DE4005684A1 - Verfahren zur erhoehung der transformationseffizienz von pflanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Transformationseffizienz von Pflanzen, Konstrukte, Genstrukturen sowie die Verwendung derselben.

Es ist allgemein bekannt, daß sich mittels gentechnologischer Arbeitstechniken gezielt einzelne Gene in das pflanzliche Genom übertragen lassen. Diese als Transformation bekannte Arbeitstechnik wird heute routinemäßig unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Das Bakterium schleust bakterieneigene DNA (Transfer-DNA/T-DNA) in die Pflanzenzellen ein, die vom bakteriellen Ti-Plasmid (Tumor-induzierend) stammt. Werden zuvor in diese T-DNA Fremdgene eingeführt, so werden auch diese in das Pflanzengenom übertragen. Bei einigen ökonomisch bedeutenden Pflanzenspezies, wie z. B. der Kartoffel (Solanum tuberosum), ist diese Methodik jedoch wenig wirksam.

Es ist weiterhin allgemein bekannt, z. B. aus einer Arbeit von P.J.M. van den Elzen und Mitarbeitern, veröffentlicht in Plant Mol.Biol. (1989) 13; 337-346, durch Expression eines Hüll­ proteingens eine Virusresistenz in ökonomisch wichtigen Pflanzenspezies wie der Kartoffelpflanze zu erreichen.

Aus einer Arbeit von E. Tacke, S. Sarkar, F. Salamini und W. Rohde, veröffentlicht in Arch. Virol (1989) 105; 153-163 , ist die DNA- Sequenz der genomischen RNA des Kartoffel-Blattroll-Virus (PLRV) bekannt. Dazu wurde eine DNA-Kopie (cDNA) der genomischen RNA des Kartoffel-Blattroll-Virus hergestellt und deren Sequenz bestimmt. Das Virus PLRV gehört zusammen mit dem Rüben-Virus (beet western yellows virus) BWYV und dem Gerste-Virus (Barley yellow dwarf virus) BYDV zu den Luteoviren. Sie sind, nach den Autoren der zitierten Arbeit, im 3′-terminalen Bereich des viralen Genoms ähnlich aufgebaut. Dieser Bereich ist durch das Hüllproteingen ORF1, das interne offene Leseraster ORF2 und ein weiteres offenes Leseraster ORF3 charakterisiert, das sich an das Hüllproteingen anschließt. Nach den Angaben in der zitierten Arbeit ist die 2kb große cDNA des Klons pCPL1 durch eine Nukleinsäure- und eine daraus resultierende Aminosäuresequenz näher definiert und enthält drei offene Leseraster (ORF), dir für das virale Kapsidprotein CP (ORF1) sowie für zwei virale Proteine (17 kDa, ORF2; 55 kDa, ORF3) mit unbekannter Funktion kodieren.

Überraschenderweise wurde nun bei Versuchen, bei denen eine DNA-Kopie (cDNA) der genomischen RNA des Kartoffel-Blattroll-Virus (PLRV) hergestellt und verschiedene Bereiche dieser cDNA in die T-DNA eines Ti-Plasmids kloniert, die erhaltenen Konstrukte in Agrobacterium tumefaciens eingebracht und N.tabacum sowie S.tuberosum nach der leaf-disc-Methode transformiert wurden, festgestellt, daß ein 1,8kb großes cDNA-Fragment zu einer nicht erwarteten überraschend hohen Steigerung der Transformationseffizienz führt. Isoliert wurde dieses Fragment nach Schneiden mit den Restriktionsenzymen SacI und EcoRI aus dem in der zitierten Literaturstelle Arch.Virol. (1989) 105; 153-163 beschriebenen cDNA-Klon pCPL1.

Das 1,8kb-Fragment wurde unter die Kontrolle von Regulationssignalen für die Transkription gebracht (CaMV 35S-Promotor und Terminator). Der Effekt der so beschriebenen viralen Sequenzen auf die Transformationsrate wurde getestet wie oben beschrieben. Bei Kombination des 1,8kb-Fragmentes mit Regulationssignalen für die Transkription in Pflanzen wurde eine Erhöhung der Transformationseffizienz beispielsweise um den Faktor 10 fest­ gestellt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Erhöhung der Transformationseffizienz von Pflanzen, das gekennzeichnet ist durch

a) die Kombination von Transkriptions-Regulationssignalen mit einem cDNA-Fragment eines Luteovirus, das drei offene Leseraster beinhaltet und dem 3′-terminalen Bereich des viralen Genoms gemäß Fig. 1 entspricht,
b) Einbringung des durch die Kombination erhaltenen Konstruktes in Agrobacterium tumefaciens sowie
c) Transformation von Pflanzen mit den selektionierten Agro­ bakterien.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Genkonstrukte, erhalten durch die Kombination von Transkriptions-Regulationssignalen mit einem cDNA-Fragment eines Luteovirus, das drei offene Leseraster beinhaltet und dem 3′-terminalen Bereich des viralen Genoms gemäß Fig. 1 entspricht, ferner eine Genstruktur, eine Pflanzenzelle sowie die Verwendung der Genstruktur zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, Pflanzenteilen und Samen, die sich durch eine Resistenz gegenüber dem PLVR-Virus und ver­ wandten Luteoviren auszeichnen.

