DE4127908C2

DE4127908C2 -

Info

Publication number: DE4127908C2
Application number: DE19914127908
Authority: DE
Inventors: Werner Dr. 6240 Koenigstein De Aretz; Udo Dr. 6230 Frankfurt De Hedtmann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1991-08-23
Filing date: 1991-08-23
Publication date: 1993-09-09
Also published as: DE4127908A1

Description

Im Rahmen der Suche nach Mikroorganismen, die in der Lage sind, Glycerinsäureether-Lipide mit mehrfach ungesättigter und verzweigter Lipidkomponente zu modifizieren, wurden Pseudomonas aeruginosa Stämme gefunden, die durch Zugabe von Glycerinsäureether-Lipiden zur Nährlösung die Produktion verschiedener Rhamnolipide induzieren. Eines dieser Rhamnolipide wurde als Rhamnolipid I (Wagner et al., Eur. Congr. Biotechnol., 3rd Vol. 1, S. 3-8, Verlag Chemie, Weinheim, 1984) identifiziert.

Die Synthese von Rhamnolipiden gewinnt wirtschaftlich immer mehr an Bedeutung, da aus Rhamnolipiden durch die saure Hydrolyse Rhamnose entsteht und z. B. das L-Enantiomer dieses Desoxyzuckers eine breite Anwendung findet (beispielsweise in der Synthese von pharmazeutischen Erzeugnissen und Pflanzenschutzmitteln).

In der Literatur sind mehrere Verfahren zur Induktion der Rhamnolipidsynthese beschrieben. Der erste Hinweis, daß Rhamnolipide aus Pseudomonas aeruginosa isoliert werden können, kommt von Garvis et al. (J. Am. Chem. Soc. 71, S. 4124, 1990).

Als Induktoren für die Rhamnolipid-Synthese sind bisher nur solche Stoffe literaturbekannt, die während der Fermentation des Mikroorganismus abgebaut und deshalb immer wieder neu zugesetzt werden müssen. In DE 21 50 375 wird z. B. die Produktion von Rhamnolipid I mit Hilfe von Pseudomonas aeruginosa in Nährlösungen mit 10% (v/v) n-Paraffinen beschrieben.

Pasra et al (Tenside Surfactants, Deterg. 27, 302 1990) beschreibt die Produktion von Rhamnolipid I, indem die Nährlösung mit Olivenöl statt Paraffin versetzt wird.

Es wurde nun gefunden, daß in Pseudomonas aeruginosa-Stämmen die Synthese von Rhamnolipiden und insbesondere von Rhamnolipid I mit Hilfe des Glycerinsäureester-Lipids MA induziert werden kann, ohne daß das als Induktor wirkende Glycerinsäureester-Lipid MA während der Fermentation neu zugesetzt wird.

Das Glycerinsäureether-Lipid MA ist ein mikrobiologisch gewonnenes Abbauprodukt des Antibiotikums Flavomycin®. Die Herstellung von MA wird in EP 8 91 15 069 beschrieben.

Die Erfindung betrifft somit: Ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Synthese von Rhamnolipiden durch Induktion in Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mit Hilfe des Glycerinsäureether-Lipids MA die Synthese von Rhamnolipiden, insbesondere von Rhamnolipid I, induziert und der Induktor MA während der Fermenation nicht neu zugesetzt wird. Die Ansprüche 2 bis 4 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Eine Verwendung des nach dem o. g. Anspruch hergestellten Rhamnolipids, insbesondere Rhamnolipid I, zur Herstellung von Rhamnose (Anspruch 5).

Das Verfahren gestaltet sich kostengünstig und arbeitssparend, da das Glycerinsäureester-Lipid MA nur einmal zu der Fermentation der Mikroorganismen zugegeben wird (Induktorwirkung) und es nach Beendigung des Verfahrens wiedergewonnen werden kann.

Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung in den Patentansprüchen definiert.

Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

Das Pseudomonas aeruginosa-Stamm ATCC 10145 ist bei der internationalen Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection (USA) erhältlich. Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701 ist von der internationalen Hinterlegungsstelle National Collection of Type Cultures zu beziehen.

Herstellen der Vorkultur

Das Wachstum der Pseudomonas aeruginosa-Stämme ist besonders gut auf einem festen Nährboden mit den Bestandteilen: Glucose, Caseinpepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Leberextrakt und NaCl. Der pH-Wert des Nährbodens beträgt pH 6,2-7,6, insbesondere pH 6,8.

Der Nährboden wird in noch flüssigem Zustand sterilisiert.

Nach dem Abkühlen wird die Kultur mit dem Stamm inokuliert und mehrere Tage bei 25-32°C, insbesondere 28°C, inkubiert.

Herstellen der Hauptkultur

Die Bestandteile der Hauptkultur sind: Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Maiswasser (flüssig) und das Glycerinsäureether-Lipid MA. In der europäischen Patentanmeldung 8 91 15 069 wird ein Verfahren zur Synthese des Glycerinsäureether-Lipids MA beschrieben.

