DE3935066A1 - Treatment of prophylaxis of polio and herpes virus infections - comprises admin. of 3-(di:hydro-5-(hydroxy-1H- indolyl-2-oxo-3H-pyrrolidene)-di:hydro-2H-indole - Google Patents

Treatment of prophylaxis of polio and herpes virus infections - comprises admin. of 3-(di:hydro-5-(hydroxy-1H- indolyl-2-oxo-3H-pyrrolidene)-di:hydro-2H-indole

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Abstract

Violacein (3-(1,2-dihydro-5-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)-2-oxo-3H pyrrole-3-ylidene)-1,3-dihydro-2H -indol-2-one) can be used in the treatment of virus diseases. Violacein can be prepd by cultivating chromobacterium violaceum in an aerated fermenter with turbulent mixing in a batch operation lasting 5-7 days at 20-25 degC in a medium contg peptone glucose and common salt at a pH of 6-7. Native violacein (90% violacein, up to 10% desoxyviolacein) can be isolated from the suspension culture by microfiltration to 10% of the vol, spray-drying or freeze-drying the concentrate, extracting the dry prod with a solvent (pref THF or dioxan), concentrating the extract by evapn and pptg the violacein with water, removing impurities from the filtered off ppte using non-polar solvents pref CHCl3 and recrystn from an organic solvent (pref THF or dioxan). Crude violacein can be recovered from chromobacterium violaceum by sepg the bacterium from the medium, lyophilising the sediment, and extracting using ethanol. The crude violacein can then be extd twice with n-heptane and subjected to DC-chromatography using CHC13/propanone/pyridine (50:40:10). Violacein is recovered by eluting the zone with Rf 0.64 with CHC13/Me0H (80:20 or 50:50) and rechromatographing and eluting, while desoxyviolacein is recovered by eluting the zone with Rf 0.71 with CHC13 and rechrommatographing, and eluting. Both fractions can be taken up in pyridine, the pyridine evapd in vacuo over H2S04 and the residue dried in vacuo at 65 deg C. USE/ADVANTAGE - Violacein is the main component (90%) of the blue-black pigment in chromobacterium violaceum which can be used as an antibiotic. The purified violacein has good antiviral activity and is esp effective against polio and herpes viruses.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Violacein und seine Verwen­ dung zur Prophylaxe und Therapie von Viruserkrankungen.The invention relates to methods for isolating violacein and its use for the prophylaxis and treatment of viral diseases.

Violacein ist der Hauptbestandteil eines blauschwarzen Pigmentes in Chromobacte­ rium violaceum, ein aus Erde und Gewässer tropischer Gebiete erhältlicher Mikro­ organismus, wobei als Nebenbestandteil Desoxyviolacein auftritt. Violacein und Desoxyviolacein sind seit langem bekannt [vgl.: J. of Infect. Dis. 76, 1, 47 (1945); Black, M.E. and Shaphan, J., J.A.M.A. 110, 1270 (1938); R.D. De Moss: An­ tibiotics, Vol. 2, Ed: D. Gottlieb and P.D. Shaw, Seite 77, Springer 1967; N. Du­ ran et. al., An. Acad. bras. Cienc. 55 (3), 231 (1983)].Violacein is the main constituent of a blue-black pigment in Chromobacte rium violaceum, a mic available from the soil and waters of tropical regions organism, wherein as a minor constituent deoxyviolacein occurs. Violacein and Deoxyviolacein has long been known [cf .: J. of Infect. Dis. 76, 1, 47 (1945); Black, M.E. and Shaphan, J., J.A.M.A. 110, 1270 (1938); R.D. De Moss: An tibiotics, Vol. 2, Ed. D. Gottlieb and P.D. Shaw, page 77, Springer 1967; N. You ran et. al., An. Acad. Bras. Cienc. 55 (3), 231 (1983)].

