DE4040874A1

DE4040874A1 - Lipolytische enzyminhibitoren und sie enthaltende diaetische agentien und lebensmittel- und futterzusaetze

Info

Publication number: DE4040874A1
Application number: DE4040874A
Authority: DE
Inventors: Toshiyuki Miyazaki; Hirofumi Motoi; Toshiaki Kodama; Taturo Maeda; Takahiro Tsujita; Hiromichi Okuda
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1989-12-25
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1991-06-27
Also published as: GB2239455A; FR2656311A1; FR2656311B1; GB2239455B; GB9027268D0

Description

Die Erfindung betrifft Inhibitoren für Enzyme, die an der Li polyse beteiligt sind. Sie betrifft insbesondere lipolytische Enzyminhibitoren, die basische Proteine und/oder basische Po lypeptide umfassen, sowie sie enthaltende diätetische Agenti en und Lebensmittel- und Futterzusätze.

In einer Reihe von Literaturstellen ist angegeben, daß Prote ine, wie Serum-Albumin, β-Lactoglobulin und bestimmte Sojaboh nen-Proteine, einige Arten von Lipseninhibieren (vgl. z. B. "Journal of Lipid Research", Band 25, 1984, Seiten 1214 bis 1221). In Gegenwart von Gallensäuren verlieren diese Proteine jedoch ihre Lipase-Inhibierungsaktivität und wirken in vivo nicht als Lipase-Inhibitor.

Umfangreiche Untersuchungen auf dem Gebiet der Protein-Lipase inhibitoren haben gezeigt, daß basische Proteine, basische Pep tide und ihre Salze die Aktivität von lipolytischen Enzymen in Gegenwart von Gallensäuren inhibieren oder unterdrücken. Darauf beruht die vorliegende Erfindung.

Gegenstand der Erfindung ist ein lipolytischer Enzyminhibitor, der als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) mindestens ein basi sches Protein und/oder mindestens ein basisches Peptid und/ oder mindestens ein Salz davon enthält.

Unter dem hier verwendeten Ausdruck "lipolytischer Enzyminhi bitor" ist ein Agens zu verstehen, das die Funktion hat, die Aktivität von lipolytischen Enzymen, wie Lipasen, zu inhibie ren bzw. zu hemmen oder zu unterdrücken, wodurch die Hydro lyse von Lipiden, die zur Inhibierung oder Unterdrückung der Intestinalabsorption von Lipiden führt, inhibiert oder unter drückt wird.

Die erfindungsgemäßen lipolytischen Enzyminhibitoren sind wirksam unter solchen Bedingungen, bei denen Lipide in Gegen wart von Gallensäuren emulgiert werden, so daß sie in vivo wirksam sind.

Zu den basischen Proteinen, basischen Polypeptiden und Salzen davon, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören Purothionine, die im Weizen enthalten sind; Purothionin-Ana loga, die in anderen Getreidearten als Weizen (einschließlich Gerste und Roggen) enthalten sind, wie z. B. Purothionin-analo ge Polypeptide, die in Gerste weit verbreitet sind, wie in der japanischen Patentpublikation 57 840/1986 beschrieben, und Pu rothionin-analoge Polypeptide, die im Roggen vorkommen, wie in "J. Agric. Food Chem.", Band 26, Nr. 4, Seiten 794 bis 796 (1978), beschrieben; Protamin; Histon; Polylysin; Polyarginin und Salze davon.

Drei Arten von Purothioninen, das α₁-, α₂- und β-Purothionin, weisen einige Unterschiede in bezug auf die Aminosäuresequenz auf, wobei jede von ihnen die folgenden Aminosäuresequenzen besit zen. Erfindungsgemäß können beliebige Purothionine verwendet werden.

Es sind drei Typen von Protaminen bekannt, die umfassen die Mono-, Di- und Triprotamine, und es sind fünf Typen von Histonen bekannt, die umfassen H1, H2A, H2B, H3, H4 und H5. Alle diese Typen können erfindungsgemäß verwendet werden.

Polylysin ist charakterisiert durch eine Peptid-Bindung und besteht aus ε-Polylysin der Formel

worin n den Polymerisationsgrad von Lysin darstellt, und α-Polylysin der Formel

worin n wie oben definiert ist.