Bei den offenen Leserastern handelt es sich um das Hüllproteingen, ein in diesem gelegenes, kleineres offenes Leseraster und ein weiteres offenes Leseraster, das sich 3′-terminal an das Hüllproteingen anschließt, von diesem durch ein UAG-Stopcodon getrennt.

Die Erfindung ermöglicht somit durch Kombination von Transkrip­ tions-Regulationssignalen mit einem cDNA-Fragment von Luteoviren, insbesondere den bisher sequenzierten Luteoviren PLRV, BMYV und BYDV, die die beschriebenen offenen Leseraster tragen, eine überraschende Steigerung der Transformationseffizienz, wobei gleichzeitig mit den durch eine hohe Transformationseffizienz gekennzeichneten Konstrukten das Kapsidprotein-Gen der genannten Viren, insbesondere des PLRV-Virus, stabil in das Pflanzengenom integriert und zur Expression gebracht wird.

Die Figuren dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. Im einzelnen sind dargestellt in

Fig. 1 die Lokalisierung eines 1,8 kb großen SacI/EcoRI- Fragmentes von cDNA-Klon pCPL1 (schraffierte Kastenfläche) im PLRV-Genom, das in 5′/3′-Orientierung mit offenen Leserastern (weiße Kastenflächen) gezeigt ist;

Fig. 2 das 1,8 kb große SacI/EcoRI Fragment aus dem Klon pCPL1, das durch eine Nukleinsäure- und eine daraus resultierende Aminosäuresequenz näher definiert ist und drei offene Leseraster (ORF) aufweist, die für das virale Kapsidprotein CP (ORF1) sowie zwei virale Proteine (17 kDa, ORF2, 55 kDa, ORF3) mit unbekannter Funktion kodieren;

Fig. 3 die strukturelle Organisation der BMY1, PLRV und BYDV Genome und in

Fig. 4 die Ligierung des 1,8 kb großen SacI/EcoRI Fragmentes aus dem Plasmid pCPL1 in die SmaI Restriktionsschnittstelle des Plasmids pAP, zwischen den CaMV-35S-Promotor und Terminator; weiterhin die Isolierung der Transkriptionseinheit Promoter/offene Leseraster/Terminator aus dem so konstruierten Plasmid durch EcoRI-Verdau und Ligierung in den mit EcoRI geöffneten binären Agrobacterium tumefaciens Vektor pGDW32.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern. Die dabei angewandten grundlegenden Techniken, wie beispielsweise enzymatische Reaktionen und Bakterientransformationen, werden dabei nicht näher erläutert, da sie bekannt sind. Im Falle des folgenden Beispiels wurde wie in dem Lehrbuch von T. Maniatis, E.F. Fritsch, E. Sambrock (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben, verfahren.

Beispiel 1) Verwendete Medien 1a) Medien für Anzucht von Bakterien

YEB-Medium: 0,5% beef extract, 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Pepton, 0,5% Saccharose, pH 7,4;
für Festmedien wurde 1,5% Agar zugegeben.

1b) Medien für Pflanzen

MS-Medium wurde hergestellt wie beschrieben bei Murashige und Skoog (1962)
MS20-Medium: MS-Medium mit 2% Saccharose
MS30-Medium: MS-Medium mit 3% Glucose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 2,0 mg/l Zeatinribosid, 500 ml/l Claforan;
für Festmedien wurde 0,8% Agar zugegeben.

2) Verbindung des 1,8 kb großen SacI/EcoRI-Fragmentes mit Signalen, welche die pflanzliche DNA-abhängige RNA-Polymerase II erkennt (Transkriptionssignale) 2a) Isolierung des Fragmentes

Als Ausgangsmaterial diente der in Arch. Virol. (1989); 105; S. 153-163 beschriebene Plasmidklon pCPL1 (Fig. 2). DNA dieses Klons wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und EcoRI geschnitten. Nach Auftrennung des Restriktionsansatzes auf einem 1,2%igen Agarosegel wurde eine DNA-Bande von 1,8 kb ausgeschnitten. Die DNA wurde aus dem Gel elektroeluiert und über DEAE-Cellulose gereinigt.

