DE4313094A1

DE4313094A1 - Lasermikroskopie

Info

Publication number: DE4313094A1
Application number: DE4313094A
Authority: DE
Inventors: Gernot K Brueck
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-04-22
Filing date: 1993-04-22
Publication date: 1994-10-27
Also published as: WO1994024600A1; JPH09500218A; EP0695432A1; US5764364A

Description

Zur Vergrößerung und Untersuchung von Objekten und Oberflächen von Objekten im Subminiaturbereich werden unterschiedliche Geräte eingesetzt. So werden dazu z. B. Lichtmikroskope, Elektronenmikroskope oder Rasterelektronenmikroskope etc. be nutzt.

Diese Geräte sind sattsam bekannt und brauchen hier nicht im Einzelnen aufgeführt werden.

Aber übliche Lichtmikroskope ohne weitere Elektronik fallen dann aus, wenn es darum geht, das aufgenommene Bild noch auszuwerten und Aussagen darüber zu entwickeln.

Die hierzu notwendige Elektronik, meistens eine CCD-Kamera ist recht aufwendig und die Auswertungslogik, also der dazu notwendige Rechner und das Programm, sind selten so eingerichtet, daß reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten sind.

Bei auswertenden Geräten, wo überwiegend bereits das Bild elektronisch erzeugt wurde, handelt es sich immer um sehr komplexe, sehr aufwendige und vor allem sehr teure Systeme.

Problem

Die bei der Vergrößerung und Auswertung auftretenden Probleme sind mannigfaltig und abhängig vom verwendeten Verfahren.

Bei der am häufigsten verwendeten Lichtmikroskopie kann, wie zuvor dargestellt nur mit einer aufgesetzten CCD-Kamera und einem sich anschließenden Imageprocessing eine Auswertung des aufgenommenen Bildes vollzogen werden.

Ein weiteres Problem ist der kleine Raumwinkel unter dem mit diesem und auch anderen Systemen detektiert wird. Dies gilt in gleicher Weise für alle anderen Systeme, die mit Linsen oder linsenähnlichen Objektiven ausgerüstet sind.

Bei anderen Vergrößerungssystemen müssen die Objekte speziell präpariert werden, so z. B. durch Aufdampfung eines Metallfilms. Dies bedeutet nicht nur einen erheblichen Aufwand, sondern auch einen Ausschluß verschiedener Objekte für die Präpration. Auch hier ist weiterhin die Fläche, auf der detektiert wird, erheblich eingeschränkt.

Sonstige Rasteraufnahmen sind ebenfalls nur entweder bei präparierten oder stofflich geeigneten Proben möglich.

Die Untersuchung von organischen, elastischen und isolierenden Objekten ist bisher nur mit der Lichtmikroskopie möglich.

Problemlösung

Es gilt nun ein Verfahren zu entwickeln, bei dem alle Arten von Objekten berührungs los und unpräpariert vergrößert werden können und eine große Fülle von Informatio nen zur Auswertung zur Verfügung stehen.

Auch sollte es mit gewissen Beschränkungen möglich sein, Objekte auch dicht unter einer Wasseroberfläche entsprechend zu vergrößern und eine Auswertung zu vollziehen.

Die Lasermikroskopie

Das erfindungsgemäße Verfahren der Lasermikroskopie mit dem Einsatz von einer oder auch zwei halbkugelförmigen Auswertungsflächen bietet eine ideale Problemlösung.

Ein Laserstrahl wird mit einer Aufweitungsoptik auf die notwendige Strahlbreite eingestellt und dann mit einer Linse geringer Brennweite im Fokus auf den minimal möglichen Durchmesser gebündelt.

Da dieser zum einen durch die Wellenlänge des Laserlichtes begrenzt ist und zum anderen durch die Parameter Strahldurchmesser vor der Linse und Brennweite der Linse bestimmt wird, sind mit Lasern im sichtbaren Bereich Strahldurchmesser von ca. 1000 nm entsprechend 1 µm im Fokus zu erreichen.

Dies alleine ist aber nicht ausreichend eine genügend auflösende Vergrößerung zu erzielen, insbesondere nicht bei der Auswertung und Analyse von organischen Objekten, so z. B. bei der Analyse von Erythrozyten. Hier ist es unabdingbar weitere Informationen auszuwerten.

Um dies durchzuführen ist es erforderlich in einem möglichst großen Raumwinkel alle Lichterscheinungen bei der Bestrahlung des Objekts mit dem hochgebündelten Laserstrahl zu erfassen und hierüber tief in die Oberflächenstruktur des zu untersu chenden Partikels einzudringen.

So wird mittels mechanischer Vorrichtungen oder auch optoelektrischer Systeme der fokussierte Strahl über den Objektträger bewegt und auf diese Weise das Objekt ausgemacht und voranalysiert. Die Schrittweite sollte dabei nicht den Strahldurch messer überschreiten.

