DE4223613A1 - Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden aus pektinhaltigen Stoffen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden aus pektinhaltigen StoffenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
ungesättigten Uroniden (Oligogalacturonsäuren) aus pektin
haltigen Stoffen unter Einsatz von Fermentation.
Pektinstoffe kommen in vielen Pflanzen als Bausteine für
das Zellwandgerüst vor. Sie können von pektolytischen En
zymen, den sogenannten Lyasen, zu niedermolekularen unge
sättigten Uroniden abgebaut werden, vgl. Albersheim et al.
Helv. Chim. Acta 43 (1960) 1422. Dabei wird das Grundgerüst
des Pektins nach Überführung in die entesterte Form (als
Pektinsäure oder Polygalacturonsäure) in der Weise in kurz
kettige Untereinheiten gespalten, daß an der vormaligen
Verknüpfungsstelle eine Doppelbindung entsteht:
Durch Umsetzung von sogenannter niedermolekularer Pektinsäure
aus Citrus-Pektin mit Pektatlyase wurde eine ungesättigte
Verbindung isoliert und als O-(4-Desoxy-L-threohexopyranos-4-
enyluronsäure)-(1-4)-D-galacturonsäure charakterisiert,
vgl. Hasegawa und Nagel, J.Biol. Chem. 237 (1962) 619.
Im Laufe der Zeit ist über die Gewinnung von verschiedenen
Pektatlyase-Typen aus Bakterien und Pilzen berichtet worden,
vgl. Linhardt et al., Appl. Biochem. Biotech. 12 (1986) 135.
Auch die Isolierung der ungesättigten Reaktionsprodukte
wurde bereits beschrieben und zwar wurde Anionenaustausch
chromatographie von Nagel und Wilson, J. Chromatogr. 41
(1969) 410 und präparative Hochleistungs-Flüssigchromato
graphie (HPLC) von Hotchkiss et al., Carbohydr. Res. 215
(1991) 81 vorgeschlagen.
Die Reaktions- und Produktkontrolle erfolgt vorzugsweise
mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie, vgl. Preston
und Rice, Carbohydr. Res., 215 (1991) 137-145.
Die Herstellung der o.g. ungesättigten Pektinsäure- (Poly
galacturonsäure-) Spaltprodukte erfolgt daher in der Praxis
in 4 Schritten, wobei die Verfahren mit Reinkulturen durchge
führt werden.
Es wird in einem ersten Schritt zunächst das Enzym gewonnen
(als Pektatlyase-Präparat bzw. Rohpräparat), etwa durch
sterile Fermentation vorgereinigter Pektinpräparate mit
Reinkulturen von Bakterien bzw. Pilzen, z. B. Bacillus sp.
In einem zweiten Schritt wird aus Reststoffen der Citrus-
oder Apfelsaftherstellung gewonnenes recht kostenintensives
reines Pektin benutzt und durch saure Hydrolyse Pektinsäure
bzw. Polygalacturonsäure hergestellt.
Diese beiden Substanzen (Polygalacturonsäure und Pektatlyase)
werden nunmehr in gepuffertem, wäßrigem Medium zur Reaktion
gebracht.
Es entstehen ungesättigte Uronide, auch als ungesättigte
Oligogalacturonsäuren bezeichnet. Sie werden abschließend
noch durch chromatographische Verfahren isoliert.
Diese Form der Herstellung ungesättigter Uronide ist auf
wendig und darüber hinaus mit hohen Kosten verbunden. Die
Gewinnung der Enzyme ist kompliziert und kostspielig.
Außerdem müssen gereinigte Substrate Pektin benutzt und
die Fermentation steril durchgeführt werden, so daß außerdem
hohe Investitionskosten für die dafür notwendigen Fermenta
tionseinrichtungen anfallen. Außerdem erfordert die aerob
durchgeführten Fermentation einen hohen Energieaufwand
zur Belüftung des Fermenters.