Chemisch ist Violacein 3-[1,2-dihydro-5-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)-2-oxo-3-H-pyr­ rol-3-yliden]-1,3-dihydro-2H-indol-2-on mit der Summenformel C₂₀H₁₃N₃O₃ (Molekulargewicht 343,33). Violacein ist in Wasser nahezu unlöslich, jedoch lös­ lich in Aceton, Ethanol und Dioxan.Chemically, violacein is 3- [1,2-dihydro-5- (5-hydroxy-1H-indol-3-yl) -2-oxo-3-H-pyr Rol-3-ylidene] -1,3-dihydro-2H-indol-2-one with the empirical formula C₂₀H₁₃N₃O₃ (Molecular weight 343.33). Violacein is almost insoluble in water but soluble in acetone, ethanol and dioxane.

Die Strukturformel für Violacein wurde durch NMR spektrometrische Untersuchungen wie folgt gefunden:The structural formula for violacein was determined by NMR spectrometric studies found as follows:

Violacein kann weiterhin durch sein UV/VIS-Absorptionsspektrum in Methanol cha­ rakterisiert werden:Violacein can continue to cha by its UV / VIS absorption spectrum in methanol be characterized:

λmax = 570 nm; λmin = 426 nm; λmax = 366 nm.λ max = 570 nm; λ min = 426 nm; λ max = 366 nm.

Zum Vergleich das Absorptionsspektrum des Nebenbestandteils Desoxyviolacein:For comparison, the absorption spectrum of the minor constituent deoxyviolacein:

λmax = 560 nm; λmin = 434 nm; λmax = 370 nm.λ max = 560 nm; λ min = 434 nm; λ max = 370 nm.

Es ist auch bekannt, daß Roh-Violacein eine bakteriostatische Wirkung be­ sitzt (vgl. Lichtstein et. al., J. of Infect. Dis. 76, No. 1, 47 (1945); De Moss in Antibiotics, Vol. 2, Seite 77 Ed: D. Gottlieb and P.D. Shaw, Springer 1967).It is also known that raw violacein has a bacteriostatic effect (see Lichtstein et al., J. of Infect., Dis., 76, No. 1, 47 (1945); De Moss in Antibiotics, Vol. 2, page 77 Ed: D. Gottlieb and P.D. Shaw, Springer 1967).

Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß die isolierte Pigment-Rohfraktion in mehrere Einzelkomponenten aufgetrennt werden kann, die strukturverwandte Verbin­ dungen darstellen, wobei die jeweiligen Einzelverbindungen jedoch ein deutlich unterschiedliches Löslichkeitsverhalten sowie unterschiedliche antibakterielle Wirkungen besitzen. Siehe zum Beispiel N. Duran et. al, An. Acad. brasil. Cienc., 55 (3), 231 (1983).Recent studies have shown that the isolated crude pigment fraction in several individual components can be separated, the structurally related verbin However, the respective individual compounds a clear different solubility behavior as well as different antibacterial Own effects. See, for example, N. Duran et. al, An. Acad. brasil. Cienc., 55 (3), 231 (1983).

Eine antivirale Wirksamkeit ist bisher jedoch weder für das Roh-Violacein noch für eine der Einzelkomponenten bekannt.However, antiviral activity is not yet available for raw violacein known for one of the individual components.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Violacein aus Chromobacterium viola­ ceum eine gute antivirale Wirkung gegen DNS- und RNS-Viren aufweist.Surprisingly, it has now been found that Violacein from Chromobacterium viola ceum has a good antiviral activity against DNA and RNA viruses.

1. Herstellung des Rohprodukts1. Preparation of the crude product

Roh-Violacein kann aus Kulturen von Chromobacterium violaceum, Janthinobacterium lividum und Chromobacterium livium isoliert werden.Raw Violacein may be obtained from cultures of Chromobacterium violaceum, Janthinobacterium lividum and Chromobacterium livium.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterien kann man auf festen oder flüssigen Nährmedien kultivieren, zum Beispiel nach dem von P. H. A. Sneath beschriebenen Verfahren [P. H. A. Sneath, J. Gen. Microbiol. 15, 70-98 (1956)]. Vorzugsweise werden die Bakterien in flüssigen Nährmedien gezüchtet, da sie aus dem Nährmedium durch Zentrifugation leicht abgetrennt werden können. Zur Züchtung auf festen Nährböden ist ein Medium der folgenden Zusammensetzung geeignet:The bacteria used as starting material can be solid or liquid Culture media, for example according to that described by P.H. A. Sneath Method [P. H. A. Sneath, J. Gen. Microbiol. 15, 70-98 (1956)]. Preferably The bacteria are bred in liquid nutrient media as they are from the nutrient medium can be easily separated by centrifugation. For breeding on solid Nutrient media is a medium of the following composition:

