DE4005245A1 - Reflexionsfluorimeter - Google Patents

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Reflexionsfluorimeter mit einem zylindrischen Meßlichtleiter.

Trifft eine Lichtwelle unter einem bestimmten Winkel auf die Grenzfläche zweier Medien mit verschiedenen Brechungsindices so kann sie total reflek­ tiert werden, sofern der Einfallswinkel R größer ist als der kritische Win­ kel R_c. Dieser Winkel errechnet sich aus der Gleichung

R_c = Sinus^-1 (n2/n1)

wobei n1 und n2 die Brechungsindices der verschiedenen Medien sind und n2 < n1 ist. An dem Ort der Reflexion wird in dem optisch dünneren Medium eine Welle generiert, die dicht an der Grenzfläche ein Energiefeld aufbaut. Die Benutzung dieses Energiefeldes für optische Analysen ist schon lange be­ kannt: die Erregung von Fluoreszenz durch totale Reflexion an der Grenzflä­ che zweier optischer Medien ist sogar die klassische Methode für den Nach­ weis dieser Energiefelder (R.W. Wood in "Physical Optics" 3. Ed. McMillan, New York, N. Y. 1934).

Die Benutzung dieses Energiefeldes für analytische Messungen hat einige Vorteile gegenüber konventioneller Anregung. Es kann eine stärkere Energie­ kupplung innerhalb des dünnen Films auftreten, was in der Regel zu einer Verringerung des Hintergrundsignals und damit zu einem besseren Signal/ Rauschverhältnis führt.

Einige experimentelle Untersuchungen hierzu wurden schon beschrieben: T. Hirschfeld, Can. Spectrosc. 10 (1965) 128 und US-Patent Nr. 36 04 927 (1971).

Stand der Technik

Einrichtungen zur Messung von Fluoreszenz, die durch Totalreflexion ange­ regt wird, benutzen Fasern, Küvetten oder Kapillaren (EP-A 02 02 021, EP-A 02 05 236, EP-A 02 45 206, EP-A 02 09 489, EP-A 02 39 382, EP-A 00 75 353, DE-A 36 05 518). Die genaue Positionierung im Lichtweg ist mechanisch schwie­ rig. Es wurden daher an den Einstrahlungsenden Verdickungen vorgeschlagen (US-A 46 54 532 und US-A 47 16 121, DE-A 36 05 518), die eine bessere Licht­ leitung über einen vergrößerten Eintrittsquerschnitt ermöglichen sollten. Eine ähnliche prismatische Verdickung an den Enden einer Meßküvette wird in EP-A 02 09 489 beschrieben. Aus den dort gemachten Angaben geht hervor, daß die physikalischen Toleranzen für die Ausführung solcher Einrichtungen sehr eng sein müssen. In der DE-A 36 05 518 ist eine Meßzelle beschrieben, die durch Verdickung an den Enden die Einstrahlung in das konische Ende des Meßlichtleiters erleichtern soll.

Einrichtungen, die mit einer sensitiven Lichtleiterfaser arbeiten, benutzen das von den angeregten Molekülen in die Faser eingestrahlte Fluoreszenz­ licht zur Messung an einem Ende des Lichtleiters. Nachteilig bei dieser An­ ordnung ist ein erheblicher Signalverlust, bedingt durch die Winkelvertei­ lung des abgegebenen Fluoreszenzlichtes (siehe auch El-Hang Lee, R. E. Benner, J. B. Fenn und R. K Chang, Applied Optics, 18 (1979) 862-868).

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Reflexionsfluorimeter nach dem Stand der Technik hinsichtlich Empfindlichkeit, Signal/Rauschverhält­ nis, erforderlichem Probenvolumen und erhältlicher Quantität und Qualität an Information zu verbessern. Erfindungsgemäß gelöst wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen definierten Gegenstände.

Gegenstand der Erfindung ist ein Reflexionsfluorimeter mit einem zylindri­ schen Meßlichtleiter, gekennzeichnet durch einen kapillarförmigen Meßlicht­ leiter, eine kegelmantelförmige Einstrahlung gepulsten Lichtes auf eine Stirnseite des Meßlichtleiters, und eine Vorrichtung zur zeitaufgelösten Messung des im wesentlichen radial aus dem Meßlichtleiter austretenden Emissionslichtes.

