DE4133688A1

DE4133688A1 - Verfahren zur herstellung einer aliphatischen, geradkettigen omega-aminocarbonyl-aminocarbonsaeure

Info

Publication number: DE4133688A1
Application number: DE19914133688
Authority: DE
Inventors: Gerald Dr Banko; Urs Dr Haenggi
Original assignee: Chemie Linz Deutschland GmbH
Current assignee: Chemie Linz Deutschland GmbH
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1991-10-11
Publication date: 1993-04-15

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung einer aliphatischen, ge radkettigen omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure aus der omega- Hydroxycarbonyl-aminocarbonsäure und aus dem omega-Aminocarbo nyl-aminocarbonsäureamid.

Enantiomerenreine Monoamide von Aminosäuren, die zwei Carbon säuregruppierungen im Molekül aufweisen, wie z. B. Glutamin oder Asparagin gewinnen im medizinischen oder im Lebensmittelbereich zunehmend an Bedeutung.

In Progr. Ind. Mikrobiol., 24 (1986), 121 bis 130 sind verschie dene Methoden zur Herstellung von Glutamin geoffenbart. Demnach kann dessen Herstellung beispielsweise fermentativ mit Hilfe von Bakterien erfolgen. Dabei entstehen aber Gemische, aus denen Glutamin nur schwer zu isolieren ist.

Gemäß der o.a. Literaturstelle kann die Glutaminherstellung auch enzymatisch mit Hilfe des Enzyms Glutamin-Synthetase er folgen. Diese Art der Herstellung ist mit einem stochiometri schen Adenosintriphosphat (ATP)-verbrauch gekoppelt. Die Rege nerierung und Zurückgewinnung von ATP ist aber nicht einfach durchzuführen.

Es wurde nun unerwarteterweise ein einfacher Weg zur Herstel lung einer aliphatischen, geradkettigen omega-Aminocarbonyl aminocarbonsäure gefunden, bei dem von der leicht erhältlichen freien Amino-alpha,omega-dicarbonsäure ausgegangen werden kann, durch Veresterung der freien Dicarbonsäure, wobei der omega- Ester sowie der Diester, aber praktisch kein alpha-Ester entstehen, Ammonolyse der Estergruppierungen zum entsprechenden omega-Amid und zum Diamid, Abtrennung des omega-Amids und enzy matische Hydrolyse des Diamids, wobei ebenfalls wieder nur das omega-Amid entsteht. Dieses kann aus dem Reaktionsgemisch auf einfache Weise isoliert und rein dargestellt werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstel lung einer aliphatischen, geradkettigen omega-Aminocarbonyl aminocarbonsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine omega-Hydroxycarbonyl-aminocarbonsäure in einem niedrigen ali phatischen Alkohol gelöst und unter Zugabe einer Mineralsäure erhitzt und reagieren gelassen wird, wobei die omega-Alkoxycar bonyl-amino-carbonsäure und der omega-Alkoxycarbonyl-amino-car bonsäureester entstehen, worauf die Estermischung mit Ammoniak behandelt wird, wobei eine Mischung aus vorwiegend omega-Amino carbonyl-aminocarbonsäure und omega-Aminocarbonyl-aminocarbon säureamid entsteht, die gebildete omega-Aminocarbonyl-aminocar bonsäure aus der Reaktionsmischung abgetrennt und das omega- Aminocarbonyl-aminocarbonsäureamid in wäßriger Lösung unter Zugabe einer Hydrolase hydrolisiert wird, wobei wiederum die omgea-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure gebildet wird, die aus dem Reaktionsgemisch isoliert und mit der bereits vorher abgetrenn ten omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure vereinigt wird.