Die Verwendung der ungesättigten Uronide und ihrer homologen
Oligomeren wird zunehmend interessanter, so wurde die Verwen
dung als pharmazeutisches Präparat zur Prophylaxe und Thera
pie in der Medizin bei Intoxikation mit toxischen Schwerme
tallen in der DD 268 866 A1 vorgeschlagen und in der EP
0 294 879 A2 ihre Verwendung als Reaktionskomponente für
die Michael-Addition angeregt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein kostengünstigeres
Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden aus
pektinhaltigen Stoffen vorzuschlagen.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß der pektinhaltige
Stoff mit einer das Entstehen des Enzyms Pektatlyase för
dernden Bakterienkultur versetzt und anaerob fermentiert
wird, so daß gleichzeitig die pektinhaltigen Stoffe zumindest
teilweise in Polygalacturonsäure umgewandelt werden, daß
die Fermentation während des Vorgangs abgebrochen wird,
daß nach dem Abbruch die entstandene Fermentationsflüssig
keit von Bakterien befreit und eine katalytische Reaktion
des entstandenen Enzyms Pektatlyase in der Fermentations
flüssigkeit mit der Polygalacturonsäure gefördert wird, und
daß das entstehende Produkt ungesättigter Uroniden iso
liert wird.
Mit diesem Verfahren können als Ausgangsmaterialien Nebenpro
dukte der Lebensmittelindustrie mit sehr niedrigem Preis,
wie extrahierte Zuckerrübenschnitzel oder Kartoffelpülpe,
ohne weitere Vorbehandlung verwendet werden. Da diese Aus
gangsmaterialien zunehmend anfallen und ihre anderweitige
Verwendung oder auch ihre Beseitigung als Abfall zunehmend
erschwert ist, wird auf diese Weise zugleich eine Möglichkeit
geschaffen, diese Nebenprodukte sinnvoll weiterzuverarbeiten.
Das erfindungsgemäße Verfahren macht sich zunutze, daß
die pektinhaltigen Rohmaterialien sowohl zur Bildung der
Polygalacturonsäure als auch des Enzyms Pektatlyase heran
gezogen werden können. Nach Durchführung einer geeigneten
Fermentation liegen sie auch beide in der Fermentationsflüs
sigkeit, einer Kulturbrühe, vor. Dadurch wird die Anzahl
der Verfahrensschritte bis zum biokatalytischen Abbau des
Rohmaterials erheblich reduziert, zusätzlich wird eine
ganze Anzahl von Reinigungsschritten und sonstigen Manipula
tionen bei den Vorprodukten überflüssig.
Darüber hinaus können unsteril/anaerob, also auf besonders
kostengünstige Weise gewonnene Biokatalysatoren eingesetzt
werden. Gegenüber aus der Literatur bekannten Verfahren
werden weit kostengünstigere Substrate und Enzyme eingesetzt
und weniger und einfachere Verfahrensstufen angewendet,
so daß alle Voraussetzungen für die brauchbare Anwendung
des Verfahrens im technischen Bereich gegeben sind.
Verfahren zur Mischenzymproduktion mit bakteriellen Mischkul
turen durch Umsetzung von polysaccharidhaltigen Substraten
wie Extraktionsrückständen der Nahrungsmittel- und Zuckerin
dustrie sind schon von Buchholz et al., Zuckerind. 113 (1988)
204, vorgeschlagen worden. Diese bakteriellen Mischkul
turen können auch hier eingesetzt werden.
Die Erfindung macht es sich zunutze, daß bei dem verwendeten
Fermentationsprozeß die Konzentration von gelöster Polygalac
turonsäure einen Maximalwert erreicht und zwar zu einem
Fermentationszeitpunkt, an dem die zweite notwendige Reak
tionskomponente, das Pektatlyase-Rohenzym, ebenfalls im
Fermentationsprozeß fast ihren endgültigen Maximalwert
erreicht hat.
Dadurch wird es möglich, Polygalacturonsäure und das Enzym
Pektatlyase gleichzeitig in einer einstufigen Reaktion als
Substrat und Enzym zu erzeugen. Dazu werden z. B. Rüben
preßschnitzel mittels Bakterienmischkulturen anaerob fermen
tiert.