Fleischextrakt:|3,0 gMeat Extract: | 3.0 g Pepton aus Fleisch:Peptone from meat: 5,0 g5.0 g Agar:agar: 18,0 g18.0 g Aqua dest.:Aqua dest .: 1000 ml1000 ml pH-Wert 7,5pH 7.5

Der nach Bebrütung gewachsene Bakterienrasen wird abgelöst und gefriergetrocknet. Die Extraktion des Roh-Violaceins erfolgt mit Ethanol im Soxhlet. Das Ethanol wird im Vakuum abdestilliert.The bacterial lawn grown after incubation is detached and freeze-dried. Extraction of the raw violacein is done with ethanol in Soxhlet. The ethanol is distilled off in vacuo.

Zur Züchtung in flüssigen Kulturen sind verschiedene Nährmedien geeignet. Als op­ timal für das Bakterienwachstum und die Pigmentausbeute hat sich folgendes Medium erwiesen:For breeding in liquid cultures different nutrient media are suitable. As op Timal for bacterial growth and pigment yield, the following medium has proved:

Casein-Pepton:|7,8 g/lCasein peptone: | 7.8 g / l Glucose:Glucose: 1,0 g/l1.0 g / l Kochsalz:Saline: 5,6 g/l5.6 g / l pH-Wert 6,3pH 6.3

Dieses Medium ist für Fermenterkulturen sowie auch für Stand- oder Schüttelkul­ turen geeignet.This medium is for fermenter cultures as well as for stand or Schüttelkul suitable.

Bei der Kultur im Fermenter kann sowohl der batch- wie auch der semikontinuierli­ che Betrieb durchgeführt werden.In the culture in the fermenter, both the batch and the semikontinuierli operation.

Nach Abernten der Kulturen wird die flüssige Phase abgetrennt und der Farbstoff extraktiv aus dem Sediment isoliert.After harvesting the cultures, the liquid phase is separated and the dye extractively isolated from the sediment.

2. Reindarstellung von Violacein2. Purification of Violacein

Zur Isolierung von Violacein extrahiert man das Roh-Violacein zweimal mit n-Hep­ tan und filtriert ab. Den Rückstand löst man in einem Gemisch aus Chloro­ form/Aceton/Pyridin 50:40:10 und trennt das Farbstoffgemisch mittels Kieselgel- Dünnschichtchromatographie auf.To isolate violacein, the crude violacein is extracted twice with n-Hep tan and filtered off. The residue is dissolved in a mixture of chloro form / acetone / pyridine 50:40:10 and separates the dye mixture by means of silica gel Thin layer chromatography on.

Im fertigen Chromatogramm lassen sich vier Einzelfraktionen mit folgenden Charak­ teristika identifizieren:In the final chromatogram can be four individual fractions with the following charac Identify teristika:

  • a) eine blaue Zone mit Rf 0,58a) a blue zone with R f 0.58
  • b) eine schwach blau gefärbte Zone mit Rf 0,2 b) a pale blue colored zone with R f 0.2
  • c) eine tief preußisch blaue bis violette Zone mit Rf 0,64c) a deep Prussian blue to violet zone with R f 0.64
  • d) eine schwach violette Zone mit Rf 0,71.d) a pale violet zone with R f 0.71.

Die Zone (c), die auf der Platte tief preußischblau gefärbt erscheint, entspricht Violacein und die Zone (d), die auf der feuchten DC-Platte rein violett gefärbt erscheint, entspricht Desoxyviolavein.The zone (c), which appears deep Prussian blue on the plate, corresponds Violacein and the zone (d), which stained pure purple on the damp DC plate appears, corresponds to deoxyviolavein.