Erfindungsgemäß können beliebige Polylysine und Salze davon verwendet werden. ε-Polylysin und seine Salze sind bevorzugt, weil sie in vivo die Funktion, die lipolytischen Enzyme zu unterdrücken oder zu inhibieren, über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten können, was zu einer stärker verminderten Ge samtlipidabsorption führt als bei α-Polylysin, anderen basi schen Proteinen und Polypeptiden und Salzen davon.

Polylysine der Formeln (I) und (II), in denen n = 4 oder mehr, insbesondere 5 oder mehr, sind wirksamer wegen ihrer höheren Aktivitäten in bezug auf die Inhibierung von lipoly tischem Enzym. ε-Polylysine, in denen n kleiner als 9 ist, weisen eine geringe antimikrobielle Aktivität auf. ε-Poly lysine, in denen n = 5 bis 9, haben somit einen Effekt auf die Inhibierung der Lipid-Absorption, ohne die Intestinalflora zu schädigen.

Die Aminosäuren, die basische Proteine und Peptide aufbauen, umfassen zwei Arten von optischen Isomeren, die L- und D-For men. Die von Naturprodukten abgeleiteten basischen Proteine und Peptide sind bekannt dafür, daß sie in der Regel aus L- Aminosäuren bestehen.

Die basischen Proteine und Polypeptide sowie ihre Salze, die erfindungsgemäß verwendet werden, können aus L- oder D-Amino säuren oder aus beiden aufgebaut sein.

Die erfindungsgemäßen lipolytischen Enzyminhibitoren können ein basisches Protein, ein basisches Peptid und Salze davon allein oder in Kombination untereinander enthalten.

Die erfindungsgemäßen lipolytischen Enzyminhibitoren können an Menschen und verschiedene Tiere einschließlich Vieh und Geflügel, wie Rinder, Pferde und Hühner, sowie Vieh, wie Hunde und Katzen, verabreicht werden. Die wirksame Dosis va riiert in Abhängigkeit vom Typ, vom Alter und vom physikali schen Zustand und dgl. der Subjekte, denen sie verabreicht werden sollen. Vorzugsweise können sie in irgendeiner für ein zelne Subjekte geeigneten Dosis verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen lipolytischen Enzyminhibitoren können zu Präparaten für die orale Verabreichung formuliert werden. Sie können entweder allein oder im Gemisch mit Trägern, wie sie üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet wer den, oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden. Außerdem können sie in irgendeiner beliebigen Form von Präparaten, beispielsweise in Form von Tabletten, Granulaten, Kapseln, Pulvern oder dgl., verwendet werden.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen lipolytischen En zyminhibitoren auch als Lebensmittel- und Futterzusatz verab reicht werden. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren sind somit auch verwendbar als Zusatz (Additiv) für Lebensmittel und Fut ter.

Durch Verabreichung der erfindungsgemäßen lipolytischen Enzym inhibitoren an Menschen und Tiere können lipolytische Enzyme inhibiert (gehemmt) werden, um die Hydrolyse von Lipiden zu unterdrücken oder zu inhibieren (zu hemmen), so daß eine schnelle Intestinalabsorption der verdauten Lipide inhibiert werden kann und die Gesamtfettabsorption auch auf einen niedrien Wert eingestellt werden kann, wodurch eine Vielzahl von Effekten erzielt werden kann, wie z. B. eine Prävention der Lipämie und der Obesität. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren sind daher auch nützlich als diätetisches Agens zur Präven tion der Obesität und Lipämie.

Unter den erfindungsgemäßen lipolytischen Enzyminhibitoren er halten insbesondere die ε-Polylysine ihre Lipidabsorptions inhibierenden Wirkungen im lebenden Körper über einen langen Zeitraum aufrecht, was zu einer stark verminderten Gesamtfett absorption in vitro führt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläu tert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1 Herstellung von Purothinonin

Ein rohes Purothionin-Gemisch, enthaltend α₁-, α₂- und ß-Puro thionine, wurde erhalten aus Weizenmehl mit wenig Kleber nach dem in "Agr. Biol. Chem.", Band 34, Nr. 7, Seiten 1089 bis 1094 (1970), beschriebenen Verfahren. Die resultierende rohe Mischung wurde gereinigt, um das α₂-Purothionin bzw. das ß-Purothionin zu isolieren.

