DE4332395A1 - Inhibitoren zur Hemmung der zymogenähnlichen Freispaltung der HIV-1 Protease - Google Patents
Inhibitoren zur Hemmung der zymogenähnlichen Freispaltung der HIV-1 ProteaseInfo
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Description
Die Prozessierung der gag p55 und gag-pol p160 Polyproteine des
Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) ist ein obligativer Schritt bei
der Bildung von infektiösen Partikeln und erfordert die Aktivität der
HIV-1 Protease. Es war bisher unklar, ob die virale Protease enzymatische
Aktivität lediglich in der maturen Dimerform besitzt, oder bereits als
Bestandteil eines dimerisierten gag-pol Polyproteins.
Wir konnten nachweisen, daß trotz der Gegenwart eines potenten HIV-1
Protease Inihibitors die ersten Schritte der gag-pol Prozessierung in
infizierten Zellen initiieren und ein intermediäres Abbauprodukt von 114
KDa akkumuliert (Bild 1). Nachdem durch spezifische Antikörper, die nur
bestimmte Domänen des gag-pol Polyproteins erkennen (p24, PR, Reverse
Transkriptase: RT), das p114 Intermediat eindeutig charakterisiert
werde konnte (Bild 2), läßt sich folgern, daß die Schnittstelle zwischen
der Nukleokapsiddomäne (p7) und p6* im gag-pol Polyprotein Initial
gespalten wird (siehe Graphik 1).
Zwei Schlußfolgerungen können aus der Tatsache gezogen werden, daß
keine mature HIV-1 Protease in Gegenweart des spezifischen Protease
Inhibitors nachweisbar ist (Bild 3). (i) Die mature HIV-1 Protease ist
hauptsächlich für die Freispaltung ihrer selbst verantwortlich. (ii) De
Akkumulation eines p114 Intermediats, trotz der Abwesenheit der
maturen Protease, läßt auf ein proteolytisch aktives gag-pol-Dimer
schließen. In diesem bereits vor einigen Jahren vorgeschlagenen
Polyproteindimer wäre das aktive Zentrum der viralen Aspartatprotease
komplettiert und somit eine proteolytische Aktivität möglich. Da diese
Aktivität offensichtlich nicht durch den, gegen die mature HIV-1 Protease
gerichteten Inihibitor, effizient hemmbar ist, läßt sich folgern, daß dieser,
bei der verwendeten Konzentration von 100 nM, eine kürzere
Verweildauer im gag-pol-Dimer besitzt. D. h. das gag-pol-Dimer würde
eine von der maturen Protease leicht abweichende Substratspezifität
(oder zumindest abweichende katalytische Konstanten) besitzen. Diese
Folgerung wird durch die Tatsache gestützt, daß die beiden für einen
initialen Schnitt in Frage kommenden Aminosäuresequenzen (1+2) sich
in wesentlichen Positionen von den Schnittstellen in den viralen
Polyproteinen unterscheiden, die von der maturen PR besonders effizient
gespalten werden. Zur Verdeutlichung wurden in der Auflistung der
Schnittstellen in den gag p55 und gag-pol p160 Polyproteinen die für eine
derartige Hypothese wesentlichen Aminosäuren in den
Aminosäuresequenzen 1) und 2) hervorgehobenen.
In in vitro Experimenten konnte weiterhin gezeigt werden, daß die
Schnittstelle 1) nur sehr ineffizient durch die mature PR gespalten wird
(3). Dies steht im Gegensatz zu einer bevorzugten Spaltung dieser
Schnittstelle in der initialen Phase, durch die mature PR und ist ein
weiteres Indiz für ein proteolytisch aktives gag-pol Dimer mit
abweichenden katalytischen Eigenschaften.
Übersicht über die Zusammensetzung von gag p55 und gag-pol p160. Die
Unterteilungsstriche entsprechen Schnittstellen.
PR: Protease, RT: Reverse Transcriptase, IN: Integrase, p7: NC.
