DE3934625A1 - Automatisiertes "in vivo"-mikrokerntest-verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung desselben - Google Patents
Automatisiertes "in vivo"-mikrokerntest-verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung desselbenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein automatisiertes "in vivo"-Mikrokern
testverfahren bei Säugern, insbesondere beim Menschen sowie bei
Ratten und Mäusen, sowie eine entsprechende Präparationsvorrich
tung zur Durchführung desselben. Der Mikrokerntest ist ein "in
vivo"-Test zur Detektion von agenz-induzierten Chromosomenschäden
und Schäden des Spindelapparates. Hierfür werden erythrozyten
artige Zellen des Knochenmarks oder des peripheren Blutes von
Säugern auf mikrokernhaltige Zellen untersucht. Am häufigsten wird
der Mikrokerntest im Knochenmark der Maus nach der modifizierten
Methode von W. Schmid angewendet, vgl. Mutation Res., 31 (1975),
9-15. Dabei untersucht man mit Hilfe eines Mikroskops die von Hand
hergestellten Knochenmark-Ausstriche auf mikrokernhaltige poly
chromatophile Erythrozyten. Dieser Standardtest spielt eine große
Rolle in der industriellen Toxikologie, um das genotoxische
Potential von neuen chemischen Verbindungen, z.B. Pharmaka, abzu
schätzen. Der Mikrokerntest im Maus-Knochenmark ist heute als
wichtiger Genotoxizitätstest weltweit akzeptiert, und zwar sowohl
seitens der Fachwelt als auch von seiten der Registrierungsbehör
den.
Da die Knochenmark-Ausstriche alle Zelltypen der Hämatopoese ent
halten, ist für die Mikrokernanalyse speziell ausgebildetes Fach
personal erforderlich. Hierin zeigt sich bereits die Problematik
dieses Standardtests. Diese anspruchsvollen Untersuchungen sind
zudem sehr zeitaufwendig und ermüdend, weil mikrokernhaltige Zel
len ein sehr seltenes Ereignis sind. Dies bedeutet, daß nur 1 bis
2 mikrokernhaltige Zellen pro 1000 polychromatophile Erythrozyten
bei Testkontrollen auftreten. Um statistisch eine Verdopplung ge
genüber einem Kontrollwert nachweisen zu können, müßten minde
stens 4000 Zellen pro Spezies untersucht werden. Dies ist aber in
der Praxis aus ökonomischen Gründen serienmäßig nicht durchführ
bar. Deshalb ist man dazu übergegangen - und zwar auf Kosten der
Sensitivität dieses Tests -, sich auf die Analyse einer Stichpro
bengröße von etwa 1000 Zellen pro Spezies zu beschränken. Dieses
Vorgehen ist in jüngster Zeit von der internationalen Fachwelt
mehrfach scharf kritisiert worden, wobei eine drastische Erhöhung
der zu analysierenden Zellzahl gefordert wurde, um damit eine
höhere Sensitivität des Tests zu erreichen. Diese Forderung ist
jedoch aus ökonomischen Gründen nur dann realisierbar, wenn die
Mikrokernanalyse automatisiert werden kann.
Obwohl verschiedentlich intensive Anstrengungen unternommen wur
den, konnte bis dato keine zuverlässige vollautomatische Mikro
kernanalyse für klassische Knochenmark-Ausstriche entwickelt wer
den, die auch den Ansprüchen der industriellen Toxikologie genügen
würde. Die Hauptschwierigkeiten bei der Automatisierung liegen
einerseits in der schwierigen Differenzierung der vielen hämato
poetischen Zellvorstadien und andererseits im Vorkommen von
artefakt-produzierendem Zelldebris im Gesamtknochenmark. Ein wei
terer Nachteil der "klassischen" Methode ist ihre beschränkte An
wendungsmöglichkeit. Es können nämlich nur diejenigen Säuger-
Spezies verwendet werden, deren Knochenmark keine artefakt-
produzierenden leukozytären Granula aufweisen. Aus diesem Grunde
läßt sich das Standardverfahren beispielsweise für Ratten nicht
anwenden. Dies ist ein großer Nachteil, weil gerade die Ratte das
Hauptmodell der industriellen Toxikologie schlechthin darstellt.
