DE4123687A1 - Monoklonale antikoerper gegen humanes interferon c und diese antikoerperproduzierende hybridomazellinien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen humanes Interferon c und diese Antikörper produzierende Zellinien.

Interferon wurde entdeckt von Nagano et al (Compt. Red. Soc. Biol., Bd. 148, S. 1700, 1954) und Isaacs et al (Proc. Roy. Soc. Ser. B, Bd. 147, S. 258, 1957).

Relativ früh wurde erkannt, daß es verschiedene Arten von Interferonen gibt, die biologische Wirkungen zeigen. Antisera konnten mindestens 3 Arten unterscheiden: In­ terferon (IFN) aus Leukozyten (IFN-a), IFN aus Fibroblasten (IFN-b) und Immunoin­ terferon (IFN-c). IFN-c wird dabei nur von Immunzellen ausgeschüttet, die durch spezi­ fische Antigene oder Mitogene stimuliert werden.

Aufgrund seiner biologischen Eigenschaften hat sich herauskristallisiert, daß besonders das IFN-c als interessantes und vielversprechendes Mittel bei der Behandlung viraler Erkrankungen eingesetzt werden kann und darüber hinaus aufgrund der antiproliferati­ ven und imunomodulierenden Aktivitäten auch bei der Bekämpfung von Krebskrank­ heiten. Eingehendere Untersuchungen scheiterten zunächst an der äußerst geringen Konzentration an IFN-c in natürlichen humanen Zellen. Erst mit der Entwicklung der Gentechnologie und der Möglichkeit, humanes Protein in niederen Organismen klonie­ ren zu können, war es nach langwierigen und schwierigen Untersuchungen möglich, auch IFN-c in Mikroorganismen zu exprimiieren. Dieses "rekombinante IFN-c" (rIFN-c) zeigt in hochgereinigter Form die gleichen Wirkungen, wie das natürliche IFN-c. Es eignet sich dadurch, daß es praktisch in beliebigen Mengen herstellbar ist, zum Einsatz in der Therapie viraler Erkrankungen.

In der Entwicklung dieses rekombinanten Interferons wurde zunächst ein Protein herge­ stellt, das am Aminoterminus drei zusätzliche Aminosäuren nämlich Cystein, Tyrosin und Cystein trägt und somit 146 Aminosäuren lang ist.

Erst durch die später mögliche Sequenzierung des natürlichen IFN-c wurde klar, daß na­ türliches IFN-c ein Protein mit 143 Aminosäuren ist, das kein Cystein enthält.

In jüngster Zeit wurde deshalb humanes rekombinantes IFN-c hergestellt, daß 143 Aminosäuren lang ist und am NH₂-Terminus Methionin trägt. Bis auf das zusätzliche, NH₂-terminalen Methionin ist es in der Aminosäuresequenz identisch mit dem soge­ nannten natürlichen IFN, das aus menschliche Zellen isoliert wird (siehe: Rinderknecht, E., O'Connor, B. H., and Rodriguez, H. 1984: J. Biol. Chem. 259: 6790).

Das natürliche IFN-c trägt zudem zusätzlich an zwei Asparginen Zuckerreste, die dem rekombinanten IFN-c fehlen. Zudem ist das Glutamin in Position 1 modifiziert und liegt als Pyro-Glutamat vor.

Wissenschaftliche Untersuchungen, ebenso wie die therapeutische Anwendung, ließen das Bedürfnis entstehen, nicht nur die Aktivität des Interferons, sondern das Protein selber nachzuweisen. Die biologische Aktivität auf lebenden Zellen ist nur mühsam und aufwendig nachzuweisen. Alternative Testsysteme müssen jedoch eine ausreichende Spezifität aufweisen, um Interferon in biologischen Flüssigkeiten, die viele verschiedene Proteine enthalten, nachweisen zu können. Diese Forderung ist nur durch immunbiolo­ gische Methoden zu erfüllen. Eine Möglichkeit, ein immunbiologisches Testsystem auf­ zubauen, besteht in der Verwendung von Antikörpern, die aus dem mit dem nachzuwei­ senden Antigen immunisierter Tiere gewonnenen Serum erhalten werden können. Seit den Arbeiten von Köhler und Milstein (Nature London 495; 1975) läßt sich die Spezifi­ tät dieser Antikörper-Testsysteme durch die Verwendung sogenannter monoklonaler Antikörper erhöhen.

Die DE 34 26 007 beschreibt 3 monoklonale Antikörper (MoBs) gegen humanes IFN-c sowie Hybridomazellinien, die diese Antikörper produzieren.