Herstellung einer Olivenölemulsion

250 mg eines Olivöls, 21,5 ml Natriumcholat als Gallensäure komponente und 30 mg Phosphatidylcholin wurden zu 5 ml einer 300 mM KaliumphosphatPufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 (nachstehend als "Kaliumphosphatpuffer" bezeichnet) zugegeben.

Die Mischung wurde zur Herstellung einer Olivenölemulsion mit Ultraschall behandelt.

Herstellung einer Protein(Polypepdid)-enthaltenden Lösung

1 ml des Kaliumphosphatpuffers wurden zu jeweils 4 mg der ro hen Purothionin-Mischung, des gereinigten α₂-Purothionins und des gereinigten β-Purothionins, Rinderserumalbumin (nachstehend als "BSA" bezeichnet, A7030 der Firma Sigma Co., Ltd., USA), β-Lactoglobulin (L0130 der Firma Sigma Co., Ltd.) und Ovalbu min (A5503 der Firma Sigma Co., Ltd.) zugegeben zur Herstel lung von sechs Arten von Protein(Polypeptin)-enthaltenden Lö sungen.

Herstellung einer Lipaselösung

Schweine-Pankreas-Lipase (hergestellt von der Firma Sigma Co., Ltd.) wurde zu der Kaliumphosphatpufferlösung zugegeben zur Herstellung einer Lipaselösung, die pro ml 100 Einheiten Por cin-Pankreas-Lipase enthielt.

"Assay zur Bestimmung der Lipaseinhibierungsaktivität von Pro teinen"

Die Kontrollprobe und sechs Testproben wurden wie folgt her gestellt:

100 µl einer Olivenölemulsion, wie sie oben hergestellt wor den war, wurden als Substrat verwendet.

50 µl Kaliumphosphatpuffer wurden zu dem Substrat zugegeben zur Herstellung einer Emulsion für die Kontrollprobe. Jeweils 50 µl der Protein(Polypeptid)-enthaltenden Lösungen, wie sie oben hergestellt worden waren, wurden zu 100 µl des Substrats zugegeben zur Herstellung von sechs Emulsionen für die Testpro ben. Alle Emulsionen wurden 5 Minuten lang inkubiert. Zu jeder der Emulsionen wurden 50 µl der wie oben hergestellten Lipase lösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert, danach wurden 3 ml Extraktionslösungs mittel (Chloroform:Methanol:n-Heptan 0 49 : 1 : 49) zugegeben. Nach 5minütigem Schütteln wurde die Mischung 5 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert. Die obere Schicht wurde mit einem Aspirator entfernt und zu der zurückbleibenden Lösung wurde 1 ml eines Kupferreagens (0,45 M Triethanolamin, 0,05 N Essig säure, 3,4% Kupfersulfatpentahydrat und 20% Natriumchlorid) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang geschüttelt und 5 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert. Es wurden 0,5 ml einer Lösung aus der oberen Schicht entnommen und zu der Lö sung wurden 0,5 ml eines Farbentwickleragens (eine Lösung von 0,1% Bathocuproin und 0,05% Butylhydroxyanisol in dem obengenannten Extraktionslösungsmittel) zugegeben.

Die resultierenden Lösungen für die Kontroll- und Testproben wurden unter Verwendung eines Photometers untersucht zur Mes sung der Extinktion bei 480 nm (A480), um die Menge an gebil deten freien Fettsäuren, d. h. die Aktivität der Schweine-Pankre as-Lipase, zu bestimmen.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben, in der die Aktivität ausgedrückt wird durch den Prozentsatz von Abs480 für den Fall, daß die Kontrollprobe durch die Schweine-Pankreas-Lipase hydrolysiert wurde.