Auch hieraus ergibt sich die große Forderung der Fachwelt, daß ein
"routinefähiger" Mikrokerntest für Ratten-Knochenmark eingeführt
werden kann. Ein solcher Test könnte sogar parallel zu den anderen
Toxizitätsprüfungen an denselben Tieren durchgeführt werden, was
auch unter dem Aspekt des Tierschutzes von eminenter Bedeutung
wäre.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikro
kerntest-Verfahren zu entwickeln, das für alle relevanten Spezies
kompatibel ist und das die Nachteile der bisher bekannten rein
manuellen Verfahren nicht mehr aufweist.
Diese Aufgabe wird bei einem Mikrokerntest-Verfahren der im Ober
begriff des Hauptanspruchs angegebenen Art durch die im Kenn
zeichen desselben stehenden Merkmale gelöst. Weitere Ausgestaltun
gen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie Präparationsvorrich
tungen zur Durchführung dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2
bis 23 beschrieben.
Die wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung bestehen
darin, daß eine Erhöhung der Sensitivität des klassischen Mikro
kerntests im Maus-Knochenmark erzielt werden konnte und daß vor
allem die Adaptierbarkeit des neuen Verfahrens für Untersuchungen
des Knochenmarks auch der Ratte gegeben ist.
In der Fig. 1 ist in rein schematischer Darstellung im Querschnitt
eine erste erfindungsgemäße Vorrichtung für die Separation von zu
untersuchenden Zellen aus dem Knochenmark bzw. dem peripheren Blut
von Säugern (Mensch; Maus, Ratte, etc.) dargestellt.
An einem Stativ 12 ist eine vertikale Säule aus Glas oder
Kunststoff befestigbar, beispielsweise eine Einweg-Spritze 7 mit
nach unten weisender, zentral angesetzter Kanüle 9. Die Füllung
der Spritze 7 besteht aus einem Zellulose-Gemisch 2 mit definier
ter Säulenhöhe. Oberhalb dieses Gemisches befindet sich ein Frei
raum 1 für die Aufnahme der zu separierenden Probensuspension 13,
die eine Trägerflüssigkeit, beispielsweise eine isotonische Lösung
oder ein fötales Kälberserum, enthält. Ein Deckel 11 schließt den
Freiraum 1 nach oben hin ab. Unterhalb des Zellulose-Gemisches 2
befindet sich mindestens eine Schicht von Filterpapier 8. Die
Spritze 7 weist im Bereich ihrer Kanüle 9 ein Filterreservoir 4 a
auf, in dem ein oder mehrere Filter 4 der Maschenweite zwischen
5 und 20 µm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 µm, vorgesehen sind.
Das Filterreservoir 4 a ist vorzugsweise als Einzelbauteil ausge
bildet und kann dementsprechend auf die Kanüle 9 der Spritze 7
paßgenau aufgeschoben werden. Es ist aber auch möglich, die
Spritze 7 zusammen mit dem Filterreservoir einstückig auszubilden.
Schließlich ist ein Auffangbehälter 5 für das Eluat 6 vorgesehen,
das aus einer Suspension reifer und unreifer Erythrozyten besteht.
Der Auffangbehälter 5 kann so dimensioniert sein, daß er mit der
Einweg-Spritze 7 - beispielsweise durch Aufschieben - lösbar
verbunden werden kann. Er kann Luftdurchtrittsöffnungen 10 aufwei
sen. Dadurch wird sichergestellt, daß bei angesetztem Behälter 5
nach dem Einfüllen einer Probensuspension 13 in den Freiraum 1 ein
langsames Durchsickern dieser Substanz durch die einzelnen Filter
regionen 2 - 8 - 4 mit normalem Druckausgleich möglich ist.