Am Maximum der Konzentration von gelöster Polygalacturonsäure
sowie einer bereits sehr hohen Enzymaktivität wird die Fer
mentation zunächst abgebrochen und die Kulturbrühe von Fest
stoffen und Bakterien, etwa durch Mikrofiltration, befreit.
Die Lösung wird anschließend mit Hilfe einer Querstrom-Ultra-
Filtrationseinheit konzentriert.
Die entstehende konzentrierte Lösung wird nun auf Bedingungen
eingestellt, die für die Lyase-Reaktion günstig sind, dies
ist etwa ein pH-Wert von 8 und eine Temperatur von 37°C.
Unter diesen Bedingungen bilden sich die gewünschten unge
sättigten Uronide.
Dabei entstehen zunächst bevorzugt Tetramere und Pentamere,
bei länger andauernder Reaktion jedoch zunehmend Trimere
und letztlich Dimere. Wie sich gezeigt hat, sind vor allem
Dimere, aber auch noch Trimere flexibler einsetzbar und
sollten daher bevorzugt hergestellt werden.
Werden aus bestimmten Gründen gerade Tetramere, Pentamere
oder Trimere als Reaktionsprodukt gewünscht, so kann einfach
die Reaktion zu dem entsprechend gewählten Zeitpunkt abge
brochen werden, um ein anderes Zusammensetzungsverhältnis
in der Mischung zu erhalten.
Nach Abschluß der Reaktion wird die Reaktionslösung durch
bekannte chromatographische Verfahren aufgearbeitet.
Das Verfahren wird besonders kostengünstig, wenn als pektin
haltige Stoffe pflanzliche Gerüstsubstanzen eingesetzt
werden, wie erwähnt besonders bevorzugt Zuckerrübenschnitzel
oder Kartoffelpülpe.
Die Fermentation läuft vorzugsweise bei einem pH-Wert von
6 bis 7, vorzugsweise von 6,5. Sie sollte bei einer Tempe
ratur von 30 bis 40°C, vorzugsweise bei 35°C, durchgeführt
werden.
Die entstandene Fermentationslösung (Kulturbrühe) wird
bevorzugt nach dem Abbrechen mittels eines Mikrofilters
von Bakterien und Feststoffen befreit und/oder mittels
einer Querstrom-Ultra-Filtrationseinheit konzentriert.
Die weitere Umsetzung der Polygalacturonsäure in der Fermen
tationsflüssigkeit mittels des Enzyms Pektatlyase erfolgt
vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 25 und 45,
insbesondere 37°C.
Dabei sollte ein pH-Wert zwischen 6 und 9, insbesondere
bei 8, eingehalten werden.
Der Umsetzungsprozeß sollte mehr als 6 Stunden, vorzugsweise
24 Stunden, durchgeführt werden, um einen möglichst hohen
Gehalt an Uronid-Dimeren zu erhalten.
In bestimmten Fällen empfiehlt es sich, ein technisch weniger
günstiges, dafür aber zu höheren Ausbeuten führendes abgewan
deltes Verfahren zu bevorzugen. Es dient z. B. zur Gewinnung
von Standardsubstanzen, die für die Kontrolle des Gewinnungs
prozesses dienen. Da hier wirtschaftliche Gesichtspunkte
nur eine untergeordnete Rolle spielen, wird diese aufwendige
re Verfahrensvariante angewendet.
Sie zeichnet sich dadurch aus, daß die anaerobe Fermentation
so durchgeführt wird, daß unterschiedliche Fermentations
flüssigkeiten entstehen, vorzugsweise durch Abbrechen der
Fermentation zu unterschiedlichen Zeitpunkten und
daß anschließend das weitere Verfahren mit einer Mischung
aus den beiden Fermentationsflüssigkeiten fortgesetzt wird.
Durch diese Verfahrensmaßnahme können beide Reaktionskompo
nenten im wesentlichen gleich hergestellt, aber zu unter
schiedlichen Abbruchszeiten zu ihrem jeweiligen, nicht
exakt identischen Maximalwert gewonnen werden.