Zur Weiterreinigung löst man das Kieselgel im Bereich der Zonen mit Violacein und/oder Desoxyviolacein ab und eluiert den Farbstoff mit Chloroform/Methanol 50 : 50 für Violacein und Chloroform oder Chloroform/Methanol 80 : 20 für Desoxyvio­ lacein.For further purification, dissolve the silica gel in the zone of violacein and / or deoxyviolacein and elutes the dye with chloroform / methanol 50:50 for violacein and chloroform or chloroform / methanol 80:20 for deoxyvio lace in.

Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum reinigt man den Rückstand wiederum durch DC-Chromatographie, und zwar mit dem Lösungsmittelgemisch Chloro­ form/Aceton/Pyridin 50 : 50 : 10 für Violacein und Chloroform/Aceton/Pyridin 60:30:10 für Desoxyviolacein.After evaporation of the solvent in vacuo, the residue is purified again by TLC chromatography, with the solvent mixture chloro form / acetone / pyridine 50: 50: 10 for violacein and chloroform / acetone / pyridine 60:30:10 for deoxyviolacein.

Man löst das Kieselgel im Bereich der entsprechenden Zonen wiederum ab, eluiert den Farbstoff mit Chloroform/Methanol 50 : 50 für Violacein und Chloroform/Methanol 80:20 für Desoxyviolacein und entfernt das Lösungsmittel durch Abdampfen im Va­ kuum bei 35°C Badtemperatur. Den Rückstand nimmt man in wenig Pyridin auf. An­ schließend entfernt man das Pyridin im Vakuumexsikkator über konzentrierter Schwefelsäure. Den schwarz-violetten Rückstand trocknet man bei 65°C im Vakuum.The silica gel is again dissolved in the area of the corresponding zones, eluted the dye with chloroform / methanol 50:50 for violacein and chloroform / methanol 80:20 for deoxyviolacein and the solvent is removed by evaporation in vacuo vacuum at 35 ° C bath temperature. The residue is taken up in a little pyridine. to closing the pyridine is removed in a vacuum desiccator over concentrated Sulfuric acid. The black-violet residue is dried at 65 ° C in a vacuum.

3. Antivirale Aktivität3. Antiviral activity

Die Prüfung der virustatischen Wirkung erfolgt mit virusinfizierten tierischen Zellkulturen in einem Farbtest wie von Finter (J. Gen. Virol. 5, 419 (1969)) be­ schrieben. Der Test beruht darauf, daß die durch die Viren zerstörten Zellen nicht mehr gefärbt werden können. Je mehr Zellen durch die virustatische Wirkung einer Substanz geschützt werden, um so mehr Farbstoff wird gebunden. Der Farb­ stoff läßt sich aus den gefärbten Zellen extrahieren, und seine Menge kann in ei­ nem Fotometer z. B. bei Verwendung von Kristallviolett bei 546 nm gemessen werden. Damit erlaubt der Test meßbare und reproduzierbare Angaben sowohl über die viru­ statische, wie auch durch Parallelversuche mit Zellkulturen ohne Viren über die zytotoxische Wirkung von Substanzen.The test of the virustatic effect is carried out with virus-infected animal Cell cultures in a color test as described by Finter (J.G. Virol. 5, 419 (1969)) wrote. The test is based on the fact that the cells destroyed by the viruses can not be colored anymore. The more cells by the virustatic effect a substance will be protected so the more dye is bound. The color Substance can be extracted from the stained cells, and its amount can in egg nem photometer z. B. when using crystal violet at 546 nm. Thus, the test allows measurable and reproducible information both on the viru static, as well as by parallel experiments with cell cultures without viruses on the cytotoxic effect of substances.