Tabelle I

Aus den Ergebnissen der Tabelle I ist zu ersehen, daß die Lipaseaktivität stark inhibiert wurde, wenn der erfindungsge mäße Inhibitor, umfassend rohe Purothionine oder ein gerei nigtes α₂- oder ß-Purothionin, in Gegenwart von Gallensäure zugegeben wurde, während Ovalbumin, β-Lactoglobulin und BSA, die nicht zu den basischen Proteinen gehören, unter den in diesem Beispiel angegebenen Bedingungen keine Lipase-Inhibie rungsaktivität aufwiesen.

Beispiel 2

Die Aktivität von Schweine-Pankreas-Lipase wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 untersucht, wobei diesmal die rohes Purothionin oder β-Purothionin enthaltende Lösung bis auf eine Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml verdünnt wurde. Die Lipaseaktivität der rohes Purothionin enthalten den Probe betrug 97,5%, was anzeigt, daß das rohe Purothio nin in dieser Konzentration eine geringe Inhibitoraktivität gegenüber Schweine-Pankreas-Lipase aufwies. Dagegen betrug die Lipaseaktivität der β-Purotionin enthaltenden Probe 0%, was anzeigt, daß das β-Purothionin in der Lage war, die Aktivität der Schweine-Pankreas-Lipase selbst bei dieser Konzentration stark zu inhibieren.

In einem getrennten Versuch, der auf ähnliche Weise wie oben durchgeführt wurde, war außerdem β-Purothionin in der Lage, die Aktivität der Schweine-Pankreas-Lipase auf 5,2% herab zusetzen, selbst wenn seine Konzentration nur 0,04 mg/ml betrug, was seine sarke Inhibitoraktivität gegenüber Schweine-Pankreas-Lipase zeigt.

Beispiel 3 Herstellung einer Cholesterinoleatemulsion

32,5 mg Cholesterinoleat und 25 mg Phosphatidylcholin und 21,5 mg Natriumcholat wurden zu 5 ml des Kaliumphosphat puffers zugegeben. Die Lösung wurde mit Ultraschall behan delt zur Herstellung einer Cholesterinoleatemulsion.

Herstellung einer Protein enthaltenden Lösung

Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden 4 Pro tein enthaltende Lösungen hergestellt, die jeweils enthielten die rohen Purothionine, BSA, β-Lactoglobulin oder Ovalbumin.

Herstellung einer Cholesterinesteraselösung

Eine Cholesterinesterase, die aus dem Schweine-Pankreas iso liert worden war, wurde zu einer 300 mM Kaliumphosphatpuffer lösung zugegeben zur Herstellung einer Enzymlösung, die 40 µg/ml Cholesterinesterase enthielt.

Assay zur Bestimmung der Cholesterinesterase-Inhibitorakti vität des Proteins

Die Kontrollprobe und vier Testproben wurden wie folgt herge stellt:

100 µl einer Olivenölemulsion, die wie oben angegeben herge stellt worden war, wurden als Substrat verwendet.

50 µl Kaliumphosphatpuffer wurden zu dem Substrat zugegeben zur Herstellung einer Emulsion für die Kontrollprobe.

Jeweils 50 µl der Protein(Polypeptid)-enthaltenden Lösungen, wie sie oben hergestellt worden waren, wurden zu 100 µl des Substrats zugegeben zur Herstellung von vier Emulsionen für die Testprobe.

Alle Emulsionen wurden 5 min lang inkubiert. Zu jeder der Emulsionen wurden 50 µl der wie oben hergestellten Lipase lösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 1 h lang bei 37°C inkubiert, danach wurden 3 ml des gleichen Ex traktionslösungsmittels, wie es in Beispiel 1 verwendet wor den war, zugegeben. Nach 5minütigem Schütteln wurde die Mischung 5 min lang bei 3000 UpM zentrifugiert. Die obere Schicht wurde mit einem Aspirator entfernt und zu der zu rückbleibenden Lösung wurde 1 ml des gleichen Kupferreagens wie es in Beispiel 1 verwendet worden war, zugegeben. Die Mischung wurde 5 min lang geschüttelt und 5 min lang bei 3000 UpM zentrifugiert. Es wurden 0,5 ml einer Lösung aus der oberen Schicht entnommen und zu der Lösung wurden 0,5 ml des gleichen Farbentwicklungsagens, wie es in Beispiel 1 verwendet worden war, zugegeben.

