DE4240801A1

DE4240801A1 - Staphylo-kinase (SAK) sequences lacking sequences for signal peptide(s)

Info

Publication number: DE4240801A1
Application number: DE4240801A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr Hartmann; Bernhard Dr Schlott; Karl-Heinz Dr Guehrs; Eckhard Dr Birch-Hirschfeld; Detlev Prof Dr Behnke
Original assignee: INST MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE
Current assignee: Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Priority date: 1992-12-01
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 1994-06-09

Abstract

DNA sequences for staphylokinase (SAK)-polypeptides are plasminogen activators lacking sequences for signal peptides, pref. the specified 414 base pair sequences or their derivs. Also claimed are (i) expression plasmids contg. the above, (i), (ii) host cells carrying (ii) capable of expressing active SAK-polypeptides, pref. E. col or Bacillus spec., (iii) SAK-polypeptides prodn. methods pref. by application to an ion exchange column, elution with aq. NACl treatment with hydrophobic interaction chromatography and isolation of the polypeptides, (iv) SAK polypeptides of the protein sequences shown, (v) pharmaceutical combinations against (ii), (vii) hybridomas ZIM0511 and ZIM0512, and (viii) pharmaceutical compsns. contg. (vi).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst DNA-Sequenzen, die für neuartige methioninfreie Plasminogenaktivatoren kodie ren, welche spezifisch abgewandelten Formen des nativen bakte riellen Proteins Staphylokinase 42D (Kurzbezeichnung SAK42D) entsprechen und wie diese reife Wildtyp-SAK eine Moleküllänge von 136 Aminosäuren aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Plasmide, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen mit hochwirksamen Expressionssignalen koppeln (generelle Kurz bezeichnung für diese Plasmidvektoren: sakM26X-rekombinante Ex pressionsplasmide). Die Erfindung betrifft damit folgerichtig auch ausgewählte E. coli-Stämme, die nach Transformation mit jeweils einem dieser Expressionsplasmide bei ihrer Kultivierung zur Biosynthese der erwähnten neuartigen Plasminogenaktivatoren befähigt sind. Die Erfindung betrifft schließlich auch die Ver wendung der auf mikrobiellem Wege hergestellten neuartigen Plasminogenaktivatoren in der thrombolytischen Therapie.The present invention initially relates to DNA sequences, the code for novel methionine-free plasminogen activators ren, which specifically modified forms of the native bacts Rial protein Staphylokinase 42D (short name SAK42D) correspond and like this mature wild-type SAK a molecular length of 136 amino acids. The invention further relates to recombinant plasmids containing the DNA sequences according to the invention couple with highly effective expression signals (general short Name for these plasmid vectors: sakM26X-recombinant Ex pressure plasmids). The invention consequently relates also selected E. coli strains, which after transformation with each one of these expression plasmids in their cultivation for the biosynthesis of the novel plasminogen activators mentioned are qualified. Finally, the invention also relates to the Ver the use of the novel, microbially produced Plasminogen activators in thrombolytic therapy.

Staphylokinase, ein Protein aus Staphylococcus aureus-Stäm men, ist, wie man seit den Pionieruntersuchungen von CH. LACK (Nature, vol. 161 (1948), 559-560) sowie von K. C. ROBBINS et al. (J. Biol. Chem., vol. 242 (1967), 2333-2342) und von K. W. JACKSON et al. (Methods in Enzymology, vol. 80 (1981), 387) weiß, in der Lage, die Umwandlung des im humanen Blutplasma lo kalisierten Proenzyms Plasminogen in das fibrinolytisch aktive Enzym Plasmin zu vermitteln, ohne selbst proteolytische Aktivi tät aufzuweisen. Der Mechanismus der Aktivierung ist dabei noch weitgehend unklar.Staphylokinase, a protein from the Staphylococcus aureus strain men, is how one has since the pioneering investigations of CH. PAINT (Nature, vol. 161 (1948), 559-560) and by K.C. ROBBINS et al. (J. Biol. Chem., Vol. 242 (1967), 2333-2342) and by K.W. JACKSON et al. (Methods in Enzymology, vol. 80 (1981), 387) knows able to transform the lo in human blood plasma calibrated proenzyme plasminogen in the fibrinolytically active To convey enzyme plasmin without proteolytic activi act. The mechanism of activation is still there largely unclear.

Das Anwendungsgebiet für die finalen Sachobjekte der Ge samterfindung liegt somit in der Humanmedizin; das Anwendungs gebiet für ihre Verfahrensteile liegt hingegen in jenem Sektor der pharmazeutischen Forschung und Industrie, in dem eine Wirk stoffgewinnung auf mikrobiellem Wege betrieben wird.The area of application for the final property objects of Ge overall invention thus lies in human medicine; the application The area for their process parts, however, lies in that sector pharmaceutical research and industry in which an effective material production is operated microbially.

In der wissenschaftlichen Literatur sind bislang zwei für Staphylokinase kodierende Gene beschrieben, die in dem einen Falle aus dem Staphylococcus aureus-Phagen PhiC (T. SAKO et al., Mol. Gen. Genet., 190 (1983), 271-277; T. SAKO und N. TSUCHIDA, Nucl. Acids Res., 11 (1983), 7679-7693; vergleiche auch Patentschrift EP 0 077 664) und in dem anderen Falle aus dem Staphylococcus aureus-Phagen Phi42D (vergleiche Patent schrift DD 2 45 444 sowie D. BEHNKE und D. GERLACH, Mol. Gen. Genet., 210 (1987), 528-534) isoliert, jeweils auf dem E. coli- Plasmid pBR322 primärkloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse identifiziert wurden. Das für das Protein SAK-C kodierende Gen wurde nach Umklonierung in ein E. coli-Expressionssystem in dem E. coli-Stamm WA802 überexprimiert (EP 0 077 664; T. SAKO, Eur. J. Biochem., vol. 149 (1985), 557-563).So far, two are in the scientific literature for Genes encoding staphylokinase are described in one Trap from the Staphylococcus aureus phage PhiC (T. SAKO et al., Mol. Gen. Genet., 190: 271-277 (1983); T. SAKO and N. TSUCHIDA, Nucl. Acids Res., 11 (1983), 7679-7693; compare also patent EP 0 077 664) and in the other case the Staphylococcus aureus phage Phi42D (see patent DD 2 45 444 as well as D. BEHNKE and D. GERLACH, Mol. Gen. Genet., 210 (1987), 528-534) isolated, in each case on the E. coli Plasmid pBR322 primary cloned and by means of DNA sequence analysis were identified. The gene coding for the SAK-C protein was after cloning in an E. coli expression system in the E. coli strain WA802 overexpressed (EP 0 077 664; T. SAKO, Eur. J. Biochem., Vol. 149: 557-563 (1985)).

Das für SAK42D kodierende Gen hingegen wurde sowohl auf gramnegative als auch auf grampositive Plasmidvektoren kloniert und in Escherichia coli, Bacillus subtilis sowie Streptococcus sanguis exprimiert (siehe wiederum Patentschrift DD 2 45 444 und D. BEHNKE und D. GERLACH, Mol. Gen. Genet., 210 (1987), 528-534).The gene coding for SAK42D, however, was both on cloned gram negative as well as gram positive plasmid vectors and in Escherichia coli, Bacillus subtilis and Streptococcus sanguis (see again patent specification DD 2 45 444 and D. BEHNKE and D. GERLACH, Mol. Gen. Genet., 210 (1987), 528-534).

Das Gen der reifen SAK42D unterscheidet sich von dem Gen der reifen SAK-C durch 3 natürliche Basenaustausche an den Nu kleotidpositionen 33, 106 und 130 bei ansonsten gleicher Se quenz in den kodierenden Genen. Die Austausche an den Positio nen 106 sowie 130 führen dabei zu einer Änderung der Proteinse quenz (Aminosäure Arginin an den Stellen 36 und 43 bei SAK42D; statt dessen Aminosäuren Glycin und Histidin an diesen Stellen bei SAK-C), wodurch beispielsweise ein verändertes isoelektri sches Verhalten der beiden Staphylokinasen bewirkt wird [p(i) SAK42D = 8,86; p(i) SAK-C = 6,16].The mature SAK42D gene is different from the gene the mature SAK-C through 3 natural base changes to the nu Kleotide positions 33, 106 and 130 with otherwise identical Se sequence in the coding genes. The exchanges at the position NEN 106 and 130 lead to a change in the proteins quenz (amino acid arginine at positions 36 and 43 in SAK42D; instead, amino acids glycine and histidine at these sites at SAK-C), for example, a changed isoelectric behavior of the two staphylokinases [p (i) SAK42D = 8.86; p (i) SAK-C = 6.16].

Die technische Lösung der Biosynthese wird für beide SAK- Wildtypen den voranstehend angegebenen Quellen zufolge jeweils nach dem Prinzip der sekretorischen Produktherstellung reali siert. Die SAK42D wird dabei in erster Linie (vgl. Patent schrift DD 2 45 444) aus Bacillus subtilis-Kulturüberständen isoliert, wobei die Expression durch das Plasmid pDB15 vermit telt wird. Dieses Verfahren ist jedoch mit dem Nachteil unbe friedigender Expressionshöhen behaftet.The technical solution of biosynthesis is used for both SAK Wild types according to the sources given above according to the principle of secretory product manufacturing reali siert. The SAK42D is primarily used (see patent document DD 2 45 444) from Bacillus subtilis culture supernatants isolated, the expression by the plasmid pDB15 is communicated. However, this method is disadvantageous with the disadvantage peaceful expression levels.

Gemäß Patentschrift EP 0 077 664 wird die SAK-C nach ther misch induzierter Überexpression, vermittelt durch das Plasmid pTS301 vorwiegend aus dem Periplasma von lysierten E. coli WA802-Zellen in geringen Ausbeuten gewonnen. Zusätzlich ist an zumerken, daß sich die thermische Induktion einer Protein-Bio synthese unter technischen Fermentationsbedingungen nach wie vor gleichermaßen aufwendig wie unpräzise handhaben läßt.According to patent specification EP 0 077 664, the SAK-C according to ther mix-induced overexpression mediated by the plasmid pTS301 predominantly from the periplasm of lysed E. coli WA802 cells obtained in low yields. Additionally is on note that the thermal induction of a protein bio synthesis under technical fermentation conditions as before can be handled just as complex as imprecise.

Alle bisher beschriebenen Verfahren zur Herstellung von mi krobiellen Plasminogenaktivatoren sind ausnahmslos an die Ex pression natürlich vorgegebener Gensequenzen gebunden. Bekannt ist jedoch seit kurzem eine erfinderische Lösung (gegenwärtig noch Patentanmeldung DE-P 41 43 279.7; zum Zeitpunkt der Offen legung dieser Erfindung aber bereits DE-OS 41 43 279), die auf mikrobiellem Wege (und dabei unter Einsatz prokaryotischer re kombinanter Produzentenstämme) nach dem Prinzip der intrazellu lären Expression eine effiziente Herstellung sowohl von reifer Wildtyp-SAK42D als auch von N- bzw. C-terminal verkürzten For men dieser nativen SAK ermöglicht. Dabei enthält unter anderem die für das reife SAK42D-Protein kodierende DNA-Sequenz nunmehr jedoch labormäßig gefertigte Teilabschnitte, mit deren Hilfe in dieser Sequenz neben der Einfügung eines ATG-Startkodons (als Ersatz für den DNA-Abschnitt, der im ursprünglichen Gen für das zur Sekretion erforderliche Signalpeptid kodiert) an günstigen Positionen außerdem zusätzliche singuläre Restriktionsspaltorte angelegt werden konnten. Insbesondere wurde dabei an der Posi tion 389 der DNA-Sequenz erstmals zweckgerichtet eine stille Punktmutation eingeführt, um einen Spaltort für die Restriktase StyI zu erhalten.All previously described processes for the production of mi crobial plasminogen activators are without exception to the Ex pression of naturally predetermined gene sequences. Known has recently become an inventive solution (currently still patent application DE-P 41 43 279.7; at the time of the open laying of this invention but already DE-OS 41 43 279) on microbial pathway (using prokaryotic re combined producer strains) according to the principle of intracellular lar expression an efficient production of both mature Wild-type SAK42D as well as For enables this native SAK. It contains among other things the DNA sequence coding for the mature SAK42D protein now however, laboratory-made sections, with the help of this sequence in addition to the insertion of an ATG start codon (as Replacement for the DNA section that is in the original gene for the encoded signal peptide required for secretion) at favorable Positions also additional singular restriction sites could be created. In particular, the Posi tion 389 of the DNA sequence is a silent for the first time Point mutation introduced to a restriction site for the restriction Get StyI.

Auch noch in anderer Hinsicht determiniert die technische Lösung aus der Schrift DE-P 41 43 279.7 bzw. DE-OS 41 43 279 für den Verfahrensteil der hier vorliegenden Gesamterfindung den Stand der Technik: So bleibt nicht nur die Produktsynthese nach dem Prinzip der intrazellulären Expression auch in der ge genwärtigen Erfindung schlechthin das Herstellungsverfahren der Wahl; vielmehr wird darüber hinaus Wert darauf gelegt, die für die nunmehrigen Zielproteine kodierenden DNA-Sequenzen wiederum unter dem Einfluß sogenannter RtacR-Konfigurationen von Expres sionskontrollsignalen zu exprimieren, womit für die Produktge winnung ebenfalls die dort gewählte vorteilhafte Variante der chemischen Induktion herangezogen werden kann. Im Gefolge die ser beiden Festsetzungen gibt die technische Lösung gemäß P 41 43 279.7/DE-OS 41 43 279 für den Verfahrensabschnitt der ge genwärtigen Gesamterfindung weiterhin in Hinsicht auf die Aus wahl der einzusetzenden bakteriellen Produzentenorganismen (nämlich Rückgriff auf Stamm E. coli TG1), in Hinsicht auf das Fermentationsregime sowie in Hinsicht auf das Teilverfahren der Aufarbeitung der erhaltenen Kulturbrühen (Kombination von Ionenaustausch- und Hydrophob-Interaktion-Chromatographie nach Zellaufschluß) den Maßstab vor.The technical also determines in other respects Solution from the document DE-P 41 43 279.7 or DE-OS 41 43 279 for the process part of the present invention the state of the art: this does not just mean product synthesis according to the principle of intracellular expression also in the ge present invention par excellence the manufacturing process of Choice; rather, it is also important that those for the DNA sequences which now encode the target proteins under the influence of so-called RtacR configurations from Expres Sions control signals to express what the product winnung also the advantageous variant of the chemical induction can be used. In the wake of the These two stipulations provide the technical solution in accordance with P 41 43 279.7 / DE-OS 41 43 279 for the procedural section of ge current overall invention continues in terms of off choice of bacterial producer organisms to be used (namely recourse to strain E. coli TG1) with regard to the Fermentation regime and with regard to the partial process of Processing of the culture broths obtained (combination of Ion exchange and hydrophobic interaction chromatography after Cell disruption) the scale.