5 mg Violacein wurden in 100 ml Ethylalkohol gelöst. Unter Verwendung des Mediums für die Zellkultur wurde eine Konzentration von 0,25 µg/ml Violacein eingestellt. Diese Lösung wird in Zweierstufen weiterverdünnt und auf 24 Stunden alte Hela- Zellen gegeben, nachdem diese vorher 45 Minuten zur Infektion mit einer Sus­ pension von Herpes simplex-Viren überschichtet worden waren. Zur Prüfung der Zytotoxität werden Parallelansätze ohne Viruszugabe analog mit den verschie­ denen Verdünnungsstufen der Prüfsubstanz überschichtet. Die Versuchsansätze mit Virus und Violacein bzw. nur Violacein werden mit 72 Stunden bei 37°C bebrütet. An­ schließend werden die Zellen fixiert und für 15 Minuten gefärbt. Nach Spülen mit Wasser wird der an die Zellen gebundene Farbstoff mit Ethanol extrahiert und in einem Fotometer die Extinktion bei 546 nm (Kristallviolett) gemessen. Die ent­ sprechenden Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben. Die Extinktion mit 50%- Zellschutz (ZK+VK)/2 liegt bei 0,355. Eine Konzentration von 0,198 µg/ml Viola­ cein bewirkt einen Zellschutz von 50%.5 mg of violacein were dissolved in 100 ml of ethyl alcohol. Using the medium for cell culture, a concentration of 0.25 μg / ml violacein was adjusted. This solution is further diluted in two stages and relied on 24-hour-old helicopters. Cells are given these after 45 minutes to infection with a Sus  pension of herpes simplex viruses had been overlaid. To check the Cytotoxicity are parallel approaches without virus addition analogous with the various covered by dilution levels of the test substance. The experimental approaches with Virus and Violacein or only Violacein are incubated at 37 ° C for 72 hours. to closing the cells are fixed and stained for 15 minutes. After rinsing with Water, the dye bound to the cells is extracted with ethanol and in measured the absorbance at 546 nm (crystal violet) on a photometer. The ent corresponding results are given in Table I. Absorbance at 50% Cell protection (ZK + VK) / 2 is 0.355. A concentration of 0.198 μg / ml Viola cein causes a cell protection of 50%.

Tabelle I: Bestimmung der virustatischen Wirkung gegen Herpes simplex-Viren in Hela-Zellkulturen TABLE I Determination of the antiviral activity against herpes simplex viruses in Hela cell cultures

Da das Violacein keine wesentliche zytotoxische Eigenschaft besitzt, kann seine antivirale Schutzwirkung in Prozent auch nach folgender Formel berechnet werden:Since the violacein has no significant cytotoxic property, its Antiviral protective effect in percent can also be calculated according to the following formula:

E₃=Extinktion der Zellkontrolle, E₂=Extinktion der Viruskontrolle, E₃=Ex­ tinktion der Versuchsansätze mit Virus und Violacein.E₃ = extinction of the cell control, E₂ = extinction of the virus control, E₃ = Ex of the experimental preparations with virus and violacein.

Die Ergebnisse dieser Auswertung sind in Tabelle II angegeben. The results of this evaluation are given in Table II.  

Tabelle II: Zellschutz (%) des Violaceins in Hela-Zellkulturen gegen Herpes simplex-Viren Table II: Cell protection (%) of violacein in Hela cell cultures against herpes simplex viruses

Mit der gleichen Versuchsanordnung (s. o.) kann die Wirkung des Violaceins gegen Polio-Viren bestimmt werden. Die Untersuchung für das Poliovirus Typ I ergab die in Tabelle III angegebenen Werte für den Zellschutz bei Hela-Zellen.With the same experimental arrangement (see above), the effect of violacein against Polio viruses are determined. The investigation for poliovirus type I revealed the in Table III values for cell protection in Hela cells.

Tabelle III: Zellschutz (%) des Violaceins in Hela-Zellkulturen gegen Polio-Viren Table III: Cell protection (%) of violacein in Hela cell cultures against polio viruses

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Violacein über ausgezeichnete virustati­ sche Eigenschaften verfügt, die seine Verwendung in der Therapie und Prophylaxe, insbesondere für Herpes- und Poliovirusinfektionen, als vorteilhaft erkennen lassen.The above results show that violacein has excellent virustati properties that are of use in therapy and prophylaxis, especially for herpes and poliovirus infections, as beneficial to let.