Die in der DE 34 26 007 aufgeführten 3 monoklonalen Antikörper (im folgenden MoB GZ-25, C-15, GZ-4 genannt) wurden gegen ein rekombinantes IFN-c gewonnen, daß am NH₂-Therminus die 3 zusätzlichen Aminosäuren Cys-Tyr-Cys trägt und damit 146 Ami­ nosäure lange ist. Dementsprechend erkennt der MoB GZ-25 und der MOB C-15 kein natürliches IFNc, da dieses ja 143 Aminosäuren lang ist. Zusätzlich weisen diese beiden MOBs keine neutralisierende Wirkung gegenüber natürlichen IFN-c auf. Lediglich der in DE 34 26 077 mit GZ-4 gekennzeichnete MoB zeigt anscheinend gegenüber natürli­ chen IFN-c eine bindende Wirkung, aber auch gleichzeitig eine neutralisierende.

Um ein gezieltes und sicheres biologisches Testsystem aufzubauen, ist es aber dringend erforderlich, daß der MoB gleichzeitig zwischen natürlichen und rekombinanten IFN-c diskriminieren kann und daß dieser MoB eine neutralisierende Wirkung gegenüber na­ türlichen IFN-c aufweist. Nur auf diese Weise ist es möglich ein ausreichend empfindli­ ches Testsystem aufzubauen, mit dem sicher zwischen körpereigenem IFN und rekom­ binantem IFN unterschieden werden kann. Nur so kann in einem Bereich mit einer ho­ hen Empfindlichkeit festgestellt werden, wieviel natürliches IFN-c vorhanden ist und wieviel durch Therapie zugeführt worden ist. Eine weiterer Nachteil der bisherigen MoB's des Standes der Technik ist, daß sie nicht in der Lage sind, ein IFN-c an einer be­ stimmten Position zu erkennen. Dadurch ist eine aufwendige Sequenzierung nötig um letztendlich zu entscheiden, ob nun das rekombinante IFN-c in der vollständigen Se­ quenz vorhanden ist.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, monoklonale Antikörper anzugeben, die spezifisch das rekombinante IFN-c mit 143 Aminosäuren an einer definierten Stelle erkennt. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, daß der monoklonare Antikörper gegenüber dem natürlichen IFN-c keine bindende Wirkung aufweisen soll aber neutralisierend wirkt. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, daß der monoklonare Antikörper auch eine bindende Wirkung gegen Mutanten des rekombinanten IFN-c aufweist, solange das Pro­ tein in Position 1 ein Glutamin als Aminosäure enthält.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es zusätzlich, einen solchen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der spezifisch mit dem Glutamin in Position 1 des Protein reagiert, um damit eine NH₂-Terminale Sequenzierung von rekombinanten IFN-c zu ersetzen.

Durch die Bereitstellung von Hybridomazellinien, die durch Zellfusion von Milzzellen einer mit rekombinanten humanen IFN-c mit 143 Aminosäuren als Antigen immunisier­ ten Maus, mit Myelomzellen erhalten werden und die von diesen produzierten mono­ klonalen Antikörper, die spezifisch mit IFN-c reagieren und zwar dann, wenn dieses IFN-c in Position 1 die Aminosäure-Glutamin in nicht modifizierter Form trägt, wird die Aufgabe gelöst. Der Antikörper G3E der Anmelderin wurde am 30.05.1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig von der Anmelderin hinterlegt.

Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgte in Anlehnung an bekannte Me­ thoden (C. Milstein, G. Köhler, Nature 256 (1975), 495).

Als Antigen wurde menschliches, rekombinantes IFN-c (r-hu-IFN-c) verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen ein rekombinantes humanes IFN-c, das aus Bakterienzellen gewonnen wurde und 143 Aminosäuren lang ist. Dieses rekombinante humane IFN-c trägt am NH₂-Terminus zusätzlich ein Methionin. Wei­ terhin ist das Glutamint in Position 1 nicht modifiziert, d. h. es liegt nicht als Pyro-Glutamat vor.

Die Immunisierung erfolgte in vivo mit weiblichen Balb/c Mäusen im Alter von 6 bis 8 Wochen über einen Zeitraum von 20 bis 50 Tagen.

Zur Zellfusion wurden Plasmazellen (B-Lymphzyten) aus der Milz der immunisierten Maus nach einem modifizierten Protokoll (siehe: Galfre, G. und Milstein, C. 1981: Pre­ paration of moniclonal antibodies: Strategy and procedures. In: Lagone, J. J. and Van Vunakis, H. (eds.), Methods in Enzymology 73: 1 Immunological Techniques Part B, Academic Press, New York) mit Myelomzellen fusioniert und die so entstandenen Hyprodomazellinien kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde als Myelomzelle die der Linie NS-0 (ECACC Nr. 85110503) verwendet.

