DE4221595C1 - Purified sucrose synthase enzyme - useful for prodn. of nucleotide-activated sugars or oligosaccharide(s) - Google Patents
Purified sucrose synthase enzyme - useful for prodn. of nucleotide-activated sugars or oligosaccharide(s)Info
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Description
Saccharose-Synthase (Glycosyltransferase EC 2.4.1.13
UDPG: D-Fructose 2-glucosyltransferase) ist ein
insbesondere in Pflanzen (z. B. Weizen, Reis, Mais,
Zuckerrüben, etc.) weit verbreitetes, seit langem
bekanntes Enzym (siehe z. B. Y. Milner u. a. in
"Nature" 206 (1965), S. 825), dessen Funktion als
Katalysator zur Bildung aktivierter Zucker innerhalb
des Stoffwechsels der Pflanze bereits umfänglich
untersucht und zusammenfassend dargestellt worden ist
(Avigad, G. in: Loewus, F. A. et al. (eds.)
Encyclopedeia of Plant Physiology New Series Vol. 13A,
Carbohydrates I, Intraacelluular Carbohydrates,
Springer-Verlag, Berlin 1982, 217-347). Danach
katalysiert das Enzym in vivo die Spaltung von
Saccharose gemäß folgender Gleichung
Saccharose+NDP⇄NDP-Glucose+Fructose (I)
in der N für Nukleoside, wie Uridin, Thymidin, Cytidin,
Guanin und Adenin steht.
Reinigung und Eigenschaften des Enzyms wurden u. a. von
T. Nomura u. a. in Arch. Biochem. Biophysics 156 (1973)
Seiten 644-52 beschrieben, die eine Ausbeute von
8,8% bei 11,4facher Aufreinigung durch Ammonsulfat-
Fällung und Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose und
Neusilin (MgO · Al₂O₃ · 2SiO₂) erreichten und Km-Werte
für Synthese- und Spaltungsreaktion angeben.
R. H. Juang u. a. beschreiben im J. Chinese Biochem. Soc.
17 (1988) 42-51 eine Saccharose-Synthase-Reinigung
durch Säulenchromatographie und Elektrophorese mit 38facher
Aufreinigung, die im Hinblick auf die
Proteinzusammensetzung durchgeführt wurde.
Trotz der seit langem bekannten Funktionsweise der
Saccharose-Synthase und Aufreinigungsverfahren ist die
Herstellung aktivierter Zucker gemäß obiger Gleichung
(I) wirtschaftlich bislang nicht angewandt worden,
obwohl die Saccharose-Synthase im Handel erhältlich ist
und aktivierte Zucker sowie darüber erhältliche Di- und
Oligosaccharide in der Zuckerchemie erhebliche
Bedeutung besitzen.
Mono-, Oligo- und Polysaccharide haben vielfältige
Funktionen als antigene Determinanten, bei der Zell-
Zell-Erkennung, bei der Zelldifferenzierung und als
Bindungsstellen für Toxine, Bakterien und Viren.
Eine zusammenfassende Darstellung von Herstellung und
Anwendung findet sich bei S. David u. a. in Advances in
Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 49, 175-237
(1991). Y. Ichikawa u. a. geben in Anal. Biochem. 202
(1992) 215-238 (1992) unterschiedliche
Umsetzungsmechanismen an. Als "Large Scale Synthese"
wird jedoch insbesondere auf die Umsetzung von Zucker-
1-Phosphat (insbesondere Glucose-1-Phosphat) mit
Nucleosidtriphosphat, insbesondere mit UTP, in Gegenwart von
Pyrophosphorylase nach C. H. Wong u. a. (J. Org. Chem. 47
(1982) 5416-18) hingewiesen, die eine mehrstufige
enzymatische Synthese von Nucleotidzuckern beschreiben.
Diese Synthese nach C. H. Wong wird auch von Toone &
Whiteside in Am. Chem. Soc. Sympos. Ser. 466 (1991) 1-22
als Methode der Wahl genannt.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß
Saccharose-Synthase-Isolate (insbesondere das im Handel
erhältliche Enzym) allgemein mehr oder minder hohe
Anteile an Nucleotidphosphatasen enthalten und daß
deren Anwesenheit - auch in nur geringer Menge - die
Synthese von NDP-Glucose und homologen Verbindungen so
weit stört, daß die Synthesetauglichkeit von
Saccharose-Synthase bislang nicht erkannt werden
konnte.