Ein bevorzugter Reflexionsfluorimeter zeichnet sich durch eine Vorrichtung zur wellenlängenaufgelösten Messung aus.

Weiterhin bevorzugt ist ein Reflexionsfluorimeter, bei dem der Meßlicht­ leiter an dem der Lichteinstrahlung gegenüberliegenden Ende eine Verspie­ gelung aufweist.

Ein besonders bevorzugtes Reflexionsfluorimeter weist einen Hilfssensor zur Messung eines Teiles des reflektierten Lichtes und/oder des Emissionslich­ tes zur Kompensation und Korrektur der Meßwerte auf.

Zur Einführung des Lichtes in den optischen Lichtleiter wird erfindungsge­ mäß eine Optik benutzt, die eine kegelmantelförmige Lichteinstrahlung her­ stellt. Unter kegelmantelförmiger Lichteinstrahlung soll eine Lichtführung verstanden werden, die durch 2 konzentrische Kegeloberflächen mit gemein­ samer Spitze als Brennpunkt begrenzt wird. Der Einfallswinkelbereich R_{i min}-R_{i max} wird in Abhängigkeit von dem Brechungsindex des verwendeten Lichtleiters ausgewählt. Der Winkelbereich sollte möglichst groß sein, da­ mit die Totalreflexionen möglichst gleichmäßig über die Grenzflächen des Lichtleiters verteilt sind. Der größte gewählte Öffnungswinkel des Licht­ kegelmantels R_{i max} sollte möglichst groß sein, damit möglichst viele To­ talreflexionen über die Länge des Lichtleiters erreicht werden. Er darf je­ doch nur so groß sein, daß die Reflexionswinkel im Inneren des Lichtleiters noch über dem kritischen Winkel R_c liegen. Hierdurch verkleinert sich das Verhältnis zwischen eingestrahlter Lichtmenge und Anzahl von Totalreflexio­ nen im Meßlichtleiter, was ein verbessertes Signal/Rauschverhältnis zur Folge hat.

Eine ähnliche Strahlenführung kann man durch mehrere konventionelle Licht­ leiter erreichen, die entsprechend in eine kegelförmige Halterung montiert sind.

Die kegelmantelförmige Lichteinstrahlung kann aber auch durch eine rota­ tionssymmetrische Spiegelanordnung erreicht werden. Der Vorteil einer sol­ chen Einrichtung ist die höhere Lichtausbeute der anregenden Lichtquelle.

Als Lichtquellen kommen die für diese Zwecke üblichen Laser in Frage. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgt durch die gepulste Einstrahlung des Anre­ gungslichtes. Die Länge der eingestrahlten Lichtpulse kann in weiten Gren­ zen variiert werden. Zweckmäßig ist ein Bereich der Pulslänge von 0,1-10 ns (Nanosekunden). Die Pulsfrequenz beträgt 0,1 Hz-1 GHz. Werden nun sowohl zeit- als auch wellenlängenabhängige Messungen durchgeführt, so ist es mög­ lich mehrere Analyte in einer Meßeinrichtung nahezu gleichzeitig zu detek­ tieren. Es können auch sogenannte innere Standards zur Meßwertkompensation und -korrektur eingebracht werden. Es können dadurch Justiermängel der Ka­ pillare oder Schwankungen der Laserleistung etc. erkannt werden. Es wird hiermit möglich, Leistung und Zuverlässigkeit der Meßeinrichtung bzw. jeder einzelnen Messung zu dokumentieren. Zusammen mit einer datei- bzw. rechner­ gestützten Verarbeitung können so diagnostische Aussagen erstellt werden.

Durch Verspiegelung des Meßlichtleiters an dem der Lichteinstrahlung gegen­ überliegenden Ende kann der Lichtweg verdoppelt werden, womit eine bessere Lichtnutzung erreicht werden kann. Dem Fachmann sind die Verfahren zur Ver­ spiegelung bekannt.