Die Fermentation der Pseudomonas aeruginosa-Stämme erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die Fermenation erfolgt bis zu 7 Tagen bei 25-32°C, insbesondere 28°C, unter gleichmäßigem Rühren.

Das Glycerinsäureether-Lipid MA wird in Mengen von 0,2 bis 1,5 g/L, insbesondere in einer Konzentration von 0,2 g/L, vor oder während der Fermentation der Hauptkultur zugegeben.

Die Rhamnolipidinduktion und -bildung wird dünnschichtchromatographisch während der gesamten Fermentation verfolgt.

Gewinnung der Rhamnose

Die Kulturlösung der Hauptkultur wird zentrifugiert, so daß die Bakterienzellen und Zellfragmente sedimentieren. Der Überstand wird zur Isolierung des Rhamnolipids mit Essigsäureethylester, vorzugsweise mit gleichem Volumen Essigsäureethylester, extrahiert und die organische Phase fast bis zur Trockenheit eingeengt.

Die Aufreinigung des Rückstandes aus der organischen Phase erfolgt mittels Säulenchromatographie.

Die Aufreinigung zeigt als Hauptbestandteil Rhamnolipid 1, sowie drei weitere Rhamnolipide in geringeren Mengen.

Mittels dem Standardverfahren der Hydrolyse kann das Rhamnolipid in Rhamnose gespalten werden. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung mittels dem Standardverfahren der sauren Hydrolyse.

Beispiele Beispiel 1 Rhamnolipidbildung in verschiedenen Pseudomonas-Stämmen

Die untersuchten Pseudomonas-Stämme ATCC 10145 und NCTC 10701 werden auf folgendem festen Nährboden gehalten:

Glucose\|1,0%
Caseinpepton	0,4%
Fleischextrakt	0,4%
Hefeextrakt	0,1%
Leberextrakt	0,1%
NaCl	0,25%
pH 6,8

Das Medium wird auf Reagenzgläser verteilt und 30 Min. bei 121°C sterilisiert, anschließend abgekühlt, mit dem Stamm beimpft und 2-3 Tage bei 28°C inkubiert.

Eine Impföse dieser Kultur dient als Inokulum folgender, MA-haltiger, Hauptkultur:

Glucose\|1%
Pepton	1%
Hefeextrakt	0,2%
Cornsteep, fl.	0,2%
MA	0,05%
pH 5,8

50 ml dieses Mediums pro 300 ml Erlenmeyerkolben werden nach dem Beimpfen für bis zu 7 Tagen bei 28°C und 190 Upm inkubiert. Die Rhamnolipidbildung wird dünnschichtchromatographisch verfolgt: HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F₂₅₄; Chloroform-Methanol-Wasser 18 : 11 : 2,7; Detektion mit PMS-CerlV-Sulfat.

Von den untersuchten Pseudomonas-Spezies konnte in folgenden Pseudomonas aeruginosa Stämmen eine Rhamnolipidbildung durch MA induziert werden:

In Kontrollansätzen ohne das Glycerinsäureether-Lipid MA wurde kein Rhamnolipid gebildet.

Beispiel 2 Optimierung der MA-Konzentration

Unter den im Beispiel 1 genannten Kulturbedingungen produziert Pseudomonas aeruginosa das Rhamnolipid bei Glycerinsäureether-Lipid MA-Konzentration im Bereich von 0,2-1,5 g/L Nährlösung. Das Maximum der Produktivität liegt bei 0,2 g/L, Konzentrationen; < 1,5 g/L verhindern die Produktbildung.

Beispiel 3 Isolierung und Reinigung des Rhamnolipid I

140 ml Kulturlösung nach Beispiel 1 wurden zentrifugiert, der Überstand mit dem gleichen Volumen Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie zunächst an 40 ml Kieselgel (Eluent: Chloroform/Methanol/Essigsäure = 80/10/1) und anschließend an RP-18 Material (50 ml, Eluent: Methanol/0,1% Trifluoressigsäure 5/1) gereinigt, dabei wurden als Hauptkomponente 79 mg des Rhamnolipid I sowie drei weitere Rhamnolipide erhalten. Die Identität der Hauptkomponente mit Rhamnolipid I wurde durch spektroskopischen und chromatographischen Vergleich mit einer authentischen Probe bewiesen.

Die Wiedergewinnung des Glycerinsäureether-Lipids aus der Fermentationsbrühe erfolgt wie in EP 8 91 15 069 beschrieben.

Claims

1. Verfahren zur Synthese von Rhamnolipiden durch Induktion in Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe des Glycerinsäureether-Lipids MA die Synthese von Rhamnolipiden, insbesondere von Rhamnolipid I, induziert und der Induktor MA während der Fermentation nicht neu zugesetzt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 und NCTC 10701 eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß MA in einer Konzentration von 0,2 bis 1,5 g/L Nährlösung der Hauptkultur zugesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß MA in einer Konzentration von 0,2 g/L Nährlösung der Hauptkultur eingesetzt wird.

5. Verwendung des nach einem der vorstehenden Ansprüche hergestellten Rhamnolipids, insbesondere Rhamnolipid I, zur Herstellung von Rhamnose.