Claims (11)

1. Verwendung von Violacein zur Behandlung von Viruserkrankungen.1. Use of violacein for the treatment of viral diseases. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Herpes Virus ist.2. Use according to claim 1, characterized in that the virus Herpes virus is. 3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Poliovirus ist.3. Use according to claim 1, characterized in that the virus Poliovirus is. 4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Violacein aus der Suspensionskultur eines zur Bildung dieses Pigmentes befähigten Bakteriums, vorzugsweise Chromobakterium violaceum, iso­ liert wird.4. Use according to one of the preceding claims, characterized records that violacein from the suspension culture of a to form this Pigmentes capable of bacterium, preferably Chromobacterium violaceum, iso is liert. 5. Verwendung nach Anspruch 4, bei dem man Chromobakterium violaceum in einem be­ lüfteten Fermenter unter turbulenter Durchmischung kultiviert, dadurch gekennzeichnet, daß
  • (i) die Fermentation satzweise mit einer Kulturdauer von 5-7 Tagen erfolgt,
  • (ii) die Temperatur in der Kultur zwischen 20-25° Celsius beträgt,
  • (iii) als Medium eine Nährlösung aus Pepton, Glucose und Kochsalz verwendet wird,
  • (iv) der pH-Wert der Kulturbrühe zwischen 6 und 7 gehalten wird.
5. Use according to claim 4, wherein the cultivated Chromobakterium violaceum in a ventilated fermenter be with turbulent mixing, characterized in that
  • (i) the fermentation is carried out batchwise with a culture time of 5-7 days,
  • (ii) the temperature in the culture is between 20-25 ° Celsius,
  • (iii) the medium used is a nutrient solution of peptone, glucose and saline,
  • (iv) keeping the pH of the culture broth between 6 and 7.
6. Verwendung nach Anspruch 4, bei dem man Chromobakterium violaceum in einem be­ lüfteten Fermenter unter turbulenter Durchmischung kultiviert, dadurch gekennzeichnet, daß
  • (i) die Fermentation semikontinuierlich mit einem Erntecyclus von 3-6 Tagen erfolgt,
  • (ii) die Temperatur in der Kultur zwischen 20-25° Celsius beträgt,
  • (iii) als Medium eine Nährlösung aus Pepton, Glucose und Kochsalz verwendet wird,
  • (iv) der pH-Wert der Kulturbrühe zwischen 6 und 7 gehalten wird.
6. Use according to claim 4, in which one cultivates Chromobakterium violaceum in a ventilated be fermenter under turbulent mixing, characterized in that
  • (i) the fermentation is semicontinuous with a harvest cycle of 3-6 days,
  • (ii) the temperature in the culture is between 20-25 ° Celsius,
  • (iii) the medium used is a nutrient solution of peptone, glucose and saline,
  • (iv) keeping the pH of the culture broth between 6 and 7.
7. Verfahren zur Isolierung des nativen Violaceins (Gemisch von Violacein mit bis zu 10% Desoxyviolacein) aus Suspensionskulturen nach Anspruch 5 oder 6, da­ durch gekennzeichnet, daß man
  • (i) die Suspension durch Mikrofiltration auf weniger als 10% des Ausgangsvolumens einengt,
  • (ii) die angedickte Suspension trocknet, vorzugsweise durch Sprüh­ oder Gefriertrocknung,
  • (iii) das Trockenprodukt mit einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise THF oder Sioxan, extrahiert,
  • (iv) den Extrakt nach 7 (iii) mittels Destillation oder Vakuumver­ dampfung aufkonzentriert,
  • (v) das Konzentrat nach 7 (iv) zur Ausfällung des Violaceins mit Wasser versetzt,
  • (vi) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
  • (vii) Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages mit geeigneten unpolaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform, abtrennt,
  • (viii) eine Endreinigung durch Rekristallisation aus geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise THF oder Dioxan, durchführt.
7. A process for isolating the native Violaceins (mixture of Violacein with up to 10% deoxyviolacein) from suspension cultures according to claim 5 or 6, characterized in that one
  • (i) the suspension is reduced to less than 10% of the initial volume by microfiltration,
  • (ii) the thickened suspension is dried, preferably by spraying or freeze-drying,
  • (iii) extracting the dry product with a suitable solvent, preferably THF or sioxane,