Der Verfahrensablauf ist folgender: Nach Einfüllen der Proben
suspension 13 - im vorliegenden Fall sei Ratten-Knochenmark einge
geben - dringt die Probe in das Zellulose-Gemisch 2 ein. Das
Zellulose-Gemisch besteht aus mikrokristalliner Zellulose und
α-Zellulose im Gewichtsverhältnis von vorzugsweise 1:1. Für be
stimmte Anwendungsfälle kann sich dieses Gewichtsverhältnis auch
zwischen 1,5:1 und 1:1,5 bewegen. Zwar wurde von Beutler et al
bereits eine ähnliche Methode entwickelt; diese beschränkte sich
aber lediglich auf peripheres Blut und wurde zudem nie im Zusam
menhang mit einem Mikrokerntest verwendet, vgl. J. Lab. Clin. Med.
88 (2), 1976, 328-333.
Als mikrokristalline Zellulose kann beispielsweise "Sigmacell type
50" der Firma SIGMA, St. Louis, USA, eingesetzt werden; als
α-Zellulose in Faserform ist ebenfalls ein Produkt der genannten
Firma verwendbar. Beide Zellulose-Modifikationen werden vor dem
Einlegen in die vertikale Säule mehrere Minuten lang kräftig durch
Schütteln gemischt. Die "Säulen-Höhe" des Zellulose-Gemisches 2
und ihre Packungsdichte in der Spritze 7 ist für den Erfolg des
Präparationsverfahrens von großer Bedeutung.
Das im Behälter 5 aufgefangene Eluat 6 enthält ausschließlich die
zwei gewünschten Zelltypen, nämlich die unreifen (polychromato
philen) und die reifen Erythrozyten. Es wurde also eine totale
Elimination der kernhaltigen hämatopoetischen Zellen erreicht.
Die Zellen werden - im Falle des Knochenmarks von Ratten - nunmehr
mittels eines Percoll-Schrittgradientenverfahrens gereinigt. Die
ser Verfahrensschritt ist für den Mikrokerntest im Ratten-Knochen
mark essentiell (Entfernung der restlichen leukozytären Granula) .
Für das genannte Reinigungsverfahren werden die von Rennie et al
in Klin. Chem. Acta, 98 (1979), Seiten 119-125, beschriebenen
Lösungen verwendet. In ein Zentrifugierröhrchen, beispielsweise
mit einem Volumen von 5 ml, werden zunächst 1,5 ml einer 80%igen
Percoll-Lösung eingegeben. Darüber werden 1,5 ml einer 30%igen
Percoll-Lösung geschichtet. Schließlich werden darüber 0,5 ml der
in dem Eluat 6 befindlichen unreifen und reifen Erythrozyten ge
geben und das Ganze sodann zentrifugiert. Im Grenzschicht-Bereich
zwischen der 80%igen und der 30%igen Percoll-Lösung sammeln sich
die zu untersuchenden Zellen an. Um für die nachfolgende
mikroskopische Auswertung verwendbare "Mikroobjekte" zu haben,
müssen die zu untersuchenden Zellen sehr flach auf dem Objekt
träger angeordnet sein. Daher werden die Zellen mittels Zyto
zentrifugation auf mit Polylysin behandelte Objektträger gebracht.
Die derart abgeflachten und homogen verteilten Zellen können so
dann mittels der bekannten Standardfärbung nach May-
Grünwald/Giemsa eingefärbt werden. Es ist indes auch eine Einfär
bung mit Fluoreszenzfarbstoffen, vorzugsweise mit Acridin-Orange,
möglich. Danach sind die so separierten, präparierten und markier
ten Zellen einer sich anschließenden automatischen quantitiv-
mikroskopischen Bildanalyse zugänglich.
Anstelle des Percoll-Reinigungs-Prozesses, wie er für Proben von
Ratten-Knochenmark vorgesehen ist, tritt bei Proben aus peri
pherem Blut ein Anreicherungs-Prozeß der polychromatophilen
Erythrozyten mittels eines modifizierten Percoll-Schrittgradien
tenverfahrens. Die Vorrichtung zur Durchführung dieses Anreiche
rungs-Verfahrens unterscheidet sich von derjenigen zur Reinigung
von Ratten-Knochenmark-Proben nur dadurch, daß anstelle der zu
erst einzugebenden 80%igen Percoll-Lösung 1,5 ml einer
55-65%igen Percoll-Lösung eingegeben werden.