Um den Fokuspunkt herum wird eine Halbkugel oberhalb des Objektträgers und bei transparenten Obejektträgern auch unterhalb des Objektträgers angebracht, deren Mittelpunkt resp. -punkte sich im Fokuspunkt des Laserstrahls befindet resp. befinden.

Innerhalb der Halbkugeln sind in einem regelmäßigen Raster direkt oder indirekt Fotosensoren angebracht.

Da die Auslesung einzelner Fotosensoren, wie z. B. Fotoelemente nur mit erheblichem Aufwand an Elektronik und vor allem an Zeit möglich ist, bietet sich der Einsatz von indirekten Fotosensoren an. Diese bestehen aus feinen Lichtleitfasern, die von den einzelnen Meßpunkten auf der Halbkugeloberfläche ausgehen und zu einer oder bei Bedarf auch mehreren Zeilen gebündelt werden.

Diese Zeilen enden dann auf einer linearen CCD. Auf diese Weise werden die Hellig keiten an den verschiedenen Punkten der inneren Oberfläche der Halbkugel auf eine oder mehrere CCD-Zeilen abgebildet, wobei jeder Pixel oder jede Pixelgruppe der CCD für eine ganz bestimmte Position auf der Halbkugel steht.

Sollten sich scharf begrenzte und nahezu punktuelle Intensitäten auf der Kugelober fläche ergeben, die räumlich zwischen den einzelnen Aufnahmepunkten liegen und somit mit der festgelegten Rasterung auf der Halbkugeloberfläche nicht erfaßbar sind, dann müssen die Felder, die sich um den Aufnahmepunkt herum ergeben mit speziel len Kollektorflächen ausgerüstet werden.

Diese können entweder aus kleinen Sektorflächen bestehen die aus einem geeigneten Streumaterial gefertigt sind, wobei die auf diese kleinen Sektorflächen auftreffende Intensität zur Aufhellung des gesamten Flächenelementes führt und mittels der Foto sensoren resp. Lichtleiterfasern diese Gesamthelligkeit gemessen wird.

Eine andere Möglichkeit ist der Einsatz von transparenten Materialien, wobei das Flächenelement über eine bestimmte Strecke auf die Lichtleiterquerschnittsfläche verjüngt wird. Durch Mehrfachreflexion wird dann das eintretende Licht in die Lichtleitfaser geführt.

Die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung geschaffenen halbkugelförmigen Detektierflächen um den Fokuspunkt herum ermöglicht nun eine umfassende Auswertung des reflektierten und vor allem des gestreuten Lichtes.

Auf diese Weise lassen sich nicht nur alle Objekte bis zur Größe des minimalen Strahl durchmessers genau vermessen und auswerten, sondern auch die Oberflächenstruktur läßt sich durch die Streulichtauswertung analysieren.

Dies insbesondere dann, wenn ein linear polarisierter Laser eingesetzt wird und dadurch besonders charakteristische Streulichtverteilungen erzielt werden. Deren Auswertung läßt Aussagen auch über extrem kleine Strukturen zu.

Somit können Strukturanalysen bis zu einigen nm herab durchgeführt werden.

Durch den Einsatz von Piezoelementen bei den Umlenkspiegeln und bei der Linsen halterung können einerseits sehr kleine Strukturen abgefahren und erfaßt werden und andererseits sehr schnell dadurch nachjustiert werden, indem der Fokuspunkt gesenkt oder gehoben wird.

Da die Messung im maximal möglichen Raumwinkel erfolgt, kann sowohl die Form größerer Körper abgetastet, vermessen und berechnet werden, als auch deren Ober flächenbeschaffenheit aus dem Streulicht abgelesen werden.

Aufgrund der berührungslosen Messung von nicht speziell präparierten Objekten bietet sich der Einsatz besonders im Bereich der serologischen Diagnostik an.

Hier ist es Aufgabe des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Oberflächen von Erythrozyten zu vermessen und deren Belegung mit Antikörpern zu quantifizieren.

Da es sich bei allen verwendeten Elementen um recht preisgünstige Massenfabrikate handelt, bleibt auch der Preis des Gesamtsystems in Grenzen und liegt weit unter dem vergleichbarer Meßsysteme.

Beschreibung

Anhand der Fig. 1 und 2 wird eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.

Anhand der Fig. 3 bis 9 wird eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung beschrieben.

So werden in den Fig. 1 und 2 die folgenden Einzelheiten dargestellt:
Der Laserstrahl aus dem Laser 1 gelangt über den Umlenkspiegel 2 in die Aufweitungsoptik 3. Hier wird der Strahl aufgeweitet. Dieser aufgeweitete Strahl 4 trifft auf die Fokussierlinie 5 und wird auf den Fokuspunkt 7 gebündelt. Mit dem auf den kleinstmöglichen Durchmesser fokussierten Strahl wird der Objektträger 8 in den beiden möglichen Richtungen der Ebene abgerastert.

Hierbei entstehen Reflexionen und Streuungen 6, die dann auf eine halbkugelige Fläche 9 fallen und dort detektiert werden.

