DE4031283A1 - Hybridzellinien zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen bromnicotinsaeure und 1-methyl-10 (alpha)-methoxydihydrolysergol - Google Patents

Hybridzellinien zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen bromnicotinsaeure und 1-methyl-10 (alpha)-methoxydihydrolysergol

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DE4031283A1
DE4031283A1 DE19904031283 DE4031283A DE4031283A1 DE 4031283 A1 DE4031283 A1 DE 4031283A1 DE 19904031283 DE19904031283 DE 19904031283 DE 4031283 A DE4031283 A DE 4031283A DE 4031283 A1 DE4031283 A1 DE 4031283A1
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Description

Die Erfindung betrifft neue Hybridzellinien für die Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper gegen zwei Haptene, nämlich Bromnicotinsäure (BNS) und 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol (NIC), die durch chemische Spaltung aus Nicergolin abgeleitet wurde, sowie die von diesen Hybridzellinien gebildeten monoklonalen Antikörper, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, diese Antikörper enthaltende Präparate und ihre diagnostische Verwendung.
Die Möglichkeit, durch Fusion von Mausmyelomzellen mit Milzzellen von immunisierten Mäusen Hybridzellinien zu gewinnen, die nach entsprechender Klonierung permanent monoklonale Antikörper gewünschter Spezifität produzieren, wurde erstmals von Köhler und Milstein 1975 (Nature, 256, 495-497) beschrieben. Seit dieser Zeit wird diese Methode vielfach eingesetzt.
Gemäß vorliegender Erfindung werden monoklonale Antikörper gebildet, die zum Nachweis von intakten Nicergolinmolekülen diagnostisch angewendet werden können. Ausgangspunkt für die Gewinnung dieser monoklonalen Antikörper ist die Spaltung des Nicergolins in BNS und NIC und die Kupplung der einzelnen Spaltprodukte an entsprechende Trägersubstanzen, z. B. Rinderserumalbumin, zur Gewinnung immunogener Konjugate. Im weiteren erfolgt die geeignete Immunisierung von Versuchstieren (Mäusen) zur Vorbereitung der Zellfusion, u. zw. Grundimmunisierung mit BNS- bzw. NIC-Konjugat, insbesondere Rinderserumalbuminkonjugat, in komplettem Freundschen Adjuvans subkutan und nach drei Wochen die Nachimmunisierung mit dem entsprechenden Konjugat, insbesondere Rinderserumalbuminkonjugat, in inkomplettem Freundschen Adjuvans intraperitoneal; jeweils 25 µg/Maus/Immunisierungsschritt. Die Zellfusion wird nach der zitierten Methode von Köhler und Milstein durchgeführt. Die Auslese der relevanten Hybridzellinien erfolgt nach einem ELISA (enzymelinked immunosorbent assay)-Verfahren. Hierbei werden beispielsweise Mikrotiterplatten parallel mit Rinderserumalbumin und Rinderserumalbuminkonjugat zur Testdurchführung nach Standardverfahren beschichtet. Selektioniert werden nur Antikörper und die zugehörigen Zellkulturen, die mit dem Konjugat eine deutlich positive Reaktion ergeben, mit dem Träger, z. B. Rinderserumalbuminträger, allein jedoch keine positive Reaktion ergeben. Die Spezifität der ausgesuchten Klone für das intakte Nicergolin wird durch kompetitive Inhibition der Reaktion der jeweiligen Antikörper gegen das zugehörige Konjugat im ELISA- Test durch den Zusatz des nativen Nicergolins überprüft. Es wurden drei Hybridkulturen mit Produkten der gewünschten Antikörper gegen NIC (benannt NIC-1, -2, -3) und zwei Kulturen mit Antikörperproduktion gegen BNS (benannt BNS-1 und -2) gefunden. Weiters wurde gefunden, daß durch geeignete Modifikation des ELISA-Nachweissystems ein unmarkierter Antikörper der BNS-Serie mit einem markierten, z. B. biotinylierten Antikörper der NIC- Serie zu einem Meßsystem für das intakte Ausgangsmolekül kombiniert werden kann. Damit ist erstmals mit Hilfe monoklonaler Antikörper der diagnostische Nachweis des nichtmetabolisierten Nicergolins möglich.