Durch angepaßte Reinigungsmethoden und empfindlichen
Phosphatase-Nachweis wurde nunmehr eine Saccharose-
Synthase entwickelt, die
eine glatte einstufige Synthesereaktion nach (I)
ermöglicht.
Gegenstand der Erfindung ist mithin eine Saccharose-
Synthase, in deren HPLC-Chromatogramm
Nucleotidphosphatasen nicht mehr nachweisbar (0,1%)
sind.
Weitere Besonderheiten ergeben sich aus den
Patentansprüchen sowie aus der nachfolgenden
Beschreibung.
Als Quelle für die Saccharose-Synthase dienen
insbesondere Reis, Mais oder Weizenkörner, die
angequollen und mechanisch aufgeschlossen werden. Der
dabei gewonnene wäßrige Rohextrakt wird entweder einer
fraktionierten PEG-Fällung mit 5% bzw. 20% PEG oder
einer Extraktion im wäßrigen 2-Phasen-System
unterworfen. Die so erhaltene Flüssigkeit wird nach
Adsorption an Sephadex A50 und Stufenelution bei pH 7,2
(mit Hepes-NaOH) mit 100 mM KCl und 300 mM KCl
umgepuffert und nach Ultrafiltration auf eine
Sepharose-Q-Säule geladen und einer linearen
Gradienten-Elution mit 50-500 mM KCl bei pH 8 (200 mM
Hepes-NaOH) unterworfen und auf einer
Gelfiltrationssäule chromatographiert.
Besonders wichtig ist dabei der Behandlungsschritt auf
der Sepharose-Q-Säule mit Gradienten-Elution wie
angegeben. Auf diese Weise erhält man aufgereinigte
Saccharose-Synthase, deren Nucleotidphosphatasegehalt
<0,1%, d. h. im Phosphatase-Test der Enzym-Präparation
nicht mehr nachweisbar ist.
Die nachfolgenden Beispiele zeigen die erfindungsgemäße
Arbeitsweise im einzelnen. Dabei wird Bezug genommen auf
die angefügten Zeichnungen; es zeigt
Fig. 1 das Chromatogramm der Sepharose Q Trennung;
Fig. 2 die NDP-Glucose-Bildung mit unterschiedlichen
Nucleotiden;
Fig. 3 u. 4 Die Bildung von TDP- und UDP-Glucose mit
Saccharose-Synthase;
Fig. 5. u. 6 Reaktionsschemata für die enzymatische Synthese
von N-Acetyllactosamin (nach Wong; Fig. 5 bzw.
erfindungsgemäß; Fig. 6)
Fig. 7 u. 8 Nucleotid-Chromatogramme der Produktmischung
(Schritt 1 u. 2 gemäß Fig. 6) nach Hitzeinakti
vierung des Enzyms;
Fig. 9 das HPLC-Chromatogramm der Produktmischung (voll
ständiger Zyklus gemäß Fig. 6)
Fig. 10-12 Kurven zur Kinetik der Synthese-Reaktion (I)
Fig. 13 den Einfluß von Metallionen auf die Enzymaktivität.
800 g Reiskörner werden über Nacht in Hepes-NaOH Puffer pH 7,2
gequollen und anschließend im Waring Blender für 1,5 min. aufge
schlossen. Nachdem mit einem Handmixer weitere 3 min. homogeni
siert worden ist, wird das Pellet abzentrifugiert (Sorvall GS3, 20 min.
5000 rpm 4°C). Anschließend wird das Protein im Überstand mit
PEG 4000 fraktioniert gefällt (5 und 20% PEG). Das Pellet nach
der 20%igen PEG Fällung wird in Puffer aufgelöst und in einer
Batch Adsorption an Sephadex A50 gebunden. 200 ml Sephadex A50 Gel
werden mit ca. 4 g Protein beladen. Die Stufenelution startet mit
300 ml Hepes-NaOH pH 7,2 und 300 ml Hepes-NaOH pH 7,2 mit 100 mM
KCl. Das Enzym wird mit zwei Volumina (100 ml) Hepes-NaOH pH 7,2
mit 300 mM KCl eluiert. Nach Umpufferung und Ultrafiltration wird
diese Fraktion auf eine Sepharose Q Säule (Hepes-NaOH pH 8,0 mit
50 mM KCl) geladen und mit einem linearen Gradienten (50 mM-500 mM
KCl in Hepes-NaOH 200 mM pH 8,0) eluiert. Die gesammelten
Enzymfraktionen werden abschließend in einer Gelfiltrationssäule
(Superdex 200 prep grade) chromatographiert.