Die Erfindung verfolgt die Zielstellung, für die thromboly tische Therapie auf effektive Weise neue mikrobielle Plasmino genaktivatoren, nämlich spezifische neuartige Staphylokinasen, die wie Wildtyp-SAK eine Moleküllänge von 136 Aminosäuren auf weisen, herzustellen.The invention aims to thromboly effective new microbial plasmino therapy gene activators, namely specific novel staphylokinases, which, like wild-type SAK, has a molecular length of 136 amino acids have to manufacture.

Gegenstand der Erfindung sind zunächst DNA-Sequenzen, die für neuartige Plasminogenaktivatoren kodieren, welche methio ninfreie Formen von reifer Wildtyp-Staphylokinase darstellen und wie dieses mikrobielle Protein eine Moleküllänge von 136 Aminosäuren aufweisen. Da reife Wildtyp-Staphylokinase, so ins besondere auch reife Wildtyp-SAK42D, in ihrer Aminosäure-Se quenz nur an einer Stelle, nämlich an der Position 26, die Ami nosäure Methionin enthält, sind Gegenstand der Erfindung somit solche DNA-Sequenzen, bei denen im Vergleich zur DNA-Sequenz von reifer Wildtyp-SAK an den Nukleotidpositionen 79 bis 81 zweckgerichtet Nukleotidaustausche in der Weise vorgenommen worden sind, daß die jeweils neuinstallierten Nukleotide klm nunmehr für eine der anderen Aminosäuren kodieren. Besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist unter diesem Aspekt eine Kollektion von DNA-Sequenzen mit der Struktur (man ver gleiche nebenher auch Abb. 3)The invention initially relates to DNA sequences which code for novel plasminogen activators, which are methionine-free forms of mature wild-type staphylokinase and how this microbial protein has a molecular length of 136 amino acids. Since mature wild-type staphylokinase, in particular also mature wild-type SAK42D, in its amino acid sequence only at one point, namely at position 26, which contains amino acid methionine, the invention thus relates to those DNA sequences in which compared to the DNA sequence of mature wild-type SAK at nucleotide positions 79 to 81, nucleotide exchanges have been made in such a way that the newly installed nucleotides klm now code for one of the other amino acids. From this point of view, a particular subject of the present invention is a collection of DNA sequences with the structure (compare also Fig. 3)

wobei klm an den Positionen 79 bis 81 jeweils für eines der nachstehenden Nukleotidtripletts steht:where klm at positions 79 to 81 each for one of the the following nucleotide triplet is:

ATA (kodiert für die Aminosäure Isoleucin)
AGA (kodiert für die Aminosäure Arginin)
GTA (kodiert für die Aminosäure Valin)
ACA (kodiert für die Aminosäure Threonin)
AAA (kodiert für die Aminosäure Lysin)
CTA (kodiert für die Aminosäure Leucin)
TGC (kodiert für die Aminosäure Cystein)
GCC (kodiert für die Aminosäure Alanin)
CAC (kodiert für die Aminosäure Histidin)
GGC (kodiert für die Aminosäure Glycin) sowie
TCC (kodiert für die Aminosäure Serin).ATA (encoding the amino acid isoleucine)
AGA (encoding the amino acid arginine)
GTA (encoding the amino acid valine)
ACA (encoding the amino acid threonine)
AAA (encodes the amino acid lysine)
CTA (encoding the amino acid leucine)
TGC (encoding the amino acid cysteine)
GCC (encoding the amino acid alanine)
CAC (encoding the amino acid histidine)
GGC (encoding the amino acid glycine) as well
TCC (encoding the amino acid serine).

(Hinweis: Am 5′-Ende der voranstehend notierten DNA-Sequenz ist zusätzlich das Expressionsstartkodon angegeben worden.)(Note: is at the 5 ′ end of the DNA sequence noted above the expression start codon was also given.)

Die 11 DNA-Sequenzen dieser Kollektion - sie werden im wei teren Text auch als Strukturgene sakM26X bezeichnet - werden im gentechnischen Verfahrensabschnitt der Gesamterfindung durch an sich bekannte Einzelschritte der DNA-Rekombination, die die An lagerung von chemisch synthetisierten Linkermolekülen ausdrück lich einschließen, erstellt. Wie ersichtlich, kommt in diesen DNA-Sequenzen das für die Aminosäure Methionin kodierende Nu kleotidtriplett ATG nicht vor. Jedes erfindungsgemäße sakM26X- Strukturgen aus der obigen Kollektion enthält über große Berei che seiner DNA-Teilsequenzen, die keinerlei Abweichung zu den entsprechenden Nukleotidfolgen des Gens der reifen Wildtyp-Sta phylokinase SAK42D aufweisen. Solche Teilbereiche der sakM26X- Strukturgene sind in der Regel durch die an sich bekannten Ein zelschritte der DNA-Rekombination wie Restriktasefragmentie rung, Linkerkopplung, Vektor-DNA-Fragmentrekombination sowie Reklonierung dem Wildtyp-Strukturgen sak42D entnommen. Das Gen sak42D steht für diese und andere Zwecke bekanntlich auf dem Trägerplasmid pMET5 (siehe auch Abb. 1) zur Verfügung. Bei der Konstruktion der sakM26X-Gene ist für jede Sequenz aus der obi gen DNA-Kollektion dafür Sorge getragen worden, daß gegebenen falls unter zweckgerichteter Einführung von stillen Punktmutan ten an definierten Positionen ihrer Nukleotidabfolge ausge wählte unikale Restriktionsspaltorte zur Verfügung stehen, näm lichThe 11 DNA sequences in this collection - they are also referred to as structural genes sakM26X in the rest of the text - are created in the genetic engineering process section of the overall invention by known individual steps of DNA recombination, which explicitly include the attachment of chemically synthesized linker molecules. As can be seen, the nucleotide triplet ATG coding for the amino acid methionine does not occur in these DNA sequences. Each sakM26X structural gene according to the invention from the above collection contains large areas of its partial DNA sequences which do not deviate in any way from the corresponding nucleotide sequences of the gene of the mature wild-type staphylokinase SAK42D. Such partial areas of the sakM26X structural genes are generally removed from the wild-type structural gene sak42D by the known individual steps of DNA recombination, such as restriction fragmentation, linker coupling, vector DNA fragment recombination and recloning. The sak42D gene is known to be available for this and other purposes on the carrier plasmid pMET5 (see also Fig. 1). In the construction of the sakM26X genes, care has been taken for each sequence from the above DNA collection to ensure that selected, unique restriction cleavage sites are available, if appropriate with the introduction of silent point mutants at defined positions in their nucleotide sequence

- such a location for SalI at position 94,
- such a location for SacI at position 112,
- such position for SacII at position 124 such as
- at position 389 another such location for StyI.

In der voranstehend angeführten Nukleotidsequenz für die sakM26X-Strukturgene der erfindungsgemäßen Kollektion sind stromauf und stromab von jener relevanten Nukleotidregion, die für die 26. Aminosäure einer reifen methioninfreien Staphyloki nase kodiert, ausgewählte Sequenzbereiche durch die Bezeichnun gen "Bereich I" und "Bereich II" kenntlich gemacht. Bereich I umfaßt jene DNA-Teilsequenz, die für die N-terminalen Aminosäu ren 1 bis 22 jeder SAKM26X (jedoch übrigens auch der nativen SAK42D) kodiert; Bereich II enthält hingegen jene DNA-Teilse quenz, die für die C-terminalen Aminosäuren 32 bis 136 dieser Protein-Moleküle kodiert. In the above nucleotide sequence for the sakM26X structural genes of the collection according to the invention upstream and downstream of that relevant nucleotide region that for the 26th amino acid of a mature methionine-free staphyloki nose coded, selected sequence areas by the designation marked "Area I" and "Area II". Area I includes the partial DNA sequence necessary for the N-terminal amino acid ren 1 to 22 of each SAKM26X (but also the native SAK42D) encoded; Area II, on the other hand, contains those DNA parts quenz for the C-terminal amino acids 32 to 136 of these Encoded protein molecules.

Gleichzeitig wird durch diese Bezeichnungsweise zusätzlich hervorgehoben, daß Gegenstand der vorliegenden Gesamterfindung weiterhin bestimmte sogenannte rekombinante Basisplasmide mit E. coli-Replikationsorigin sowie Polylinkerbereich sind. Bevor zugter Erfindungsgegenstand sind in diesem Zusammenhang solche rekombinanten Basisplasmide, die jeweils als Derivate des E. coli-Klonierungsvektors pUC19 in ihrem PolylinkerbereichAt the same time, this designation means additional emphasized that the subject of the present overall invention also certain so-called recombinant base plasmids E. coli replication origin and polylinker area are. Before In this context, the subject matter of the invention is such recombinant base plasmids, each as derivatives of E. coli cloning vector pUC19 in its polylinker region

a) the for amino acids 1 to 22, d. H. for the area I, a DNA encoding SAKM26X (as a prototype of this plasmid group will be found in the further description of the invention, the basic plasmid prove pUC19sak1) respectively
b) the for amino acids 32 to 136, d. H. for the Be Reich II, a DNA encoding SAKM26X (as a prototype of this plasmid group will be found in the further description the basic plasmid pUC19sakA2 er point).

Ein jedes Basisplasmid vom Typ a) ist darüber hinaus da durch gekennzeichnet, daß es die für den Bereich I einer SAKM26X kodierende DNA-Sequenz in funktioneller Ankopplung an eine Tandemkonfiguration von Ribosomenbindungssequenzen (Kurzwort: RBS) enthält. Eine als RBS-Tandemkonfiguration auf gebaute DNA-Teilsequenz ist - das stromab angelagerte Expres sionsstartkodon gegebenenfalls inbegriffen - in der vorliegen den Erfindung parallel immer auch als Bereich für die Instal lierung ausgewählter weiterer unikaler Restriktionsspaltorte genutzt worden, wodurch unter anderem die RBS selbst ebenfalls zu portablen Komponenten in der jeweiligen Expressionskonstruk tion werden können. (Wie beispielsweise Abb. 3 entnommen werden kann, sind speziell in der RBS-Tandemkonfiguration des Ba sisplasmids puC19sak1 unikale Spaltorte für die Restriktasen EcoRI, StuI und NdeI angelegt worden.) Each basic plasmid of type a) is also characterized by the fact that it contains the DNA sequence coding for area I of a SAKM26X in functional coupling to a tandem configuration of ribosome binding sequences (short word: RBS). A RBS tandem configuration based on a partial DNA sequence - possibly including the downstream expression start codon - has always been used in the present invention in parallel as an area for the installation of selected further unique restriction sites, which among other things also makes the RBS itself portable Components can be in the respective expression construction. (As can be seen in Fig. 3, for example, unique cleavage sites for the EcoRI, StuI and NdeI restrictionases have been created in the RBS tandem configuration of the base plasmid puC19sak1.)

Gegenstand der vorliegenden Gesamterfindung ist zudem eine Familie rekombinanter E. coli-Trägerplasmide, von denen jedes eine Gesamt-DNA aus der oben offenbarten Kollektion von sakM26X-Genen enthält. Bevorzugt sind solche Trägerplasmide wiederum Derivate des Klonierungsvektors puC19 und zwar solche, die das jeweilige sakM26X-Gen, verknüpft etwa mit der verfah rensgemäßen RBS-Tandemkonfiguration aus dem Prototyp-Basisplas mid pUC19sak1, als EcoRI/PstI-Fragment beherbergen. Die Gesamt- DNA eines jeden derartigen Fragments wird erneut unter Rück griff auf Standardverfahren der DNA-Rekombination (so Restrik tasefragmentierung, Adaption chemisch synthetisierter Linker, Vektor-DNA-Fragmentrekombination und Reklonierung) sowie aus drücklich unter Einbezug der Teilfragmente, die auf den erwähn ten Basisplasmiden pUC19sak1 und pUC19sak2A bereitgestellt sind, zusammengefügt. In der nachstehend dargelegten bevorzug ten Ausführungsform der Erfindung umfaßt diese Kollektion 11 Plasmide und trägt die Bezeichnung {pUC19sakM26X}-Familie.The present overall invention is also a subject Family of recombinant E. coli carrier plasmids, each of which an overall DNA from the collection of contains sakM26X genes. Such carrier plasmids are preferred again derivatives of the cloning vector puC19, namely those that connects the respective sakM26X gene, roughly with the procedure RBS-compliant tandem configuration from the prototype base plas mid pUC19sak1, host as EcoRI / PstI fragment. The total DNA from each such fragment is reclassified resorted to standard methods of DNA recombination (see Restrik fragmentation, adaptation of chemically synthesized linkers, Vector DNA fragment recombination and recloning) as well expressly including the partial fragments mentioned on the The basic plasmids pUC19sak1 and pUC19sak2A were provided are put together. Preferred in the below This embodiment of the invention comprises this collection 11 Plasmids and is named {pUC19sakM26X} family.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin rekombinante Ex pressionsplasmide, die jedes der voranstehend charakterisierten 11 sakM26X-Strukturgene in funktioneller Ankopplung an eine in bakteriellen Wirtsorganismen, namentlich in E. coli-Stämmen, wirksame Kombination von Expressionskontrollsequenzen enthal ten. Vorzugsweise werden zu den erfindungsgemäßen Expressions plasmiden solche gerechnet, welcheThe invention further relates to recombinant ex pressure plasmids that characterized each of the above 11 sakM26X structural genes in functional coupling to an in bacterial host organisms, especially in E. coli strains, effective combination of expression control sequences The preferred expressions according to the invention plasmids such as

- in each case a derivative of the E. coli expression vector pMEX6 are as well
- With regard to the expression control sequences involved zen are additionally characterized by the feature that the respective included sakM26X gene, d. H. those for each a mature methionine-free staphylokinase SAKM26X kodie rende DNA, according to the illustrated prior art always under the influence of expression control sequences is expressed upstream of the structural gene have complete RtacR configuration, d. H. (in reading direction) the specific DNA structure Binding sequence for the lac repressor - tac promoter - two ribosome bonds formed in tandem own sequences (short word: RtacR configuration).

Da in der vorliegenden erfinderischen Lösung die Produkt synthese nach dem Prinzip der intrazellulären Überexpression zu realisieren ist, tragen die erfindungsgemäßen Expressionsplas mide in jenem Abschnitt ihrer DNA-Sequenz, der jeweils Einfluß auf die Expression von heterologen Genen nehmen kann, hingegen keine Teilsequenzen, die für Signalpeptide kodieren. Hierbei wird durch den spezifischen Aufbau der RtacR-Kontrollsequenz die Voraussetzung dafür gelegt, daß die Biosynthese der oben angegebenen erfindungsgemäßen sakM26X-Gene während der Fermen tation zum gewünschten Zeitpunkt induziert werden kann (chemische Induktion durch Isopropylthiogalactopyranosid-Zu satz).Because in the present inventive solution the product synthesis according to the principle of intracellular overexpression is realized, the expression plas according to the invention mide in that section of their DNA sequence, the influence can take on the expression of heterologous genes, however no partial sequences coding for signal peptides. Here is due to the specific structure of the RtacR control sequence laid the foundation for the biosynthesis of the above specified sakM26X genes according to the invention during the fermentation tion can be induced at the desired time (chemical induction by isopropylthiogalactopyranoside-Zu sentence).