Gegenstand der Erfindung sind somit monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus-Antikörper, welche
  • a) in einem ELISA-Test mit einem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC- OH-Rinderserumalbuminkonjugat (1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol- 17-hemisuccinat-Rinderserumalbuminkonjugat), positiv reagieren, und
  • b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Rinderserumalbumin, nicht reagieren.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung werden die monospezifischen Antikörper, insbesondere monoklonalen Maus-Antikörper, durch Zusatz von nativen Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Testsystem in ihrer Reaktivität mit dem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbuminkonjugat, inhibiert. Diese monospezifischen Antikörper besitzen also eine Spezifität für das native Nicergolin. Nach Reinigung aus Serum bzw. Aszitesflüssigkeit von Mäusen und nachfolgender Biotinylierung nach Standardverfahren unter Verwendung von Avidin-Peroxidasekonjugaten reagieren die erfindungsgemäßen Antikörper im ELISA-Test mit NIC-OH- Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbuminkonjugat. Die Biotinylierung erfolgt mit 200 µg N-Biotinsuccinimidester/mg gereinigter Antikörper in 0,1molarem Natriumhydrogencarbonatpuffer während 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Gegenstand der Erfindung sind weiters monospezifische Antikörper, insbesondere Maus-Antikörper, welche
  • a) in einem ELISA-Test mit einem BNS-Konjugat, insbesondere BNS- Serumalbuminkonjugat (5-Bromnicotinsäure-Rinderserumalbuminkonjugat) positiv reagieren, und
  • b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Serumalbumin, nicht reagieren.
Durch Zusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Testsystem werden die Antikörper in ihrer Reaktivität mit dem BNS-Konjugat, z. B. Serumalbuminkonjugat, inhibiert. Auch diese monoklonalen Antikörper besitzen eine Spezifität für das native Nicergolin.
Nach Reinigung aus Serum bzw. der Aszitesflüssigkeit von Mäusen binden die Antikörper nach ihrer Immobilisierung an die Oberfläche von Kunststoffen (z. B. Mikrotiterplatten, magnetische Partikel) oder anorganischen Trägern das intakte Nicergolinmolekül.
Der Umstand, daß diese erfindungsgemäßen Antikörper das intakte Nicergolinmolekül binden, kann mit biotinylierten Anti-NIC-Antikörper nachgewiesen werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung bereitgestellt, welches die folgenden Stufen umfaßt:
  • a) Erzeugung von immunologisch aktiven NIC-OH- bzw. BNS-Konjugaten, z. B. Serumalbuminkonjugaten;
  • b) Grundimmunisierung von Mäusen mit einer Suspension oder Lösung der entsprechenden Konjugate in komplettem Freundschen Adjuvans subkutan;
  • c) Nachimmunisierung der behandelten Mäuse mit demselben Konjugat in inkomplettem Freundschen Adjuvans intraperitoneal 3 Wochen nach der Grundimmunisierung;
  • d) Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und Bereiten einer Suspension von Milzzellen;
  • e) Fusion der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors;
  • f) Verdünnen und Vermehren der vereinigten Zellen in getrennten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einem Selektionsmedium, welches nur das Wachstum von Hybridzellen unterstützt;
  • g) Auswerten des Überstandes in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten mit positivem Hybridwachstum hinsichtlich des Vorliegens eines Antikörpers der gewünschten Spezifität durch paralleles Testen zweier Überstandsaliquote in einem ELISA- Testsystem mit immobiliertem Träger als negative Kontrolle und NIC-OH- bzw. BNS-Konjugat als positive Testsubstanz;
  • h) Klonierung der Hybride mit der gewünschten Reaktivität nach der Methode der "limitierenden Verdünnung";
  • i) Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand;
  • j) Überprüfung der Reaktivität der entsprechenden selektionierten Antikörper mit dem nativen Ausgangsmolekül durch Nachweis der kompetitiven Inhibition nach Zusatz von steigenden Konzentrationen des Ausgangsmoleküls im ELISA-Test;
  • k) Selektion und zweite Klonierung der überprüften Hybridzellinien sowie die Überprüfung der Klone auf intraperitonealem Wege in Pristan-vorbehandelten Mäusen; und
  • l) Ernten der malignen Asziten aus den genannten Mäusen, welche die gewünschten Antikörper enthalten und Reinigung der Antikörper nach Standardtechniken.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Konjugate, z. B. Rinderserumalbuminkonjugate, und der erzeugten monoklonalen Antikörper zur Erfassung und quantitativen Bestimmung des Nicergolins. Als Testprinzip wird dabei die kompetitive Inhibition der Reaktion zwischen spezifischen monoklonalen Antikörpern und zugehörigem immobilisiertem Konjugat in einem ELISA-System zur quantitativen Bestimmung angewandt. Als Proben können wässerige Lösungen und Plasma- oder Serumproben verwendet werden. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit kann der Test auch in gleicher Art mit nach Standardverfahren jodierten Antikörpern der angegebenen Spezifität oder mit jodierten Serumalbuminkonjugaten durchgeführt werden.