Die abschließende vollautomatische Mikrokernanalyse von großen
Zellzahlen ist mit Hilfe des bei WILD-LEITZ entwickelten Bild
analysesystems MIAMED möglich. Wichtigste Voraussetzung hierzu ist
die vorausgehende und weiter oben bereits beschriebene Eliminie
rung der kernhaltigen Zellen der Hämatopoese mit Hilfe der er
wähnten Präparations- bzw. Separations-Methode nach Art einer
"Säulenchromatographie". Das MIAMED besteht einerseits aus dem
automatisierten WILD-LEITZ-Mikroskop MEDILUX und andererseits aus
dem Bildverarbeitungssystem MIAC (Modular Image Analysis
Computer).
Das Mikroskop verfügt über einen Scanning-Tisch, der bis zu
sechzehn Objektträger aufnehmen kann, einen Fokustrieb, eine
Lampenregelung und einen Objektivrevolver. Tisch, Fokus und Objek
tivrevolver sind motorgetrieben und werden per Software über den
MIAC gesteuert. Eine an Mikroskop und MIAC adaptierte Videokamera
ermöglicht die elektronische Aufnahme der Mikroskop-Bilder und
deren Übergabe an das Bildverarbeitungs-System.
Der MIAC ist ein modulares bus-orientiertes System von großer
Flexibilität. Ein neuartiges Bus-System gestattet eine schnelle
und flexible Kommunikation zwischen den diversen Modulen des MIAC.
Bei den Modulen handelt es sich unter anderem um Bildspeicher und
spezielle Bildprozessoren zur schnellen Verarbeitung von Grau- und
Binärbildern. Die Architektur des Systems ist für sogenanntes
Pipeline-Processing ausgelegt, das heißt für eine kontinuierliche
und parallele Verarbeitung der von der Kamera angelieferten Bil
der. Die Modularität ermöglicht darüber hinaus eine problemange
paßte Konfigurierung des Systems im Sinne der Erzielung eines
optimalen Preis-/Leistungs-Verhältnisses.
Das Programmpaket zur automatischen Detektion von Mikrokernen ist
in eine Software-Architektur eingebettet, die speziell für
sogenannte "rare event"-Strategien ausgelegt ist und an die
schnelle MIAMED-Pipeline-Struktur angepaßt ist.
Entsprechend dieser Strategie hat es der Benutzer mit den drei
Programmteilen Dateneingabe, automatische Detektion und Ergeb
nisanalyse zu tun. Hinzu kann noch ein sogenanntes "superuser"-
Programm kommen, das dem Routineanwender nicht zugänglich ist. Es
dient der Einstellung spezieller Systemparameter.
Im Dateneingabeteil sind die interaktiven Aktionen des Benutzers
neben der Einstellung allgemeiner Suchparameter auf die Eingabe
einiger spezieller problemabhängiger Parameter beschränkt, die den
automatischen Suchablauf des Systems steuern. Wesentliche Eingabe
daten sind beispielsweise Vorgabewerte für die Suchbereiche auf
den Objektträgern, die Einstellung der Fokusebene des Startfeldes
und die Angabe der Anzahl auszuwertender Zellen.
Bei der automatischen Detektion handelt es sich um ein Programm,
das unüberwacht unter Benutzung der Eingabedaten vollautomatisch
die Objektträger spiralartig Bildfeld für Bildfeld nach mikrokern
haltigen Zellen durchmustert. Es setzt sich zusammen aus einem
problemunabhängigen "Detektionsrahmen", der für die exakte An
steuerung und Justierung der Bildfelder zuständig ist, und einem
problemspezifischen "Detektionskern", der durch entsprechende
Algorithmen die Extraktion der gewünschten Bildinformation garan
tiert. Alle im automatischen Suchlauf gewonnenen Daten, insbeson
dere die Positionen der detektierten mikrokernhaltigen Zellen,
werden - wie zuvor schon die Eingabedaten - in einer speziellen
Datenbank abgelegt. Zur Ausgabe aktueller Zwischenergebnisse kann
der Suchlauf jederzeit seitens des Anwenders unterbrochen werden.