Gegenstand der Erfindung sind auf dieser Grundlage insbe sondere die 11 Expressionsplasmide der {pMEX6sakM26X}-Familie (siehe Abb. 2). Diese tragen auf einem EcoRI/Pstl-Insert (entnommen aus dem zugehörigen pUC19sakM26X-Trägerplasmid) je weils ein sakM26X-Gen aus der eingangs angegebenen Kollektion in funktioneller Ankopplung an das nachstehende erfindungsgemä ße RBS-Tandem (vgl. auch Abb. 3)On this basis, the invention particularly relates to the 11 expression plasmids of the {pMEX6sakM26X} family (see FIG. 2). These each carry a sakM26X gene from the collection specified at the beginning in a functional coupling to the RBS tandem according to the invention (see also FIG. 3) on an EcoRI / Pstl insert (taken from the associated pUC19sakM26X carrier plasmid).

Die verfahrensgemäß gewonnenen Expressionsplasmide werden auf an sich bekannte Weise in transformierbare bakterielle Produ zentenstämme eingebracht. Für die vorzugsweise hergestellten Expressionsplasmide werden hierfür transformierbare Rezipien tenstämme der Spezies E. coli herangezogen; und mit besonderem Vorteil wird für diesen Verfahrensschritt der Gesamterfindung der Produzentenstamm E. coli TG1 verwendet.The expression plasmids obtained according to the method are based on in a manner known per se into transformable bacterial produ cent tribes introduced. For the preferably manufactured Expression plasmids are transformable receptacles for this strains of the species E. coli used; and with special The advantage for this process step is the overall invention the producer strain E. coli TG1 is used.

Gegenstand der Erfindung ist nach diesem Verfahrensschritt somit insbesondere die als Ensemble {E. coli TG1(pMEX6sakM26X)} bezeichnete Gesamtheit von rekombinanten Produzentenstämmen.The subject of the invention is after this process step thus in particular as an ensemble {E. coli TG1 (pMEX6sakM26X)} designated set of recombinant producer strains.

Durch die Kultivierung der verfahrensgemäß erhaltenen re kombinanten E. coli TG1(pMEX6sakM26X)-Stämme wird man in die Lage versetzt, die erfindungsgemäßen reifen methioninfreien Staphylokinasen SAKM26X überhaupt erstmals herzustellen. Insbe sondere wird man auf diese Weise darüber hinaus jedoch auch in die Lage versetzt, diese neuartigen Proteine mit Plasminogenak tivator-Wirkung in jenen Mengen verfügbar zu machen, wie sie für die systematische Untersuchung ihrer stofflichen Eigen schaften sowie ihrer Eignung in der thrombolytischen Therapie benötigt werden.By cultivating the re E. coli TG1 (pMEX6sakM26X) strains are combined in the Positioned, the mature methionine-free according to the invention Staphylokinases SAKM26X for the first time ever. In particular special one will also be in this way beyond able to place these novel proteins with plasminogenak To make the tivator effect available in the amounts they are for the systematic investigation of their material properties and their suitability in thrombolytic therapy are needed.

Mit den verfahrensgemäß erhaltenen rekombinanten E. coli- Stämmen dieses Ensembles liegen außerdem erstmals mikrobielle Produzentenorganismen vor, die ausgewählte reife methioninfreie Staphylokinasen durch intrazelluläre Überexpression gemäß dem eingangs dargelegten Stand der Technik in hohen Ausbeuten (vgl. Abb. 4) zu synthetisieren vermögen.With the method according obtained recombinant E. strains coli this ensemble are also first microbial producer organisms which are able to synthesize the selected mature methionine-Staphylokinasen by intracellular overexpression of the prior art initially in high yields set forth according to (see. Fig. 4).

Zur Kultivierung werden die die erfindungsgemäß erhaltenen rekombinanten Stämme, vorzugsweise die Stämme des Ensembles {E. coli TG1(pMEX6sakM26X)}, unter sterilen und aerob-submersen Be dingungen in an sich bekannter Weise in den Stufen Vor- sowie Hauptkultur in jeweils einem Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie mit einem definierten Gehalt an Mineralsalzen gemäß dem in der Patentschrift DE-P 41 43 279.7/DE-OS 41 43 279 dargelegten Verfahren, welches die chemische Induktion durch Zugabe von Isopropylthiogalactopy ranosid einschließt, fermentiert, und die Aufarbeitung der ge ernteten Biomasse wird dabei jeweils durch einen Zellaufschluß, vorzugsweise durch einen Aufschluß mittels Ultraschall, einge leitet. Aus dem danach in den Kulturbrühen jeweils vorliegenden heterologen Produktgemisch wird durch eine insgesamt nur 2-stu fige Kombination aus Ionenaustausch-Chromatographie und Hydro phob-Interaktion-Chromatographie das jeweilige SAKM26X-Zielpro tein in überraschend hoher Reinheit gewonnen wird (siehe hierzu auch Abb. 5).For the cultivation, the recombinant strains obtained according to the invention, preferably the strains of the ensemble {E. coli TG1 (pMEX6sakM26X)}, under sterile and aerobically submerged conditions in a manner known per se in the stages pre-culture and main culture in a nutrient medium each with assimilable carbon and nitrogen sources and with a defined content of mineral salts according to the in the patent DE -P 41 43 279.7 / DE-OS 41 43 279 described method, which includes chemical induction by adding isopropylthiogalactopy ranoside, fermented, and the processing of the harvested biomass is in each case by a cell disruption, preferably by a disruption by ultrasound directs. The respective SAKM26X target protein is obtained in a surprisingly high degree of purity from the heterologous product mixture that is then present in the culture broths by means of a combination of ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography, which is only 2-stage in total (see also Fig. 5 ).

Als Konsequenz aller vorhergehenden Ausführungen sind Ge genstand der Erfindung somit auch die unter den angegebenen Fermentationsbedingungen synthetisierten reifen methioninfreien Staphylokinasen SAKM26X, wobei X erfindungsgemäß für eine der Aminosäuren aus der Kollektion {I, R, V, T, K, L, C, A, H, G, S} steht. Für diese neuartigen Plasminogenaktivator-Proteine ist in den eingeführten Nachweissystemen die spezifische Akti vität vermessen worden. Dabei hat sich überraschend ergeben, daß einige der verfahrensgemäß gewonnenen reifen methionin freien Staphylokinasen, nämlich SAKM26C und SAKM26L, eine (im Vergleich zu reifer nativer Wildtyp-SAK42D; vgl. Abb. 6) hohe Plasminogenaktivator-Wirkung aufweisen.As a consequence of all the foregoing, the subject of the invention is also the mature methionine-free staphylokinases SAKM26X synthesized under the fermentation conditions indicated, where X according to the invention for one of the amino acids from the collection {I, R, V, T, K, L, C, A, H, G, S} stands. The specific activity for these novel plasminogen activator proteins has been measured in the introduced detection systems. It has surprisingly been found that some of the mature methionine-free staphylokinases obtained according to the process, namely SAKM26C and SAKM26L, have a (compared to mature, wild-type SAK42D; see FIG. 6) high plasminogen activator activity.

Im Zusammenhang mit diesen Befunden betrifft die vorliegen de Erfindung schließlich auch Arzneimittel (Fibrinolytika), in die neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen als Wirkkomponente jeweils ein erfindungsgemäß hergestelltes SAKM26X-Protein ein bezogen ist. Vorzugsweise betrifft die Erfindung dabei Arznei mittel obiger Kennzeichnung, die als Wirkkomponente entweder jene SAKM26C oder jene SAKM26L enthalten, welche durch Kulti vierung des rekombinanten Stammes E. coli TG1(pMEX6sakM26C) oder des rekombinanten Stammes E. coli TG1(pMEX6sakM26L) nach dem voranstehend skizzierten Fermentations- und Aufarbeitungs regime gewonnen worden ist.In connection with these findings concerns the present Finally, the invention also medicines (fibrinolytics), in which, in addition to conventional auxiliaries and carriers, as an active component each a SAKM26X protein produced according to the invention is related. The invention preferably relates to medicinal products medium above labeling, which as an active component either contain those SAKM26C or those SAKM26L which are cultivated vation of the recombinant strain E. coli TG1 (pMEX6sakM26C) or the recombinant strain E. coli TG1 (pMEX6sakM26L) the fermentation and processing outlined above regime has been won.

Bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul turen GmbH (DSM), Braunschweig, ist seit dem 02. 07. 1990 der folgende Stamm hinterlegt:At the German Collection of Microorganisms and Cell Culture turen GmbH (DSM), Braunschweig, has been the following trunk deposited:

E. coli TG1 (DSM 6056);E. coli TG1 (DSM 6056);

weiterhin wurde am 06. 12. 1991 bei der DSM hinterlegt:the following was also deposited with the DSM on December 6, 1991:

Plasmid pMET5 (DSM 6841).Plasmid pMET5 (DSM 6841).

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der Verfahrens abschnitt der Gesamterfindung (unter Einbeziehung der Abb. 1 bis 6 sowie einer Tabelle) zweckmäßigerweise in 4 Teil schritten wie folgt realisiert:In an advantageous embodiment, the method section of the overall invention (including Figs. 1 to 6 and a table) is expediently implemented in 4 part steps as follows:

Sub-step A: Construction of the amino acids 1 to 22 of the mature base plasmids encoding SAKM26X pUC19sak1

Der Aufbau der kodierenden Sequenz von Aminosäurenposition 1 bis 22 einschließlich der Einführung effizienter portabler Translationssignale (Ribosomenbindungsort, RBS) und Übergangs sequenzen zum Expressionsstartcodon ATG, sowie einer Zusatzse quenz zum Expressionsanschluß der finalen kodierenden DNA-Se quenz von SAKM26X an ein geeignetes Translationssignal (Promoter) erfolgt durch Klonierung von chemisch synthetisier ten Qligonukleotidlinkern mit der entsprechenden Nukleotidab folge in 2 Stufen über das Zwischenplasmid pUC19sak0.The construction of the coding sequence from amino acid position 1 to 22 including the introduction of more efficient portable Translation signals (ribosome binding site, RBS) and transition sequences to the expression start codon ATG, and an additional se sequence for the expression connection of the final coding DNA-Se sequence of SAKM26X to a suitable translation signal (Promoter) is done by cloning chemically synthesized ten ligonucleotide linkers with the corresponding nucleotide follow in 2 steps via the intermediate plasmid pUC19sak0.

Zunächst wird an die beiden Enden des durch EcoRI-Spaltung linearisierten Vektorplasmides pUC19 das mittels T4-Polynukleo tidkinase semiphosphorylierte Linkerpaar L1*h/L2 (* zeigt in nachfolgender Beschreibung den phosphorylisierten Linkerpartner an) auf an sich bekannte Weise mittels T4-DNA-Ligase angela gert. Die im beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleoti de sind in der Tabelle zusammmengestellt. Das verwendete Lin kerpaar ist verfahrensmäßig so aufgebaut, daß es neben der por tablen Nukleotidsequenz für den Translationsanschluß die kodie rende DNA-Sequenz für die Aminosäuren 1 bis 3 und die ersten beiden Nukleotide von Aminosäure 4 sowie die auf pUC19 nicht vorkommende Erkennungssequenz der Restriktase SfuI (überlappt Kodon 4) und ein BamHI-kompatibles 5′-Nukleotidende enthält. Durch nachfolgende Spaltung mit BamHI wird das ebenfalls an der Polyklonierungssequenz (PKS) angelagerte Linkerpaar wieder ab gespalten. Der gebildete L1/L2-modifizierte lineare pUC19-Vek tor wird nunmehr mittels T4-DNA-Ligase zikularisiert und an schließend zwischenkloniert. Dabei entsteht das Plasmid pUC19sak0.First, go to both ends of it by EcoRI cleavage linearized vector plasmids pUC19 that using T4 polynucleo tidkinase semiphosphorylated linker pair L1 * h / L2 (* shows in following description the phosphorylized linker partner an) in a manner known per se using T4 DNA ligase angela device. The oligonucleotides used in the described method de are compiled in the table. The Lin used procedurally kerpaar is constructed so that it is next to the por the nucleotide sequence for the translation connection is the code DNA sequence for amino acids 1 to 3 and the first two nucleotides of amino acid 4 as well as those on pUC19 not occurring recognition sequence of the restrictionase SfuI (overlapped Codon 4) and a BamHI-compatible 5'-nucleotide end contains. Subsequent cleavage with BamHI will also affect the Polycloning sequence (PKS) attached linker pair again split. The formed L1 / L2 modified linear pUC19 vek Tor is now cellularized using T4 DNA ligase and an finally cloned in between. This creates the plasmid pUC19sak0.

Im nachfolgenden Verfahrensschritt wird in prinzipiell gleicher Verfahrensweise das partiell phosphorylierte Linker paar L3*/L4 (vgl. Tab.) an das über den eingeführten SfuI-Ort geöffnete Plasmid pUC19sak0 angelagert. Dabei wird die Sequenz von Kodon 4 des reifen sakM26X-Genes komplettiert und die durchgängig kodierende Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 1 bis 13 einschließlich der portablen Übergangssequenz aufgebaut. Im Anschluß daran wird durch Spaltung mit der Restriktase SphI das an die PKS angelagerte Linkerpaar L3*/L4 wieder abgespal ten. An das entstehende SphI-Ende des linearen Plasmides wird nunmehr das vorher kinasierte Linkerpaar L5/L6* (Tab. 1) mit tels T4-DNA-Ligase angeknüpft. Auf diese Weise wird vom rekon stituierten SphI-Ort in Leserichtung zum überhängenden 5′-Ende des Linkerpaares die kodierende Nukleotidsequenz der Aminosäu ren 22 bis 16 sowie ein singulärer Spaltort für die Restriktase NaeI, der das Kodon 22 und den SphI-Ort überlappt, eingeführt. Das entstehende lineare pUC19-Derivat trägt darüber hinaus an seinen Enden eine 6 Nukleotide lange einzelsträngige, zueinan der komplementäre DNA-Sequenz, welche nach dem Annealing die Kodone 14 und 15 komplettiert.In the subsequent process step, in principle same procedure, the partially phosphorylated linker couple of L3 * / L4 (see table) to the introduced SfuI location opened plasmid pUC19sak0 attached. The sequence completed by codon 4 of the mature sakM26X gene and the Consistent coding nucleotide sequence for amino acids 1 to 13 including the portable transition sequence. This is followed by cleavage with the SphI the linker pair L3 * / L4 attached to the PKS are split again At the resulting SphI end of the linear plasmid now the previously kinased linker pair L5 / L6 * (Tab. 1) with t4 DNA ligase attached. In this way the recon substituted SphI site in the reading direction to the overhanging 5'-end of the linker pair the coding nucleotide sequence of the amino acid ren 22 to 16 and a unique cleavage site for the restrictase NaeI, which overlaps codon 22 and the SphI site. The resulting linear pUC19 derivative also contributes its ends are a 6-nucleotide single-stranded to each other the complementary DNA sequence, which after annealing the Codons 14 and 15 completed.