Die Konjugate, z. B. Rinderserumalbuminkonjugate, und die zugehörigen monoklonalen Antikörper, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden, können in gleichartigen Standardtechniken zur quantitativen Messung der als Hapten verwendeten Substanzen unter Modifikation des Antigen- oder Antikörperimmobilisierungsverfahrens (Papier, Plastikkugel, Magnetpartikel u. a.) sowie des Antikörper- oder Antigennachweisverfahrens verwendet werden.
Die Erfindung besteht ferner in einem Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung des nichtmetabolisierten Nicergolins unter Verwendung von gereinigten Anti-BNS-Antikörpern (BNS-1 oder -2) in Kombination mit Anti-NIC-Antikörpern, wobei entweder die Anti-BNS-Antikörper oder die Anti-NIC-Antikörper in geeigneter Weise, z. B. durch Biotinylierung oder radioaktive Markierung, zum Nachweis modifiziert wurden. Als Proben können auch hier wässerige Lösungen und Plasma- oder Serumproben verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 Alkalische Hydrolyse von Nicergolin
5,0 g (16,6 mMol) Nicergolin werden in 150 ml 12%iger methanolisch- wässeriger Kalilauge unter Lichtausschluß und Rückfluß 2 Stunden gekocht.
Die erkaltete, hellgelbe Lösung wird zweimal mit je 75 ml Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformauszüge werden so lange mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Chloroformphase einrotiert und der gelbliche, harzartige Rückstand aus wenig Aceton kristallisiert: 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol.
Ausbeute: 2,85 g (91% der Theorie, 98,9% rein - HPLC).
Schmelzpunkt: 214-216°C (Zers.), nicht korrigiert.
UV-Spektrum:
Absorptionsmaximum bei 225 nm: Emolar = 32 500;
Absorbtionsmaximum bei 292 nm: Emolar =  8 340.
Infrarotspektrum: Carbonylvalenzschwingung (Ester) bei 1720 cm-1 fehlt.
¹³C-Kernresonanzspektrum:
135,20 ppm  C16
130,32 ppm  C11
126,48 ppm  C15
123,08 ppm  C13
121,40 ppm  C2
115,00 ppm  C12
110,60 ppm  C3
108,68 ppm  C14
 73,73 ppm  C10
 70,28 ppm  C5
 66,04 ppm  C17
 60,75 ppm  C7
 49,33 ppm  OCH₃ an C10
 43,86 ppm  CH₃ an N6
 34,36 ppm  CH₃ an N1
 32,61 ppm  C8
 30,37 ppm  C9
 22,39 ppm  C4
Massenspektrum:
m/e = 300  Molekülpeak (= Basispeak)
m/e = 285  Molekülion - Methyl;
m/e = 270  Molekülion - zwei Methylgruppen.
Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60:
Fließmittel Chloroform/Methanol/Wasser 90+10+1;
hRf Nicergolin = 50;
hRf MMD = 13.
Fließmittel Methanol;
hRf Nicergolin = 39;
hRf MMD = 22.
HPLC: an RP 18, 7 µm mit Fließmittel Acetonitril/Wasser/Triethylamin 44+45+1.
Retentionszeit Nicergolin: 7,98 Minuten.
Retentionszeit MMD: 1,91 Minuten.
Die mit dem Waschwasser vereinigte alkalische wässerige Phase wird mit rauchender Salzsäure auf pH 1 gestellt, mit Propanol versetzt und eingeengt. Anschließend wird dreimal mit je 100 ml Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformextrakte mit 0,1 M Salzsäure gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und einrotiert. Der farblose, mikrokristalline Rückstand wird aus wenig heißem Wasser umkristallisiert: 5-Bromnicotinsäure.
Ausbeute: 251 mg (12% der Theorie).
Schmelzpunkt: 176°C, nicht korrigiert.
UV-Spektrum: Absorptionsmaximum 273 nm: Emolar = 3150.
Infrarotspektrum: ident mit Vergleichssubstanz.