Ein kleiner Teil des austretenden Anregungslichtes kann gewünschtenfalls von einem Hilfssensor für Absorptions- oder Kontroll- und Korrekturmessun­ gen genutzt werden, um Fehler durch schwankende Intensität des Anregungs­ lichtes, Inhomogenitäten des Lichtleiters oder ungenügende Justierung rech­ nerisch oder mechanisch zu kompensieren.

Es werden kapillare Lichtleiter eingesetzt, da hier das Verhältnis von Vo­ lumen zu innerer Oberfläche günstig ist. Für Untersuchungen mit sehr ver­ dünnten Lösungen ist es sinnvoll das Verhältnis von innerer Oberfläche zum Probenvolumen möglichst groß zu halten. Das erhöht die Empfindlichkeit der Messung und verkürzt die Reaktionszeiten für Adsorbtionsvorgänge oder Bin­ dungsreaktionen, die an der inneren Oberfläche stattfinden können.

Beispielsweise hat eine Kapillare mit einer Länge von 100 mm und einem in­ neren Durchmesser von 0.56 mm, ein Volumen von 25 µl und eine innere Ober­ fläche von 1.77 cm². Im Vergleich dazu hat eine Vertiefung in einer Mikro­ titerplatte ein Volumen von ca. 220 µl und eine Fläche von 1.65 cm².

Gewünschtenfalls kann die innere Oberfläche aktiviert werden, beispielswei­ se durch Fixierung von für die zu untersuchenden Analyte spezifischen Anti­ körpern.

Das vom Meßlichtleiter emittierte Fluoreszenzlicht kann durch eine herkömm­ liche Meßkammer und einen Meßsensor gemessen werden. Als besonders vorteil­ haft erweist sich jedoch die Verwendung einer verspiegelten Meßkammer. Be­ sonders zweckmäßig ist es, die Meßkammer so zu gestalten, daß ein möglichst großer Anteil des emittierten Lichts auf den Meßsensor gelenkt wird. Bei­ spielsweise hat die Meßkammer einen im wesentlichen elliptischen Quer­ schnitt, wobei der Lichtleiter in einer Brennlinie und der Sensor auf der zweiten Brennlinie installiert ist. Es ist dem Fachmann unschwer möglich, die Form der Meßkammer der Geometrie des Lichtleiters und des Sensors opti­ mal anzupassen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umschließt der Sensor den Lichtleiter zylinderförmig.

Das Fluoreszenzsignal wird zeitversetzt zu der Lichtanregung gemessen. Da­ durch ist es möglich, die Messung des Fluoreszenzlichtes an den zeitlichen Ablauf des Fluoreszenz-/Phosphoreszenzvorganges anzupassen. Außerdem ist es möglich, bei Verwendung von mehreren Fluorophoren mit unterschiedlichem Ab­ klingverhalten zwischen diesen zu diskriminieren. (Die Technik der zeitauf­ gelösten Lichtmessung ist bekannt: z. B. E. Reichstein et al., Anal. Chem. 60 (1988) 1069-1074.) Zur zeitaufgelösten Detektion kommen entweder soge­ nannte Boxcar-Photomultipher-Kombinationen oder Diodenarrays in Frage oder es wird ein sogenanntes phasenauflösendes Detektorsystem (E. Gaviola, Z. Phys., 42 (1927) 853-61; L. McGown, Anal. Chem. 56 (1984) 1400-15) verwen­ det. Dadurch ist zusätzlich zu der Lichtwellenlänge ein weiterer Meßpara­ meter nutzbar. Es ist hiermit möglich, durch eine geeignete Fluorophoraus­ wahl in einem Meßlichtleiter viele Analyte in einem Meßvorgang zu bestim­ men. Ausgehend von den analytischen Daten können dann über eine Datenver­ arbeitungsanlage Diagnosen ausgegeben oder weiteres Vorgehen bestimmt wer­ den.