Nach Phosphorylierung der freien überhängenden 5′-Nukleo tidenden wird das linkermodifizierte Vektorfragment auf die be schriebene Weise zirkularisiert. Durch Klonierung wird das Plasmid pUC19sak1 erhalten, welches unter anderem den singulä ren Spaltort für NaeI mit Anschlußsequenz an Kodon 23 enthält.After phosphorylation of the free overhanging 5'-nucleo The linker-modified vector fragment is tidend to the be circularized way of writing. Cloning will Receive plasmid pUC19sak1, which among other things the singular ren cleavage site for NaeI with connection sequence to codon 23 contains.

Sub-step B: Construction of the amino acids 32 to 136 of SAKM26X encoding base plasmids pUC19sakA2

Die Konstruktion des Plasmides pUC19sakA2, das die für den C-Terminus von SAKM26X ab Aminosäure 32 kodierende DNA-Sequenz in einer für die nachfolgenden Verfahrensschritte angepaßter Form enthält, erfolgt in 2 aufeinander abgestimmten gentechni schen Verfahrensschritten unter Verwendung des Zwischenplasmi des pUC19sakA1.The construction of the plasmid pUC19sakA2, which the for the C-terminus of SAKM26X starting from amino acid 32 coding DNA sequence in one adapted for the subsequent process steps Form contains, takes place in 2 coordinated genetic engineering process steps using the intermediate plasma of the pUC19sakA1.

Zur Bereitstellung der verfahrensmäßig benötigten, für die Aminosäuren 44 bis 124 von SAKM26X kodierenden DNA-Teilsequenz wird das Plasmid pMET5 (Abb. 1) benutzt, welches in nachstehend angegebener Modifizierung das Gen der reifen Wildtyp-Staphylo kinase SAK42D trägt. Auf diesem Plasmid fehlen die nativen 5′- flankierenden regulatorischen Bereiche, die kodierende Sequenz für das Signalpeptid sowie die Codons für die ersten 3 Ami nosäuren der reifen SAK42D, die durch einen TaqI-Restriktase schnitt vom ursprünglichen Gen abgetrennt werden. Bei der Klo nierung des das sak42D-Gen tragenden Fragmentes in den AccI-Ort eines pUC19-Derivates wird unmittelbar am 5′-Ende dieses Genes ein unikaler SalI-Ort gebildet. Stromab der für SAK42D kodie renden Sequenz sind auf pMET5 noch die 3′-flankierenden nicht kodierenden Bereiche des sak42D-Gens und Teile des Plasmides pBR322 enthalten. Zur Abtrennung dieses 3′-flankierenden DNA- Abschnittes wird zunächst aus pMET5 das 1,2 kbp große SalI/PstI-Fragment isoliert und aus diesem durch konsekutive Restriktaseverdauung mit AvaI, AvaII und HinfI auf günstige Weise das 361 bp große SalI/HinfI-Fragment gewonnen, in welchem durch den HinfI-Schnitt zwischen den für die Aminosäuren 124 und 125 kodierenden Kodonen die letzten 27 bp der für SAK42D kodierenden Sequenz mit entfernt worden sind.The plasmid pMET5 ( FIG. 1), which carries the gene of the mature wild-type staphylokinase SAK42D in the modification given below, is used to provide the DNA part-sequence coding for the amino acids 44 to 124 of SAKM26X. This plasmid lacks the native 5'-flanking regulatory regions, the coding sequence for the signal peptide and the codons for the first 3 amino acids of the mature SAK42D, which are separated from the original gene by a TaqI restrictase cut. When the fragment carrying the sak42D gene is cloned into the AccI site of a pUC19 derivative, a unique SalI site is formed directly at the 5 'end of this gene. Downstream of the sequence coding for SAK42D, the 3′-flanking non-coding regions of the sak42D gene and parts of the plasmid pBR322 are also contained on pMET5. To separate this 3'-flanking DNA section, the 1.2 kbp SalI / PstI fragment is first isolated from pMET5 and from this by consecutive restrictase digestion with AvaI, AvaII and HinfI the 361 bp SalI / HinfI fragment is advantageously obtained in which the last 27 bp of the sequence coding for SAK42D were also removed by the HinfI cut between the codons coding for amino acids 124 and 125.

In einem parallelen Verfahrensschritt wird das HinfI/PstI- adaptierbare Linkerpaar L7/L8* (vgl. Tab.) in vorangehend be schriebener Weise an die PstI-Enden des mit den gleichen Enzy men verdauten Vektors pUC19 angelagert und anschließend nach Spaltung mit SalI der nunmehr SalI/HinfI-kompatible, lineare, L7/L8-linkermodifizierte Klonierungsvektor pUC19 gewonnen. Das angelagerte Linkerpaar enthält in vorgefertigter Weise die wie derhergestellte kodierende Sequenz stromab von Kodon 125 des reifen sak42D-Genes und darüber hinaus unter Beibehaltung der Aminosäureabfolge zwischen den Aminosäuren 129 und 130 (d. h. an Nukleotidposition 389) eine zusätzliche Erkennungssequenz für die Restriktase StyI.In a parallel process step, the HinfI / PstI adaptable linker pair L7 / L8 * (see Tab.) in the previous be written to the PstI ends of the with the same enzyme digested vector pUC19 and then after Splitting with SalI the now SalI / HinfI compatible, linear, L7 / L8 linker-modified cloning vector pUC19 was obtained. The attached linker pair contains the like in a prefabricated manner the coding sequence produced downstream of codon 125 des mature sak42D genes and beyond while maintaining the Amino acid sequence between amino acids 129 and 130 (i.e. an Nucleotide position 389) an additional recognition sequence for the restrictionase StyI.

In den vorangehend beschriebenen, modifizierten linearen Vektor pUC19 wird das isolierte 361 bp große SalI/HinfI-Frag ment mittels T4-DNA-Ligase inseriert und nach Tansformation zu nächst das Zwischenplasmid pUC19sakA1 gewonnen, welches die vollständige kodierende DNA-Sequenz des reifen sak42D-Genes ab Kodon 4 enthält. Das so hergestellte Zwischenplasmid wird in Fortführung des gentechnischen Verfahrens über den EcoRI-Spalt ort linearisiert und nach dem beschriebenen Prinzip durch das semiphosphorylierte Linkerpaar L9*/L10 (vgl. Tab.) modifiziert. Diese zueinander komplementären Linker enthalten unter anderem die kodierende Teilsequenz von Kodon 32 bis 43 sowie die ersten beiden Nukleotide von Kodon 44 der Zielsequenz für SAKM26X, wo bei zwischen den Kodonen 32/33, 38/39 und 42/43 abweichend zum gleichen Genabschnitt des reifen nativen sak42D-Genes zusätz lich 11 stille Mutationen eingeführt wurden. Dadurch entstehen unter Beibehaltung der Aminosäresequenz von SAKM26X in dieser Region verfahrensgemäß zusätzlich erwünschte singuläre Erken nungsorte für die Restriktasen SalI, SacI und SacII. Nach an schließender HindIII-Verdauung des linkersubstituierten Plasmi des werden aus dem Spaltgemisch gleichzeitig der lineare L9/L10-HindIII-flankierte Vektor pUC19 und das 414 bp große sak-Gensubfragment isoliert. Aus letzterem entsteht durch Spal tung mit der Restriktase MnlI unter anderem das 290 bp große MnlI/HindIII-Fragment, welches 5′-seitig kompatibel zum 3′-Ende des Linkerpaares L9/L10 ist und die ab Aminosäure 46 den C-Ter minus von SAKM26X kodierende DNA-Sequenz umfaßt, welche nach dem TAA-Stopkodon trunkiert ist.In the modified linear lines described above Vector pUC19 becomes the isolated 361 bp SalI / HinfI frag ment inserted using T4 DNA ligase and after transformation the intermediate plasmid pUC19sakA1, which the complete coding DNA sequence of the mature sak42D gene Codon 4 contains. The intermediate plasmid thus produced is in Continuation of the genetic engineering process via the EcoRI gap linearized and according to the principle described by the semi-phosphorylated linker pair L9 * / L10 (see table) modified. These mutually complementary linkers contain, among other things the coding partial sequence from codons 32 to 43 and the first two nucleotides of codon 44 of the target sequence for SAKM26X, where at deviating between codons 32/33, 38/39 and 42/43 same gene segment of the mature native sak42D gene additional 11 silent mutations were introduced. This creates while maintaining the amino acid sequence of SAKM26X in it Region additionally desired singular orks according to the procedure Locations for the SalI, SacI and SacII restrictionases. After on closing HindIII digestion of the left-substituted plasmi of the gap mixture will simultaneously become the linear one L9 / L10 HindIII flanked vector pUC19 and the 414 bp sak gene subfragment isolated. The latter is created by Spal the 290 bp, among others, with the MnlI restriction enzyme MnlI / HindIII fragment which is 5'-side compatible with the 3'-end of the linker pair L9 / L10 and the C-ter from amino acid 46 minus DNA sequence encoding SAKM26X, which follows the TAA stop codon is truncated.

Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden auf bekannte Weise mittels T4-DNA-Ligase miteinander rekombiniert. Nach Transfor mation und Selektion wird schließlich das zweite Basisplasmid pUC19sakA2 erhalten, welches gemeinsam mit pUC19sak1 als Aus gangsplasmid für die nachfolgenden gentechnischen Verfahrens schritte fungiert.The DNA fragments obtained in this way are known recombined with each other using T4 DNA ligase. According to Transfor mation and selection finally becomes the second basic plasmid pUC19sakA2 received, which together with pUC19sak1 as Aus gang plasmid for the subsequent genetic engineering process steps acts.

Sub-step C: Production of the mature sakM26X genes (X = I, R, V, T, K, L, C, A, H, G and S) carrying plasmids of the type pUC19sakM26X

Die Vereinigung der in den Teilschritten A und B beschrie benen und zwischenklonierten N- und C-terminalen Genabschnitte zu den durchgängigen reifen sakM26X-Genen wird mit Hilfe von komplementären Adapteroligonukleotiden vollzogen, welche für die noch fehlenden DNA-Teilsequenzen kodieren, die den Bereich zwischen den Aminosäuren 23 bis 31 umfassen.The union of the described in steps A and B. benen and intermediate cloned N- and C-terminal gene segments the mature sakM26X genes are developed with the help of complementary adapter oligonucleotides carried out for the missing DNA partial sequences encoding the area between amino acids 23 to 31.

Verfahrensgemäß werden 2 Serien (Typen) von Adapterpaaren verwendet, die durch die gemeinsamen Eigenschaften gekennzeich net sind:According to the procedure, 2 series (types) of adapter pairs used, characterized by the common properties net are:

- They have the same sequence length.
- They are 5'-terminal to a NaeI and 3'-terminal a SalI restriction cleavage end is adaptable and
- they contain such nucleotides for codon position 26 follow, each ent 12 different codons speak.

Daraus resultiert, daß die so aufgebauten über automati sierte Oligonukleotidsynthese hergestellten Adapteroligonukleo tide ein Gemisch von jeweils 12 unterschiedlichen Oligonucleo tidsequenzen repräsentieren und demzufolge in jeder Serie ein Gemisch von jeweils 12 unterschiedlichen Adapterpaaren erzeugt wird. Die Mischung der Nukleotide bei der Synthese der Oligonu kleotide ist dabei so konzipiert, daß durch die Adapterserie AG11/AG12 11 und durch die Adapterserie AG13/AG14 6 verschie dene Aminosäuren an Position 26 verschlüsselt sind und poten tiell demzufolge der Einbau von insgesamt 17 unterschiedlichen Kodonen für Aminosäure 26 ermöglicht wird.The result of this is that the automati based oligonucleotide synthesis adapter oligonucleotide tide a mixture of 12 different oligonucleotides tid sequences and therefore appear in every series Mixture of 12 different adapter pairs generated becomes. The mixture of nucleotides in the synthesis of the Oligonu kleotide is designed so that through the adapter series AG11 / AG12 11 and through the adapter series AG13 / AG14 6 whose amino acids are encoded at position 26 and potentiate consequently the installation of a total of 17 different ones Codons for amino acid 26 is made possible.

Im gentechnischen Verfahrensablauf werden in getrennten Re aktionsschritten in an sich bekannter Weise zunächst die oben beschriebenen Adapterpaare AG11/AG12* bzw. AG13/AG14* an die nach SalI-Spaltung von pUC19sakA2 entstehenden freien Enden an gekoppelt. Durch nachfolgende HindIII-Verdauung werden die nun mehr AG11/AG12-HindIII- bzw. AG13/AG14-HindIII-terminierten Fragmentgemische isoliert, die den kodierenden Sequenzbereich ab Kodon 24 umfassen. Die durch den jeweiligen Adaptertyp de terminierten Fragmentgemische werden abschließend in dem mit NaeI und HindIII geöffneten Basisplasmidvektor pUC19sak1 klo niert. Die nach Transformation erhaltenen Klone werden durch Doppelspaltung der enthaltenen Plasmid-DNA mit EcoRI und HindIII auf sakM26X-Gen tragende Plasmide vorselektiert. Nach DNA-Sequenzanalyse einer repräsentativen Anzahl vorselektierter rekombinanter Plasmide werden schließlich aus den unter Verwen dung der Adapterpaare AG11/AG12 erhaltenen Klonen die Plasmide pUC19sakM26I, pUC19sakM26R, pUC19sakM26V, pUC19sakM26T, pUC19M26K und pUC19sakM26L selektiert, die für reife SAKM26I, SAKM26R, SAKM26V, SAKM26T, SAKM26K und SAKM26L kodieren. Auf die gleiche Weise werden aus der AG13/AG14-Serie die für SAKM26C, SAKM26A, SAKM26H, SAKM26G und SAKM26S kodierenden Plasmide pUC19sakM26C, pUC19sakM26A, pUCsak19M26H, pUCsak19M26G und pUC19sakM26S identifiziert und selektiert.In the genetic engineering process, separate Re action steps in a known manner first of all the above described adapter pairs AG11 / AG12 * or AG13 / AG14 * to the free ends formed after SalI cleavage of pUC19sakA2 coupled. Through subsequent HindIII digestion, the now more AG11 / AG12-HindIII or AG13 / AG14-HindIII-terminated Fragment mixtures isolated that encode the coding sequence region from codon 24 onwards. The de Terminated fragment mixtures are finally in the with NaeI and HindIII opened base plasmid vector pUC19sak1 klo kidney. The clones obtained after transformation are by Double cleavage of the contained plasmid DNA with EcoRI and HindIII pre-selected plasmids carrying sakM26X gene. To DNA sequence analysis of a representative number of preselected recombinant plasmids will eventually be used under the Using the adapter pairs AG11 / AG12 clones obtained the plasmids pUC19sakM26I, pUC19sakM26R, pUC19sakM26V, pUC19sakM26T, pUC19M26K and pUC19sakM26L selected for mature SAKM26I, Code SAKM26R, SAKM26V, SAKM26T, SAKM26K and SAKM26L. On the same way, the AG13 / AG14 series become the for SAKM26C, SAKM26A, SAKM26H, SAKM26G and SAKM26S encoding Plasmids pUC19sakM26C, pUC19sakM26A, pUCsak19M26H, pUCsak19M26G and pUC19sakM26S identified and selected.