Char. Banden:
Carbonylvalenzschwingung (Carbonsäure) 1675 cm-1;
Kombinationsschwingung C-Br 1015 cm-1.
Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60:
Fließmittel Chloroform/Methanol/Wasser 90+10+1;
hRf Bromnicotinsäure = 8.
Fließmittel Methanol;
hRf Bromnicotinsäure = 62.
HPLC an RP 18, 7 µm mit Fließmittel Acetonitril/Wasser/Triethylamin 44+45+1.
Retentionszeit Bromnicotinsäure: 0,91 Minuten.
Beispiel 2 Antigensynthese mit 5-Bromnicotinsäure als Hapten
Zur Herstellung der Haptenlösung werden 404 mg 5-Bromnicotinsäure (2 mMol) in 25 ml getrocknetem Dioxan suspendiert, auf Zusatz von 480 µl Tri-N-Butylamin (2 mMol) tritt Lösung ein. Die auf 12°C gekühlte Lösung wird mit 260 µl Chlorameisensäureisobutylester (2 mMol) versetzt und 30 Minuten bei 12°C gerührt.
Zur Herstellung der Trägerlösung werden 2,0 g Rinderserumalbumin (0,02 µMol) in 67 ml destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert wird mit 1 M Natronlauge auf pH 9,5 gestellt. Nach Zusatz von 45 ml Dioxan wird auf 4°C gekühlt.
Die Haptenlösung wird mit der Trägerlösung vereinigt und der pH-Wert während der ersten zwei Stunden mit Natronlauge nachgestellt. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wird die Lösung unter zehnmaligem Wechsel gegen 2 Liter destilliertem Wasser dialysiert, danach auf pH 4,6 gestellt, der Niederschlag bei 7500 rpm (SS34) abzentrifugiert und der Überstand mit dem vierfachen Volumen versetzt. Die trübe Lösung wird über Nacht bei 4°C stehengelassen und anschließend der Niederschlag wie oben abzentrifugiert.
Die vereinigten Niederschläge werden lyophilisiert.
Ausbeute: 861 mg Konjugat (43% der Theorie).
UV-Differenzspektrum: in 0,6% Tris/HCl-Puffer pH 8,6, der 0,3% Natriumdodecylsulfat enthält;
41 Mol Bromnicotinsäure pro Mol Rinderserumalbumin (Meßwellenlänge: 273 nm).
Dinitrofluorbenzol-Test nach F. Sanger, Biochem. J., 45, 565 (1949): 26,4 derivatisierte Aminogruppen pro Mol Rinderserumalbumin.
Trinitrobenzolsulfonsäure-Test nach A. F. S. A. Habeeb, Anal. Biochem.,14, 328 (1966), modifiziert;
46,2 derivatisierte Aminogruppen pro Mol Rinderserumalbumin.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen nach U. K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970).
Deutliche Beeinflussung der Wanderungsweite (Rinderserumalbumin 66 kDa, Bromnicotinsäurekonjugat 57 kDa).
Beispiel 3 Synthese von 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol- 17-hemisuccinat
300 mg 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol (1 mMol) und 400 mg Bernsteinsäureanhydrid (4 mMol) werden in 30 ml getrocknetem Pyridin suspendiert und unter Lichtschutz und Feuchtigkeitsausschluß vier Stunden bei 62°C unter Rückfluß erwärmt.
Die Reaktionslösung wird einrotiert und am Rotavapor getrocknet, bis kein Pyridingeruch mehr wahrnehmbar ist. Der gelbliche Rückstand wird in 50 ml destilliertem Wasser aufgenommen und zweimal mit je 50 ml Ether ausgeschüttelt, um bräunliche Zersetzungsprodukte zu entfernen. Die wäßrige Lösung wird einrotiert, in Chloroform aufgenommen und die überschüssige Bernsteinsäure abfiltriert (Ausbeute: 382 mg, 95% der Theorie).
Durch Chromatographie an 180 g Kieselgel 60 mit Methanol-Wasser (4+1) wird eine farblose, harzartige Substanz erhalten, die aus Aceton-Wasser umkristallisiert wird.
Ausbeute: 290 mg (76% der Theorie).
Schmelzpunkt: 91°C, nicht korrigiert.
UV-Spektrum:
Absorbtionsmaximum bei 232 nm: Emolar = 18 600;
Absorptionsmaximum bei 295 nm: Emolar =  5200.