Die resultierenden Lösungen für die Kontroll- und Testproben wurden unter Verwendung eines Photometers untersucht zur Messung der Extinktion bei 480 nm (A480), um die Menge an gebildeten freien Fettsäuren, d. h. die Aktivität der Chole sterinesterase, zu bestimmen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben, in der die Aktivität ausgedrückt ist durch den Prozentsatz der Abs480 für den Fall, daß die Kontrollprobe durch die Cholesterinesterase hydrolysiert wurde.

In den Proben enthaltenes Protein (Polypeptid)
Aktivität der Cholesterinesterase
Kontrolle
100
rohe Purothionine	9,8
Ovalbumin	93,.6
β-Lactoglobulin	89,9
BSA	120,0

Aus den Ergebnissen der Tabelle II geht hervor, daß die Cholesterinesterase-Aktivität stark inhibiert wurde, wenn der erfindungsgemäße Inhibitor, umfassend rohe Purothionine, d. h. ein basisches Protein, in Gegenwart einer Gallensäure zugegeben wurde, während Ovalbumin, β-Lactoglobulin und BSA, die nicht zu den basischen Proteinen gehören, unter diesen Bedingungen keine oder nur eine geringe Inhibitor aktivität aufwiesen.

Beispiel 4 Herstellung einer Olivenölemulsion

250 mg eines Olivenöls, 21,5 mg Natriumcholat als Gallen säure-Komponente und 30 mg Phosphatidylcholin wurden zu 5 ml einer 200 mM Tris-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 (nachstehend als "Tris-Puffer" bezeichnet) zugegeben.

Die Mischung wurde mit Ultraschall behandelt zur Herstellung einer Olivenölemulsion.

Herstellung einer Protein- oder Peptid-enthaltenden Lösung

10 ml Tris-Puffer wurden zu jeweils 1 mg des gleichen gerei nigten β-Purothionins, wie es in Beispiel 1 verwendet worden war, Protamin (P4005 der Firma Sigma Co., Ltd., USA), Histon H2A (H6881 der Firma Sigma Co., Ltd.), Histon H3 (H4380 der Firma Sigma Co., Ltd.), α-Poly-L-lysin (3075 der Firma Peptide Research Co., Ltd.) und Poly-L-arginin (P3892 der Firma Sigma Co., Ltd.) zugegeben zur Herstellung von sechs Arten von Protein- oder Peptid-enthaltenden Lösungen.

Herstellung einer Lipase-Lösung

Schweine-Pankreas-Lipase (hergestellt von der Firma Sigma Co., Ltd.) wurde zu dem Tris-Puffer zugegeben zur Herstellung einer Enzymlösung, die pro ml 100 Einheiten Schweine-Pankreas- Lipase enthielt.

"Assay zur Bestimmung der Lipaseinhibierungsaktivität von Proteinen"

Die Kontroilprobe und sechs Testproben wurden wie folgt her gestellt:

100 µl einer Olivenölemulsion, wie sie oben hergestellt worden war, wurden als Substrat verwendet.

50 µl Tris-Puffer wurden zu dem Substrat zugegeben zur Her stellung einer Emulsion für die Kontrollprobe.

Jeweils 50 µl der Protein (Polypeptid)-enthaltenden Lösungen, wie sie oben hergestellt worden waren, wurden zu 100 µl des Substrats zugegeben zur Herstellung von sechs Emulsionen für die Testproben.

Alle Emulsionen wurden 5 min lang inkubiert. Zu jeder der Emulsionen wurden 50 µl der oben hergestellten Lipaselösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 1 h lang bei 37°C inkubiert, danach wurden 3 ml des gleichen Extraktions lösungsmittels, wie es in Beispiel 1 verwendet worden war, zugegeben. Nach 5minütigem Schütteln wurde die Mischung 5 min lang bei 3000 UpM zentrifugiert. Die obere Schicht wurde mit einem Aspirator entfernt und zu der zurückbleiben den Lösung wurde 1 ml des gleichen Kupferreagens, wie es in Beispiel 1 verwendet worden war, zugegeben. Die Mischung wurde 5 min lang geschüttelt und 5 min lang bei 3000 UpM zentrifu giert. Es wurden 0,5 ml einer Lösung aus der oberen Schicht entnommen und zu der Lösung wurden 0,5 ml des gleichen Farb entwicklungsagens, wie es in Beispiel 1 verwendet worden war, zugegeben.