Aufgrund einer -1 Rasterverschiebung (=frameshift) auf
Translationsebene entsteht ca. jedes zwanzigste Mal ein gag-pol
Polyprotein.
# Henderson et al. (1) kann in Viruspartikeln Proteine, die durch derartige
Schnittstellen entstehen, nachweisen. Er betont, daß bei der Abtrennung der
Nukleokapsiddomäne (NC) von p1 zwei Schnittstellen in Frage kommen, die beide
nur mit geringer Effizienz gespalten werden (#a, #b).
Da die Schnittstelle #a sich exakt am Ort des frameshift-Ereignisses befindet, sind die
Aminosäuren der Positionen P4, P3, P2, P1 im gag p55- und gag-pol p160 Polyprotein
identisch. Interessanterweise liegen trotz einer -1 Rasterverschiebung im gag-pol
Polyprotein Phe und Leu in P1′ und P2′ in in vitro Experimenten (zu 70%) vor (2),
obwohl bei Übersetzung der DNA-Sequenz, zweimal Phe in diesen Positionen
vorkommen müßte.
Aufgrund dieses Sachverhalts liegt es nahe, im gag-pol Polyprotein eine
Schnittstelle direkt am frameshift-Ort zu erwarten. Da diese Schnittstelle (#a)
aufgrund in vitro Untersuchungen, durch die mature PR nur ineffizient
geschnitten wird (3), läßt sich bei einer bevorzugten Prozessierung des gag-pol
Polyproteins an exakt der Verbindungsstelle von gag- und pol-Proteinen folgender
Schluß ziehen: In der initialen Phase, in der noch keine freigespaltene mature PR
existiert, spaltet das postulierte gag-pol-Dimer gag-pol Polyproteine bevorzugt an
einer von der maturen PR nur ineffizient gespaltenen Schnittstelle, was auf eine
leicht veränderte Substratspezifität des gag-pol-Dimers (oder abweichende
katalytische Konstanten) hinweist.
§ Die Bezeichnung der Positionen von Aminosäuren in einem Peptid mit Pn-Pn′,
bezüglich der Schnittstelle, stammt von Berger und Schechter (6).
Für die Entkopplung der Struktur- von den enzymatischen Proteinen
kommt nach Erkenntnissen aus in vitro Untersuchungen noch eine weitere
Schnittstelle im gag-pol Polyprotein, 8 Aminosäuren in Richtung C-
Terminus vom frameshift-Ort entfernt, in Frage (4). Diese lautet:
Da diese Experimente mit dem Laborstamm BH10 durchgeführt wurden,
in klinischen Isolaten (5) aber in der Position P1′ die Aminosäure Pro
dominiert, sollte diese Aminosäure in einem möglichen Inhibitor Vorrang
haben.
Aufgrund der Sequenzen 1) und 2) lassen sich die hier beschriebenen
neuartigen, speziell die initiale Prozessierung hemmenden, Inhibitoren
ableiten.
Inhibitorgrundschema:
- 1) Arg-Gln-Ala-Asn-Hydroxyethylen Isoster-Phe-Leu-Arg
bzw. - 2) Asp-Leu-Ala-Phe-Hydroxyethylamin-Pro-Gln-Gly
Mit Hilfe weiterer gezielter Modifikationen, die die Biokompatibilität,
Wasserlöslichkeit, Membrangängigkeit und inhibitorische Wirkung
betreffen, können basierend auf diesem Grundschema, die Inhibitoren
weiter optimiert werden.
Eine vorteilhafte Wirkung dieser gegen das proteolytisch aktive gag-pol-
Dimer gerichteten Inhibitoren sollte sich vor allem in Kombination mit
den bisherigen PR-Inhibitoren, die speziell gegen die mature 22Kda PR-
Form konzipiert wurden, einstellen. In dieser Kombination sollte es das
Virus (HIV-1) besonders schwer haben, durch neue Mutationen der
vermehrungshemmenden Wirkung dieser, sich synergistisch ergänzenden,
Inhibitoren zu entgehen.