Dabei wird in der einen Fermentationslösung, die optimal
auf die Gewinnung auf Polygalacturonsäure ausgerichtet
ist, keine Ultrafiltration durchgeführt. Dadurch werden
auch Polygalacturonsäurebruchstücke mit einem Molekular
gewicht unterhalb von 3000 der anschließenden Enzymreaktion
zugänglich.
Im folgenden wird anhand zweier Beispiele das erfindungsge
mäße Verfahren näher erläutert. Die Zeichnung dient dabei
zur Erläuterung.
Es zeigt:
Fig. 1 den zeitlichen Verlauf der Fermentation; aufgetragen
sind Pektatlyase-Aktivität und Polygalacturonsäure
anteil; und
Fig. 2 den zeitlichen Verlauf der Lyasereaktion; aufgetragen
ist die Konzentration der verschiedenen ungesättigten
Oligogalacturonsäuren.
Es wird zunächst in einem Beispiel die Reaktionsführung
für die Bildung eines ungesättigten Diuronids beschrieben.
Zunächst wird diskontinuierlich aber gleichzeitig das Enzym
Pektatlyase sowie das Substrat Polygalacturonsäure herge
stellt.
In einem 150-l-Rührfermenter mit Blattrührer, der 200 mm
Durchmesser besitzt und mit einer Drehzahl von 120 U/min
betrieben wird, werden 140 l Leitungswasser und 14 kg feuchte
Rübenpreßschnitzel (5,2 kg Trockensubstanz) gegeben und mit
Inoculum angeimpft. Als Inoculum (Starterkultur) dient ein
an das Substrat angepaßter Versäuerungsschlamm. Dieser wird
dadurch gewonnen, daß Bakterienschlamm aus einer anaeroben
Abwasserreinigung (Herkunft, z. B. kommunale Kläranlage) in
einer Konzentration von 0,5 kg Trockenmasse je Liter Flüssig
keit mit Rübenpreßschnitzeln bei einem Feststoffgehalt von
20 g Trockensubstanz je Liter bei 35 bis 40°C 48 Stunden fer
mentiert wird. Nach dem Abtrennen des groben Feststoffes
enthält der Überstand eine Bakterientrockensubstanz von
1 bis 2 g je Liter Suspension.
Die Fermentation wird durch Zugabe von 1 Liter Inoculum ge
startet und unter Luftabschluß durchgeführt. Die Fermentation
erfolgt bei 35°C und einem pH-Wert von 6,5, der automatisch
durch Zugabe von 25%iger Natronlauge korrigiert wird. Nach
einer Lag-Phase von ca. 10 Stunden beginnen die Mikroorganis
men, die gewünschten Enzyme in das Medium auszuscheiden.
Wie Fig. 1 zeigt, ist nach etwa 38 Stunden das Maximum
an Substrat (Polygalacturonsäure) in Lösung erreicht, ein
weiteres Fermentieren würde den Polygalacturonsäureanteil
relativ schnell wieder abfallen lassen.
Zum gleichen Zeitpunkt ist praktisch das Maximum der Enzym
aktivitäten ebenfalls schon erreicht.
Zu diesem Zeitpunkt (nach 38 Stunden) enthält die Kulturbrühe
bzw. Kulturflüssigkeit eine Pektatlyaseaktivität von 3,5
nkat/ml und eine Konzentration von Polygalacturonsäure
von 2,0 g/l.
An dieser Stelle wird daher die Fermentation abgebrochen.
Aus dem Fermenter wird die Fermentationsflüssigkeit abgezo
gen, grob gefiltert sowie nachfolgend mit Hilfe einer Quer
strom-Mikrofiltrationseinheit mit einer Ausschlußgrenze von
0,2 µm von Bakterien und Feststoff befreit, gesammelt und
über eine Ultrafiltrationseinheit (Prinzip "hollow fiber")
mit einer Ausschlußgrenze von 3000 g/mol konzentriert.