In den Fig. 3 bis 9 sind die folgenden Einzelheiten dargestellt:

Auf der Aufnahmehalbkugel 9 befinden sich in einem gleichen Abstand voneinander oder in Sektoren aufgeteilten Abständen die Lichtaufnahmepositionen 19. In diese Positionen führen von der Halbkugeloberfläche 20 entweder direkt die Lichtleitfasern 21 in das Innere der Halbkugel oder dies geschieht über Lichtkollektoren gem. Fig. 8 oder Fig. 9.

Bei diesen Lichtkollektoren handelt es sich entweder um eine Streuscheibe 27, die in einem Rahmen 28 eingepaßt ist oder um einen sich auf den Lichtleitfaserdurchmesser verjüngenden Sektorteil 29 aus einem transparenten Material, wobei beim Ersteren die sich einstellende Gesamthelligkeit der Streuscheibe gemessen wird und beim Zweiteren das Licht über Mehrfachreflexionen zur Lichtleitfaser 21 gelangt.

Die Lichtleitfasern 21 münden auf der linearen CCD 22 und sitzen auf der Glasscheibe 24 der CCD auf. Eine Halterung 23 stellt sicher, daß die Lichtleitfasern 21 direkt über der Pixelreihe 25 gehalten werden.

Über die Anschlußpinne 26 gelangen die Informationen in den nicht dargestellten Rechner.

Um den Strahl 4 schneller und unter Rechnerkontrolle zu führen, wird der Strahl über den Horizontalspiegel 17 und Vertikalspiegel 18 geführt. Diese Spiegel bestehen dann jeweils aus der Spiegelaufnahme 15, auf dem der Spiegelkörper 10 mit seiner Reflektionsschicht 11 in der Weise aufliegt, daß eine Kante des Spiegelkörpers in einem elastischen Kunststoff 12 eingebettet ist und auf der gegenüberliegenden Seite über die Klebeschicht 14 auf dem Piezoelement 13 aufliegt. Durch die Veränderung der an das Piezoelement angelegten Spannung verändert sich dessen Form, wodurch sich eine Lageveränderung des Spiegels ergibt und zwar in der Weise, daß sich der Spiegel um die in Kunststoff gelagerte Kante dreht.

In ähnlicher Weise läßt sich die Feinfokussierung erreichen, indem die Fokuslinse 5 in einem Kunststoffring 19 gehalten wird, welcher auf Piezoelementen 13 aufliegt. Die Piezoelemente liegen auf der Linsenhalterung 16 auf.

Durch eine Spannungsveränderung an allen die Linse tragenden Piezoelementen ergibt sich auch eine Lagerveränderung der Linse, wodurch der Fokuspunkt gehoben oder gesenkt werden kann.

Claims

1. Verfahren der Lasermikroskopie dadurch gekennzeichnet, daß Proben mit einem auf den kleinstmöglichen Durchmesser fokussierten Laserstrahl angestrahlt werden und Lichtreflexionen und Lichtstreuungen in einem sehr großen Raumwinkel erfaßt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der Reflexionen und Streuungen auf einer halbkugelförmigen Fläche erfaßt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung auf einer kugelförmigen Fläche erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die erfaßten Intensitätsverteilungen in einem Rechner ausgewertet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Laserstrahl ein Teilstrahl zur Kompensation von Intensitätsschwankungen über einen Teilerspiegel herausgeführt wird.

6. Vorrichtung eines Lasermikroskops dadurch gekennzeichnet, daß der Laserstrahl erst über eine Aufweitungsoptik auf einen größeren Strahldurchmesser aufgeweitet wird und dann mit einer Linse geringer Brennweite auf einen möglichst kleinen Strahldurchmesser fokussiert wird, die Erfassung der Intensitäten auf einer oder zwei inneren Oberflächen von Halbkugelschalen mit direkten oder indirekten Fotosensoren erfolgt und das Objekt mechanisch unter dem Fokuspunkt in beiden Richtungen bewegt wird und/oder der Strahl optoelektrisch über das Objekt geführt wird und die Meßwerte in einem Rechner ausgewertet werden.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtsensoren Lichtleitfasern eingesetzt werden, die auf einer oder mehreren linearen CCD′s führen und die Pixel oder Pixelgruppen jeweils für eine bestimmte Position auf der Halbkugelfläche stehen und die dort auftretenden Lichtquanten verarbeiten.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß der Laserstrahl über Umlenkspiegel geführt wird, deren Winkelstellung durch Anlegung von Spannungen an Piezoelemente verändert werden kann.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß als Klebe- und Befestigungsmaterialien der Spiegel und der Verbindung mit den Piezoelementen elastische Kunststoffe eingesetzt werden.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 dadurch gekennzeichnet, daß der Objektträger mechanisch in allen beiden Richtungen der Ebene über Schrittmotore bewegt wird.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierlinse mechanisch oder elektromechanisch auf- und abwärts geführt werden kann.