Saccharose-Synthase aus Reis wurde 151fach mit einer Ausbeute von
5,4% angereichert (Tabelle 1). Ein großer Verlust entsteht bei
der Fällung mit Polyethylenglykol 4000 (ca. 80% Verlust bei der 5-20%
Fällung). Hier wird zur Zeit untersucht, ob mit Hilfe eines
wäßrigen Zweiphasensystems (PEG/Salz) höhere Ausbeuten erzielt
werden können. Sehr effektiv sind die Batch Adsorption an Sephadex
A50 und die anschließende Anionenchromatographie an Sepharose Q
FastFlow mit einem Aufreinigungsfaktor von insgesamt 43. Außerdem
wird die Nukleotiddi- und monophosphatase Aktivität vollständig
abgetrennt (Fig. 1), was für den Einsatz der Saccharose
Synthase in enzymatischen Synthesen sehr wichtig ist.
Das Molekulargewicht des nativen Enzyms beträgt 362 000±7000 Da,
es besteht aus 4 Untereinheiten zu je 90 000 Da und besitzt keine
inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken. Die N-terminale
Aminosäuresequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau in einem
Pulsed Liquid Protein Sequencer erbrachte, daß der N-Terminus der
Untereinheit blockiert ist. Der isoelektrische Punkt des nativen
Enzyms liegt bei pH 6,16.
Die Untersuchung der Spalt- und Synthese-Reaktion mit Saccharose-
Synthase läßt erkennen, daß
- 1. Saccharose-Synthase zur enzymatischen Synthese von UDP- Glucose, TDP-Glucose, GDP-Glucose und CDP-Glucose aus Saccharose geeignet ist.
- 2. die Kombination der Saccharose-Synthase mit anderen Enzymen (siehe oben) zur enzymatischen Synthese von sekundären Nukleotidzuckern (UDP-Galactose, UDP-Glucuronsäure) genutzt werden kann.
- 3. bei der enzymatischen Synthese von Oligosacchariden im Enzymmembranreaktor der Einsatz der Saccharose-Synthase zur "Kofaktorregenerierung" eine erhebliche Vereinfachung der kinetischen Kontrolle darstellt.
- 4. das Substratspektrum der Saccharose-Synthase für Di-, Tri- und Oligosaccharide sowie Glykoside zu bisher noch nicht zugänglichen aktivierten Mono-, Di- und Oligosacchariden führt.
- 5. andere Nukleotidzucker als UDP-Glucose in der Synthesereak tion mit Fructose eingesetzt werden können.
- 6. Fructose durch andere Zucker mit β-Furanosekonfiguration, sowie durch Zuckeralkohole und andere chemische Verbindun gen mit strukturellen Ähnlichkeiten zur β-Furanose, ersetzt werden kann.
Nachfolgend werden Beispiele für die Wirkungsweise und Anwendung
der Saccharose-Synthase beschrieben:
Es wurden UDP, TDP, CDP, ADP und GDP untersucht. Die Reaktionsan
sätze enthielten:
550 µl Hepes-NaOH (200 mM, pH 7,2),
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl Nukleotiddiphosphat (15-90 mM),
100 µl gereinigte Saccharose-Synthase (21,1 mU/ml).
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl Nukleotiddiphosphat (15-90 mM),
100 µl gereinigte Saccharose-Synthase (21,1 mU/ml).
Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C inkubiert und zu verschie
denen Zeiten abgestoppt (5 min. bei 95°C). Nach Filtration der
Probe durch einen 0,22 µm Filter wurden die entstandenen Nukleo
tidzucker mittels Ionenpaar HPLC analysiert.
Die Bildung von UDP- und TDP-Glucose wurde an Hand von Eichkurven
für die HPLC Chromatogramme (Peak Area/Konzentration) quantifi
ziert.