Darüber hinaus hat der Anwender die Möglichkeit, während der
Unterbrechung die Anzeige zur graphischen Darstellung der einzel
nen Detektionsschritte einzuschalten, um so die Parameterwahl zu
überprüfen und gegebenenfalls zu modifizieren.
Ein Programmteil für die Auswertung und Analyse der automatisch
detektierten mikrokernhaltigen Zellen vervollständigt das Pro
grammpaket. Das Analyseprogramm, dessen allgemeiner Teil die
schnelle Wiedervorführung der detektierten Zellen erlaubt, enthält
darüber hinaus einen speziellen Teil zur problemspezifischen Ana
lyse der erzeugten Daten. Dadurch wird es möglich, alle stati
stisch relevanten Daten so aufzubereiten und zu formatieren, daß
sie auch von kommerziell verfügbaren PC-Programmen weiterbearbei
tet werden können.
Mit dem vorliegenden Verfahren ist es erstmals möglich, den Mikro
kerntest im Knochenmark der Ratte zuverlässig durchzuführen. Dies
ist deswegen möglich, weil durch die neue Säulenmethode und die
anschließende Reinigung der Zellen mittels des Percoll-Schritt
gradientenverfahrens alle artefakt-produzierenden leukozytären
Granula entfernt werden können, so daß eine hochwertige Zellprä
paration resultiert. Diese kann dann nach Wahl - entweder manuell
oder vollautomatisch mit Hilfe eines speziellen Bildanalysever
fahrens - auf mikrokernhaltige Erythrozyten untersucht werden.
Alle hier beschriebenen neuen Techniken sind nicht nur für das
Knochenmark anwendbar, sondern auch für Untersuchungen des peri
pheren Bluts von Säugern. Als Besonderheit können hier die poly
chromatophilen Erythrozyten (Retikulozyten) mit Hilfe eines
Percoll-Schrittgradientenverfahrens angereichert werden; bei der
Spezies "Ratte" z.B. von ursprünglich 2 bis 5% auf über 80%. Ein
weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der
guten Adaptierbarkeit für andere Säuger-Spezies, einschließlich
des Menschen. Die Genotoxizitäts-Prüfung in vivo ist damit wesent
lich flexibler geworden.
Die in der Fig. 1 schematisch dargestellte Säulenanordnung ist
hier als Laborgerät konzipiert. Es ist selbstverständlich auch
möglich, diese Anordnung in einstückiger Form als "Einweg-Set"
11-7-4-6 vorzusehen. Damit ist eine größere Flexibilität in der
Handhabung an jedwedem Einsatzort gegeben. Der Deckel der Einweg-
Set-Vorrichtung hat jedoch eine andere Innen-Raumform als bei der
in der Fig. 1 dargestellten Laboranordnung, da er als zylin
drischer Innenstopfen ausgebildet ist, der den gesamten Freiraum 1
einschließlich des Teilvolumens 13 einnimmt. Auf diese Weise ist
sichergestellt, daß das Präparations-Set vor dessen Einsatz eine
konstante, reproduzierbare, definiert einstellbare Säulen-Füllhöhe
des Zellulose-Gemisches 2 aufweist. Die Menge des einzusetzenden
Zellulose-Gemisches 2 ist speziesabhängig. Es liegt im Rahmen der
vorliegenden Erfindung, die Beschickung der Einweg-Spritze 7 mit
Zellulose-Gemisch-Füllungen und/oder mit Filterpapier(en) 8
und/oder mit Filtermaterial (4) für die jeweils zu untersuchende
Spezies zu optimieren.