  • (iv) concentrating the extract according to 7 (iii) by means of distillation or vacuum evaporation,
  • (v) the concentrate of 7 (iv) is added with water to precipitate the violacein,
  • (vi) filtering off the precipitate formed,
  • (vii) separating impurities by treatment of the precipitate with suitable non-polar organic solvents, preferably chloroform,
  • (viii) performs a final purification by recrystallization from suitable organic solvents, preferably THF or dioxane.
8. Verfahren zur Isolierung des nativen Violaceins (Gemisch von Violacein mit bis zu 10% Desoxyviolacein) aus Suspensionskulturen nach Anspruch 5 oder 6, da­ durch gekennkeichnet, daß man
  • (i) die Bakterien und das Pigment aus dem Zellmedium durch Zentrifugation abtrennt,
  • (ii) das Sediment vorzugsweise durch Sprüh- oder Gefriertrocknung trocknet,
  • (iii) das Trockenprodukt mit einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise THF oder Dioxan, extrahiert,
  • (iv) den Extrakt nach 8 (iii) mittels Destillation oder Vakuumver­ dampfung aufkonzentriert.
  • (v) das Konzentrat nach 8 (iv) zur Ausfällung des Violaceins mit Wasser versetzt,
  • (vi) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
  • (vii) Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages mit geeigneten unpolaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform, abtrennt,
  • (viii) eine Endreinigung durch Rekristallisation aus geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise THF oder Dioxan, durchführt.
8. A method for isolating the native Violaceins (mixture of Violacein with up to 10% deoxyviolacein) from suspension cultures according to claim 5 or 6, as gekennkeichnet that one
  • (i) separating the bacteria and the pigment from the cell medium by centrifugation,
  • (ii) drying the sediment preferably by spray drying or freeze drying,
  • (iii) extracting the dry product with a suitable solvent, preferably THF or dioxane,
  • (iv) concentrating the extract of 8 (iii) by distillation or vacuum evaporation.
  • (v) the concentrate of 8 (iv) is added with water to precipitate the violacein,
  • (vi) filtering off the precipitate formed,
  • (vii) separating impurities by treatment of the precipitate with suitable non-polar organic solvents, preferably chloroform,
  • (viii) performs a final purification by recrystallization from suitable organic solvents, preferably THF or dioxane.
9. Verfahren zur Isolierung des nativen Violaceins (Gemisch von Violacein mit bis zu 10% Desoxyviolacein) aus Suspensionskulturen nach Anspruch 5 und 6, da­ durch gekennzeichnet, daß man
  • (i) die Bakterien und das Pigment gem. 7 (i) bzw. 8 (i) anreichert,
  • (ii) die angedickte Suspension mit einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise THF oder Dioxan, extrahiert,
  • (iii) die festen, unlöslichen Bestandteile mittels Filtration oder Zentrifugation entfernt,
  • (iv) den Extrakt nach 9 (iii) mittels Destillation oder Vakuumver­ dampfung aufkonzentriert,
  • (v) das Konzentrat nach 9 (iv) zur Ausfällung des Violaceins mit Wasser versetzt,
  • (vi) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
  • (vii) Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages mit geeigneten unpolaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform, abtrennt,
  • (viii) eine Endreinigung durch Rekristallisation aus geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise THF oder Dioxan, durchführt.
9. A process for isolating the native Violaceins (mixture of Violacein with up to 10% deoxyviolacein) from suspension cultures according to claim 5 and 6, characterized in that one
  • (i) the bacteria and the pigment acc. Enriches 7 (i) or 8 (i),
  • (ii) extracting the thickened suspension with a suitable solvent, preferably THF or dioxane,
  • (iii) removing the solid, insoluble constituents by filtration or centrifugation,
  • (iv) concentrating the extract of 9 (iii) by distillation or vacuum evaporation,
  • (v) the concentrate of 9 (iv) is added with water to precipitate the violacein,
  • (vi) filtering off the precipitate formed,