Infrarotspektrum: Carbonylvalenzschwingung (gesättigte Ester) 1730 cm-1.
Massenspektrum:
m/e = 400 Molekülpeak;
m/e = 385 Molekülion - Methyl;
m/e = 300 1-Methyl-10α-methoxydihydrolysergol;
m/e = 268 Basispeak.
¹³C-Kernresonanzspektrum:
176,53 ppm  C4′
172,93 ppm  C1′
135,13 ppm  C16
128,76 ppm  C11
126,17 ppm  C15
123,52 ppm  C13
121,55 ppm  C2
115,05 ppm  C12
109,25 ppm  C14
 73,56 ppm  C10
 68,71 ppm  C5
 66,29 ppm  C17
 58,92 ppm  C7
 49,37 ppm  OCH₃ an C10
 41,96 ppm  CH₃ an N6
 32,70 ppm  C8
 30,69 ppm  C2′, C4′
 30,19 ppm  C9
 21,57 ppm  C4
Da die Signale für C13 und CH₃ an N1 fehlen, werden 100 mg des Hemisuccinates der alkalischen Hydrolyse wie unter 1) beschrieben, unterworfen und analog aufgearbeitet.
Ausbeute: 85,6 mg (85,6% der Theorie).
Das Hydrolyseprodukt (1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol) ergibt folgende Signale:
135,14 ppm  C16
130,23 ppm  C11
126,40 ppm  C15
123,10 ppm  C13
121,39 ppm  C2
114,98 ppm  C12
110,49 ppm  C3
108,70 ppm  C14
 73,68 ppm  C10
 70,22 ppm  C5
 65,98 ppm  C17
 60,70 ppm  C7
 49,32 ppm  OCH₃ an C10
 43,85 ppm  CH₃ an N6
 34,30 ppm  CH₃ an N1
 32,63 ppm  C8
 30,29 ppm  C9
 22,33 ppm  C4
Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60:
Fließmittel Methanol/Wasser 4+1;
hRf 1-Methyl-10α-methoxydihydrolysergol = 12;
hRf MMD-17-Hemisuccinat = 43.
Fließmittel Methanol/Wasser 1+1;
hRf MMD = 1;
hRf MMD-17-Hemisuccinat = 50,5.
Beispiel 4 Antigensynthese mit 1-Methyl-10α-methoxydihydrolysergol- 17-hemisuccinat als Hapten
Zur Herstellung der Haptenlösung werden 420 mg MMD-17-Hemisuccinat (1,05 mMol) in 8,4 ml getrocknetem Dioxan suspendiert, auf Zusatz von 251 µl Tri-N-Butylamin tritt Lösung ein. Die auf 12°C gekühlte Lösung wird mit 138 µl Chlorameisensäureisobutylester (1,05 mMol) versetzt und 30 Minuten bei 12°C gerührt.
Zur Herstellung der Trägerlösung werden 640 mg Rinderserumalbumin (9,84 µMol) in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Mit 1 N NaOH wird der pH-Wert auf 9,0 eingestellt. Nach Zusatz von 13,3 ml Dioxan wird auf 4°C gekühlt.
Die entsprechenden Volumina Hapten- und Trägerlösung (siehe Tabelle) werden vereinigt und der pH-Wert während der ersten 2 Stunden durch Zusatz von 1 N Natronlauge zwischen 7,0 und 8,0 gehalten. Danach wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (zehnmaliger Wechsel) wird die Lösung lyophilisiert.
Es ist daher die Belegungsrate durch Variation des molaren Verhältnisses der Reaktionspartner zueinander steuerbar.
Zur Immunisierung wird ein Konjugat im Verhältnis von 1 : 1,3 verwendet (Ausbeute: 62%).
Belegung mit Hapten:
a) Differenzspektrum: 23,2 Mol Hapten/Mol Träger.
b) Dinitrofluorbenzoltest: 25,4 Mol/Mol Träger.
c) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
MGKonjugat = 78 kDa, das entspricht einer Kopplungsrate von 30 Mol Hapten/Mol Träger.
Zum Nachweis, daß das Hapten durch die Kopplungsreaktion nicht verändert wird, wird eine Reaktion entsprechend Beispiel 4 durchgeführt, wobei anstatt Rinderserumalbumin als Träger die doppelte Menge 6-Aminocaptronsäure verwendet wird.