Fig. 2 zeigt, daß die Nukleotiddiphosphate in der Reihenfolge
UDP, TDP, ADP, CDP und GDP akzeptiert werden. Das gereinigte Enzym
war frei von Nukleotidphosphatasen (NPasen, Kontrolle ohne Saccha
rose), die Nukleotiddiphosphate zu den - monophosphaten oder auch
Basen abbauen. Im HPLC Chromatogramm konnten die auftretenden
Peaks für UMP, TMP, Uridin und Thymidin durch geeignete Kontroll
versuche auf Verunreinigungen im Substrat und auf die Zersetzung
der Nukleotiddiphosphate durch die Hitzebehandlung zurückgeführt
werden. Nach Hitzebehandlung von 1,57 mM UDP entstanden 0,123 mM
UMP; davon waren 0,082 mM (5%) als Verunreinigungen im UDP Sub
strat bereits vorhanden.
Aus einer Untersuchung des zeitlichen Konzentrationsver
lauf der Synthese von UDP- und TDP-Glucose wird deutlich,
daß durch steigende Mengen des Enzyms die nahezu vollständige
Umsetzung der Nukleotiddiphosphate zu Nukleotidzucker in kurzen
Reaktionszeiten erreicht werden kann.
Tabelle 2 faßt die Umsatzraten für die Synthese von UDP- und TDP-
Glucose zusammen. Mit 0,16 mU Enzym wird die Raum-Zeit-Ausbeute
bei höheren Substratkonzentrationen nur wenig gesteigert. Mit 1,8 mU
Saccharose-Synthase wird nach 3 h ein 99%iger Umsatz bezogen
auf die eingesetzte UDP Konzentration (1,57 mM) erreicht. Das
entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,21 g/l*h. Mit einer
höheren UDP Konzentration (7,86 mM) beträgt die Raum-Zeit-Ausbeute
0,4 g/l*h.
Die Raum-Zeit-Ausbeute für die Synthese von TDP-Glucose beträgt
für 0,16 mU eingesetztes Enzym 0,011 g/l*h; das entspricht einem
49%igen Umsatz nach 30 h für 0,16 mU Enzym. Ein weiteres Experi
ment zeigt, daß der Umsatz von 8,2 mM TDP mit 0,2 mU Enzym nach
24 h auf 80% gesteigert werden kann.
Zum Vergleich wurde ein kommerzielles Präparat der Saccharose
Synthase aus Weizen (spezifische Aktivität 8,15 mU/mg) getestet.
Dieses Enzym zeigt ähnliche Raum-Zeit-Ausbeuten wie das gereinigte
Enzym aus Reis. Allerdings zeigen die HPLC Chromatogramme die
gleichzeitige Bildung relativ großer Mengen UMP und Uridin durch
Nukleotidphosphatasen (Tabelle 2). Diese Enzymverunreinigungen
sind im gereinigten Enzym aus Reis nicht mehr vorhanden. Die auf
tretenden UMP und Uridin Peaks im Chromatogramm sind allein auf
Erhitzung der Proben zurückzuführen.
Das Pufferspektrum für die Synthese von UDP- und TDP-Glucose mit
der gereinigten Saccharose-Synthase aus Reis und dem kommerziellen
Enzym aus Weizen wurde untersucht. Folgende Puffer wurden getestet
(alle 200 mM und pH 7,2, angegeben sind die pH Pufferbereiche):
Mops-NaOH-NaCl | |
pH 6,25-8,15 | |
TES-NaOH-NaCl | pH 6,55-8,45 |
Tris-HCl | pH 7,00-9,00 |
Hepes-NaOH | pH 6,80-8,20 |
KH₂PO₄-NaOH | pH 5,80-8,00 |
Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ | pH 5,80-8,00 |
Imidazol-HCl | pH 6,20-7,80 |
TEA-hydrochlorid-NaOH | pH 6,80-8,80 |
Die Inkubationsansätze enthielten:
550 µl Puffer (200 mM, pH 7,2),
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl UDP (15,7 mM) oder TDP (16,4 mM),
100 µl Enzymlösung.
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl UDP (15,7 mM) oder TDP (16,4 mM),
100 µl Enzymlösung.
Inkubation und Analytik wurden wie unter 1. beschrieben durchge
führt.