Sub-step D: Construction of the expression plasmids pMEX6sakM26X; Obtaining recombinant produ centenarians

Als Expressionsvektor wird das kommerzielle erwerbbare Plasmid pMEX6 verwendet, in dem die Expresssion durch den syn thetischen tac-Promoter vermittelt wird. Dieses Plasmid enthält unter anderem auch einen die Bildung einzelsträngiger DNA er möglichenden Bereich aus dem f1-Phagen. The commercially obtainable becomes the expression vector Plasmid pMEX6 used, in which the expression by the syn theoretical tac promoter. This plasmid contains including the formation of single-stranded DNA possible area from the f1 phage.

Aus den vorangehend beschriebenen, die reifen sakM26X-Gene tra genden 11 Plasmiden pMEX6sakM26X werden die EcoRI/PstI-Frag mente isoliert und diese nachfolgend in den mit EcoRI und PstI behandelten Expressionsvektor pMEX6 inseriert, mit welchen dann der E. coli-Stamm TG1 transformiert wird. Hierbei entstehen die Expressionsplasmide pMEX6sakM26X (Abb. 2), die im weiteren zur fermentativen Produktion von reifen SAKM26X-Proteinen einge setzt werden. In allen Plasmiden dieser Familie wird die Ex pression des Zielproteins durch eine gleichartige Anordnung von Expressionssignalen bewirkt, die dadurch charaktisiert ist, daß zusätzlich zu lac-Repressor sowie tac-Promoter zwei in Tan dem-Orientierung angeordnete RBS den zu exprimierenden sakM26X- Genen vorgeschaltet sind (sogenannte RtacR-Konfiguration, siehe Abb. 3). Die zweite RBS ist, ebenso wie die Erkennungssequenzen für die Restriktasen StuI und NdeI, bereits durch das zur Re konstitution des 5′-Endes der reifen sakM26X-Gene verwendete Linkerpaar L1/L2, in das Plasmid pUC19sak0 (siehe Teilschritt A) eingeführt worden.The EcoRI / PstI fragments are isolated from the 11 plasmids pMEX6sakM26X carrying the mature sakM26X genes described above and these are subsequently inserted into the expression vector pMEX6 treated with EcoRI and PstI, with which the E. coli strain TG1 is then transformed . This creates the expression plasmids pMEX6sakM26X ( Fig. 2), which are then used for the fermentative production of mature SAKM26X proteins. In all plasmids of this family, the expression of the target protein is brought about by a similar arrangement of expression signals, which is characterized in that, in addition to lac repressor and tac promoter, two RBS arranged in Tan dem orientation are connected upstream of the sakM26X genes to be expressed (so-called RtacR configuration, see Fig. 3). The second RBS, like the recognition sequences for the StuI and NdeI restrictionases, has already been introduced into the plasmid pUC19sak0 (see substep A) by the linker pair L1 / L2 used to reconstitute the 5′-end of the mature sakM26X genes.

Sub-step E: determination of expression and activity of Plasminogen activators

Die mit den Expressionsplasmiden für SAKM26X transformierten E. coli-StämmeThe E. transformed with the expression plasmids for SAKM26X coli strains

E. coli TG1(sakM26I), E. coli TG1(sakM26R), E. coli TG1(sakM26V),
E. coli TG1(sakM26T), E. coli TG1(sakM26K), E. coli TG1(sakM26L),
E. coli TG1(sakM26C), E. coli TG1(sakM26A), E. coli TG1(sakM26H),
E. coli TG1(sakM26G) und E. coli TG1(sakM26S)E. coli TG1 (sakM26I), E. coli TG1 (sakM26R), E. coli TG1 (sakM26V),
E. coli TG1 (sakM26T), E. coli TG1 (sakM26K), E. coli TG1 (sakM26L),
E. coli TG1 (sakM26C), E. coli TG1 (sakM26A), E. coli TG1 (sakM26H),
E. coli TG1 (sakM26G) and E. coli TG1 (sakM26S)

werden zum Nachweis der intrazellulär gebildeten reifen Staphy lokinasen entweder in einem komplexen Vollmedium oder in einem synthetischen Medium bis zur mittleren oder späten log-Phase submers kultiviert. In dieser Wachstumsphase wird die sak-Ex pression durch Zugabe von Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Nach weiteren 1 bis 6 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in einem Phenylmethylsul fonylfluorid enthaltenden Phosphat-Puffer resuspensiert. Mit tels Ultraschallaufschluß und hochtouriger Zentrifugation wer den aus den Zellen Zellrohextrakte hergestellt. Aus diesen wer den in an sich bekannter Weise (siehe Patentschrift DE-OS 41 43 279) in einer Folge säulenchromatischer Schritte die Plasmino genaktivator-Spezies (SAKM26X) bis zur elektrophoretischen Ho mogenität angereichert.are used to detect the intracellularly formed mature Staphy locinases either in a complex full medium or in one synthetic medium up to the middle or late log phase submerged cultivated. In this growth phase, the sak-Ex pression by adding isopropylthiogalactopyranoside (IPTG) induced. After another 1 to 6 hours, the cells harvested by centrifugation and in a phenylmethylsul phosphate buffer containing fonyl fluoride. With ultrasonic digestion and high-speed centrifugation the crude extracts produced from the cells. For those who in a manner known per se (see patent specification DE-OS 41 43 279) in a sequence of column-chromatic steps the Plasmino gene activator species (SAKM26X) up to electrophoretic Ho enriched homogeneity.

Die Konzentration der Plasminogenaktivatoren in den Rohex trakten oder in den chromatografischen Fraktionen werden semi quantitativ nach SDS-PAGE durch Kalkulation der Bandenintensi täten nach Coomassie-Brilliant-Blue-Anfärbung oder auf indirek tem Wege über die proteolytische Aktivität der aus Plasminogen freigesetzten Protease Plasmin bestimmt. Methodisch erfolgt dieser Nachweis durch Bestimmung der Größe der Lysehöfe auf Plasminogen-Casein-Agar-Platten (D. Behnke und D. Gerlach (1987), Mol. Gen. Genet., 210, 528-534) und durch kolorimetri sche Bestimmung des aus dem synthetischen Plasminsubstrat Chro mozym PL freigesetzten Nitrophenolates.The concentration of plasminogen activators in the Rohex tracts or in the chromatographic fractions become semi quantitatively according to SDS-PAGE by calculating the band intensity after Coomassie Brilliant Blue staining or indirect pathways via the proteolytic activity of plasminogen released protease plasmin determined. Methodically done this evidence by determining the size of the lysis yards Plasminogen-casein agar plates (D. Behnke and D. Gerlach (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 528-534) and by colorimetri cal determination of the Chro from the synthetic plasma substrate mozym PL released nitrophenolates.

Embodiments

Die folgenden Ausführungen sollen an Beispielen die einzelnen Schritte der Verfahren zur Konstruktion der Vektoren, zur Durchführung der Produktsynthesen sowie zum Aufarbeitungsregime näher veranschaulichen. Sie enthalten jedoch keine detaillier ten Angaben zu standardisierten Einzelverfahren der Gentechno logie wie Gewinnung von Plasmid-DNA, Spaltung von DNA mit Re striktionsenzymen, Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosege len (ausschließlich nach Glasmilchmethode mit Geneclean®, Bio101, La Jolla), Einfügen von DNA-Bruchstücken in Vektorplas mide, Transformation von bakteriellen Rezipientenstämmen mit Plasmid-DNA und DNA-Sequenzanalyse. Solche Verfahren sind in einer Reihe von Veröffentlichungen (z. B. in "Molecular Clon ing, a Laboratory Manual", T. Maniatis, E. R. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, 1989 oder in "Recombinant DNA Methodology", J-A. R. Dillon, A. Nasim und E. R. Nestman, John Wiley & Sons) ausführlich be schrieben und dem Fachmann als Stand der Technik bekannt.The following explanations are intended to illustrate the individual Steps in the methods of constructing the vectors Implementation of the product synthesis and the processing regime illustrate in more detail. However, they do not contain any details information on standardized individual genetic engineering processes logie like extraction of plasmid DNA, cleavage of DNA with Re restriction enzymes, isolation of DNA fragments from agarose gene len (only according to the glass milk method with Geneclean®, Bio101, La Jolla), inserting DNA fragments into vector plas mide, transformation of bacterial recipient strains with Plasmid DNA and DNA sequence analysis. Such procedures are in a number of publications (e.g. in "Molecular Clon ing, a Laboratory Manual ", T. Maniatis, E.R. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, 1989 or in "Recombinant DNA Methodology", J-A. R. Dillon, A. Nasim and E. R. Nestman, John Wiley & Sons) in detail wrote and known to the person skilled in the art as prior art.

example 1 Production of the intermediate plasmid pUC19sak0

Aus dem Stamm E. coli TG1(pUC19) wurde zunächst in an sich bekannter Weise durch Ethidiumbromid-CsCl-Dichtegradientenzen trifugation der Vektor pUC19 isoliert und für alle nachfolgen den gentechnischen Verfahrensschritte bereitgestellt.The strain E. coli TG1 (pUC19) was initially in itself known manner by ethidium bromide-CsCl density gradients trifugation of vector pUC19 isolated and follow for all the genetic engineering process steps provided.

Etwa 2 µg pUC19 werden in 30 µl H-Puffer (Boehringer, Mann heim) mit 10 Einheiten EcoRI bis zur vollständigen Linearisie rung (ca. 1 Stunde) inkubiert. Nach Zugabe von bidestilliertem Wasser (nachfolgend nur H₂O genannt) ad 90 µl und 10 µl 1 M Tris-HCl (pH 8,5) wird mit 100 µl wassergesättigem und mit 0,5% 8-Oxychinolin stabilisiertem Phenol (nachfolgend nur Phenol genannt) extrahiert und das Gemisch anschließend 2 Minuten bei 15 000 rpm zentrifugiert. Nach Einstellen der separierten wäßri gen Phase auf eine Ammoniumacetat (NH₄-Az)-Konzentration von 2,5 M wird der EcoRI-gespaltene Vektor mit einem 2,5fachen Vo lumenäquivalent absoluten Alkoholes (EtOH) ausgefällt, der Nie derschlag 2mal mit 70%igem EtOH gewaschen und nachfolgend in 20 µl H₂O gelöst.About 2 µg pUC19 are incubated in 30 µl H buffer (Boehringer, Mannheim) with 10 units EcoRI until linearization is complete (approx. 1 hour). After adding double-distilled water (hereinafter referred to as H ₂ O) to 90 µl and 10 µl 1 M Tris-HCl (pH 8.5), 100 µl of water-saturated phenol stabilized with 0.5% 8-oxyquinoline (hereinafter only called phenol extracted) and the mixture was then centrifuged at 15,000 rpm for 2 minutes. After adjusting the separated aqueous phase to an ammonium acetate (NH ₄ -Az) concentration of 2.5 M, the EcoRI-cleaved vector is precipitated with a 2.5-fold volume equivalent of absolute alcohol (EtOH), the precipitation twice with 70% Washed EtOH and then dissolved in 20 ul H ₂ O.

Parallel dazu wird die Menge des Linkers L1, die einem 50- bis 80fachem molaren Überschuß an freien EcoRI-Enden des li nearen Vektors pUC19 entspricht (je µg linearem Vektor ca. 0,1 A₂₆₀-Einheiten Linker der Nukleotidlänge 30 bis 40) in 15 µl Reaktionsvolumen in Gegenwart von 2 mM Adenosin-5′-triphosphat (ATP, Boehringer) unter Kinasebedingungen bei 37°C mit T4- Polynukleotidkinase (PNK, Boehringer) phosphoryliert. Nach 20 Minuten wird die Reaktion durch 15minütiges Erhitzen auf 70°C vollständig gestoppt und nach Abkühlen des Ansatzes im Eisbad die gleiche molare Menge des Linkers L2 zugegeben. Die Bildung des doppelsträngigen (ds) Linkerpaares L1*/L2 wird durch lang sames Abkühlen des vorher auf 80°C erhitzten Linkergemisches auf Raumtemperatur (RT) erreicht (Annealing). Zu dem so herge stellten Linkerpaar L1*/L2 werden 18 µl EcoRI-gespaltene pUC19- DNA hinzugegeben und mit 10fach konzentriertem T4-DNA-Ligase- Puffer (0,7 M Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM MgCl₂, 10 mM ATP und 100 mM Dithiothreitol) und H₂O auf DNA-Ligase-Bedingungen in einem Reaktionsvolumen von 100 µl eingestellt. Nach Zugabe von 5 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) wird bei 15°C über Nacht (üN) inkubiert. Der linkermodifizierte Vektor wird in Gegenwart von NH₄-Az mit EtOH ausgefällt, das Präzipitat mit 70%igem EtOH 2mal gewaschen und nach Trocknung in 50 µl H-Puffer auf genommen. Nach Zugabe von 15 Einheiten BamHI (Boehringer) wird 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird in ei nem 1%igem Agarosegel aufgetrennt und das Vektorfragment mit tels 5 µl Glasmilch aus der Kaliumjodid-Gellösung isoliert.At the same time, the amount of linker L1, which corresponds to a 50- to 80-fold molar excess of free EcoRI ends of the linear vector pUC19 (approx. 0.1 A ₂₆₀ units of linker of nucleotide length 30 to 40 per µg linear vector) in 15 ul reaction volume in the presence of 2 mM adenosine 5'-triphosphate (ATP, Boehringer) under kinase conditions at 37 ° C with T4 polynucleotide kinase (PNK, Boehringer) phosphorylated. After 20 minutes, the reaction is stopped completely by heating at 70 ° C. for 15 minutes and, after the batch has cooled in an ice bath, the same molar amount of linker L2 is added. The formation of the double-stranded (ds) linker pair L1 * / L2 is achieved by slowly cooling the linker mixture previously heated to 80 ° C. to room temperature (RT) (annealing). 18 μl of EcoRI-cleaved pUC19-DNA are added to the linker pair thus prepared L1 * / L2 and with 10-fold concentrated T4-DNA ligase buffer (0.7 M Tris-HCl (pH 7.5), 60 mM MgCl ₂ , 10 mM ATP and 100 mM dithiothreitol) and H ₂ O to DNA ligase conditions in a reaction volume of 100 ul. After adding 5 units of T4 DNA ligase (Boehringer), the mixture is incubated at 15 ° C. overnight (above sea level). The linker-modified vector is precipitated with EtOH in the presence of NH ₄ -Az, the precipitate is washed twice with 70% EtOH and, after drying, is taken up in 50 μl of H buffer. After adding 15 units of BamHI (Boehringer), the mixture is incubated at 37 ° C. for 2 hours. The reaction mixture is separated in a 1% agarose gel and the vector fragment is isolated from the potassium iodide gel solution using 5 μl of glass milk.