Unter omega-Hydroxycarbonyl-aminocarbonsäuren sind aliphatische Aminosäuren zu verstehen, die im Molekül in alpha- und omega- Stellung je eine Säuregruppe enthalten, also Amino-alpha,omega dicarbonsäuren. Bevorzugt sind dabei alpha-Aminodicarbonsäuren, insbesonders Asparagin- oder Glutaminsäure. Die Amino-al pha,omega-dicarbonsäuren können optisch aktive Aminodicarbonsäuren sein und in reiner D- oder L-Form oder in Form von D,L-Gemischen vorliegen. Unter D,L-Gemischen sind da bei racemische Gemische oder Gemische, in denen eines der mög lichen Enantiomeren angereichert vorliegt, zu verstehen.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens be steht darin, daß die Aminogruppe der Amino-alpha,omega-dicar bonsäure für die erfindungsgemäße Umsetzung nicht geschützt vorliegen muß, obwohl auch eine Amino-alpha,omega-dicarbon säure, bei der die Aminogruppe geschützt vorliegt, eingesetzt und erfindungsgemäß umgesetzt werden kann.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zuerst eine Amino-alpha,omega-dicarbonsäure, deren Aminogruppe frei oder auf übliche Weise mit Hilfe von Schutzgruppen wie etwa Acetyl-, Benzoyloxycarbonylschutzgruppen geschützt vorliegen kann, bevorzugt aber frei vorliegt, in einem niedrigen alipha tischen Alkohol, etwa Methanol, Ethanol, iso-Propanol, Cyclohexanol, bevorzugt in Methanol, gelöst, mit einer Mineral säure, z. B. Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, bevorzugt Schwefelsäure versetzt und unter Schütteln oder Rühren erhitzt. Vorzugsweise wird auf Rückflußtemperatur erhitzt. Dabei werden pro Mol Dicarbonsäure etwa 0.5-3 Mol, bevorzugt etwa 1 bis 2 Mol Mineralsäure eingesetzt. Gegebenenfalls erfolgt die Reak tion unter Druck. Dabei entsteht aus der eingesetzten Aminodi carbonsäure und dem verwendeten Alkohol neben einem kleineren Anteil an Diester ein größerer Anteil der in der omega-Stellung veresterten Amino-alpha-omega-dicarbonsäure, während die in al pha-Stellung veresterte Amino-alpha,omega-Dicarbonsäure nicht oder nur zu einem ganz geringen Anteil gebildet wird.

Nach beendeter Reaktion wird die Reaktionsmischung abgekühlt. Die Reaktionsprodukte können anschließend wie üblich z. B. ex traktiv, destillativ oder vorzugsweise chromatographisch iso liert werden, wobei der omega-Ester und der Diester der Amino- alpha,omega-dicarbonsäure erhalten werden.

Die Ester, die als Reaktionsprodukte anfallen, werden an schließend einer Ammonolyse unterworfen. Dabei können die Ester direkt in der Reaktionsmischung aus der Veresterung oder gege benenfalls nach Reinigung und Abtrennung der gegebenenfalls nicht umgesetzten Amino-alpha,omega-dicarbonsäure mit Ammoniak behandelt werden. Bevorzugt wird der Reaktionsmischung aus der Veresterung direkt und ohne Aufarbeitung Ammoniak zugesetzt. Pro Mol Estergruppierung werden dabei etwa 1-25 Mol, bevorzugt etwa 3-15 Mol Ammoniak verwendet.

Die Zugabe des Ammoniaks erfolgt bei Temperaturen von -20°C bis etwa 40°C, bevorzugt unter Eiskühlung. Das Ammoniak kann dabei gasförmig eingeleitet oder in Wasser gelöst in die Mi schung, die den omega-Monoester und/oder den Diester enthält, eingebracht werden. Nach Einbringen des Ammoniaks wird die Reaktionsmischung bei Temperaturen von etwa 0°C bis Raumtempe ratur geschüttelt, gerührt oder einfach stehegelassen. Dabei reagiert das Ammoniak mit den Estergruppen der Amino-al pha,omega-dicarbonsäure und es entstehen das entsprechende omega-Amid und/oder das Diamid, wobei durch Hydrolyse auch ein kleiner Anteil an alpha-Amid gebildet werden kann. Nach been deter Reaktion wird das Verdünnungsmittel und das überschüssige Ammoniak abgedampft und der Rückstand wie üblich, bevorzugt chromatographisch gereinigt, oder das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe einer Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure ange säuert, wobei das omega-Amid kristallin ausfallen und durch Ab filtrieren isoliert werden kann.

Dabei wird die omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure, beim Ein satz von Asparaginsäure oder Glutaminsäure also Asparagin oder Glutamin, gewonnen.

Zur Erhöhung der Ausbeute der gewünschten omega-Aminocarbonyl aminocarbonsäure wird das bei der Reinigung der Reaktionsmi schung anfallende omega-Aminocarbonyl-aminosäureamid (Amino-al pha,omega-dicarbonsäurediamid) anschließend mit Hilfe eines En zyms oder Enzymgemisches hydrolisiert, wobei wieder die omega- Aminocarbonyl-aminocarbonsäure entsteht. Das omega-Hydroxycar bonyl-aminocarbonsäureamid wird praktisch nicht gebildet. Da Enzyme im allgemeinen das L- oder D-Enantiomere einer Verbin dung bevorzugt umsetzen, kann dabei die Umsetzung je nach der Selektivität des Enzyms mehr oder weniger enantioselektiv er folgen. Werden reine D- bzw. L-Diamide verwendet, entstehen die entsprechenden enantiomerenreinen Monoamide. Dieses enzymati sche Verfahren ist neu und ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Herstellung der dabei eingesetzten Amino-alpha,omega-dica bonsäurediamide kann dabei durch Ammonolyse der Diester oder auch durch andere Verfahren erfolgen.