Die Selektion erfolgte in der Art, daß die Überstände der verschiedenen Hybridomazel­ len mit einem "ELISA-Test" (Enzym linked Immunsorbent Assay) auf IFNc spezifische Antikörper untersucht wurden (Peters, J. H., Baumgarten usw., siehe Literaturstelle 3 des Anhanges). Positive Klone wurden danach von einer von Köhler und Milstein be­ schriebenen Methode kultiviert. Hybridomazellklone wurden dann nach der "Limiting Dilution Methode" rekloniert (siehe: Fazekas De St. Groth, S., (1982): The Evaluatin of Limiting Dilution Assays. J. of Immunol. Meth. 49: R11).

Die Charakterisierung der moniklonalen Antikörper erfolgt mittels ELISA und Immu­ noblottechniken, in denen gentechnologisch verkürzte IFNc ausgetestet wurden.

Dieser monoklonale Antikörper G3E gehört zur Klasse Ig0G 1 und hat eine Molekular­ gewicht im Bereich von ca. 150 000 dalton.

Am Beispiel der Herstellung des monoklonaren Antikörpers G3E wird die Erfindung näher erläutert.

Dazu wurde als Antigen das menschliche rekombinante IFN-c, das aus Bakterienzellen gewonnen wurde, 143 Aminosäuren lang ist und am NH₂-Terminus zusätzlich ein Me­ thionin trägt, verwendet. Dieses Antigen ist bis auf das zusätzliche NH₂-terminale Methinin mit dem natürlichen IFN-c, das aus menschlichen Zellen isoliert wird, iden­ tisch. Das natürliche IFN-c trägt nur noch zusätzlich an zwei Asparaginen Zuckerreste, die dem rekombinanten IFN-c fehlen (siehe Abb. 1). Das Glutamin in Position 1 ist beim natürlichen IFN-c zusätzlich noch modifiziert und liegt in Form des Pyro-Glutamat vor.

Weibliche Balb/c Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden dann über einen Zeit­ raum von 45 Tagen mit dem o. angegebenen rekombinanten IFN-c immunisiert. Den Tieren wurden 4·IFN-c injiziert. Die eingesetzte Proteinmenge sowie das verwendetet Adjuvans und die Applikationsart geht aus Tabelle 1 hervor.

Zur Zellfusion wurden dann Plasmazellen aus der Milz der immunisierten Maus nach einem modifizierten Protokoll, wie oben aufgezeigt, mit der Myelomzellinie NS-0 (ECACC Nr. 85110503) fusioniert und die so entstandenen Hybridomazellen kultiviert.

Die Überstände der verschiedenen Hybridomazellen wurden mit einem ELISA-Test auf IFN-c spezifische Antikörper untersucht. Positive Klone wurden nach der Methode von Köhler und Milstein, wie bereits ausgeführt, kultiviert. Der Hybridomazellklon wurde dann nach der Limiting Dilution Methode rekloniert.

Zur Charakterisierung dieses moniklonalen Antikörper wurden gentechnologisch ver­ kürzte oder verlängerte IFN-c-Mutantenproteine eingesetzt, deren mögliche Wechsel­ wirkung mit dem Antikörpern mittels ELISA und Immunoblottechniken ausgetestet wurden.

Dabei wurde ein monoklonaler Antikörper (G3E) charakterisiert, der nur dann das IFN-c erkennt, wenn dieses Protein in Position 1 die Aminosäure Glutamin trägt. Das Glutamin wird dabei nur dann erkannt, wenn es in nicht modifizierter Form, d. h. nicht als Pyro-Glutamat. Zusätzliche Aminosäuren vor dem Glutamin wie das Methionin im kompletten IFN-c oder die Aminosäuren Cys-Tyr-Cys in der Mutante N+3 stören das Erkennen nicht. Der Austausch des Glutamins durch eine andere Aminsosäure (wie z. B. die Mutante N3^X) oder Deletion dieser Aminosäure (Mutante N-1) führt aber, wie auch bei weiterer Deletion (Mutanten N-3 und N-4) zu einem Verlust des Erkennens. Selbst das im natürlichen IFN-c vorhandene Pyro-Glutamat in Position 1 führt bereits zu einer Diskriminierung, d. h. die Modifizierung dieses Glutamins stört bereits die Wechselwirkung. Abbildung 2 zeigt die Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers G3E mit NH₂-terminalen Mutanten des IFN-c.

