DE4131546A1 - Verfahren zur erhoehung der enantioselektivitaet einer candida lipase bei der veresterung chiraler alkohole und eine immobilisierte candida lipase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Enantio­ selektivität, Aktivität und Stabilität einer Lipase aus einem Mikroorganismus der Gattung Candida in einem enzymatischen Um­ esterungsverfahren, in dem ein chiraler Alkohol, der mindestens ein Asymmetriezentrum im Molekül enthält, mit Hilfe eines Enolesters enantioselektiv verestert wird, eine immobilisierte Candida Lipase und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Chirale, enantiomerenreine Alkohole sind für verschiedenste An­ wendungszwecke, etwa zur Synthese pharmazeutischer Wirkstoffe oder Agrarchemikalien von Bedeutung. Ihre Herstellung kann z. B. durch enantioselektive Umesterung erfolgen, wobei ein Enantio­ merengemisch eines chiralen Alkohols in Gegenwart eines Carbon­ säureesters mit Hilfe einer Hydrolase umgesetzt wird. Da Hydro­ lasen im allgemeinen sowohl die Hin-, als auch die Rückreaktion katalysieren, entsteht das gewünschte Endprodukt bei solchen Um­ setzungen häufig nur sehr langsam und in ungenügender optischer Reinheit. In M.Degueil-Castaing et al, Tetrahedron Letters, Vol. 28, 9 (1987), 953-954 wird daher vorgeschlagen, als Carbonsäu­ reester einen Enolester einzusetzen, da eine Rückreaktion dann nicht mehr erfolgen kann. Wie jedoch aus Zakrzewska et al, Acta Med. Pol., 29, (1988), 1-2, Seite 44 hervorgeht, können die Aldehyde, die bei der Umesterung aus dem Enolester entstehen, durch Reaktion mit endständig funktionellen Gruppen von Amino­ säuren des Enzyms das Enzym desaktivieren. In EP-A-03 21 918 ist ein Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Enantiomergemischen eines racemischen Alkohols mit oder in einem Vinylester mit Hilfe einer Lipase beschrieben, bei dem der freigesetzte Aldehyd die Lipase nicht desaktivieren soll. Es hat sich aber herausgestellt, daß beim wiederholten Einsatz einer Candida Lipase in einem solchen Verfahren sowohl deren Aktivität als auch deren Selektivität sehr rasch stark absinkt.

In C.J.Gray et al, Enzyme Microb. Technol., Vol 12 (1990), Sei­ ten 800 bis 807, ist geoffenbart, daß die Stabilität einer Can­ dida cylindracea Lipase durch verschiedene Immobilisierungs­ techniken für einen wiederholten Gebrauch erhöht werden kann. Umesterungen unter Einsatz von Enolester sind dort aber nicht erwähnt.

Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, daß sich sowohl die Stabilität gegen Aldehyde, als auch die Aktivität und ungewöhn­ licherweise auch die Selektivität einer Candida Lipase erhöhen, wenn die Lipase vor ihrem Einsatz in einem Umesterungsverfahren unter Verwendung von Enolestern durch Umsetzung von epsilon- Aminogruppen des Lysins der Lipase mit Epoxidgruppen eines epo­ xid-aktivierten makroporösen Trägers, wobei eine N-Alkylierung stattfindet, immobilisiert wird. Durch diese Immobilisierung wird sowohl die Beständigkeit der Lipase gegenüber Aldehyden als auch ihre Aktivität und Substratselektivität im Vergleich zu einer nicht immobilisierten Lipase erhöht, wobei die Substratselektivität bei wiederholtem Einsatz nicht absinkt, sondern völlig konstant bleibt.

Gegenstand der Erfindung ist daher eine Lipase aus einem Mikro­ organismus der Gattung Candida, die dadurch gekennzeichnet ist, daß epsilon-Aminogruppen des Lysins in der Lipase durch N-Alky­ lierung kovalent über geöffnete Epoxidgruppen eines epoxid- aktivierten makroporösen Trägers gebunden sind, wodurch die Li­ pase immobilisiert wird.

Unter Lipase aus einem Mikroorganismus der Gattung Candida sind dabei sowohl ungereinigte Mikroorganismussuspensionen der Gat­ tung Candida als auch gereinigte Enzymfraktionen zu verstehen. Spezies der Gattung Candida (C.) sind beispielsweise C.antarctica, C.rugosa, C.cylindracea. Bevorzugt wird eine Li­ pase aus C.cylindracea eingesetzt. Lipasen der Gattung Candida sind in verschiedenen Reinheitsstufen käuflich zu erwerben.