Die resultierenden Lösungen für die Kontroll- und Testproben wurden untersucht zur Bestimmung der Extinktion bei 480 nm (A480) unter Verwendung eines Photometers, um die Menge an gebildeten freien Fettsäuren, d. h. die Aktivität der Schweine- Pankreas-Lipase, zu bestimmen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle III angegeben, in der die Aktivität ausgedrückt ist als Prozentsatz von Abs480 für den Fall, daß die Kontrollprobe durch die Schweine- Pankreas-Lipase hydrolysiert wurde.

Tabelle III

Aus den Ergebnissen der Tabelle III geht hervor, daß die Aktivität der Lipase stark inhibiert wurde, wenn der er findungsgemäße Inhibitor, umfassend gereinigtes ß-Puro thionin, Protamin, Histon, α-Poly-L-lysin oder Poly-L-arginin, eine Art eines basischen Proteins oder Peptids, unter den in diesem Beispiel angegebenen Bedingungen zugegeben wurde.

Beispiel 5

Es wurden zwei Gruppen von jeweils 10 männlichen SD-Ratten (9 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht 200 g) be handelt.

50 g Maisöl, 6 g Eidotter-Lecithin und 12,5 g Glycerin wurden zu destilliertem Wasser zugegeben zum Auffüllen bis auf 100 ml. Die Mischung wurde mit Ultraschall behandelt zur Herstellung einer Emulsion.

Den Ratten der ersten Gruppe wurden jeweils 2 ml der Emulsion und 100 mg ε-Poly-L-lysin, hergestellt von der Firma Chisso Corp. (enthaltend Dextrin und ε-Poly-L-lysin in einem Ge wichtsverhältnis von 1 : 1 und mit einer Struktur der Formel (I), worin n etwa 30 bedeutet) oral verabreicht unter Ver wendung einer Magensonde. In vorgegebenen Zeitabständen wurde aus der Schwanzvene Blut entnommen und es wurde die Serumtriglycerid-Konzentration gemessen, bestimmt für den Mittelwert (mg/dl) pro Tier und errechnet auf der Basis der Serumtriglyceridkonzentration vor der Verabreichung (dieser Wert wurde mit 0 mg/dl angenommen) (gemäß der Erfindung).

Den Ratten der zweiten Gruppe wurden oral 2 ml der Emulsion und 50 mg Dextrin verabreicht. Die Serumtriglyceridkonzen tration wurde in vorgegebenen Zeitabständen gemessen, bestimmt für den Mittelwert und errechnet auf die gleiche Weise wie oben (Vergleichsbeispiel).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Wie aus den Ergebnissen der Tabelle IV ersichtlich, wurde für den Fall, daß den Ratten eine Testprobe verabreicht wurde, die ε-Poly-L-lysin (ein basisches Peptid gemäß der Erfindung) enthielt, die Intestinal-Lipidabsorption inhi biert und die Serum-Triglyceridkonzentration konnte auf einen niedrigen Wert eingestellt werden über einen Zeitraum ab Beginn bis zu 7 Stunden nach der Verabreichung, was zu einer stark verminderten Gesamtfettabsorption führte. Diese Werte zeigen an, daß ε-Polylysin eine Inhibitoraktivität in vivo gegenüber einem lypolytischen Enzym über einen langen Zeit raum aufweist.

Beispiel 6 Herstellung von Peptid enthaltenden Lösungen

Es wurden zwei Peptid enthaltende Lösungen hergestellt durch Zugabe von 1 mg destilliertem Wasser zu jeweils 1 mg α-Poly- L-lysinhydrochiorid (3075 der Firma Peptide Research Co., Ltd.) und α-Poly-D-lysinhydrobromid (P7886 der Firma Sigma Co., Ltd.).