Die übrigen Konstruktionsmerkmale wie z. B. Monochromator, optische Filter, Sensoren und so weiter entsprechen denen gängiger Fluorimeter.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Fig. 1 bis 3 näher erläutert:

Fig. 1 zeigt schematisch einen Längsschnitt durch eine Meßanordnung.

Fig. 2 zeigt schematisch im Längsschnitt eine Spiegelkombination zur Er­ zeugung einer kegelmantelförmigen Lichtführung.

Fig. 3 zeigt schematisch den Aufbau einer Meßanordnung wie sie bevorzugt beansprucht wird.

In Fig. 1 trifft Licht 1 auf eine Sammellinse, dargestellt durch die Lin­ senebene 2 durch eine Blende 3, die mit einer ringförmigen Blendenöffnung versehen ist. Dadurch entsteht eine kegelmantelförmige Lichtführung. Der Kegelmantel ist dargestellt durch den äußeren Begrenzungsstrahl 4 und inneren Begrenzungsstrahl 5. Das Licht tritt an der Stirnfläche 6 des Meß­ lichtleiters 7 in diesen ein. Der weitere Lichtweg durch den Meßlichtleiter 7 durch mehrfache Totalreflexion ist schematisch angedeutet. An dem der Lichteinstrahlung gegenüberliegenden Ende des Meßlichtleiters 7 kann durch eine Verspiegelung 8 das Licht den Meßlichtleiter 7 in umgekehrter Richtung durchlaufen. Nach Austritt kann dann ein Teil des Lichtes von einem Hilfs­ sensor 9 erfaßt werden. An der Lumenoberfläche des Meßlichtleiters können fluoreszenzfähige Substanzen durch die Totalreflexion der Anregungsstrah­ lung Licht abstrahlen. Die emittierte Fluoreszenzstrahlung 10 kann durch den Meßsensor 11 detektiert werden. Durch eine optoelektronische Einrich­ tung 19 (Fig. 3) kann das emittierte Licht zeitabhängig zur Anregung gemes­ sen werden. R_{i min} und R_{i max} sind die minimalen und maximalen Einfallswin­ kel der Anregungsstrahlung, während R_c den kritischen Winkel für die Total­ reflexion im Inneren des Lichtleiters bedeutet.

In Fig. 2 ist dargestellt wie Licht 1 auf den Zentralspiegel 12 trifft und von dessen sphäroiden Spiegelflächen 13 über den ringförmigen Außenspiegel 14 zum Brennpunkt 15 geleitet wird. Beide Spiegel sind rotationssymmetrisch und haben eine gemeinsame Symmetrieachse.

In Fig. 3 ist eine Meßeinrichtung schematisch dargestellt, die das Laser­ licht 1 über einen Lichtleiter 17 auf die Eingangsoptik 12-15 in den Meß­ lichtleiter 7 bringt und über den Hilfssensor 9 Kontroll- oder Korrektur­ messungen durchführt. Fluoreszenzstrahlung 10 der quantitativ zu messenden Substanzen wird über einen Monochromator (oder Filtersystem) 18 auf den Photomultiplier 20 mit angeschlossenem Boxcar 19 geleitet.

Claims (4)

1. Reflexionsfluorimeter mit einem zylindrischen Meßlichtleiter (7), ge­ kennzeichnet durch einen kapillarförmigen Meßlichtleiter (7), eine kegel­ mantelförmige Einstrahlung (4, 5) gepulsten Lichtes (1) auf eine Stirn­ seite (6) des Meßlichtleiters (7) und eine Vorrichtung zur zeitaufgelösten Messung (19) des im wesentlichen radial aus dem Meßlichtleiter (7) austre­ tenden Emissionslichtes (10).

2. Reflexionsfluorimeter nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Vor­ richtung (18) zur wellenlängenaufgelösten Messung.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßlichtleiter (7) an dem der Lichteinstrahlung gegenüberliegenden Ende eine Verspiegelung (8) aufweist.

4. Reflexionsfluorimeter nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Hilfs­ sensor (9) zur Messung eines Teiles des reflektierten Lichtes und/oder des Emissionslichtes (10) zur Kompensation und Korrektur der Meßwerte.