Die initialen proteolytischen Ereignisse, die zur Bildung eines 114 KDa
Abbauprodukts führen, konnten durch einen potenten PR-spezifischen
Inhibitor bei einer Konzentration von 100 nM nicht gehemmt werden. Der
verwendete PR Inhibitor ist ein Peptidanalog und wurde aufgrund
bekannter Schnittstellen (Konsensussequenz: Asn-Phe * Pro) der maturen
PR konzipiert. Dabei wurde die Peptidbindung an der Schnittstelle durch
eine von der PR nicht hydrolysierbare Bindung ersetzt.
Für die initiale Schnittstelle, die das 114 KDa Intermediat erzeugt,
kommen aufgrund theoretischer Überlegungen sowie experimenteller
Daten lediglich zwei Sequenzen im gag-pol Polyprotein in Betracht. Beide
Sequenzen unterscheiden sich in wesentlichen Positionen von der
Aminosäure-Sequenz, nach denen der von uns verwendete PR Inhibitor
(sowie auch die gängigen anderen PR-Inhibitoren) erstellt wurde. D. h.
nachdem erstmals in infizierten Zellen ein derartiges 114 KDa
Abbauprodukt nachgewiesen werden konnte, welches einen wesentlichen
Schritt in der zymogenähnlichen Freispaltung der PR dokumentiert,
erscheint es sinnvoll, dieses initiale Ereignis (im Replikationszyklus von
HIV-1) mit neuartigen Inhibitoren zu hemmen.
Diese neuen Inhibitoren würden, wie die bisherigen kompetitiven PR
Inhibitoren, in erster Linie der Aminosäuresequenz ihrer Schnittstelle
entsprechen. Durch gezielte Modifikationen, der in der Regel 6-7
Aminosäure langen Peptide, ähnlich der Vorgehensweise bei den
bisherigen PR Inhibitoren (7-10), könnten diese neuen Inhibitoren
erzeugt werden.
Zitierte Literatur
(1) HENDERSON L. E., BOWERS M. A., SOWDER II R. C., SERABYN S. A., JOHNSON D., BESS J., ARTHUR L., BRYANT D., FENSELAU C. (1992) J. Virol. 66: 1856-1865
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(4) PHYLIP L., MILLS J., PARTEN B., DUNN B., KAY J. (1992) FEBS LETT. 314: 449-454
(5) LI Y., HUI H., BURGESS C., PRICE R., SHARP P., HAHN B., SHAW. (1992) J. Virol. 66: 6587-6600
(6) BERGER A., SCHECHTER I. (1970) Phil. Trans. R. Soc. London Ser. B. 257: 249-264
(7) MILLER M. et al. (1989) Science 246: 1149-1152
(8) DREYER G. B. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9752-9756
(9) ROBERTS N. A. et al. (1990) Science 248: 358-361
(10) MEEK T. D. et al. (1992) J. Enzyme Inhibition 6: 65-98
(1) HENDERSON L. E., BOWERS M. A., SOWDER II R. C., SERABYN S. A., JOHNSON D., BESS J., ARTHUR L., BRYANT D., FENSELAU C. (1992) J. Virol. 66: 1856-1865
(2) JACKS T., POWER M. D., MASIARZ F. R., LUCIW P. A., BARR P. J., VARMUS H. E. (1988) Nature 331: 280-283
(3) TÖZSER J., BLAHA I., COPELAND T. D., WONDRAK E. M., OROSZLAN S. (1991) FEBS Lett. 281: 77-80
(4) PHYLIP L., MILLS J., PARTEN B., DUNN B., KAY J. (1992) FEBS LETT. 314: 449-454
(5) LI Y., HUI H., BURGESS C., PRICE R., SHARP P., HAHN B., SHAW. (1992) J. Virol. 66: 6587-6600
(6) BERGER A., SCHECHTER I. (1970) Phil. Trans. R. Soc. London Ser. B. 257: 249-264
(7) MILLER M. et al. (1989) Science 246: 1149-1152
(8) DREYER G. B. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9752-9756
(9) ROBERTS N. A. et al. (1990) Science 248: 358-361
(10) MEEK T. D. et al. (1992) J. Enzyme Inhibition 6: 65-98
Ergänzende Erläuterungen zu Grafik 1 und den Bildern 1-3:
zu Grafik 1: Reaktivität der einzelnen Antiseren im Western Blot mit den intermediären Abbauprodukten des gag-pol Polyproteins von HIV-1. Aufgrund der Reaktionsmuster konnte die bei ca. 114 KDa im SDS-PAGE laufende Bande, dem intermdiären Abbauprodukt p114 zugeordnet werden.