Assay zur Bestimmung der Lipaseinhibitoraktivität von Poly lysin

Die Kontrollprobe und die beiden Testproben wurden wie folgt hergestellt:

100 µl einer Olivenölemulsion, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurden als Substrat verwendet.

Jeweils 50 µl der Polypeptid-enthaltenden Lösungen, wie sie oben hergestellt worden waren, wurden zu 100 µl des Substrats zugegeben zur Herstellung von zwei Emulsionen für die Test proben. Nach 5 minütigem Inkubieren der Emulsion wurden 50 µl der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 hergestellten Enzymlösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 1 h lang bei 37°C inkubiert.

Außerdem wurde die inkubierte Mischung behandelt und unter sucht zur Bestimmung der Aktivität der Schweine-Pankreas- Lipase auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4.

Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V angegeben.

In den Proben enthaltenes Polylysin
Aktivität der Schweine-Pankreas-Lipase (%)
Kontrolle
100
α-Poly-L-lysin-hydrochlorid	1.6
α-Poly-D-lysin-hydrobromid	1.1

Aus den Daten der vorstehenden Tabelle V geht hervor, daß sowohl die L- als auch die D-Polylysine die Lipaseaktivität unter den in diesem Beispiel angegebenen Bedingungen stark inhibierten.

Beispiel 7 Herstellung von Peptid-enthaltenden Lösungen

Es wurden Lysin-Oligomere mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 5, wie in der folgenden Tabelle VI angegeben, herge stellt unter Verwendung eines Peptidsynthesereaktors (Biolynx 4170 der Firma LKB-Pharmacia Co., Ltd.). Jedes der Oligomeren wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt. Jedes der gereinigten Oligomeren wurde zu destilliertem Wasser zugegeben zum Auffüllen auf 1 µMol/ml. Auf diese Weise wurden 7 Lysinoligomer-enthaltende Lösungen hergestellt.

Assay zur Bestimmung der Lipaseinhibitoraktivität von Lysin- Oligomeren

Die Kontrollprobe und die sechs Testproben wurden wie folgt hergestellt:

100 µl einer Olivenölemulsion, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 hergestellt wurde, wurden als Substrat verwendet.

Jeweils 50 µl der Lysinoligomer-enthaltenden Lösungen, die oben hergestellt worden waren, wurden zu 100 µl des Substrats zugegeben zur Herstellung von sechs Emulsionen für die Test proben. Nach 5minütigem Inkubieren der Emulsionen wurden 50 µl einer Lipaselösung, enthaltend 100 Einheiten Schweine- Pankreas-Lipase pro ml, hergestellt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4, zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 1 h lang bei 37°C inkubiert.

Außerdem wurde die inkubierte Mischung behandelt und unter sucht zur Messung der Aktivität der Schweine-Pankreas-Lipase auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4.

Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI angebeben.

In den Proben enthaltenes Lysinoligomer
Aktivität der Schweine-Pankreas-Lipase (%)
Kontrolle
100
α-(L-lysin)₂	103.6
α-(L-lysin)₄	103.8
α-(L-lysin)₅	2.1
ε-(L-lysin)₃	89.0
ε-(L-lysin)₄	53.8
ε-(L-lysin)₅	3.1

Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, inhibierten die Lysinoligomeren vom α-Typ mit einem Polymerisationsgrad von 5 oder mehr die Lipaseaktivität stark, während die Oligo meren mit einem Polymerisationsgrad von 4 oder weniger unter den in diesem Beispiel angegebenen Bedingungen überhaupt kei ne Lipase-Inhibitoraktivität aufwiesen. Außerdem war bei den Lysin-Oligomeren vom ε-Typ mit einem Polymerisationsgrad von 4 zwar eine Lipase-Inhibitoraktivität festzustellen, die jedoch nicht hoch genug war, während bei dem Oligomer mit einem Polymerisationsgrad von 5 die Lipase-Inhibitorakti vität sehr hoch war. Aus der Tabelle VI ist zu ersehen, daß bei dem Lysin-Oligomer mit einem höheren Polymerisationsgrad die Lipase-Inhibitoraktivität stärker war als bei dem niedri ger polymerisierten Lysin.