Es zeigt sich, daß der bisher benutzte Hepes-NaOH
Puffer für die Synthese von UDP und TDP-Glucose am besten geeignet
ist. Für beide Enzyme ergeben der Mops und der TES Puffer 60-80%
Restaktivität. Das kommerzielle Enzym zeigt im Gegensatz zum
Reisenzym im TEA Puffer eine um 30-40% höhere Restaktivität. In
den restlichen Puffer haben beide Enzyme eine Restaktivität von
unter 50%.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wahl des Puffers Auswirkungen auf
die Aktivität der Saccharose-Synthase hat und die Bestimmung des
pH Optimums beeinflussen kann.
Folgende Puffer wurden für die Bestimmung des pH Optimums verwen
det (alle 200 mM):
Na-Citrat-Citronensäure | |
pH 4,0-6,2 | |
KH₂PO₄-NaOH | pH 5,8-7,2 |
Mops-NaOH-NaCl | pH 6,3-7,4 |
Hepes-NaOH | pH 6,8-8,2 |
TEA-hydrochlorid-NaOH | pH 7,2-8,8 |
Die Inkubationsansätze enthielten:
640 µl Puffer (200 mM),
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl UDP (15,7 mM) oder TDP (16,4 mM),
10 µl Enzymlösung.
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl UDP (15,7 mM) oder TDP (16,4 mM),
10 µl Enzymlösung.
Inkubation und Analytik erfolgten wie unter 1. beschrieben.
Beide Enzyme zeigen in Abhängigkeit von den verwendeten Puffer
unterschiedliche pH Optima.
Mit UDP als Substrat haben beide Enzyme bei Verwendung von Citrat
oder Phosphat Puffer ein pH Optimum zwischen pH 5,5 und 5,7.
Bei Verwendung von Hepes und Mops Puffer
liegt das Optimum für die UDP-Glucose Synthese zwischen 6,7 und
7,0.
Für die Synthese von TDP-Glucose gilt dies in gleicher Weise; mit
Citrat oder Phosphat Puffer liegt das Optimum zwischen pH 5,8 und
6,2 und mit Mops oder Hepes Puffer zwischen pH 6,5 und 6,8.
Für die Ermittlung der pH Stabilität wurde das Reisenzym bei
verschiedenen pH Werten in Hepes-NaOH Puffer (200 mM) und Raumtem
peratur verschieden lang inkubiert. Das Enzym wurde anschließend
in den herkömmlichen Aktivitätstest eingesetzt:
550 µl Hepes-NaOH (200 mM, verschiedene pH Werte)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl UDP (20 mM)
100 µl Enzymlösung
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl UDP (20 mM)
100 µl Enzymlösung
Nach 1 h Reaktionszeit wurde die Probe wie oben beschrieben mit
HPLC analysiert.
Die gereinigte Saccharose-Synthase aus Reis zeigt bei pH 7,0 und
7,9 nach 2 Tagen eine Restaktivität von <60%, die
sich für die Synthese von UDP- und TDP-Glucose ausnutzen lassen.
Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Reisenzym 1 h bei
pH 6,5 (pH Optimum) und verschiedenen Temperaturen inkubiert.
Anschließend wurde das Enzym in folgenden Aktivitätstest einge
setzt:
550 µl Puffer (200 mM, pH 6,5),
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl UDP (20 mM),
100 µl Enzymlösung.
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl UDP (20 mM),
100 µl Enzymlösung.
Nach 1 h Reaktionszeit wurde die Probe wie oben beschrieben mit
HPLC analysiert. Zusätzlich wurde jeweils eine Kontrolle ohne
Enzym inkubiert und analysiert.
Für die Spaltung von Saccharose mit UDP liegt das Temperaturopti
mum der Saccharose-Synthase aus Reis bei pH 6,5 zwischen 50° und
60°C.
Das Enzym besitzt nach 5 h bei 37°C seine volle Aktivität, nach 5 h
bei 56°C ist eine Restaktivität von 37% vorhanden.
Zur Bestimmung von Vmax und Km der Substrate wurden UDP oder TDP
bei konstanter Saccharose Konzentration von 500 mM zwischen 0 und
10 mM im Reaktionsansatz variiert. Bei konstanter UDP (2 mM)
Konzentration wurde Saccharose zwischen 0 und 500 mM im
Reaktionsansatz variiert. Alle Reaktionsansätze wurden 1 h bei
30°C und pH 6,5 (Hepes-NaOH 200 mM) inkubiert. Die Proben wurden
wie oben beschrieben behandelt und mit HPLC analysiert.