Zur Aufarbeitung wird der Reaktionsansatz nach Stehen über Nacht bei 4°C mit 1 M Salzsäure neutralisiert und nach Zusatz von Propanol einrotiert. Der Rückstand wird in Chloroform/Methanol 1+1 aufgenommen und durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60 mit Chloroform/Wasser 1+1 als Fließmittel aufgereinigt.
Die Bande wird mit der Chloroform-Methanol-Mischung eluiert (hRf=23). 21 mg des Amides mit 6-Aminocapronsäure werden wie unter 1) beschrieben alkalisch hydrolysiert.
Ausbeute: 9,7 mg öliger Rückstand.
Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60: In den Fließmitteln Methanol und Methanol/Wasser 4+1 zeigen das Hydrolyseprodukt und 1-Methyl-10α-methoxydihydrolysergol den gleichen Rf-Wert.
Im folgenden Formelschema ist die Antigensynthese gezeigt:
Beispiel 5 Selektion eines spezifisch reaktiven Hybrids gegen das NIC-Rinderserumalbuminkonjugat
25 µg NIC-Rinderserumalbuminkonjugat werden in 1 ml Phosphat- gepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgenommen, und mit einer entsprechenden Menge dieser Lösung werden die Näpfe einer Mikrotiterplatte (110 µl/Napf) beschichtet (24 Stunden, 4°C). Als Kontrollplatte werden die Näpfe einer Mikrotiterplatte mit dem nichtderivatisierten Rinderserumalbumin beschichtet. Nach dem Waschen der Platten mit PBS werden jeweils ein Napf der Test- und Kontrollplatte mit 50 µl desselben Hybridüberstandes inkubiert (2 Stunden, 37°C). Überschüssiger Antikörper wird wieder ausgewaschen (3×PBS) und die Platten mit Anti-Maus (IgG+IgM)- Antikörper-Peroxidasekonjugat von der Ziege wie oben inkubiert. Die Menge an gebundenem Enzym wird durch die Substratreaktion mit Diaminobenzidin/ Wasserstoffperoxid als Farbstoff nachgewiesen. Weiterkultiviert werden nur diejenigen Hybridlinien, die nur mit dem Hapten-Rinderserumalbuminkonjugat, nicht aber mit dem Rinderserumalbumin eine positive Reaktion zeigen.
Beispiel 6 Nachweis der Spezifität der selektionierten Antikörper für das intakte Nicergolin
Der ELISA-Test wird, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit BNS- Rinderserumalbuminkonjugat durchgeführt. Ein zusätzlicher Probesatz enthält neben dem Gewebekulturüberstand mit dem zu untersuchenden Hybridüberstand einen großen Überschuß der intakten Ausgangssubstanz (gesättigte Lösung von Nicergolin in PBS, 50 µl Hybridüberstand mit 50 µl Nicergolinlösung). Weiter verwendet werden nur Hybridlinien, die bei Zusatz des intakten Nicergolins im ELISA-Test eine verringerte Reaktivität gegen das entsprechende Rinderserumalbuminkonjugat zeigen und damit auch mit dem Nicergolin reaktiv sein müssen.
Beispiel 7 Quantitative Bestimmung von inaktivem Nicergolin mit Hilfe der beschriebenen monoklonalen Antikörper
Mikrotiterplatten werden, wie oben beschrieben, mit gereinigtem Anti-BNS-Antikörper beschichtet. Die gewaschenen Mikrotiterplatten (3×PBS) werden mit einer Standardverdünnungsreihe von Nicergolin in PBS (1 ng-10 µg/ml) und mit geeigneten Probenverdünnungen (Serum) 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach erneutem Waschen werden die Mikrotiterplatten mit einer 1 : 100- Verdünnung des biotinylierten Anti-NIC-Antikörpers (0,5 mg/ml) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dem nächsten Waschschritt erfolgt eine erneute Inkubation mit einer geeigneten Verdünnung eines kommerziell erhältlichen Avidin-Peroxidase-Konjugates, und anschließend wird die Substratreaktion mit Diaminobenzidin/ Wasserstoffperoxid durchgeführt. Die optische Dichte wird bei 490 nm bestimmt. Aus den Werten für die Standardkonzentrationen wird die Eichkurve berechnet und damit durch Vergleich der Gehalt an Nicergolin in den Serumproben ermittelt.