Die Fermentationslösung enthält nun das Enzym Pektatlyase
als auch das Substrat Polgalacturonsäure. Diese beiden Reak
tionskomponenten werden nunmehr zu ungesättigter Digalactu
ronsäure verarbeitet, also zu (O-(4-Desoxy-L-threo-hexo
pyranosido-4-enyluronsäure)-(1-4)-D-galacturonsäure).
Hierzu werden 50 ml des Konzentrats (Konzentrierungsfaktor
10) auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und bei 37°C
inkubiert. Die Bildung der ungesättigten Digalacturonsäure
wird mittels Hochleistungsanionenaustausch-Chromatographie
(HPAEC) verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion, etwa nach
24 Stunden, wird die Reaktionslösung aufgearbeitet.
Wird die Reaktion vor dem Ablauf von 24 Stunden gestoppt,
vgl. Fig. 2, entstehen nicht die gewünschten Dimere, sondern
längerkettige ungesättigte Uronide.
Es folgt jetzt noch die Produktisolierung.
Das Reaktionsgemisch wird zur Abtrennung von kationischen
und neutralen Begleitstoffen über eine Anionenaustauscher
säule (Amberlite IRA 400, Formiat-Form, Bettvolumen 65 cm3)
gegeben. Die auf dem Harz verbleibenden anionischen Produkte
werden nach einem Waschvorgang (500 ml H2O) mit 500 ml 0,2 m
Natriumformiatlösung (pH 4,7) eluiert. Das Produkt wird durch
Zugabe von 150 mg Sr(NO3)2 und 6 Vol. Ethanol aus der Puffer
lösung ausgefällt. Nach Zentrifugation wird das Präzipitat
in wenig Wasser gelöst und über eine Kationenaustauschersäu
le (Amberlite IR 120, Bettvolumen 65 cm3) gegeben. Nach
Gefriertrocknung des Eluats erhält man 250 mg ungesättigte
Digalacturonsäure. Das entspricht einer Ausbeute von 25%
bezogen auf Polygalacturonsäure in Lösung (Reinheit 80%,
mit HPLC bestimmt).
Eine weitere Aufreinigung (95% Reinheit) gelingt mittels
präparativer HPLC. Dazu werden 250 mg des Präparats (80%ige
Reinheit) auf eine präparative Hochleistungssäule (NH2-Phase,
25×3,2 cm ) gegeben und mit 0,11 m Natriumacetatlösung,
pH 6,5 bei einer Fließrate von 25 ml/min eluiert. Das Produkt
wird durch Zusatz von 150 mg Sr(NO3)2 und 6 Vol. Ethanol
ausgefällt. Nach Zentrifugation wird das Präzipitat in
wenig Wasser gelöst und über eine Kationenaustauschersäule
(Amberlite IR 120, Bettvolumen 65 cm3) gegeben. Nach Gefrier
tocknung erhält man 210 mg ungesättigte Digalacturonsäure
(95%ige Reinheit).
In einem zweiten Beispiel sei noch die Gewinnung von Stan
dardsubstanzen für die Chromatographie erläutert. Die Aus
beute kann um den Faktor 2 erhöht werden, wenn Enzym- und
Substratherstellung zwar grundsätzlich wie im ersten Bei
spiel, jedoch in zwei Fermentationen durchgeführt werden,
um jeweils einzeln aufeinander abgestimmte optimale Zusammen
setzungen zu erhalten.
Darüber hinaus wird die Substratlösung ohne Ultrafiltration
hergestellt. Dabei werden auch Polygalacturonsäurebruchstücke
mit einem Molekulargewicht von weniger als 3000 der anschlie
ßenden Enzymreaktion zugänglich.
Die Umsetzung der Substratlösung mit der Enzymkonzentrat
lösung erfolgt so, daß 200 ml der Substratlösung auf einen
pH-Wert von 8,0 eingestellt werden. Nach Zugabe von 2 ml
der Enzymkonzentratlösung wird die Reaktionslösung 30 Stunden
bei 37°C inkubiert.
Schließlich erfolgt die Aufarbeitung wie im ersten Beispiel.