zu Bild 1: Während in frisch infizierten, PR-Inhibitor behandelten Zellen im hochmolekularen Bereich das ungespaltene gag-pol Polyprotein (p164) und das gag-pol Abbauprodukt p114 vorherrschen, dominieren in frisch infizierten Zellen zum gleichen Erntezeitpunkt die Abbauprodukte p107 und p97 (deutlicher zu sehen im rechten Western Blot). Die diffuse Bande bei ca. 160 KDa konnte in einem hier nicht gezeigten Western Blot als gp120/gp160 identifiziert werden.
zu Bild 2: Das zusammengefaßte Ergebnis dieser Western Blots ist in Grafik 1 dargestellt.
zu Bild 3: In PR-Inhibitor behandelnten Zellen (I) ist keinerlei freigsspaltene PR (monomere Form, 10 KDa) im Gegensatz zu infizierten Zellen (+) nachweisbar.
zu Grafik 1: Reaktivität der einzelnen Antiseren im Western Blot mit den intermediären Abbauprodukten des gag-pol Polyproteins von HIV-1. Aufgrund der Reaktionsmuster konnte die bei ca. 114 KDa im SDS-PAGE laufende Bande, dem intermdiären Abbauprodukt p114 zugeordnet werden.
zu Bild 1: Während in frisch infizierten, PR-Inhibitor behandelten Zellen im hochmolekularen Bereich das ungespaltene gag-pol Polyprotein (p164) und das gag-pol Abbauprodukt p114 vorherrschen, dominieren in frisch infizierten Zellen zum gleichen Erntezeitpunkt die Abbauprodukte p107 und p97 (deutlicher zu sehen im rechten Western Blot). Die diffuse Bande bei ca. 160 KDa konnte in einem hier nicht gezeigten Western Blot als gp120/gp160 identifiziert werden.
zu Bild 2: Das zusammengefaßte Ergebnis dieser Western Blots ist in Grafik 1 dargestellt.
zu Bild 3: In PR-Inhibitor behandelnten Zellen (I) ist keinerlei freigsspaltene PR (monomere Form, 10 KDa) im Gegensatz zu infizierten Zellen (+) nachweisbar.
Claims (2)
1. Stoffanspruch: Inhibitoren 1) und 2) zur Hemmung der initialen
Spaltung des gag-pol p160 Polyproteins von HIV-1, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß sie folgende Zusammensetzung besitzen:
Die unterstrichenen Gruppen sind lediglich Beispiele und durch Gruppen
vergleichbarer Funktion ersetzbar.
Modifikation 1: Durch Verknüpfung der in Position P1 und P1′ befindlichen Aminosäuren über ein Hydroxyethylen Isoster (Mod. 1a) oder eine Hydroxyethylamin-Gruppe (Mod. 1b) oder weitere Gruppen vergleichbarer Funktion, werden 2 Ziele erreicht: a) die in dieser Position befindliche Peptidbindung wird durch eine von einer Protease nicht spaltbare Verbindung ersetzt; b) diese neu eingeführte Verbindung ähnelt dem während der proteolytischen Reaktion von dem Substrat eingenommenen Übergangszustand. Dadurch wird eine besonders hohe Verweildauer des Inhibitors im aktiven Zentrum der Zielprotease erreicht.
Modifikation 2: Hinzufügen geeigneter Gruppen, um die Wasserlöslichkeit bzw. Membrangängigkeit des Inhibitors zu verbessern. Zum Beispiel: Hinzufügen einer Acetyl-Gruppe (Mod. 2a) an den N-Terminus des Peptidanalogs sowie einer OCH3-Gruppe (Mod. 2b) an den C-Terminus.