Für die enzymatische Umsetzung wird das Amino-alpha,omega dicarbonsäurediamid, in dem die Aminogruppe bevorzugt unge schützt vorliegt, in Wasser, einer Pufferlösung oder einer Salzlösung gelöst und mit einem Enzym versetzt. Als Pufferlö sung wird zweckmäßig jene verwendet, in der das jeweils verwen dete Enzym seine höchste Aktivität und/oder Selektivität zeigt. Die Umsetzung erfolgt dabei in jenem Temperaturbereich, in dem das Enzym oder die Enzymmischung die höchste Aktivität bzw. Se lektivität zeigt. Diese Temperatur liegt üblicherweise zwischen Raumtemperatur und der Desaktivierungstemperatur des Enzyms. Der PH-Wert der Reaktionslösung kann sowohl hinsichtlich der Beständigkeit als auch hinsichtlich der Aktivität und/oder Se lektivität des Enzyms von Bedeutung sein. Er wird daher ent sprechend dem jeweils eingesetzten Enzyms so gewählt und einge stellt, daß sowohl die Beständigkeit als auch die Aktivität, als auch die Selektivität ein Höchstmaß erreicht. Im all gemeinen ist bei käuflichen Enzymen die optimale Pufferlösung, die optimale Reaktionstemperatur und der optimale pH-Bereich angegeben.

Als Enzym kommt eine Hydrolase, die selektiv nur die omega- Stellung des Diamids hydrolisiert in Frage. Dabei kann die Hy drolase in verschiedenen Reinheitsstufen, in freier Form oder immobilisiert eingesetzt werden.

Hydrolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind beispielsweise Lipasen, Esterasen, Proteasen. Als besonders geeignet haben sich Proteasen, speziell die Protease Bromelain herausgestellt. Bromelain setzt aus dem 2-Amino-bern steinsäurediamid oder aus dem 2-Amino-glutarsäurediamid aus schließlich das Säureamid in alpha-Stellung frei, so daß beispielsweise aus 2-Aminobernsteinsäurediamid oder aus 2-Ami noglutarsäurediamid praktisch ausschließlich 2-Aminobernstein säure-4-amid (Asparagin) oder 2-Aminoglutarsäure-5-amid (Glutamin) entstehen.

Nach erfolgter Umsetzung wird das omega-Amid der Dicarbonsäure aus der Reaktionsmischung isoliert. Dies kann beispielsweise extraktiv, kristallographisch, destillativ oder vorzugsweise chromatographisch erfolgen und gelingt wegen des großen Polari tätsunterschiedes zwischen dem Diamid und dem Monoamid im all gemeinen problemlos.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure in Methanol gelöst und mit conc. Schwefelsäure versetzt, wobei pro Mol Aminosäure 1-2 Mol Schwefelsäure ein gesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird auf Rückflußtempera tur erhitzt, nach beendeter Reaktion abkühlen und, mit einer wäßrigen Lösung von Ammoniak versetzt, stehen gelassen. Das ge bildete L-Glutamin oder L-Asparagin wird chromatographisch oder kristallographisch aus der Reaktionsmischung abgetrennt und das dabei ebenfalls anfallende Aminodicarbonsäurediamid in einer Pufferlösung mit Bromelain reagieren gelassen, wobei ebenfalls L-Glutamin oder L-Asparagin entsteht, das chromatographisch aus der Reaktionsmischung abgetrennt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert auf einfache Weise omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäuren ausgehend von Amino-al pha,omega-dicarbonsäuren oder Amino-alpha,omega-dicarbonsäu rediamiden, die nicht N-geschützt sein müssen, in guten Ausbeu ten und stellt daher eine Bereicherung der Technik dar.

Beispiel 1

5,8 g L-Asparaginsäure (0,043 Mol) wurden in 37 ml Methanol un ter Zugabe von 6,4 g konzentrierter Schwefelsäure (0,065 Mol) gelöst und unter leichtem Schütteln auf Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtempera tur abgekühlt. Der Fortschritt der Reaktions wurde über die Or thophthalaldehyd-derivate nach der bei D.Hill et al., Analyti cal Chemistry, Vol. 51, 8 (1979) oder R.Schuster et al., Hew lett Packard HPLC Application note, Publication number 12 -5954- 6257 (1986) geoffenbarten Verfahrensweise mittels HPLC-Analyse geprüft, wobei die Peakflächen, die bei der UV-Detektion ausge messen wurden, ausgewertet wurden. Dabei wurden die folgenden, in Tabelle 1 zusammengestellten Konzentrationsverhältnisse er mittelt:

Tabelle 1

Beispiel 2

25 ml eines Reaktionsgemisches aus der Veresterungsreaktion, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit 17 ml 25 Gew.%igem Ammoniak unter Eiskühlung versetzt und 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Fortschritt der Reaktion wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, geprüft. Nach beendeter Reaktion wurden die folgenden, in Tabelle 2 zusammengestellten, Konzentrationsverhältnisse ermittelt:

Tabelle 2

10 ml des Reaktionsgemisches wurden anschließend über eine Kie selgelsäule (Kieselgel 60, Art. 9385, Merck) aufgetrennt. Lauf mittel: 1-Propanol: 25 Gew.% wäßriger Ammoniak = 7 : 3. Dabei wurde L-Asparagin in einer Ausbeute von 55% der Theorie, erhalten.

Die Fraktionen, die das L-Asparaginsäure-1,4-diamid enthielten, wurden zur Trockene abgedampft und der Rückstand, in Wasser ge löst. Die Lösung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, analy siert. Dabei wurden die in Tabelle 3 zusammengestellten Konzen trationsverhältnisse ermittelt:

Tabelle 3

Beispiel 3

1 ml der Lösung von L-Asparaginsäure-1,4-diamid erhalten nach der Reinigung über Kieselgel, wie im Beispiel 2 beschrieben, wurde mit 2 mg Bromelain (Merck) versetzt und bei pH 8 und 37°C vier Stunden reagieren gelassen. Danach wurde das Reaktions gemisch, wie im Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Dabei wur den die in Tabelle 4 zusammengestellten Kon zentrationsverhältnisse ermittelt:

Tabelle 4

Beispiel 4

5 ml einer Lösung von 180 mg L-Glutaminsäure-1,5-diamid (BACHEM Feinchemikalien AG, Schweiz) in 100 ml Phosphatpuffer, pH 7, wurden mit 0,5 ml einer 10 Gew.%igen wäßrigen Lösung von Brome lain versetzt und bei 30 °C unter Rühren reagieren gelassen. Dabei wurde das Diamid hydrolisiert. Der Fortschritt der Reak tion wurde mittels HPLC-Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, geprüft, wobei die Peakflächen, die bei der UV-Detektion ausge messen wurden, ausgewertet wurden. Als Vergleich wurde eine L- Glutaminsäure-1,5-diamidlösung ohne Bromelain auf dieselbe Art und Weise wie oben beschrieben behandelt (Standard). Nach 180 Minuten wurde die Reaktion abgebrochen. Im Reaktionsgemisch wurden die in Tabelle 5 zusammengestellten Konzentrationsver hältnisse ermittelt.

Tabelle 5

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer aliphatischen, geradkettigen omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure, dadurch gekenn zeichnet, daß eine omega-Hydroxycarbonyl-aminocarbonsäure in einem niedrigen aliphatischen Alkohol gelöst und unter Zugabe einer Mineralsäure erhitzt und reagieren gelassen wird, wobei die omega-Alkoxycarbonyl-amino-carbonsäure und der omega-Alkoxycarbonyl-amino-carbonsäureester entstehen, worauf die Estermischung mit Ammoniak behandelt wird, wobei eine Mischung aus vorwiegend omega-Aminocarbonyl-aminocar bonsäure und omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäureamid ent steht, die gebildete omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure aus der Reaktionsmischung abgetrennt und das omega-Amino carbonyl-aminocarbonsäureamid in wäßriger Lösung unter Zugabe einer Hydrolase hydrolisiert wird, wobei wiederum die omgea-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure gebildet wird, die aus dem Reaktionsgemisch isoliert und mit der bereits vor her abgetrennten omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure ver einigt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als niederer aliphatischer Alkohol ein Alkohol mit 1 bis 6 C- Atomen eingesetzt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß als Mineralsäure Schwefelsäure, Salzsäure oder Salpetersäure eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Umsetzung mit dem niederen aliphatischen Alkohol bei Rückflußtemperatur ausgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß bei der Ammonolyse pro Mol Estergruppierung 3 bis 15 Mol Ammoniak eingesetzt werden.

6. Verfahren zur Herstellung einer omega-Aminocarbonyl- aminocarbonsäure aus dem entsprechenden omega-Aminocarbo nyl-aminocarbonsäureamid, dadurch gekennzeichnet, daß das omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäureamid in Wasser oder in einer Pufferlösung gelöst und mit einer Hydrolase behandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Hydrolase eine Protease eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Bromelain eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß die omega-Aminocarbonyl-aminocarbonsäure chromatographisch oder kristallographisch aus dem jeweili gen Reaktionsgemisch isoliert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß als omega-Hydroxycarbonyl-aminocarbonsäure Asparaginsäure oder Glutaminsäure eingesetzt wird.