Das Reisenzym zeigt für UDP eine Substratüberschußinhibition
(Ki(S)=16 mM mit 0,9 mU Enzym) bei einem Km Wert von 0,4 mM
(Fig. 10). Der Km Wert für TDP beträgt 1,69 mM (Fig. 11).
Der Substratüberschußinhibition kann durch höhere Enzymmengen
entgegengewirkt werden. Der Km Wert für Saccharose beträgt 108 mM
(Fig. 12).
Fig. 13 zeigt, daß in Anwesenheit von 1 mM Metallionen, wie
z. B. Mn2+ und Mg2+ die Aktivität der Saccarose Synthase nur wenig
beeinflußt wird. Eine Stimulierung der Enzymaktivität tritt durch
Mn2+ und Ca2+ mit TDP als Substrat auf. In Anwesenheit von Cu2+
und Fe2+ wird das Enzym vollständig inaktiviert.
Die Reaktionsansätze enthielten:
550 µl Hepes-NaOH (200 mM, pH 7,2),
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl Nukleotiddiphosphat (UDP 100 mM oder TDP 124 mM),
100 µl gereinigte Saccharose-Synthase (15 mU/ml).
250 µl Saccharose (2 M),
100 µl Nukleotiddiphosphat (UDP 100 mM oder TDP 124 mM),
100 µl gereinigte Saccharose-Synthase (15 mU/ml).
Die Reaktionsansätze wurden mit UDP bei pH 7,0 bzw. mit TDP bei pH 6,8
bei 30°C inkubiert und zu verschiedenen Zeiten abgestoppt (5 min.
bei 95°C). Nach Filtration der Probe durch einen 0,22 µm
Filter wurden die entstandenen Nukleotidzucker mittels Ionenpaar
HPLC analysiert.
Die Bildung von UDP- und TDP-Glucose wurde an Hand von Eichkurven
für die HPLC Chromatogramme (Peak Area/Konzentration) quantifi
ziert.
Fig. 3 und 4 zeigen, daß nach 24 h 92% des UDP′s zu
UDP-Glucose und 84% des TDP′s zu TDP-Glucose umgesetzt wurden.
Für die Spaltreaktion der Saccharose-Synthase wurde Saccharose
gegen andere Di- oder Trisaccharide ausgetauscht:
α Glc 1-2 β-Fruc+UDP (TDP)⇄UDP-Glc (TDP-Glc)+Fruc
Die Konzentration der Saccharide betrug 75 bis 500 mM im
Reaktionsansatz. Es wurden 2 mM UDP oder TDP und in der Regel 9,1 mU
Enzym eingesetzt. Nach 3 h bei 30°C und pH 7,2 (200 mM Hepes-
NaOH) wurde die Reaktion bei 95°C 5 min. abgestoppt. Die Bildung
von Nukleotidzuckern wurde mit HPLC verfolgt und mit einer Kon
trolle (ohne Enzym) verglichen.
Tabelle 3 zeigt für UDP und TDP, daß neben Saccharose das
Disaccharid β-Lactose relativ gut (relative Peakfläche 4,7% für
UDP und 0,8% für TDP) umgesetzt wird. Das Produkt des entstan
denen Nukleotidzuckers wird noch analysiert; in Frage kommt eine
UDP bzw. TDP aktivierte Galactose oder es ist das Disaccharid
aktiviert worden. Bemerkenswert ist, daß α-Lactose nicht als Sub
strat akzeptiert wird. Das Disaccharid Isomaltulose (Palatinose)
und die Trisaccharide Raffinose und Melezitose ergeben kleine,
aber im Vergleich zur Kontrolle signifikante Umsetzungen.
Als entscheidendes Kriterium zur Auswahl anderer Saccharide
kristallisiert sich das Vorliegen der β-Furanose Konformation mit
mindestens einer Hydroxymethylgruppe oder das Vorliegen von räum
lich ähnlichen Strukturen, in denen der reduzierende Zuckeranteil
Ankerstellen in bestimmten Positionen aufweisen muß, heraus
(Beispiel: Anomeres C-Atom der β-Lactose). In letzterem Fall ist
es sehr wahrscheinlich, daß der nichtreduzierende Zuckeranteil des
Disaccharides die Rolle der Glucose im Saccharosemolekül übernimmt
und wahrscheinlich aktiviert wird. Dafür muß er allerdings in β-
Stellung verknüpft sein. Nach diesem Kriterium werden noch weitere
mögliche Substrate getestet.