2b) Verbindung des Fragmentes mit Transkriptionssignalen

Ein pBR-Plasmid, das den Promotor und den Terminator des 35S-Transkriptes des Cauliflower Mosaic Virus trägt (beschrieben in Nature (1985), 313; S. 810-812), wurde zwischen diesen beiden Sequenzen durch Schneiden mit dem Restriktionsenzym SmaI geöffnet. Dadurch konnte das oben beschriebene Fragment, nach Behandlung mit dem Enzym mungbean nuclease, hinter den Promoter und vor den Terminator inseriert werden durch Inkubation mit der T4-DNA-Ligase.

2c) Einbringung des Konstruktes mit Agrobacterium tumefaciens

Für die anschließende Pflanzentransformation wurde das binäre Vektorsystem von Wing und Mitarbeitern (beschrieben in MGG (1989), 219; S. 9-16) benutzt. Der dort beschriebene Vektor pGDW32 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI in der T-DNA geöffnet und mit der calf intestinal phospatase (CIP) dephosphoryliert. Durch Schneiden mit EcoRI wurde aus dem oben bechriebenen Vektor die Transkriptionseinheit Promoter/1,8 kb, Fragment/Terminator herausgeschnitten, wie unter 2a) beschrieben, über ein Agarosegel und DEAE-Cellulose gereinigt und in die T-DNA des Vektorplasmids pGDW32 inseriert.

Dieses Plasmid wurde mittels der Methode der direkten Agrobacterium tumefaciens-Transformation in den bei Koncz und Schell in MGG (1986), 204; S. 383-396 beschriebenen Agrobakterien-Stamm GV3101 (pMP90RK) transformiert. Hierfür wurde eine Bakterienkolonie dieses Stammes in 4 ml YEB-Medium über Nacht bei 28°C angezogen. Am nächsten Tag wurde mit dieser Bakteriensuspension 100 ml YEB-Medium angeimpft und 4 h bei 28°C geschüttelt, nach einer Stunde in einer Heraeus Minifuge RF bei 6000 rpm zentrifugiert und das Pellet in 1 ml YEB-Medium resuspendiert. Zu 200 µl dieser Suspension wurden 200 ng des oben beschriebenen pGDW-Konstruktes hinzugegeben und in flüssigen Stickstoff eingefroren. Nach einem Hitzeschock von 5 min bei 37°C wurde 1 ml YEB-Medium zugegeben und 1 h bei 28°C inkubiert. Durch Wachstum bei 28°C auf YEB-Medien unter selektiven Bedingungen (100 mg/l Rifampicin, Selektion auf das bakterielle Chromosom; 25 mg/l Kanamycin, Selektion auf das Helferplasmid pMP90RK; 100 mg/l Carbenicillin, Selektion auf das Plasmid pGDW32) wurden dann plasmidtragende Bakterienkolonien isoliert. Mittels der Southern blot-Analyse wurde überprüft, daß die isolierten Bakterienklone das rekombinante Plasmid pGDW32 mit der intakten Transkriptionseinheit Promoter/1,8 kb Fragment/Terminator besaßen (Fig. 4).

3) Transformation von Solanum tuberosum mit den selektionierten Agrobakterien 3a) Anzucht von Bakterien

Einzelne Bakterienkolonien wurden in 1 ml YEB-Medium mit den oben angegebenen Antibiotika 2 Tage lang bei 28°C angezogen. Mit dieser Kultur wurden 20 ml Antibiotika-haltiges YEB-Medium angeimpft und 2 Tage bei 28°C geschüttelt. Die Bakterienkultur wurde 10 min bei RT und 6000 rpm in einer Heraeus Minifuge RF zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 ml 10 mM MgSO₄ resuspendiert, erneut zentrifugiert und resuspendiert in MS-Medium.