Es wurde darüber berichtet, daß ε-Lysin-Oligomere mit einem Polymerisationsgrad von etwa 10 oder höher starke antimikro bielle Eigenschaften aufweisen. Aus diesem Bericht und den in der vorstehenden Tabelle VI wiedergegebenen Ergebnissen geht hervor, daß ε-Lysin-Oligomere mit einem Polymerisations grad von 5 bis 9, die keinen nachteiligen Effekt auf die Intestinalflora haben, wirksamer verwendet werden können als lipolytischer Enzyminhibitor.

Claims

1. Lipolytischer Enzyminhibitor, dadurch gekenn zeichnet, daß er als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) mindestens einen Vertreter aus der Gruppe der basischen Proteine, der basischen Polypeptide und der Salze davon um faßt.

2. Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem basischen Protein um Histon und Protamin handelt.

3. Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem basischen Protein um die Histone H1, H2A, H2B, H3, H4 und H5 und Mono-, Di- und Triprotamine handelt.

4. Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem basischen Polypeptid um Purothionin, ein Purothionin-Analogon, Polylysin und Polyarginin handelt.

5. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß es sich bei dem basischen Polypeptid um die α₁-, α₂- und β-Purothionine handelt.

6. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß es sich bei dem basischen Polypeptid um die α- und β-Polylysine handelt.

7. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem basischen Polypeptid um ein α-Lysin-Oligomer mit einem Polymerisationsgrad von 5 oder mehr, ein ε-Lysin-Oligomer mit einem Polymerisationsgrad von 5 oder mehr und eine Mischung davon handelt.

8. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß es sich bei dem Salz des basischen Poly peptids um das α-Poly-L-lysinhydrochlorid und das α-Poly-D- lysinhydrobromid handelt.

9. Diätetisches Agens, dadurch gekennzeichnet, daß es eine lipolytische Enzym-inhibierende Substanz, ausgewählt aus mindestens einem Vertreter aus der Gruppe der basischen Proteine, der basischen Polypeptide und der Salze davon, enthält.

10. Diätetisches Agens nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um Histon und Protamin handelt.

11. Diätetisches Agens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um die Histone H1, H2A, H2B, H3, H4 und H5 und die Mono-, Di- und Triprotamine handelt.

12. Diätetisches Agens nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um Purothionin, ein Purothionin-Analogon, Polylysin und Poly arginin handelt.

13. Diätetisches Agens nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um die α₁-, α₂- und β-Purothionine handelt.

14. Diätetisches Agens nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um die α- und β-Polylysine handelt.

15. Diätetisches Agens nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um ein α-Lysin-Oligomer mit einem Polymerisations grad von 5 oder mehr, ein ε-Lysin-Oligomer mit einem Poly merisationsgrad von 5 oder mehr und eine Mischung davon handelt.

16. Diätetisches Agens nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um α-Poly-L-lysinhydrochlorid und α-Poly-D-lysin hydrobromid handelt.

17. Lebensmittel- und Futterzusatz, dadurch gekennzeichnet daß er eine ein lipolytisches Enzym inhibierende Substanz, ausgewählt aus mindestens einem Vertreter aus der Gruppe der basischen Proteine, basischen Polypeptide und Salze davon enthält.

18. Zusatz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um Histon und Protamin handelt.

19. Zusatz nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um die Histone H1, H2A, H2B, H3, H4 und H5 und die Mono-, Di- und Triprot amine handelt.

20. Zusatz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um Purothionin, ein Purothionin-Analogon, Polylysin und Polyarginin handelt.

21. Zusatz nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um die α₁-, α₂- und β-Purothionine handelt.

22. Zusatz nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um die α- und β-Polylysine handelt.

23. Zusatz nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um ein α-Lysin-Oligomer mit einem Polymerisationsgrad von 5 oder mehr, ein ε-Lysin-Oligomer mit einem Polymerisa tionsgrad von 5 oder mehr und eine Mischung davon handelt.

24. Zusatz nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inhibierenden Substanz um α-Poly-L-lysinhydrochlorid und α-Poly-D-lysinhydrobromid handelt.