Modifikation 3: (Wahlweise falls die Ki-Werte für die Heptamer- Peptidanaloga nicht klein genug sind.) Aus Gründen der Stabilität, Membrangängigkeit sowie Biokompatibilität und einfacheren Herstellung ist es sinnvoll, sowohl die Größe als auch den Peptidcharakter der Inhibitoren zu minimieren.
Bei dieser Vorgehensweise gibt es zwei Möglichkeiten:
Modifikation 1: Durch Verknüpfung der in Position P1 und P1′ befindlichen Aminosäuren über ein Hydroxyethylen Isoster (Mod. 1a) oder eine Hydroxyethylamin-Gruppe (Mod. 1b) oder weitere Gruppen vergleichbarer Funktion, werden 2 Ziele erreicht: a) die in dieser Position befindliche Peptidbindung wird durch eine von einer Protease nicht spaltbare Verbindung ersetzt; b) diese neu eingeführte Verbindung ähnelt dem während der proteolytischen Reaktion von dem Substrat eingenommenen Übergangszustand. Dadurch wird eine besonders hohe Verweildauer des Inhibitors im aktiven Zentrum der Zielprotease erreicht.
Modifikation 2: Hinzufügen geeigneter Gruppen, um die Wasserlöslichkeit bzw. Membrangängigkeit des Inhibitors zu verbessern. Zum Beispiel: Hinzufügen einer Acetyl-Gruppe (Mod. 2a) an den N-Terminus des Peptidanalogs sowie einer OCH3-Gruppe (Mod. 2b) an den C-Terminus.
Modifikation 3: (Wahlweise falls die Ki-Werte für die Heptamer- Peptidanaloga nicht klein genug sind.) Aus Gründen der Stabilität, Membrangängigkeit sowie Biokompatibilität und einfacheren Herstellung ist es sinnvoll, sowohl die Größe als auch den Peptidcharakter der Inhibitoren zu minimieren.
Bei dieser Vorgehensweise gibt es zwei Möglichkeiten:
- a) Verzicht auf die in Position P4 befindliche Aminosäure. In vergleichbaren HIV-1 PR Inhibitoren konnte durch diese Beschränkung auf ein Hexamer der Ki-Wert von Peptidanaloginhibitoren verbessert werden. Generell sollte sich bei Heptamer- oder Hexamerinhibitoren die OH-Gruppe des Übergangszustandes in der (S) Konfiguration befinden.
- b) Reduzierung des Inhibitors auf die in Position P2, P1 und P1′ befindlichen Aminosäuren. Bei einem derart verkürzten Peptidanalog sind zur Optimierung des Ki-Wertes allerdings weitere Modifikationen erforderlich. So hat sich bei HIV-1 PR Inhibitoren das Hinzufügen einer quinoline-2-carbonyl Gruppe am Aminoterminus des Tripeptids bewährt. Bei Tripeptidanaloga sollte sich die OH-Gruppe des Übergangszustandes in der (R) Konfiguration befinden.
2. Verwendung der nach Anspruch 1 definierten Inhibitoren als
Arzneimittel, um die Vermehrung von HIV-1 in infizierten Personen zu
hemmen.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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| Country | Link |
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| DE (1) | DE4332395A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997012907A1 (en) * | 1995-10-05 | 1997-04-10 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Peptide inhibitor for viral protease derived from the transframe region of the gag-pol gene |
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| EP0374098A2 (de) * | 1988-12-15 | 1990-06-20 | Ciba-Geigy Ag | Retrovirale Proteasehemmer |
| EP0374097A2 (de) * | 1988-12-15 | 1990-06-20 | Ciba-Geigy Ag | Verwendung von Peptidisosteren als retrovirale Proteasehemmer |
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| US5872210A (en) * | 1995-10-05 | 1999-02-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Transframe peptide inhibitor of viral protease |
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