Zur Immobilisierung der Lipase wird ein epoxid-aktivierter, ma­ kroporöser Träger eingesetzt. Seine Herstellung erfolgt bei­ spielsweise durch Suspensionspolymerisation von Vinylacetat und einem Monomer, das mit Vinylacetat copolymerisierbar ist, z. B. N,N′-Divinylethylenharnstoff in Wasser, partielle Verseifung der Acetat- zu Hydroxygruppen und anschließende Umsetzung mit Epichlorhydrin, das mit freien Hydroxygruppen unter Erhalt des Epoxidringes reagiert. Dabei werden im Polymerisat Spacergrup­ pen mit reaktiven Epoxidgruppen ausgebildet, die zum Verknüpfen des Trägers mit verschiedensten Substraten geeignet sind. Sol­ che Träger und deren Herstellung sind z. B. in K.Burg et al, An­ gew. Makromol. Chem. 157, (1988), Seiten 105 bis 121 beschrie­ ben. Sie sind käuflich erhältlich. Besonders bevorzugt werden als Träger Eupergit C (Röhm Pharma, Deutschland) oder VA-Epoxy- Biosynth, Riedel de Haen (Deutschland), verwendet.

In A.N.Glazer, "The proteins", ed. H.Neurath und R.L. Hill, Academic press London, 1976, Band II, Seiten 1-109, ist geof­ fenbart, daß bei dieser Art der Immobilisierung von Enzymen in erster Linie epsilon-Aminogruppen des Lysins mit Epoxidgruppen des Trägers reagieren, wobei Aminogruppen des Lysins alkyliert werden.

Die erfindungsgemäße Lipase ist also an epsilon-Aminogruppen des Lysins der Lipase über geöffente Epoxidgruppen des Trägers alkyliert, d. h. kovalent mit dem Träger verbunden.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen immobilisierten Lipase. Dazu wird ein ep­ oxid-aktivierter makroporöser Träger mit einer wäßrigen Enzymlösung einer Candida-Lipase bei Temperaturen von 15°C bis zur Desaktivierungstemperatur der Lipase, bevorzugt von 18 bis 30°C in Kontakt gebracht, beispielsweise etwa in einem Schüt­ telkolben bewegt. Das Verhältnis von Träger und Lipase muß zu­ mindest so beschaffen sein, daß in der Reaktionsmischung pro freie Aminogruppe des Lysins in der Lipase eine Epoxidgruppe des Trägers vorliegt. Bevorzugt werden auf 1 g Träger etwa 0,05 bis 0,1 g Lipase verwendet. Die Lipase kann dabei in reinem Wasser, einer Puffer- oder Salzlösung gelöst sein. Dabei rea­ gieren epsilon-Aminogruppen des Lysins in der Lipase mit Epo­ xidgruppen des Trägers, wobei eine N-Alkylierung, also eine ko­ valente Bindung zwischen Lipase und Träger ausgebildet wird. Nach beendeter Reaktion wird die immobilisierte Lipase gegebe­ nenfalls nach Zugabe von Salzen, z. B. NaCl in die Reaktions­ mischung, abfiltriert und mit Pufferlösung gewaschen. Die immo­ bilisierte Lipase kann im Puffer oder feucht oder auch getrock­ net bis zum Einsatz aufbewahrt werden.

Die auf diese Weise hergestellte Lipase wird zur enantioselek­ tiven Veresterung von Enantiomerengemischen chiraler Alkohole durch Umesterung unter Verwendung von Enolestern eingesetzt.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur enan­ tioselektiven Veresterung eines Alkohols, der mindestens ein Asymmetriezentrum im Molekül enthält, das dadurch gekennzeich­ net ist, daß der Alkohol in Gegenwart eines Enolesters und ei­ ner Lipase aus einem Mikroorganismus der Gattung Candida, die an epsilon-Aminogruppen des Lysins in der Lipase mit geöffneten Epoxidgruppen eines epoxid-aktivierten, makroskopischen Trägers durch N-Alkylierung kovalent verbunden ist, verestert wird, wo­ rauf der gebildete Ester des chiralen Alkohols und gegebenen­ falls der nicht umgesetzte Alkohol aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.

Der eingesetzte Alkohol besitzt mindestens ein Asymmetriezen­ trum und ist daher optisch aktiv. Er kann in Form von racemi­ schen Enantiomerengemischen, oder solchen, in denen das eine oder andere Enantiomer angereichert ist, vorliegen.

Von der erfindungsgemäß immobilisierten Lipase können sowohl primäre, als auch sekundäre Alkohole umgesetzt werden. Der Al­ kohol kann auch ein Dialkohol mit zwei Asymmetriezentren im Mo­ lekül sein, wobei Gemische aus R,S-, S,R-, R,R- oder S,S-Alko­ hol vorliegen können. Bevorzugt werden sekundäre Alkohole mit einem Asymmetriezentrum im Molekül als Substrat eingesetzt.