  • (vii) separating impurities by treatment of the precipitate with suitable non-polar organic solvents, preferably chloroform,
  • (viii) performs a final purification by recrystallization from suitable organic solvents, preferably THF or dioxane.
10. Verfahren zur Isolierung von Violacein aus Chromobacterium violaceum, bei dem man die Bakterien durch Zentrifugation vom Medium abtrennt, das Sediment lyo­ philisiert, daraus durch Ethanol-Extraktion Roh-Violacein isoliert, da­ durch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Violacein
  • (i) das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan extrahiert,
  • (ii) den Rückstand einer DC-Chromotographie mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 unterwirft,
  • (iii) die Zone mit einem Rf von 0,64 ablöst, den Farbstoff mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol 80 : 20 oder 50 : 50 eluiert und die Substanz einer nochmaligen DC-Chromotographie wie in Schritt (ii) unterwirft, die in diesem Chromatogramm enthaltene Zone mit dem Rf 0,64 wiederum ablöst und wie oben beschrieben isoliert, anschließend
  • (iv) das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in Pyridin aufnimmt und das Pyridin im Vakuum über Schwefelsäure abdampft und den Rückstand bei 65°C im Vakuum trocknet.
10. A process for the isolation of Violacein from Chromobacterium violaceum, in which the bacteria are separated by centrifugation from the medium, the lyo philionized sediment, isolated therefrom by ethanol extraction Roh-Violacein, characterized in that one for the isolation of Violacein
  • (i) extracting the crude violacein twice with n-heptane,
  • (ii) subjecting the residue to a TLC chromotography with the solvent mixture chloroform / acetone / pyridine 50: 40: 10,
  • (iii) stripping the zone with an R f of 0.64, eluting the dye with a mixture of chloroform / methanol 80:20 or 50:50, and subjecting the substance to a second TLC plot as in step (ii) described in U.S. Pat this chromatogram contained zone with the R f 0.64 again separates and isolated as described above, then
  • (iv) the solvent is removed, the residue is taken up in pyridine and the pyridine is evaporated off in vacuo over sulfuric acid and the residue is dried at 65 ° C. in vacuo.
11. Verfahren zur Isolierung von Desoxyviolacein aus Chromobacterium violaceum, bei dem man die Bakterien durch Zentrifugation vom Medium abtrennt, das Sedi­ ment lyophilisiert, daraus durch Ethanol-Extraktion Roh-Violacein isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Desoxyviolacein
  • (i) das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan extrahiert,
  • (ii) den Rückstand einer DC-Chromotographie mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 unterwirft,
  • (iii) die Zone mit einem Rf von 0,71 ablöst, den Farbstoff mit Chloroform eluiert und die Substanz einer nochmaligen DC-Chromotographie wie in Schritt (ii) unterwirft, die in diesem Chromatogramm enthaltene Zone mit dem Rf 0,71 wiederum ablöst und wie oben beschrieben isoliert, anschließend
  • (iv) das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in Pyridin aufnimmt und das Pyridin im Vakuum über Schwefelsäure abdampft und den Rückstand bei 65°C im Vakuum trocknet.
11. A process for the isolation of deoxyviolacein from Chromobacterium violaceum, in which the bacteria are separated from the medium by centrifugation, lyophilized the sediment, isolated therefrom by ethanol extraction Roh-Violacein, characterized in that one for the isolation of deoxyviolacein
  • (i) extracting the crude violacein twice with n-heptane,
  • (ii) subjecting the residue to a TLC chromotography with the solvent mixture chloroform / acetone / pyridine 50: 40: 10,
  • (iii) dissolving the zone with an R f of 0.71, eluting the dye with chloroform, and subjecting the substance to a second TLC plot as in step (ii), the R f 0.71 zone contained in this chromatogram again detached and isolated as described above, then
  • (iv) the solvent is removed, the residue is taken up in pyridine and the pyridine is evaporated off in vacuo over sulfuric acid and the residue is dried at 65 ° C. in vacuo.
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