Für die Synthesereaktion wurden die Nukleotidzucker variiert:
UDP-Glucose+Fructose ⇄ Saccharose+UDP
Es wurden zunächst nur UDP-aktivierte Zucker eingesetzt:
UDP-Galactose, UDP-N-Acetylglucosamin, UDP-Glucuronsäure, UDP-N-
Acetylgalactosamin.
Die Ansätze enthielten:
550 µl Puffer (200 mM, pH 7,5),
250 µl Fructose (40 mM),
100 µl UDP-Zucker (20 mM),
100 µl Enzymlösung.
250 µl Fructose (40 mM),
100 µl UDP-Zucker (20 mM),
100 µl Enzymlösung.
Die Ansätze wurden 2 h bei 30°C inkubiert und 5 min. bei 95°C
gestoppt. Mit HPLC wurde nach Vergleich mit einer Kontrolle (ohne
Enzym) die Entstehung von UDP verfolgt.
Neben UDP-Glucose kann auch UDP-N-Acetylglucosamin vom Reisenzym
umgesetzt werden (Tabelle 4).
Für die Synthesereaktion wurde der Akzeptor variiert. Neben dem
natürlichen Akzeptor wurden andere Diastereomere der D-Fructose,
wie D-Psicose, D-Tagatose, D-Sorbose eingesetzt. Weiterhin wurden
systematisch einige Ketosen. Neben Aldosen wurden auch
Nichtzuckerakzeptoren untersucht, z. B. Hydroxypyruvat,
Hydroxybenzaldehyd.
Tabelle 5 verdeutlicht, daß die Diastereomere der D-Fructose bis
auf D-Sorbose alle akzeptiert werden. Von den Aldosen werden D-
Mannose und D-Lyxose akzeptiert. Als Akzeptoren können auch
Derivate der Glucose fungieren, z. B. 1,6 Anhydro-β-D-Glucose oder
Octyl-β-D-Glucopyranosid.
UDP-Galaktose und N-Acetyllactosamin wurde gemäß Fig. 6 herge
stellt (Fig. 5 zeigt den Synthesezyklus nach Wong)
Ansatz:
Ansatz:
677 µl Hepes Puffer (50 mM, pH 7),
100 µl UDP (100 mM),
100 µl Saccharose,
123 µl Enzym (10 mU im Ansatz).
100 µl UDP (100 mM),
100 µl Saccharose,
123 µl Enzym (10 mU im Ansatz).
Nach 3 h Inkubation bei 30°C waren 80% des UDP zu UDP-Glucose
laut HPLC-Analyse umgesetzt. Anschließend wurden 100 mU UDP-
Galaktose Epimerase zugegeben und über Nacht bei 30°C inkubiert.
Fig. 7 zeigt, daß UDP-Galaktose aus UDP-Glucose entstanden
ist. Da das Gleichgewicht der UDP-Galaktose Epimerase stark auf
der Seite von UDP-Glucose liegt, können UDP-Glucose/UDP-Galaktose
Verhältnisse von 0,3 erwartet werden (siehe Peakhöhenverhältnisse
von UDP-Glucose/UDP-Galaktose in Fig. 7).
Zur enzymatischen Synthese von N-Acetyllactosamin wurden zu einem
Parallelansatz (siehe oben nach 3 h Inkubation bei 30°C) 1 ml
einer Lösung mit 300 mU UDP-Gal-Epimerase, 4 mU UDP-Gal
Transferase 5 mM N-Acetylglucosamin und 1 mM MnCl₂ gegeben und
über Nacht bei 30°C inkubiert. Fig. 9 zeigt, daß N-
Acetyllactosamin mit Hilfe von drei Enzymen (Fig. 6)
gebildet wird.
UDP-Galaktose kann auch enzymatisch hergestellt werden, indem die
benötigten Enzyme gleichzeitig im Ansatz inkubiert werden.
Ansatz:
Ansatz:
500 mM Saccharose,
1-10 mM UDP,
3-30 mU Saccharose Synthese,
200 mU UDP-Gal-Epimerase,
alles in 200 mM Hepes Puffer pH 7,2.
1-10 mM UDP,
3-30 mU Saccharose Synthese,
200 mU UDP-Gal-Epimerase,
alles in 200 mM Hepes Puffer pH 7,2.
Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dokumentiert.
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde aus Reiskörnern
isolierte Saccharose-Synthase verwendet, jedoch kann auch aus
Weizen o. a. unter Beachtung der erfindungsgemäßen Vorschriften
eine für die einstufige Bildung aktivierter Monosaccharide brauch
bare Saccharose-Synthase erhalten werden.
Claims (8)
1. Aufgereinigte Saccharose-Synthase, in deren HPLC-Chromato
gramm Nukleosidphosphatasen nicht mehr nachweisbar (0,1%)
sind.
2. Saccharose-Synthase nach Anspruch 1 vegetabilen Ursprungs,
insbesondere isoliert aus Reiskörnern.
3. Verfahren zur Herstellung von Saccharose-Synthase nach An
spruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Saccharose-Synthase enthaltenden Rohextrakt
einer Folge von Reinigungsschritten unterwirft, die die Auf
gabe eines ultrafiltrierten 50 mM KCl aufweisenden Extraktes
von pH 8 auf eine Sepharose-Q-Säule und eine Gradienten-Elu
tion aus der Säule bei pH 8 mit 50-500 mM KCl umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Rohextrakt aus angequollenen und mechanisch
aufgeschlossenen Reiskörnern folgenden Reinigungsschritten
unterwirft:
- - Fraktionierte PEG-Fällung (mit 5 bzw. 20% PEG) oder wäß rige 2-Phasentrennung;
- - Sephadex A50 Adsorption und Stufenelution mit KCl bei pH 7,2 (0; 100 und 300 mM KCl);
- - Umpuffern, Ultrafiltration und Aufgabe auf eine Sepharose- Q-Säule;
- - Gradienten-Elution bei pH 8 mit 50-500 mM KCl;
- - Chromatographie auf Gelfitrationssäule.
5. Verwendung von Saccharose-Synthase nach Anspruch 1 oder 2 zur
Produktion von Nucleotidzuckern durch Umsetzung von
Nucleosiddiphosphaten mit Di- oder Trisacchariden.
6. Verwendung nach Anspruch 5, bei der als Nucleosiddiphosphat
UDP, ADP oder TDP und als Disaccharid Saccharose dienen.
7. Verwendung nach Anspruch 6 zusammen mit UDP-Glucose Epimerase
und/oder Transferasen zur Herstellung von abgewandelten akti
vierten Zuckern oder Oligosacchariden.
8. Verwendung nach Anspruch 6 zur Nukleosid-Umsetzung mit Di-,
Tri- oder Oligozuckern zur Herstellung von aktivierten
Zuckern.
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---|---|---|---|
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US08/367,178 US5750389A (en) | 1992-07-01 | 1993-06-26 | Purified saccharose-synthase, process for its production and its use |
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DE59310312T DE59310312D1 (de) | 1992-07-01 | 1993-06-26 | Verfahren zur herstellung von saccharose-synthase |
CA002139419A CA2139419C (en) | 1992-07-01 | 1993-06-26 | Purified saccharose synthase, process for its production and its use |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0767239A2 (de) * | 1995-10-06 | 1997-04-09 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen |
DE19812156A1 (de) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Nucleotidaktivierte Di- und Oligosaccharide sowie Verfahren zu deren Herstellung II |
DE19812162A1 (de) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Nucleotidaktivierte Di- und Oligosaccharide sowie Verfahren zu deren Herstellung I |
WO2021219463A1 (de) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen | Enzymkaskaden auf basis von saccharose synthase und pyrophosphorylase zur umsetzung von adp zu atp |
-
1992
- 1992-07-01 DE DE4221595A patent/DE4221595C1/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
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NICHTS ERMITTELT * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0767239A2 (de) * | 1995-10-06 | 1997-04-09 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen |
EP0767239A3 (de) * | 1995-10-06 | 1998-06-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen |
DE19812156A1 (de) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Nucleotidaktivierte Di- und Oligosaccharide sowie Verfahren zu deren Herstellung II |
DE19812162A1 (de) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Nucleotidaktivierte Di- und Oligosaccharide sowie Verfahren zu deren Herstellung I |
WO2021219463A1 (de) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen | Enzymkaskaden auf basis von saccharose synthase und pyrophosphorylase zur umsetzung von adp zu atp |
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