Als Enolester können beispielsweise in EP-A-03 21 918 geoffen­ barte Enolester eingesetzt werden. Bevorzugt werden Vinylester niedriger organischen Säuren, besonders bevorzugt Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat eingesetzt.

Zur Durchführung der Reaktion werden pro Gramm des Enan­ tiomerengemisches des chiralen Alkohols 2 bis 30 g, bevorzugt 6 bis 10 g immobilisierte Lipase und zumindest 5 Äquivalente Enolester, gegebenenfalls mit einem unter den Reaktionsbedin­ gungen inerten Verdünnungsmittel vermischt und unter Rühren oder Schütteln bei Temperaturen von 15°C bis zur Desaktivierungstemperatur der Lipase, bevorzugt bei Raumtempe­ ratur reagieren gelassen.

Die Reaktion kann in unter den Reaktionsbedingungen inerten Verdünnungsmittel durchgeführt werden oder der zur Umesterung verwendeten Enolester wird selbst auch als Verdünnungsmittel und in hohem Überschuß eingesetzt. Bevorzugt wird die Reaktion nicht in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Verdün­ nungsmittel sondern in dem zur Umsetzung verwendeten Enolester durchgeführt.

Die Reaktion wird zweckmäßigerweise bei Temperaturen ausge­ führt, bei denen die Lipase ihre höchste Aktivität zeigt. Diese Temperatur ist vom Anbieter angegeben oder durch einfache Versu­ che festzustellen. Dabei bildet sich je nach verwendetem Alkoholgemisch, Enolester und Spezifität der eingesetzten Lipase vorwiegend der R- oder vorwiegend der S- bzw. vorwiegend der R,S- oder vorwiegend der S,R-Ester des eingesetzten Alkohols, während der entsprechende S- oder R- bzw. S,R-, R,S-, R,R- oder S,S-Alkohol nicht oder nur zu einem kleinen Anteil umgesetzt wird.

Der Fortgang der Reaktion wird dabei durch geeignete und in der Enzymchemie bekannte Methoden, beispielsweise mit Hilfe gaschromatographischer Methoden, verfolgt.

Die Reaktion wird nach Erreichen der gewünschten Enantiomeren­ reinheit des Produktes abgebrochen und das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Dazu wird die immobilisierte Lipase abfiltriert und die Mutterlauge einer geeigneten Trennoperation unterzogen, in deren Verlauf die gewünschten Produkte isoliert werden. Die Abtrennung der gewünschten Produkte aus dem Reaktionsgemisch kann dabei etwa mit Hilfe von Extraktion, Destillation, Chromatographie wie üblich erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein racemisches Ge­ misch eines Alkohols mit Candida cylindracea Lipase, immobili­ siert mit Hilfe von VA-Epoxy-Biosynth, Riedel-de-Haen, Deutschland, in Vinylacetat bei Raumtemperatur gerührt oder geschüttelt. Nach Erreichen eines gewünschten Enantiome­ renüberschusses des gebildeten R- oder S- bzw. R,S- oder S,R- Esters wird das Enzym abfiltriert und die gewünschten Produkte destillativ oder chromatographisch aufgetrennt.

Es hat sich herausgestellt, daß bei der erfindungsgemäßen Reak­ tion im Vergleich zu einer nicht immobilisierten Lipase sowohl die Beständigkeit der Lipase gegen Acetaldehyd, als auch ihre Aktivität und Selektivität anstieg. Besonders überraschend war der mehr als 5fache Anstieg der Selektivität, die beim wieder­ holten Einsatz der immobilisierten Lipase völlig konstant blieb.

Die immobilisierte Lipase und ihre Verwendung bei der erfin­ dungsgemäßen enantioselektiven Veresterung stellen daher eine Bereicherung der Technik dar.

Beispiel 1

10,0 g VA-Epoxy-Biosynth (Riedel-de-Haen, Deutschland) wurden in 70 ml 0,1 n Phosphatpuffer, pH 7,00, suspendiert und nach Zugabe von 300 mg Lipase von Candida cylindracea Lipase (AY-30, Firma Amano Pharm. Co, Japan) bei 27°C und 80 U.p.min 3 Tage geschüttelt. Nach Zugabe von 70 ml Natriumchloridlösung wurde abfiltriert, zweimal mit je 30 ml 0,05 n Phosphatpuffer, pH 7 gewaschen und getrocknet.