Beispiel 8 Herstellung polyklonaler Antikörper Grundimmunisierung
1 mg NIC-OH- oder BNS-Konjugat in 1 ml 0,9%iger Kochsalzlösung werden mit 1 ml kompletten Freundschem Adjuvans gemischt und an 10 bis 12 Stellen am Rücken eines männlichen Kaninchens (etwa 4 kg) subkutan injiziert.
Nachimmunisierung
Nach 4 Wochen werden 0,5 mg Konjugat in 0,5 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gelöst, mit einem gleichen Volumen an inkomplettem Freundschem Adjuvans gemischt und jeweils an den Hinterläufen in die Nähe der poliplietalen Lymphknoten intramuskulär appliziert. Insgesamt wird die Nachimmunisierung viermal wiederholt.
Serumgewinnung
Durch Inzision der Ohrvene wird 1 Woche nach der letzten Nachimmunisierung Plasma gewonnen, nach Koagulation bei 2000 g zentrifugiert und das so gewonnene Serum zur Analytik verwendet.

Claims (17)

1. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus- Antikörper, welche
  • a) in einem ELISA-Test mit einem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC- OH-Rinderserumalbuminkonjugat (1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol- 17-hemisuccinat-Rinderserumalbuminkonjugat), positiv reagieren, und
  • b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Rinderserumalbumin, nicht reagieren.
2. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus- Antikörper nach Anspruch 1, welche durch Zusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Testsystem in ihrer Reaktivität mit dem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC- OH-Rinderserumalbuminkonjugat inhibiert werden.
3. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus- Antikörper nach den Ansprüchen 1 und 2, welche nach Reinigung aus Serum bzw. Aszitesflüssigkeit von Mäusen und nachfolgender Biotinylierung nach Standardverfahren unter Verwendung von Avidin-Peroxidasekonjugaten im ELISA-Test mit NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbuminkonjugat reagieren.
4. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus- Antikörper, welche
  • a) in einem ELISA-Test mit einem BNS-Konjugat, insbesondere BNS- Serumalbuminkonjugat (5-Bromnicotinsäure-Rinderserumalbuminkonjugat) positiv reagieren, und
  • b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Serumalbumin, nicht reagieren.
5. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus- Antikörper nach Anspruch 4, welche durch Zusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Testsystem in ihrer Reaktivität mit dem BNS-Konjugat, z. B. BNS-Serumalbumin inhibiert werden.
6. Monospezifische Antikörper nach Anspruch 5, welche nach Reinigung aus Serum bzw. Aszitesflüssigkeit von Mäusen nach ihrer Immobilisierung an der Oberfläche von Kunststoffen (z. B. Mikrotiterplatten, magnetische Partikel) oder anorganischen Trägern das intakte Nicergolinmolekül binden.
7. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß man NIC-OH- oder BNS-Konjugat mit komplettem Freundschen Adjuvans mischt und Kaninchen subkutan und nach mindestens 4 Wochen mehrmals intramuskulär injiziert und anschließend das Serum gewinnt.
8. Hybridzellinien, welche monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 produzieren und durch Fusion von Zellen von einer zuvor mit BNS- bzw. NIC-OH-Konjugat, insbesondere Serumalbuminkonjugat immunisierten Maus und Zellen einer Maus- Myelom-Linie gebildet sind.
9. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
  • a) Erzeugung von immunologisch aktiven NIC-OH- bzw. BNS-Konjugaten, z. B. Serumalbuminkonjugaten;
  • b) Grundimmunisierung von Mäusen mit einer Suspension oder Lösung der entsprechenden Konjugate in komplettem Freundschen Adjuvans subkutan;
  • c) Nachimmunisierung der behandelten Mäuse mit demselben Konjugat in inkomkplettem Freundschen Adjuvans intraperitoneal 3 Wochen nach der Grundimmunisierung;
  • d) Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und Bereiten einer Suspension von Milzzellen;
  • e) Fusion der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors;
  • f) Verdünnen und Vermehren der vereinigten Zellen in getrennten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einem Selektionsmedium, welches nur das Wachstum von Hybridzellen unterstützt;
  • g) Auswerten des Überstandes in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten mit positivem Hybridwachstum hinsichtlich des Vorliegens eines Antikörpers der gewünschten Spezifität durch paralleles Testen zweier Überstandsaliquote in einem ELISA- Testsystem mit immobiliertem Träger als negative Kontrolle und NIC-OH- bzw. BNS-Konjugat als positive Testsubstanz;
  • h) Klonierung der Hybride mit der gewünschten Reaktivität nach der Methode der "limitierenden Verdünnung";
  • i) Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand.
10. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
  • a) Erzeugung von immunologisch aktiven NIC-OH- bzw. BNS-Konjugaten, z. B. Serumalbuminkonjugaten;
  • b) Grundimmunisierung von Mäusen mit einer Suspension oder Lösung der entsprechenden Konjugate in komplettem Freundschen Adjuvans subkutan;
  • c) Nachimmunisierung der behandelten Mäuse mit demselben Konjugat in inkomplettem Freundschen Adjuvans intraperitoneal 3 Wochen nach der Grundimmunisierung;
  • d) Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und Bereiten einer Suspension von Milzzellen;
  • e) Fusion der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors;
  • f) Verdünnen und Vermehren der vereinigten Zellen in getrennten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einem Selektionsmedium, welches nur das Wachstum von Hybridzellen unterstützt;
  • g) Auswerten des Überstandes in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten mit positivem Hybridwachstum hinsichtlich des Vorliegens eines Antikörpers der gewünschten Spezifität durch paralleles Testen zweier Überstandsaliquote in einem ELISA- Testsystem mit immobiliertem Träger als negative Kontrolle und NIC-OH- bzw. BNS-Konjugat als positive Testsubstanz;
  • h) Klonierung der Hybride mit der gewünschten Reaktivität nach der Methode der "limitierenden Verdünnung";
  • i) Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand;
  • j) Überprüfung der Reaktivität der entsprechenden selektionierten Antikörper mit dem nativen Ausgangsmolekül durch Nachweis der kompetitiven Inhibition nach Zusatz von steigenden Konzentrationen des Ausgangsmoleküls im ELISA-Test;
  • k) Selektion und zweite Klonierung der überprüften Hybridzellinien sowie die Überprüfung der Klone auf intraperitonealem Wege in Pristan-vorbehandelten Mäusen; und
  • l) Ernten der malignen Asziten aus den genannten Mäusen, welche die gewünschten Antikörper enthalten und Reinigung der Antikörper nach Standardtechniken.
11. 5-Bromnicotinsäure-Trägerkonjugate, insbesondere Rinderserumalbuminkonjugate der Formel wobei
X ein Kohlenwasserstoffrest mit 1-6 C-Atomen ist, der gegebenenfalls durch S, O, N unterbrochen sein kann.
12. 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol-Konjugate, insbesondere 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol-17-hemisuccinat-Serumalbuminkonjugate, der Formel wobei
X ein Kohlenwasserstoffrest mit 1-6 C-Atomen ist, der gegebenenfalls durch S, O, N unterbrochen sein kann.
13. Verfahren zur Herstellung von 5-Bromnicotinsäurekonjugaten, insbesondere Serumalbuminkonjugaten, dadurch gekennzeichnet, daß 5-Bromnicotinsäure mit dem Träger (Serumalbumin) umgesetzt wird.
14. Verfahren zur Herstellung von 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol- 17-hemisuccinat-Träger-Konjugat (Serumalbuminkonjugat), dadurch gekennzeichnet, daß 1-Methyl-10α-methoxy-dihydrolysergol mit Bernsteinsäureanhydrid und das erhaltene 1-Methyl- 10α-methoxydihydrolysergol-17-hemisuccinat mit den jeweiligen Haptenträgern umgesetzt wird.
15. Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Nicergolins mit Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß die kompetitive Inhibition der Reaktivität zwischen spezifischen Antikörpern nach Anspruch 2 oder 5 und zugehörigem immobilisiertem Konjugat in einem ELISA-System bestimmt wird.
16. Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung des nichtmetabolisierten Nicergolins, dadurch gekennzeichnet, daß gereinigte Anti-BNS-Antikörper (BNS-1 oder -2) in Kombination mit Anti-NIC-Antikörpern eingesetzt werden, wobei entweder die Anti-BNS-Antikörper oder die Anti-NIC-Antikörper in geeigneter Weise, z. B. durch Biotinylierung oder radioaktive Markierung, zum Nachweis modifiziert sind.
17. Diagnostisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es Anti- BNS-Antikörper nach Anspruch 3 und/oder Anti-NIC-Antikörper nach Anspruch 6 in getrennter Weise enthält, wobei entweder die Anti-BNS-Antikörper oder die Anti-NIC-Antikörper in geeigneter Weise, z. B. durch Biotinylierung oder reaktive Markierung, zum Nachweis modifiziert sind.
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