Etwa 50 ng des L1*/L2-BamHI-flankierten pUC19-Vektors wer den mit 0,5 Einheiten T4-DNA-Ligase in 20 µl Endvolumen unter Ligasebedingungen 2 Stunden bei 15°C inkubiert und anschließend nach Standardvorschriften in kompetente Zellen von E. coli TG1 transformiert. Diese werden nach der Transformation auf Nähragarplatten (Serva, Heidelberg) ausgestrichen, die mit 80 mg Ampicillin/ml Agar, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal, Serva) und IPTG (Serva) supplementiert waren (X-Gal- Amp-NA). Aus 6 weißen Klonen wird mittels der Mini-Präpara tionsmethode nach Standardprotokoll (Plasmid-Minipräp) Plasmid- DNA isoliert, diese durch Spaltung mit der entsprechenden Re striktase auf Anwesenheit eines singulären SfuI-Ortes (Boehringer) getestet und durch DNA-Sequenzanalyse (Plasmidsequenzierung) der korrekte Einbau der Linker bestä tigt.About 50 ng of the L1 * / L2-BamHI-flanked pUC19 vector with 0.5 units of T4 DNA ligase in 20 µl final volume Incubate ligase conditions at 15 ° C for 2 hours and then according to standard regulations in competent cells of E. coli TG1 transformed. These will appear after the transformation Nutrient agar plates (Serva, Heidelberg) streaked with 80 mg Ampicillin / ml agar, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal, Serva) and IPTG (Serva) were supplemented (X-Gal- Amp-NA). 6 white clones are made using the mini preparation standard protocol (plasmid miniprep) plasmid DNA isolated, this by cleavage with the appropriate Re stricture for the presence of a singular SfuI site (Boehringer) tested and by DNA sequence analysis (Plasmid sequencing) the correct installation of the linker does.

Einer der positiven Klone wird zur Isolierung des nunmehr als pUC19sak0 bezeichneten Zwischenplasmides ausgewählt.One of the positive clones is used to isolate the now Intermediate plasmids designated pUC19sak0 selected.

Example 2 Construction of the basic plasmid pUC19sak1

In der vorangehend exemplarisch beschriebenen Weise werden ca. 10 µg pUC19sak0 in 100 µl H-Puffer mit 30 Einheiten SfuI (Boehringer) linearisiert, das Reaktionsgemisch mit Phenol ex trahiert, das geöffnete Vektorplasmid mit EtOH ausgefällt und der mit 70%igem EtOH gewaschene Niederschlag in 30 µl H₂O ge löst. Gleichzeitig werden 0,4 A₂₆₀ Einheiten des Oligonukleoti des L3 zur Anlagerung an 4 µg Vektor mit PNK kinasiert und nach Inaktivierung der T4-Kinase mit der gleichen molaren Menge des Linkers L4 durch die Annealing-Reaktion zum ds-Linkerpaar kom plementiert. Zu diesem werden 12 µl des SfuI-gespaltenen Vek torplasmides hinzugefügt, auf 100 µl Ligationspuffer einge stellt und mit 5 Einheiten T4-DNA-Ligase 4 Stunden bei 16°C in kubiert. Nach EtOH-Präzipitation und -Waschung wird das in 80 µl M-Puffer gelöste Plasmid mit 20 Einheiten SphI (Boehringer) bei 37°C im PKS des pUC19-Replikons gespalten. Das L3/L4-modi fizierte und SphI-Enden tragende Plasmidfragment wird durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel mit anschließender Fragmentisolierung gereinigt.In the manner described by way of example above, approximately 10 μg of pUC19sak0 in 100 μl of H buffer with 30 units of SfuI (Boehringer) are linearized, the reaction mixture is extracted with phenol, the opened vector plasmid is precipitated with EtOH and the precipitate washed with 70% EtOH in Dissolves 30 µl H ₂ O. At the same time, 0.4 A ₂₆₀ units of the oligonucleotide of L3 are kinased with PNK for attachment to 4 μg vector and, after inactivation of the T4 kinase, are complemented with the same molar amount of linker L4 by the annealing reaction to form the ds linker pair. 12 μl of the SfuI-cleaved vector plasmid are added to this, set to 100 μl of ligation buffer and incubated with 5 units of T4-DNA ligase for 4 hours at 16 ° C. After EtOH precipitation and washing, the plasmid dissolved in 80 μl M buffer is cleaved with 20 units of SphI (Boehringer) at 37 ° C. in the PKS of the pUC19 replicon. The L3 / L4-modified plasmid fragment carrying SphI ends is purified by electrophoresis in a 1% agarose gel with subsequent fragment isolation.

An etwa 600 ng des so gereinigten Fragmentes wird nach der vorangehend beschriebenen Verfahrensweise das zweite Linker paar, nämlich L5/L6*, in 70 µl Reaktionsvolumen mittels 4 Ein heiten T4-DNA-Ligase üN angelagert, wobei in einem vorangehen den Schritt etwa 0,05 A₂₆₀-Einheiten L6 in 15 µl Kinasepuffer vor dem Annealing-Schritt mit der gleichen molaren Menge L5 mittels PNK am 5′-Ende phosphoryliert wurden. Durch 15minüti ges Erhitzen des Ligationsgemisches auf 65°C wird die T4-DNA- Ligase inaktiviert. Zur Kinasierung der nach der zweiseitigen Linkeranlagerung vorliegenden freien 5′-OH-Enden (am L4- und L5-Strangende) wird das temperierte Ligationsgemisch auf 3 mM ATP eingestellt und mit 2 Einheiten PNK 25 Minuten bei 37°C in kubiert. Das 5′-L4*/L5*-flankierte Plasmidfragment wird durch Agarose-Gelelektrophorese wie beschrieben von dem Linkerüber schuß abgetrennt und isoliert. Etwa 30 ng der so gewonnenen Vektor-DNA werden im abschließenden gentechnischen Konstruk tionsschrittt über die L4*- und L5*-komplementären Hexanukleo tid-Enden mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase üN in vitro zikulari siert. Der Ligationsansatz wird in kompetente Zellen von E. coli TG1 transformiert und 1/3 des Ligationsansatzes auf Amp- NA-Platten ausgestrichen. Von 12 Klonen werden Plasmid-Mini präps hergestellt und diese auf Anwesenheit von singulären NaeI-Restriktasespaltorten (Boehringer) getestet. Einer der NaeI-positiven Klone wird durch DNA-Sequenzanalyse als das Ba sisplasmid mit dem erwarteten Linker-Insert identifiziert. Die ses Plasmid erhält die Bezeichnung pUC19sak1 und wird für die folgenden Konstruktionsschritte in präparativem Maßstab bereit gestellt.The second linker pair, namely L5 / L6 *, is attached to about 600 ng of the thus purified fragment in 70 µl reaction volume using 4 units of T4 DNA ligase above sea level, in a preceding step about 0, 05 A ₂₆₀ units L6 in 15 µl kinase buffer were phosphorylated with the same molar amount L5 using PNK at the 5 'end before the annealing step. The T4 DNA ligase is inactivated by heating the ligation mixture to 65 ° C. for 15 minutes. To kinase the free 5′-OH ends present at the bilateral linker attachment (at the L4 and L5 strand ends), the tempered ligation mixture is adjusted to 3 mM ATP and incubated with 2 units of PNK at 37 ° C. for 25 minutes. The 5'-L4 * / L5 * -flanked plasmid fragment is separated from the linker excess and isolated by agarose gel electrophoresis as described. About 30 ng of the vector DNA obtained in this way are cicularized in vitro in the final genetic engineering step via the L4 * and L5 * complementary hexanucleotide ends with 1 unit of T4 DNA ligase. The ligation mixture is transformed into competent cells from E. coli TG1 and 1/3 of the ligation mixture is spread on AmpNA plates. Plasmid mini preps are produced from 12 clones and these are tested for the presence of unique NaeI restriction sites (Boehringer). One of the NaeI positive clones is identified by DNA sequence analysis as the base plasmid with the expected linker insert. This plasmid is given the designation pUC19sak1 and is provided on a preparative scale for the following construction steps.

Example 3 Construction of the intermediate plasmids pUC19sakA1

Zunächst wird nach dem gleichen Verfahren, das bei der Her stellung von pUC19sak0 ausführlich beschrieben wurde, ein L7*/L8-flankiertes pUC19-Vektorfragment hergestellt, indem das Linkerpaar L7*/L8 an die PstI-Enden des linearisierten pUC19 angelagert und nachfolgend in der PKS mit SalI gespalten wird.First of all, the same procedure as that used in Her position of pUC19sak0 has been described in detail L7 * / L8-flanked pUC19 vector fragment produced by the Linker pair L7 * / L8 to the PstI ends of the linearized pUC19 is deposited and subsequently split in the PKS with SalI.

Zur Gewinnung des für den Bereich der Aminosäuren 5 bis 124 der reifen Wildtyp-SAK42D kodierenden DNA-Fragmentes von sak42D wird in einem Zwischenschritt aus dem Stamm E. coli TG1(pMET5) das Plasmid pMET5 isoliert. Aus diesem wird eine ausreichende Menge des die gewünschte Gensequenz tragenden, 1,2 kb großen SalI/PstI-Fragmentes gewonnen. Dazu werden ca. 50 µg pMET5 in 250 µl H-Puffer erst mit 200 Einheiten SalI (Boehringer) ver daut und nach vollständiger Spaltung mit der gleichen Aktivität PstI (Boehringer) nachverdaut. Das SalI/PstI-Fragment wird nach Agarose-Gelelektrophorese aus einem 1,2%igen Gel isoliert. Zur Abtrennung des 3′-flankierenden, nicht für SAK42D kodierenden DNA-Bereiches werden etwa 2 µg dieses Fragmentes in 150 µl un ter M-Puffer-Bedingungen gleichzeitig mit jeweils 15 Einheiten der Restriktasen AvaI und AvaII inkubiert und nachfolgend mit 15 Einheiten HinfI (alle Enzyme Boehringer) nachverdaut. Das bei der Reaktion neben sehr kleinen Spaltfragmenten entstehende 361 bp große SalI/HinfI-sak42D-Genfragment wird durch Elektro phorese in einem 1,8%igen Agarosegel so auf günstige Weise isoliert.For the production of amino acids 5 to 124 the mature wild-type SAK42D encoding DNA fragment from sak42D is in an intermediate step from the strain E. coli TG1 (pMET5) the plasmid pMET5 isolated. This becomes an adequate one Amount of 1.2 kb carrying the desired gene sequence SalI / PstI fragment obtained. About 50 µg pMET5 in 250 µl H buffer only with 200 units of SalI (Boehringer) ver indigestion and after complete splitting with the same activity PstI (Boehringer) digested again. The SalI / PstI fragment is after Agarose gel electrophoresis isolated from a 1.2% gel. For Separation of the 3'-flanking, not coding for SAK42D DNA range are about 2 ug of this fragment in 150 ul M buffer conditions at the same time with 15 units each of the AvaI and AvaII restrictases and subsequently with 15 units of HinfI (all Boehringer enzymes) digested again. The very small cleavage fragments formed during the reaction 361 bp SalI / HinfI-sak42D gene fragment is by electro in a 1.8% agarose gel isolated.

Etwa 50 ng des gewonnenen SalI/HinfI-Fragmentes werden in 30 ng des in dem vorangehenden Abschnitt beschriebenen modifi zierten pUC19-Vektor inseriert und in E. coli TG1 kloniert. Ein Screening auf Anwesenheit von StyI-Restriktionsspaltorten in ausgewählten Klonen und DNA-Sequenzanalyse bestätigten das Vor liegen der erwarteten Insertsequenz in einer repräsentativen Anzahl von Plasmid-Minipräps. Einer der so charakterisierten Klone wird ausgewählt und im weiteren als Quelle für das Plas mid pUC19sakA1 verwendet.About 50 ng of the SalI / HinfI fragment obtained are in 30 ng of the modifi described in the previous section adorned pUC19 vector and cloned in E. coli TG1. A Screening for the presence of StyI restriction sites in selected clones and DNA sequence analysis confirmed the pre are in a representative range of the expected insert sequence Number of plasmid mini preps. One of the so characterized Clones are selected and subsequently as the source for the plas mid pUC19sakA1 used.

Example 4 Production of the basic plasmid pUC19sakA2

Nach den gleichen gentechnischen Schritten wie in Beispiel 3 beschrieben, wird an die Enden des EcoRI-geöffneten Plasmides pUC19sakA1 das Linkerpaar L9*/L10 angelagert. Nach Phenolex traktion und EtOH-Fällung werden etwa 3 µg des linkersubstitu ierten Plasmidfragmentes in 80 µl B-Puffer mit 15 Einheiten HindIII (Boehringer) verdaut und das Spaltgemisch in einem 1,6%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Aus dem Gel wird sowohl das L9/L10-HindIII-flankierte, im nachfolgenden Teilschritt als Vektorfragment fungierende DNA-Fragment als auch das sak-Gen-tragende 414 bp große Bruchstück isoliert.Following the same genetic engineering steps as in example 3 is described at the ends of the EcoRI-opened plasmid pUC19sakA1 attached the linker pair L9 * / L10. According to Phenolex traction and EtOH precipitation become about 3 µg of the linker substituent ized plasmid fragment in 80 ul B buffer with 15 units HindIII (Boehringer) digested and the gap mixture in one 1.6% agarose gel separated electrophoretically. From the gel is flanked by both the L9 / L10 HindIII, hereinafter Partial step as a DNA fragment acting as DNA fragment the 414 bp fragment bearing the sak gene is also isolated.

Etwa 250 ng des letztgenannten Subfragmentes werden in 50 µl NE2-Puffer mit 10 Einheiten MnlI (New England Biolabs, Schwalbach) nachverdaut, wodurch aus dem Reaktionsgemisch das 290 bp große MnlI/HindIII-Fragment nach Gelelektrophorese aus einem 1,8%igen Agarosegel isoliert werden kann. Etwa 25 ng des so gewonnenen, für den Bereich ab Aminosäure 46 von SAK42D ko dierenden DNA-Fragmentes werden abschließend in 30 ng des oben isolierten Vektorfragmentes gemäß Standardprozeduren in E. coli TG1 kloniert.About 250 ng of the latter subfragment are in 50 µl NE2 buffer with 10 units of MnlI (New England Biolabs, Schwalbach) digested, so that from the reaction mixture 290 bp MnlI / HindIII fragment after gel electrophoresis a 1.8% agarose gel can be isolated. About 25 ng of thus obtained, for the region from amino acid 46 of SAK42D ko DNA fragment are finally in 30 ng of the above isolated vector fragment according to standard procedures in E. coli TG1 cloned.