Die spezifische Aktivität der derart hergestellten immobili­ sierten Lipase wurde durch Titration der gebildeten Essigsäure mit 0,1 n Natronlauge während der Hydrolyse von Triacetin in 0,1 n Phosphatpuffer, pH 7,00, bestimmt und betrug 5,70 µmol min^-1 g^-1. Die spezifische Aktivität der nicht immobilisierten Lipase betrug unter den gleichen Bedingungen 13 µmol min^-1.

Beispiel 2

1 g racemisches endo-Norborn-5-en-2-ol (9 mmol) wurde mit 200 mg Candida cylindracea Lipase (Ay-30, Firma Amano Pharm. Co., Japan) vermischt und in 10 ml Vinylacetat bei 20° und 200 U.p.min geschüttelt. Der Fortgang der Reaktion wurde gaschroma­ tographisch verfolgt. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion abge­ brochen. Die Lipase wurde abfiltriert und die Mutterlauge im Vakuum eingedampft. Nach konventioneller Säulenchromatographie des Rückstandes über Kieselgel wurden (+)-endo-Norborn-5-en-2- yl Acetat und (-)-endo-Norborn-5-en-2-ol erhalten. Die Untersuchungsergebnisse betreffend Lipaseaktivität, Umsatz, Enantiomerenverhältnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Beispiel 3

wurde wie Beispiel 2 durchgeführt, mit dem Unterschied, daß die nach Beispiel 1 immobilisierte Lipase eingesetzt wurde. Die Un­ tersuchungsergebnisse betreffend Lipaseaktivität, Umsatz, Enan­ tiomerenverhältnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Der jeweilige Enantiomerenüberschuß wurde mit Hilfe gaschroma­ tographischer Auftrennung der entsprechenden Menthylcarbonate, die durch Derivatisierung mit (-)-Menthylcarbonat nach B.Berger et al, Tetrahedron: Asymmetry, 1 (1990), Seiten 541-546, herge­ stellt wurden, bestimmt. S: Enantioselektivität der Reaktion Bestimmt nach der Methode von Chen et al., J.Am.Chem. Soc, 104 (1982), Seiten 7294-7299.

Claims (10)

1. Lipase aus einem Mikroorganismus der Gattung Candida, da­ durch gekennzeichnet, daß epsilon-Aminogruppen des Lysins in der Lipase durch N-Alkylierung kovalent über geöffnete Epoxidgruppen eines epoxid-aktivierten makroporösen Trägers gebunden sind, wodurch die Lipase immobilisiert wird.

2. Lipase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ma­ kroskopische Träger durch Suspensionspolymerisation von Vi­ nylacetat und einem Monomer, das mit Vinylacetat copolyme­ risierbar ist, in Wasser, partielle Verseifung der Acetat zu Hydroxygruppen und anschließende Umsetzung mit Epichlor­ hydrin, das mit freien Hydroxygruppen unter Erhalt des Epo­ xidrings reagiert, hergestellt wird.

3. Verfahren zur Immobilisierung einer Lipase aus einem Mikro­ organismus der Gattung Candida, dadurch gekennzeichnet, daß ein epoxid-aktivierter makroporöser Träger mit einer Lösung einer Candida-Lipase in Wasser, einer Puffer- oder einer Salzlösung bei Temperaturen von 15°C bis zur Desaktivierungstemperatur der Lipase umgesetzt wird, wobei durch N-Alkylierung kovalente Bindungen zwischen epsilon- Aminogruppen des Lysins in der Lipase mit geöffneten Epo­ xidgruppen des epoxid-aktivierten makroporösen Trägers aus­ gebildet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß pro g des makroporösen Trägers 0,05 bis 0,1 g Lipase eingesetzt werden.

5. Verwendung einer Lipase nach Anspruch 1 zur enantioselekti­ ven Veresterung eines chiralen Alkohols mit Hilfe eines Enolesters.

6. Verfahren zur enantioselektiven Veresterung eines chiralen Alkohols, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol in Gegen­ wart eines Enolesters und einer Lipase aus einem Mikroorga­ nismus der Gattung Candida, die durch N-Alkylierung über epsilon-Aminogruppen des Lysins mit Epoxidgruppen eines ep­ oxid-aktivierten makroporösen Trägers kovalent verbunden ist, verestert wird, worauf der gebildete Ester des chiralen Alkohols und gegebenenfalls der nicht umgesetzte Alkohol aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß auf ein Gramm des chiralen Alkohols mindestens 5 Äquivalente Enolester und 2 bis 30 Gramm immobilisierte Lipase einge­ setzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Verdünnungsmittel für die Veresterung je­ ner Enolester, der auch als Reaktionspartner verwendet wird, eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Enolester Vinylacetat, Vinylpropionat oder Vinylbutyrat eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Lipase eine Lipase aus einem Mikroorga­ nismus der Spezies Candida cylindracea eingesetzt wird.