Mit diesem momoklonalen Antikörper G3E steht demnach erstmals ein Antikörper zur Verfügung, der zwischen natürlichem und rekombinanten IFN-c in der Weise unter­ scheiden kann, daß er das rekombinante IFN-c spezifisch an der ersten Aminosäure, nämlich an Glutamin erkennt und zwar in der Weise, daß G3E zwischen Glutamin und Pyro-Glutamat unterscheiden kann. Dadurch ist eine Diskriminierung zwischen rekomibinanten und natürlichen IFN-c möglich. Eine weitere wichtige Eigenschaft die­ ses neuen MoBs ist, daß er neben der Diskriminierung zwischen natürlichen und re­ kombinanten IFN-c alle biologischen Aktivitäten des IFN-c neutralisiert. Durch diese beiden Eigenschaften ist es möglich, ein biologisches Testsystem aufzubauen, daß eine Empfindlichkeit aufweist, die bis zu 10^-9 Gramm reicht.

Die Fähigkeit dieses MoB G3E zur Erkennung des rekombinanten IFN-c an einer ganz bestimmten definierten Stelle, nämlich an der Aminosäure 1 der Sequenz, ermöglicht nun auch, daß, wenn eine Bindung mit einem derartigen rekombinanten IFN-c eintritt, die Aussage, daß dieses IFN-c zumindest im Anfangsbereich eine korrekte Abfolge der Aminosäuresequenz aufweist. Dadurch wird eine aufwendige Sequenzanalyse am NH₂-terminalen Ende erspart. Der neue Antikörper G3E bietet somit weitere entscheidende Vorteile gegenüber dem Stand der Technik.

Tabelle 1

Immunisierung von Balb/c Mäusen mit IFNγ

IFNγ wurde jeweils ein einem Endvolumen von 200 µl Adjuvans oder PBS pro Maus injiziert.

Erklärungen der Abkürzungen

a: komplettes Freund'sches Adjuvans
b: imkomplettes Freund'sches Adjuvans
i. p. intraperitoneal
i. v. intravenös

Abbildung 1

Aminosäurensequenz des menschlichen Interferon Gamma (IFNγ)

Die potentielle Bindungsstelle des monoklonalen Antikörpers G3E ist unterstrichen. Die für die Erkennung essentielle erste Aminosäure (Gln) ist doppelt unterstrichen.

Abbildung 2

Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers G3E mit NH₂-terminalen Mutanten des IFNγ

Vereinbarungsgemäß ist die Aminosäure Glutamin festgelegt in Position 1. Dieses Glutamin ist in den IFNγ-Proteinen unterstrichen.

Claims (13)

1. Hybridomazellinien, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Zellfusion von Milzzellen einer mit rekombinantem humanem In­ terferon c (r-hu-IFNc) als Antigen immunisierten Maus, mit Myelomzellen er­ halten werden und die monoklonalen Antikörper produzieren, die spezifisch mit Interferon c (IFNc) reagieren, wenn dieses Protein in Position 1 die Aminosäure Glutamin, in nichtmodifizierter Form, trägt.

2. Hybridomazellinien nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein r-hu-IFNc ist, das aus Bakterienzellen gewonnen wird, und folgende Aminosäuresequenz aufweist:

3. Hybridomazellinien nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Milzzellen die von Balb/c Mäusen und als Myelomzellen die der Linie NS-0 (ECACC Nr. 85110503) verwendet werden.

4. Hybridomazellinie G3E nach Anspruch 1 bis 3 mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2010.

5. Hybridomazellinie nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie permanent als einzigen Antikörper den monoklonalen Antikörper G3E produziert.

6. Monoklonaler Antikörper G3E erhalten aus der Hybridomazellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2010.

7. Monoklonaler Antikörper G3E nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er der Klasse IgGl angehört und ein Molekulargewicht ca. 150 000 dalton hat.

8. Monoklonaler Antikörper G3E nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch mit IFNc reagiert, wenn dieses Protein in Position 1 die Amino­ säure Glutamin in nichtmodifizierter Form trägt und daß er alle biologischen Ak­ tivitäten dieses IFNc neutralisiert.

9. Monoklonaler Antikörper G3E nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er auch dann mit dem Glutamin in Position 1 des Proteins reagiert, wenn zu­ sätzliche Aminosäuren vor dem Glutamin wie z. B. Methionin (wie im komplet­ ten IFNc) oder die Aminosäuren Cys/Tyr/Cys vorhanden sind.

10. Monoklonaler Antikörper G3E nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er das IFNc nicht erkennt, wenn die Aminosäure Glutamin durch eine an­ dere Aminosäure (Mutante N3⁺) ersetzt wird oder diese Aminosäure deletiert ist (Mutante N-1).

11. Monoklonaler Antikörper G3E nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er das natürliche INFc nicht erkennt.

12. Verwendung des monoklonalen Antikörpers G3E nach Anspruch 6 bis 11 zur diagno­ stischen Diskriminierung von natürlichen IFNc.

13. Verwendung des monoklonalen Antikörpers G3E nach Anspruch 6 bis 11 zum Ersatz der NH₂-terminalen Sequenzanalyse des rekombinanten IFNc.