Eine repräsentative Anzahl von Plasmid-Minipräps werden durch Doppelverdauuung sowohl mit SalI und HindIII (alle Enzyme Boehringer) als auch mit SacII und HindIII (alle Enzyme Boeh ringer) unter jeweils angepaßten Bedingungen auf das Vorhanden sein der gesuchten DNA-Abschnitte getestet. Nach DNA-Sequenz analyse wird einer der positiven Klone zur Isolierung des nun mehr als pUC19sakA2 bezeichneten zweiten Basisplasmides ausge wählt.A representative number of plasmid mini preps will be made by double digestion with both SalI and HindIII (all enzymes Boehringer) as well as with SacII and HindIII (all enzymes Boeh ringer) under existing conditions be tested of the searched DNA sections. By DNA sequence analysis becomes one of the positive clones for isolating the now more than pUC19sakA2 designated second base plasmids elects.

Example 5 Production of the SAKM26X-encoding donor plasmids pUC19sakM26X

Mit Hilfe der automatisierten Oligonukleotidsynthese (380B Synthesizer, Applied Biosystems, Weiterstadt) werden durch si multanen Einbau von 3 bzw. 4 verschiedenen Nukleotidbausteinen in die beiden ersten Positionen des Kodons 26 die Adapterge mische AG11, AG12, AG13 und AG14 bereitgestellt, die jeweils eine Mischung von 12 Sequenzvarianten darstellen. Gemäß des für die Konstruktion des zweiten Basisplasmides entwickelten Ver fahrens wird in einem Ansatz das Adaptergemisch AG12 und in ei nem anderen Ansatz das Adaptergemisch AG14 kinasiert. Die phos phorylierten Linkergemische werden durch Annealing mit den je weils komplementären Adaptergemischen AG11 bzw. AG13 zu doppel strängigen DNA-Fragmenten vereinigt. Nach der Ankopplung der so erhaltenen Adapterpaargemische an die SalI-Enden des mit diesem Enzym geöffneten zweiten Basisplasmides pUC19sakA2 in separaten Reaktionsschritten werden nach HindIII-Verdauung wie beschrie ben diejenigen Reaktionsgemische erhalten, aus welchen durch gelelektrophoretische Auftrennung in einem Fall das AG11/AG12- und im anderen Fall das AG13/AG14-determinierte Fragmentgemisch isoliert wird. Diese Gemische werden jeweils durch ein HindIII- und durch ein stumpfes (blunt), damit NaeI-kompatibles Ende be grenzt.With the help of automated oligonucleotide synthesis (380B Synthesizers, Applied Biosystems, Weiterstadt) are by si Multane incorporation of 3 or 4 different nucleotide building blocks in the first two positions of codon 26 the adapterge mix AG11, AG12, AG13 and AG14, each provided represent a mixture of 12 sequence variants. According to the for the construction of the second basic plasmid developed Ver in one approach, the adapter mixture AG12 and in egg In another approach, the AG14 adapter mixture kinased. The phos phorylated linker mixtures are annealed with each because complementary adapter mixtures AG11 or AG13 to double stranded DNA fragments combined. After coupling the so obtained adapter pair mixtures at the SalI ends of the with this Enzyme opened second base plasmid pUC19sakA2 in separate Reaction steps are as described after HindIII digestion ben receive those reaction mixtures from which by gel electrophoretic separation in one case the AG11 / AG12- and in the other case the AG13 / AG14-determined fragment mixture is isolated. These mixtures are each replaced by a Hind III and by a blunt, so NaeI compatible end be borders.

Jeweils 150 ng jedes Fragmentgemisches werden mit 100 ng NaeI/HindIII-linearisiertem ersten Basisplamid pUC19sak1 rekom biniert und in E. coli TG1 kloniert. Eine Vielzahl von Klonen beider Serien werden durch Restriktasedoppelspaltungen der Plasmid-Minipräps mit EcoRI und HindIII auf das Vorliegen von 436 bp großen DNA-Inserten vorselektiert. In einem umfangrei chen Programm der DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung des Pri mers S26 werden schließlich aus der L11/L12*-Serie die Plasmide gefunden, die an Position 26 des sak126X-Genes folgende Kodone tragen:150 ng of each fragment mixture are mixed with 100 ng NaeI / HindIII-linearized first base plamide pUC19sak1 recom binated and cloned in E. coli TG1. A variety of clones both series are restricted by double cleavage of the Plasmid minipreps with EcoRI and HindIII for the presence of 436 bp DNA inserts pre-selected. In an extensive Program of DNA sequence analysis using the Pri mers S26 finally become the plasmids from the L11 / L12 * series found the following codons at position 26 of the sak126X gene carry:

ATA(Ile), AGA(Arg), GTA(Val), ACA(Thr), AAA(Lys), und CTA(Leu)ATA (Ile), AGA (Arg), GTA (Val), ACA (Thr), AAA (Lys), and CTA (Leu)

Ausgehend von der LG13/LG14*-Serie wurden Plasmide selektiert, die an Position 26 des sakM26X-Genes folgende Kodone aufweisen:Based on the LG13 / LG14 * series, plasmids were selected, which have the following codons at position 26 of the sakM26X gene:

TGC(Cys), GCC(Ala), CAC(His), GGC(Gly) und TCC(Ser).TGC (Cys), GCC (Ala), CAC (His), GGC (Gly) and TCC (Ser).

Example 6 Production of the expression plasmids of the type pMEX6sakM26X

Das Expressionsplasmid pMEX6 (medac, Hamburg) wird aus dem Stamm E. coli TG1(pMEX6) nach Standardprotokoll durch Ethidium bromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Etwa 20 µg dieses Vektors werden mit 100 Einheiten EcoRI bis zur vollständigen Linearisierung gespalten, mit 100 Einheiten PstI (Boehringer) unter gleichen Bedingungen nachverdaut, und schließlich wird der so gespaltene Vektor durch Elektrophorese an 1%iger Agarose von der PKS abgetrennt. Aus den 11 Träger plasmiden pUC19sakM26X werden jeweils die 433 bp großen EcoRI/PstI-Fragmente, welche am 5′-Ende zusätzlich die Transla tionssignalsequenzen (RBS und ATG-Startkodon) tragen, wie be schrieben gelelektrophoretisch aus einem 1,6%igen Agarosegel isoliert.The expression plasmid pMEX6 (medac, Hamburg) is derived from the E. coli strain TG1 (pMEX6) according to standard protocol by Ethidium Bromide-cesium chloride density gradient centrifugation obtained. About 20 µg of this vector are mixed with 100 units of EcoRI split for full linearization, with 100 units PstI (Boehringer) re-digested under the same conditions, and finally the vector thus cleaved is electrophoresis separated from the PKS on 1% agarose. From the 11 carriers plasmids pUC19sakM26X will each be 433 bp EcoRI / PstI fragments, which additionally have the transla at the 5′-end tion signal sequences (RBS and ATG start codon) carry, as be wrote gel electrophoresis from a 1.6% agarose gel isolated.

Etwa 50 ng jedes dieser expressionsangepaßten sak-Genfrag mente werden in separaten Ansätzen mit ca. 20 ng des EcoRI/PstI-linearisierten Vektors pMEX6 ligiert und in E. coli TG1 kloniert. Aus je 10 ml Kulturlösung der das jeweilige Ex pressionsplasmid enthaltenden E. coli TG1-Stämme werden nach der Minipräp-Methode die entsprechenden Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse mit EcoRI und PstI sowie durch Se quenzanalyse beider Stränge charakterisiert. Die jeweils die erwartete sak-Gensequenz tragenden Plasmide werden der Plasmid familie pMEX6sakM26X zugeordnet.About 50 ng of each of these expression-adapted sak gene questions elements are separated in approx. 20 ng EcoRI / PstI linearized vector pMEX6 ligated and in E. coli TG1 cloned. From each 10 ml culture solution the respective Ex E. coli TG1 strains containing pressure plasmid are identified the corresponding plasmids are isolated using the miniprep method and by restriction analysis with EcoRI and PstI as well as by Se characterized the sequence analysis of both strands. The each the expected plasmids carrying the sak gene sequence will be the plasmid assigned to family pMEX6sakM26X.

Zum analytischen Nachweis der induzierbaren Überexpression der SAKM26X-Varianten in den entsprechenden, mit den Plasmiden pMEX6sakM26X transformierten E. coli TG1-Stämmen werden jeweils 5 ml eines 2fach konzentrierten Trypton-Hefeextrakt-Mediums, welches zusätzlich mit 50 µg/ml Ampicillin ausgestattet ist, (2xTY-Amp-Medium) mit 100 µl einer üN-Kultur beimpft, die aus einer Einzelkolonie des jeweiligen E. coli TG1(pMEX6sakM26X)- Stammes bereitet wurde. Es wird 3 Stunden bei 37°C unter Schüt teln kultiviert und danach die Expression durch Zugabe einer sterilen IPTG-Lösung (40 mg/ml Isopropanol) bis zu einer End konzentration von 0,2 mM induziert. Die Fermentation wird 4 Stunden fortgeführt und die Zellen von 1 ml Kulturmedium dann durch Zentrifugation gesammelt. Das Zellpellet wird in 400 µl 40 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, mit 100 µl 5fach konzentrierter Zellaufschlußlösung (20%ige SDS-Lösung/β- Mercaptoäthanol/Glycerol/0,02%ige Bromphenolblau-Lösung; 6 : 1 : 1 : 0,1; V/V ) versetzt und während 5 Minuten im siedenden Wasserbad aufgeschlossen. Aliquote (2 bis 6 µl) der so herge stellten Lysate werden nach Standardprotokoll in einem 1 mm dicken 15%igen SDS-Polyacrylamid-Gel nach Coomassie-Brilliant- Blue-G250-Färbung in Hinsicht auf das Auftreten einer überex primierten Proteinbande analysiert (Abb. 4 ). For analytical detection of the inducible overexpression of the SAKM26X variants in the corresponding E. coli TG1 strains transformed with the plasmids pMEX6sakM26X, 5 ml each of a 2-fold tryptone yeast extract medium, which is additionally equipped with 50 µg / ml ampicillin, ( 2xTY-Amp-Medium) with 100 µl of a ÜN culture, which was prepared from a single colony of the respective E. coli TG1 (pMEX6sakM26X) strain. It is cultivated for 3 hours at 37 ° C. with shaking and then expression is induced by adding a sterile IPTG solution (40 mg / ml isopropanol) to a final concentration of 0.2 mM. The fermentation is continued for 4 hours and the cells are then collected from 1 ml of culture medium by centrifugation. The cell pellet is suspended in 400 µl 40 mM phosphate buffer (pH 7.0) with 100 µl 5-fold concentrated cell disruption solution (20% SDS solution / β-mercaptoethanol / glycerol / 0.02% bromophenol blue solution; 6: 1: 1: 0.1; V / V) and digested for 5 minutes in a boiling water bath. Aliquots (2 to 6 µl) of the lysates produced in this way are analyzed according to the standard protocol in a 1 mm thick 15% SDS polyacrylamide gel after Coomassie Brilliant Blue G250 staining with regard to the occurrence of an overex primed protein band ( Fig . 4).

Example 7 Fermentation of the E. coli TG1 (pMEX6sakM26X) strains and purification of the SAKM26X proteins

Alle Stämme werden gemäß dem nachfolgend beschriebenen Bei spiel fermentiert und aufgearbeitet. Die Fermentation erfolgt bei 37°C in mit 200 ml Medium gefüllten 500-ml-Rundkolben unter intensivem Schütteln ohne zusätzliche Belüftung. Dazu werden 5 ml 2xTY-Amp-Medium mit einer Einzelkolonie des entsprechenden Stammes beimpft und ca. 16 Stunden bei 37°C unter Schütteln vorkultiviert. Jeweils 2 ml dieser Vorkultur werden zum Be impfen von 200 ml des gleichen Mediums verwendet. Diese Kultu ren werden bei 35°C geschüttelt, bis eine bei 600 nm gemessene optische Dichte von 0,4 bis 0,9 erreicht ist. Nach Erreichen dieser Zelldichte wird die Expression der auf den Plasmiden pMEX6sakM26X kodierten Staphylokinase-Gene durch Zugabe von 400 µl einer sterilen wäßrigen IPTG-Lösung (40 mg/ml) induziert. Im Anschluß daran werden die Kulturen weitere 2 bis 6 Stunden bei 37°C geschüttelt und dann durch Zentrifugation bei 4°C und 4000 rpm geerntet. Die Zellniederschläge werden in 1/20 bis 1/40 Vo lumenäquivalenten (bezüglich des Kulturvolumens) Aufschlußpuf fer (40 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA und 10 mM β-Mercaptoethanol) suspendiert und mit Phenylmethylsulfonylfluorid bis zu einer Endkonzentration von 1 mM versetzt. Die Suspensionen werden auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur 15 Minuten mit Ultraschall (Leistung 100 bis 120 MBit) aufgeschlossen.All strains are according to the case described below game fermented and processed. The fermentation takes place at 37 ° C in 500 ml round bottom flasks filled with 200 ml medium intensive shaking without additional ventilation. For this, 5 ml 2xTY amp medium with a single colony of the corresponding Inoculated the strain and shake for about 16 hours at 37 ° C pre-cultivated. 2 ml of this preculture are used for loading Inoculate 200 ml of the same medium used. This culture Ren are shaken at 35 ° C until one measured at 600 nm optical density of 0.4 to 0.9 is reached. After reaching This cell density is the expression of the on the plasmids pMEX6sakM26X encoded staphylokinase genes by adding 400 µl of a sterile aqueous IPTG solution (40 mg / ml) induced. in the After that, the cultures are left for another 2 to 6 hours Shaken at 37 ° C and then by centrifugation at 4 ° C and 4000 rpm harvested. The cell precipitation is in 1/20 to 1/40 Vo lumen equivalents (in terms of culture volume) digestion puff fer (40 mM phosphate buffer (pH 6.5), 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA and 10 mM β-mercaptoethanol) suspended and with Phenylmethylsulfonyl fluoride up to a final concentration of 1 mM offset. The suspensions are cooled to 0 ° C and at this temperature for 15 minutes with ultrasound (power 100 to 120 Mbit) unlocked.

