ selwirkung garantierende Coimmobilisierung von Dehydrogenase und/oder Reduktase mit ihrem Cofaktor unter Nutzung des schonenden und stabilisierenden physikalischen Einschlusses ermöglicht. Seine prinzipielle Eignung auf der Grundlage von Elektropo­ lymeren einschließlich der simultanen Inkorporierung von Redoxmediatoren gestattet das Aufbringen von Im­ mobilisatschichten auf lokal definierte Elektroden­ flächen sowie ein sehr schnelles Ansprechverhalten.

Im Hinblick auf die im allgemeinen hohe Stabilität und Aktivität von Dehydrogenasen sowie dem Umstand, daß mehr als 250 Dehydrogenasen für verschiedenste Analyte bekannt sind, ermöglicht dieses einfache und kostengünstige Verfahren zur Coimmobilisierung von Dehydrogenase (gegebenenfalls Reduktase) und Cofaktor eine Vielzahl von Anwendungen sowohl für die Reali­ sierung neuartiger "reagenzloser" Enzymsensoren als auch für Bioreaktor-Entwicklungen zur enzymkataly­ sierten Stoffwandlung.

Claims (15)

1. Coimmobilisatschicht, enthaltend - in eine Poly­ mermatrix eingeschlossen - Dehydrogenase und/oder Reduktase und ihre Cofaktoren bzw. deren Komplexe, wobei der Cofaktor an einen polymeren Spacer mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und 20 000 gekoppelt ist.

2. Coimmobilisatschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer ausge­ wählt aus Polyethylenglykol, Polypeptid oder Polysaccharid oder einer Mischung davon.

3. Coimmobilisatschicht nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymermatrix ein polymeres Netzwerk aus Polyacrylat, Polyvi­ nylalkohol, Polysulfonsäureester, Polysaccharid, Polypeptid, quervernetztes Polypeptid, Poly­ urethan, Polypyrrol, Polyanilin, Poly-o-pheny­ lendiamin, Polyphenol oder Polyphenothiazin ist.

4. Coimmobilisatschicht nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Cofaktoren poly­ mer modifiziertes NAD(P) oder NAD(P)H ist.

5. Coimmobilisatschicht nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase eine NAD- oder NADP-abhängige Dehydrogenase ist.

6. Coimmobilisatschicht nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktase eine NAD- oder NADP-abhängige Reduktase ist.

7. Coimmobilisatschicht nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Matrix insbesondere bei Elektropolymeren zusätzlich einen Redoxmediator enthält.

8. Coimmobilisatschicht nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Redoxmediator ausgewählt ist aus der Gruppe der Phenazine, Phenoxazine, Phenothiazine oder Chinone.

9. Coimmobilisatschicht nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Dicke im Be­ reich von 0,5 bis 50 µm liegt.

10. Verfahren zur Herstellung der Coimmobilisat­ schicht nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß

• (a) eine wäßrige Lösung der Dehydrogenase und/oder Reduktase mit ihren Cofaktoren bzw. deren Komplexen in eine wäßrige Lösung von polymerisierbaren Monomeren und/oder einer Präpolymer- oder Polymerlösung eingebracht wird, und
• (b) die so erhaltene Lösung vernetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung des Präpolymers bzw. Polymers durch physikalische Prozesse, chemische, photochemische, radikalche­ mische oder elektrochemische Reaktionen erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Molekül Cofaktor pro Untereinheit des Enzyms eingesetzt wird.

13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Verfahrens­ schritt (a) erhaltene Lösung auf eine Elektro­ denoberfläche oder semipermeable Membran oder ein inertes Trägermaterial aufgebracht und an­ schließend vernetzt wird.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle einer Elek­ tropolymerisierung die Vernetzung durch Einbrin­ gen der Elektrode in die Lösung direkt auf der Elektrodenoberfläche erfolgt.

15. Verwendung der Coimmobilisatschicht nach minde­ stens einem der Ansprüche 1 bis 9 für Sensoren.