Man erhält 200 mg ungesättigter Digalacturonsäure. Das
entspricht einer Ausbeute von 50% bezogen auf Polygalac
turonsäure in Lösung.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden
aus pektinhaltigen Stoffen unter Einsatz von Fermentation,
dadurch gekennzeichnet,
daß der pektinhaltige Stoff mit einer das Entstehen des Enzyms Pektatlyase fördernden Bakterienkultur versetzt und anaerob fermentiert wird, so daß gleichzeitig die pektinhaltigen Stoffe zumindest teilweise in Polygalac turonsäure umgewandelt werden,
daß die Fermentation während des Vorgangs abgebrochen wird,
daß nach dem Abbruch die entstandene Fermentationsflüssig keit von Bakterien befreit und eine katalytische Reaktion des entstandenen Enzyms Pektatlyase in der Fermentations flüssigkeit mit der Polygalacturonsäure gefördert wird, und
daß das entstehende Produkt ungesättigter Uroniden iso liert wird.
daß der pektinhaltige Stoff mit einer das Entstehen des Enzyms Pektatlyase fördernden Bakterienkultur versetzt und anaerob fermentiert wird, so daß gleichzeitig die pektinhaltigen Stoffe zumindest teilweise in Polygalac turonsäure umgewandelt werden,
daß die Fermentation während des Vorgangs abgebrochen wird,
daß nach dem Abbruch die entstandene Fermentationsflüssig keit von Bakterien befreit und eine katalytische Reaktion des entstandenen Enzyms Pektatlyase in der Fermentations flüssigkeit mit der Polygalacturonsäure gefördert wird, und
daß das entstehende Produkt ungesättigter Uroniden iso liert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die pektinhaltigen Stoffe pflanzliche Gerüstsubstanzen
sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die pektinhaltigen Stoffe Zuckerrübenschnitzel oder
Kartoffelpülpe sind.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Fermentation bei einem pH-Wert von 6 bis 7,
vorzugsweise 6,5, durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Fermentation bei 30° bis 40°C, vorzugsweise
bei 35°C, durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Fermentation im Bereich der maximalen Konzentra
tion von gelöster Polygalacturonsäure abgebrochen wird.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Fermentation nach 35 bis 40 Stunden, vorzugsweise
nach 38 Stunden, abgebrochen wird.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die entstandene Fermentationsflüssigkeit nach dem
Abbrechen mittels Mikrofiltration von Bakterien und
Feststoffen befreit wird.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die entstandene Fermentationsflüssigkeit nach dem
Abbrechen mittels einer Querstrom-Ultra-Filtrationseinheit
konzentriert wird.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Umsetzung der Polygalacturonsäure mittels des
Enzyms Pektatlyase bei einer Temperatur zwischen und
25° und 45°C, vorzugsweise 37°C, erfolgt.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Umsetzung der Polygalacturonsäure mittels des
Enzyms Pektatlyase bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9,
vorzugsweise 8, erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Umsetzungsprozeß der Polygalacturonsäure mittels
des Enzyms Pektatlyase mehr als 6 Stunden, vorzugsweise
24 Stunden, durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Isolierung der ungesättigten Uronide durch Fällung
und/oder säulenchromatographische Verfahren erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die anaerobe Fermentation so durchgeführt wird,
daß unterschiedliche Fermentationsflüssigkeiten entstehen, vorzugsweise durch Abbrechen der Fermentation zu unter schiedlichen Zeitpunkten und
daß anschließend das weitere Verfahren mit einer Mischung aus den beiden Fermentationsflüssigkeiten fortgesetzt wird.
dadurch gekennzeichnet,
daß die anaerobe Fermentation so durchgeführt wird,
daß unterschiedliche Fermentationsflüssigkeiten entstehen, vorzugsweise durch Abbrechen der Fermentation zu unter schiedlichen Zeitpunkten und
daß anschließend das weitere Verfahren mit einer Mischung aus den beiden Fermentationsflüssigkeiten fortgesetzt wird.
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