3b) leaf disc-Transformation

Solanum tuberosum-Pflanzen der Varietät Desiree waren auf MS20-Medium angezogen worden bei einem Tag/Nacht-Wechsel von 16 h Licht/24°C und 8 h Dunkelheit/18°C. Blätter wurden unter sterilen Bedingungen an der Basis abgeschnitten und mit obiger Bakteriensuspension 1 h lang im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blätter auf MS30-Platten gelegt und zwei Tage im Dunkeln bei 28°C inkubiert. Dann wurden die Blätter in MS-Medium mit Claforan (500 mg/l) gewaschen, auf MS30-Platten mit Hygromycin (10 mg/l) gelegt und bei dem oben beschriebenen Tag/Nacht-Wechsel gehalten. Da die T-DNA des Plasmids pGDW32 ein Hygromycin-Resistenzgen trägt, konnte mit Hygromycin auf solche Pflanzenzellen selektioniert werden, die diese T-DNA aufgenommen hatten. Alle 10 Tage wurden die Blätter auf frische Platten transferiert. Nach der Sproßbildung wurden diese vom kallösen Gewebe abgeschnitten und auf MS30 ohne Hormone, jedoch mit Saccharose statt Glucose zur Bewurzelung gebracht. Durch eine Southern blot-Analyse der transformierten Pflanzen wurde überprüft, daß diese wirklich die T-DNA mit dem inserierten Konstrukt Promoter/1,8 kb Fragment/Terminator aufgenommen hatten, daß die Pflanzen also wirklich transformiert waren.

4) Nachweis der transformationssteigernden Wirkung

Bei Pflanzen-Transformationen mit dem pGDW32 mit inseriertem Promoter/1,8 kb Fragment/Terminator kam es zu einer Erhöhung der Rate von Transformationsereignissen, mindestens um den Faktor 10, verglichen mit folgenden Transformationen:

- das Plasmid pGDW32 ohne Fremd-DNA
- das Plasmid pGDW32 mit 1,8 kb Fragment ohne Promotor und Terminator
- das Plasmid pGDW32 mit einem kleineren Fragment, das nur die ersten 0,8 kb des oben beschriebenen SacI/EcoRI-Fragmentes trägt, ebenfalls zwischen Promoter und Terminator inseriert. Es handelt sich hierbei um das SacI/AccI-Frag­ ment.

5) Nachweis der Expression des viralen Kapsidprotein-Gens

Transformierte Pflanzen wurden durch DNA-Analyse ("Southern blotting") auf das Vorhandensein des intakten Promoter/1,8 kb PLRV cDNA/Terminator-Konstrukts überprüft. Die Expression des PLRV-CP-Gens wurde durch RNA-Analyse ("Northern blotting") und durch immunologische Reaktion des Kapsidproteins mit entsprechenden Antiseren im ELISA-Test und in der "Western blotting"-Analyse nachgewiesen.

Claims (9)

1. Verfahren zur Erhöhung der Transformationseffizienz von Pflanzen, gekennzeichnet durch

• a) die Kombination von Transkriptions-Regulationssignalen mit einem cDNA-Fragment eines Luteovirus, das drei offene Leseraster beinhaltet und dem 3′-terminalen Bereich des viralen Genoms gemäß Fig. 1 entspricht,
• b) Einbringung des durch die Kombination erhaltenen Konstruktes in Agrobakterium tumefaciens sowie
• c) Transformation von Pflanzen mit den selektionierten Agro­ bakterien.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe a) ein cDNA-Fragment verwendet, das erhalten wird durch Schneiden des cDNA-Klons pCPL1 mit den Restriktionsenzymen SacI und EcoRI.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe a) Transkriptions-Regulationssignale mit einem cDNA-Fragment des Kartoffel-Blattroll-Virus (PLRV), des Rüben-Virus (BWYV) und des Gerste-Virus (BYDV) kombiniert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe c) mit den selektionierten Agrobakterien Solanum tuberosum oder Nicotiana tabacum transformiert.

5. Konstrukt, erhalten durch die Kombination von Transkriptions- Regulationssignalen mit einem cDNA-Fragment eines Luteovirus, das drei offene Leseraster beinhaltet und dem 3′-terminalen Bereich des viralen Genoms gemäß Fig. 1 entspricht.

6. Genstruktur, bestehend aus offenen Leserastern aus dem 3′-terminalen Bereich eines Luteovirus-Genoms, gekennzeichnet durch ein offenes Leseraster für ein Luteovirus-Hüllprotein, ein in diesem gelegenes kleineres offenes Leseraster und ein weiteres offenes Leseraster, das sich 3′-terminal an ersteres anschließt, jedoch durch ein UAG-Stopcodon getrennt, gekoppelt an in Pflanzen wirksame Regulations- und Expressionssignale.

7. Genstruktur, gekennzeichnet durch die DNA-Sequenz (Fig. 2), gekoppelt an in Pflanzen wirksame Regulations- und Expressions­ signale.

8. Pflanzenzelle, gekennzeichnet durch eine Genstruktur nach Anspruch 6.

9. Verwendung der Genstruktur nach Anspruch 6 zur Erzeugung von Virus-resistenten Pflanzenzellen, Pflanzenteilen, Pflanzen und Samen.