Die Aufschlüsse werden bis zur Aufarbeitung bei -20°C gela gert. Am Beginn der Aufreinigung werden maximal 30 ml Auf schlußsuspension im Wasserbad (30°C) aufgetaut und danach 60 Minuten bei 4°C und 25 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird mit H₂O auf das 4fache Volumen verdünnt und anschließend auf eine mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) äquilibrierte Chromato grafiesäule gepumpt, die S-Sepharose fast flow (Pharmacia, Freiburg) enthält. Das Gelbett hat einen Durchmesser von 2,6 cm und eine Höhe von 30 cm. Die Flußgeschwindigkeit beim Auftragen beträgt 1,9 ml/min. Anschließend wird mit dem Äquilibrierungs puffer gewaschen (Flußgeschwindigkeit 3,8 ml/min), bis die Ba sislinie der UV-Detektion (280 nm) erreicht wird. Das ungebun den die Säule passierende Material enthält nur Spuren von SAKM26X und wird verworfen. Die Elution der Säule (Flußrate 3,8 ml/min) erfolgt mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), der 250 mM NaCl enthält. Das Elutionsprofil zeigt mehrere Peaks, von denen einer das entsprechende SAKM26X-Protein in angereicherter Form enthält (Nachweis in SDS-PAGE). Die entsprechenden Peak-Frak tionen werden vereinigt und anschließend durch Zugabe von NaCl in Salzform (Endkonzentration 2,0 M NaCl) für die Chromatogra phie an Phenyl-Sepharose vorbereitet. Für diesen Schritt wird eine fertiggepackte HiLoad-Phenyl-Sepharose HP XK26/10-Säule (Pharmacia) verwendet, die mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, der 2,0 M NaCl enthält, äquilibriert worden ist. Nach dem Pro benauftrag (Flußrate 5,0 ml/min) wird mit Äquilibrierungspuffer bis zum Erreichen der Basislinie der UV-Detektion gewaschen (Flußrate 12,6 ml/min). Danach werden die SAK-Derivate mit ei nem absteigenden Salzgradienten (Flußrate 12,6 ml/min) eluiert:The digestions are stored at -20 ° C until they are worked up. At the start of the purification, a maximum of 30 ml of the final suspension are thawed in a water bath (30 ° C.) and then centrifuged for 60 minutes at 4 ° C. and 25,000 rpm. The supernatant is diluted to 4 times the volume with H ₂ O and then pumped onto a chromatography column equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 6.5), which contains S-Sepharose fast flow (Pharmacia, Freiburg). The gel bed has a diameter of 2.6 cm and a height of 30 cm. The flow rate during application is 1.9 ml / min. The mixture is then washed with the equilibration buffer (flow rate 3.8 ml / min) until the baseline of the UV detection (280 nm) is reached. The unbound material that passes through the column contains only traces of SAKM26X and is discarded. The column is eluted (flow rate 3.8 ml / min) with 10 mM phosphate buffer (pH 6.5) which contains 250 mM NaCl. The elution profile shows several peaks, one of which contains the corresponding SAKM26X protein in enriched form (detection in SDS-PAGE). The corresponding peak fractions are combined and then prepared for the chromatography on phenyl Sepharose by adding NaCl in salt form (final concentration 2.0 M NaCl). For this step a pre-packed HiLoad-Phenyl-Sepharose HP XK26 / 10 column (Pharmacia) is used, which has been equilibrated with 10 mM phosphate buffer, pH 6.5, which contains 2.0 M NaCl. After the sample application (flow rate 5.0 ml / min) is washed with equilibration buffer until the baseline of the UV detection is reached (flow rate 12.6 ml / min). The SAK derivatives are then eluted with a descending salt gradient (flow rate 12.6 ml / min):

100% Puffer A → 25% Puffer A
0% Puffer B → 75% Puffer B100% buffer A → 25% buffer A
0% buffer B → 75% buffer B

Puffer A: 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5; 2,0 M NaCl
Puffer B: 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5.Buffer A: 10 mM phosphate buffer, pH 6.5; 2.0 M NaCl
Buffer B: 10 mM phosphate buffer, pH 6.5.

Das Gesamtgradientenvolumen beträgt 300 ml. Das Verfahren gestattet die Gewinnung reiner SAKM26X-Proteine (Reinheitskriterien SDS-PAGE und isoelektrische Focussierung) in nur zwei Reinigungsschritten. Die Effektivität des Reini gungsverfahrens ist aus Abb. 5 ersichtlich, in der die exempla rische Konzentrierung des SAKM26L Proteins aus den Zellrohex trakten bis hin zur elektrophoretischen Homogenität anhand ei nes SDS-Geles dargestellt ist.The total gradient volume is 300 ml. The process allows pure SAKM26X proteins (purity criteria SDS-PAGE and isoelectric focusing) to be obtained in only two purification steps. The effectiveness of the purification process can be seen in Fig. 5, in which the exemplary concentration of the SAKM26L protein from the cell raw extracts up to electrophoretic homogeneity is shown using an SDS gel.

Example 8 Determination of the specific activity of SAKM26X proteins compared to SAK42D

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität ist für den Ver gleich der plasminogenaktivierenden Kapazität der SAKM26X-Pro teine untereinander und im Vergleich zu SAK42D (gewonnen aus E. coli TG1(pMEX602sak); vgl. Patentschrift DE-OS 41 43 279) not wendig. Die spezifischen Aktivitäten der Staphylokinasen werden definiert als diejenigen Mengen Plasmin (mg), die von 1 mg der entsprechenden SAKM26X aus Plasminogen (eingesetzt im Über schuß) pro Minute freigesetzt wird. In separaten Bestimmungen werden deshalb die Plasminfreisetzung durch SAK42D und SAKM26X- Proteine (a) und deren Proteinkonzentration (b) ermittelt.The determination of the specific activity is for the ver equal to the plasminogen activating capacity of the SAKM26X-Pro teine with each other and in comparison to SAK42D (obtained from E. coli TG1 (pMEX602sak); see. Patent specification DE-OS 41 43 279) not agile. The specific activities of staphylokinases will be defined as those amounts of plasmin (mg) ranging from 1 mg of corresponding SAKM26X from plasminogen (used in over shot) is released per minute. In separate provisions are therefore the release of plasmin by SAK42D and SAKM26X- Proteins (a) and their protein concentration (b) determined.

a1) First, dilution series of SAK42D and SAKM26X proteins made in 100 mM Tris (pH 8.0). Then a reaction mixture consisting of 30 ul Plasminogen solution (20 mg plasminogen (Fluka) dissolved in 1 ml distilled water), 150 µl 100 mM Tris buffer (pH 8.0) and 10 µl activator solution (dilution series SAK42D or SAKM26X). This mixture is at 10 minutes Incubated at 25 ° C.
a2) The plasma substrate Chromozym-PL (Boehringer) is called 2 mM solution in aqua dest. scheduled. To 50 µl of this solution 400 ul 100 mM Tris (pH 8.0) and and 50 ul given from the activation approach a1. This mixture is incubated at 25 ° C for 2 minutes. After that, the reaction stopped with 25 µl of concentrated acetic acid. At the same time, a plasmin calibration series is carried out in step a2 prepared by adding 50 µl of a plasmin dilution series with 400 µl 100 mM Tris buffer (pH 6.5) and 50 µl of Chromozym-PL solution included under the same conditions beers and be stopped. In reference samples, the Implementation of the plasma substrate by adding 25 µl concentrated acetic acid in combination with the activation sample prevented from approach a1. Reference samples, Calibration samples and the actual measurement samples (250 µl each) are placed in a 96-well microtiter plate (Flat bottom) pipetted and the absorption at 405 nm in measured with a multi-channel photometer. From the absorption values of the test samples, under Be taking into account the absorption values of the plasmin calibration series and the reference samples calculated the amount of plasmin by the in the starting solutions (see a1) contained SAK42D or SAKM26X proteins per minute is released.
b) The determination of the protein content of the samples, the SAK42D or SAKM26X, is done using the Bio-Rad Pro tein assays (Bio-Rad, Munich) with bovine serum albumin as standard.

Unter Berücksichtigung des Proteingehalts sowie der Plas minfreisetzung können nunmehr die spezifischen Aktivitäten von SAK42D- bzw. SAKM26X-Proteinen ermittelt und verglichen werden. Auf diese Weise ergeben sich für die beschriebenen Staphyloki nasen die in Abb. 6 zusammengefaßten spezifischen Aktivitäten. Taking the protein content and the plasma release into account, the specific activities of SAK42D and SAKM26X proteins can now be determined and compared. This results in the specific activities summarized in Fig. 6 for the Staphyloki noses described.

Tabelle1 Table 1

Zusammenstellung der im beschriebenen Verfahren benutzten Oligonukleotide Compilation of the oligonucleotides used in the described method

Description of the pictures

Abb. 1 Physische und Restriktionskarte des Plasmides pMET5, das als Ausgangsplasmid für die gentechnischen Kon struktionen der erfindungsgemäßen Plasmide dient Fig. 1 Physical and restriction map of the plasmid pMET5, which serves as the starting plasmid for the genetic engineering constructions of the plasmids according to the invention

Abb. 2 Physische und Restriktionskarte der Plasmidfamilie pMEX6sekM26X, die als erfindungsgemäße Expressionsplasmide für die Expression reifer Staphylokinase vom Typ SAKM26X dienen Fig. 2 Physical and restriction map of the plasmid family pMEX6sekM26X, which serve as expression plasmids according to the invention for the expression of mature staphylokinase of the SAKM26X type

Abb. 3 Vollständige Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen Strukturgens für reife Staphylokinase der Familie SAKM26X und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz mit erfindungsgemäßer Tandemkonfiguration portabler Ri bosomensequenzen Fig. 3 Complete nucleotide sequence of the structural gene according to the invention for mature staphylokinase of the SAKM26X family and the resulting amino acid sequence with a tandem configuration according to the invention of portable rhomboid sequences

Abb. 4 Verdeutlichung der Überexpression von Staphylokinasen der Familie SAKM26X nach Induktion mit IPTG in nachfol gend aufgeführten E. coli TG1(pMEX6sakM26X)-Stämmen an hand eines 15%igen SDS-PAG-Elektropherogrammes von Zellrohlysaten Fig. 4 Clarification of the overexpression of staphylokinases from the SAKM26X family after induction with IPTG in the E. coli TG1 (pMEX6sakM26X) strains listed below using a 15% SDS-PAG electropherogram of cell raw lysates

Abb. 5 Exemplarische Veranschaulichungen der Anreicherung von SAKM26X im Verlauf chromatographischer Anreiche rungsschritte aus Ultraschall-Rohlysaten von E. coli TG1(pMEX6sakM26X)-Zellen am Beispiel der Aufreinigung von SAKM26L durch SDS-PAGE Fig. 5 Exemplary illustrations of the enrichment of SAKM26X in the course of chromatographic enrichment steps from ultrasonic raw lysates of E. coli TG1 (pMEX6sakM26X) cells using the example of the purification of SAKM26L by SDS-PAGE

Abb. 6 Spezifische Aktivitäten von SAKM26X und SAK42D. Fig. 6 Specific activities of SAKM26X and SAK42D.

Claims

1. Collection of DNA sequences of the structure where klm either
ATA or
AGA or
GTA or
ACA or
AAA or
CTA or
TGC or
GCC or
CAC or
GGC or
TCC
means, each of which codes for a mature methionine-free Phi42D staphylokinase (short word: SAKM26X).

2. Recombinant base plasmid, characterized in that it

is a deriyate of the E. coli cloning vector pUC19 and
- In the polylinker region of this vector contains the DNA sequence coding for amino acids 1 to 22, ie for region I, of a SAKM26X.

3. Recombinant base plasmid according to claim 2, characterized ge indicates that it is the one for area I of a SAKM26X coding DNA sequence in a functional coupling to a Tandem configuration of ribosome binding sequences (short word: RBS) contains.

4. Recombinant base plasmid pUC19sak1 according to claim 3, characterized in that it is a 87 bp EcoRI / NaeI fragment that encodes the region I coding for a SAKM26X DNA sequence in functional coupling to the RBS tandem configuration contains.

5. Recombinant base plasmid, characterized in that it

is a derivative of the E. coli cloning vector pUC19 and
- In the polylinker region of this vector contains the DNA sequence coding for amino acids 32 to 136, ie for region II, of a SAKM26X.

6. Recombinant base plasmid pUC19sakA2 according to claim 5, since characterized in that it is in its polylinker range as a 322 bp SalI / PstI fragment the DNA sequence of the Area II of a SAKM26X contains.

7. Family of recombinant carrier plasmids, characterized in that each plasmid from this family

is a derivative of the E. coli cloning vector pUC19 and
- In its Polylinkerbereich each contains a DNA from the collection of claim 1, which codes for a mature methionine-free staphylokinase SAKM26X.

8. carrier plasmid family {pUC19sakM26X} according to claim 7 as 4 and 6, characterized in that each plasmid this family in its polylinker region after synchronous linkage

the 81 bp EcoRI / NaeI fragment from base plasmid pUC19sak1,
- A pair of linkers constructed accordingly
- The 322 bp SalI / PstI fragment from plasmid pUC19sakA2

as a 436 bp EcoRI / PstI total fragment each a DNA coding for a mature methionine-free staphylokinase SAKM26X from the collection of claim 1 in functional coupling to the RBS tandem contains.

9. family of recombinant expression plasmids, characterized in that each plasmid of this family

- is a derivative of the E. coli expression vector pMEX6 and
- Each contains a DNA coding for a mature methionine-free Staphylokinase SAKM26X from the collection of claim 1 in functional coupling to expression control sequences which have a complete RtacR configuration.

10. Expression plasmid family {pMEX6sakM26X} according to claim 9 and 8, characterized in that each plasmid of this Family as insert from the assigned pUC19sakM26X-Trä gerplasmid a 436 bp EcoRI / PstI fragment with a for one mature methionine-free staphylokinase SAKM26X encoding DNA from the collection of claim 1 in functional connection to the RtacR configuration with the RBS tandem according to claim 4 or 8.

11. Ensemble of recombinant E. coli producer strains, thereby characterized that each tribe of this ensemble an expression plasmid from the families according to claim 9 or carries 10 in itself.

12th producer master ensemble {E. coli TG1 (pMEX6sakM26X} e according to claims 11 and 10, characterized in that each Strain of this ensemble each an expression plasmid of the (pMEX6sakM26X) family carries in itself and for biosynthesis the associated mature methionine-free staphylokinase SAKM26X is capable.

13. Collection {SAKM26X} of proteins with plasminogen activator activity in the form of mature methionine-free staphy locinases with the amino acid sequence where X is either
I (for isoleucine) or
R (for arginine) or
V (for valine) or
T (for threonine) or
K (for lysine) or
L (for leucine) or
C (for cysteine) or
A (for alanine) or
H (for histidine) or
G (for glycine) or
S (for serine)
means, characterized in that each protein of this collection is encoded by the assigned DNA from the collection according to claim 1.

14. A method for producing the SAKM26X proteins according to An Proof 13 by cultivating a recombinant E. coli Producer strain under sterile and aerobic-submerged loading conditions in a nutrient medium, the product synthesis 2 Hours to 6 hours after the start of fermentation by iso propylthiogalactopyranoside addition is induced, as well by isolating the target protein formed in each case Cell disruption through a combination of ion exchange and hydrophobic interaction chromatography, characterized thereby records that one each fermentation rearranged recombinant E. coli TG1 (pMEX6sakM26X) strain uses the ensemble according to claim 12.

15. Medicament (fibrinolytic) containing besides usual Excipients and carriers a mature methionine-free staphy lokinase SAKM26X from the collection of proteins according to An Proverb 13

16. Medicament according to claim 15, containing besides usual Auxiliaries and carriers the mature methionine-free staphylo kinase SAKM26C from the collection of proteins according to An Proverb 13, which uses the recombinant Strain E. coli TG1pMEX6sakM26C) according to the method of Claim 14 has been produced.

17. Medicament according to claim 15, containing besides usual Auxiliaries and carriers the mature methionine-free staphylo kinase SAKM26L from the collection of proteins according to An Proverb 13, which uses the recombinant E. coli strain TG1 (pMEX6sakM26L) according to the method of Claim 14 has been produced.