In Fig. 2 wird in schematischer Darstellung im Querschnitt eine
vereinfachte Variante gezeigt, die ebenfalls als Einweg-Set ausge
bildet ist und eine kompakte Zellseparationsvorrichtung 22 dar
stellt. Die vorzugsweise rotationssymmetrische Vorrichtung weist
eine Eingangsöffnung 14 auf, in die die Kanüle beispielsweise
einer Einweg-Spritze eingeführt werden kann. In ihrem mittleren
Bereich befindet sich das Zellulose-Gemisch 2, das bereits in
Fig. 1 näher beschrieben wurde. Dieses Gemisch wird mittels einer
oberen Abdichtung 15 sowie einer unteren Abdichtung 16 in dem
mittleren Bereich der Vorrichtung 22 gehalten. Die obere Abdich
tung 15 verhindert das Austreten des Zellulose-Gemisches 2 und
erlaubt gleichzeitig den Durchtritt der zu separierenden Proben
suspension. Dabei sind zwei Ausführungsformen möglich. Die Ab
dichtung 15 kann aus Kunststoff bestehen und als entfernbarer
Deckel oder als zelldurchlässiges Gitter ausgebildet sein. Die un
tere Abdichtung 16 verhindert ebenfalls den Durchtritt des Zellu
lose-Gemisches 2 und erlaubt den Durchtritt der Zellsuspension und
ist vorteilhafterweise als zelldurchlässiges Kunststoffgitter aus
gebildet. Der Verbindungsteil 17 grenzt als Einschnürungsbereich
die das Zellulose-Gemisch 2 enthaltene Kammer von der darunter
befindlichen Filterkammer peripher ab und dient gleichzeitig zur
Befestigung und peripheren Abdichtung eines oder mehrerer Spezial
filter 18, die auf einer Filterauflage 20 aufliegen. Der oder die
Spezialfilter 18 dienen in Analogie zu der Funktion des Filters 4
in Fig. 1 der Nachfiltrierung. Sie können als Zellulose- oder
Polycarbonatmembran mit Maschenweiten zwischen 3 und 8 µm, vor
zugsweise 5 µm, oder als Zelluloseestergemisch, MF von Nuclepore,
USA, ausgebildet sein. Auch die Filterauflage 20 ist zweckmäßiger
weise ein zelldurchlässiges Kunststoffgitter. Mit der Bezugsziffer
19 ist eine sich konisch verjüngende Abdichtungswand bezeichnet,
die den Filterraum nach unten hin gezielt einengt und für einen
festen Sitz sowie für eine solide periphere Abdichtung der/des
Spezialfilter(s) 18 sorgt. Die sich nach unten hin anschließende
Ausgangsöffnung 21 ist der Austrittsort für die Fraktion der
reinen reifen und unreifen Erythrozyten-Suspension. Sie ist vor
zugsweise verschließbar. Die bevorzugte Größennorm des
Anschlusses ist: Luer oder Record. Die Zellseparationsvorrichtung
22 besteht aus Kunststoff oder aus Glas. Der Außendurchmesser
beträgt bei einer bevorzugten Ausführungsform zwischen 10 und 12
mm; die Höhe b (ohne Berücksichtigung der als Stutzen ausgebil
deten Eingangsöffnung 14) zwischen 13 und 15 mm. Bei dieser in
Fig. 2 dargestellten, als Einweg-Set konzipierten Einfach-Variante
einer Zellseparationsvorrichtung wird zunächst eine die proben
suspension enthaltende Spritze, beispielsweise eine Einwegspritze
mit 2 oder 5 ml Volumen, in die Eingangsöffnung 14 eingeführt.
Dann wird die Zellsuspension durch manuelles Drücken des Spritzen
kolbens langsam und vorsichtig durch die Vorrichtung 22 gepreßt
und die separierten Zellen in einem in Fig. 2 nicht dargestellten
Auffanggefäß aufgefangen. Dieses vereinfachte Verfahren ist zeit
sparend und braucht im Gegensatz zu dem Verfahrensablauf, wie er
im Zusammenhang mit der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung be
schrieben ist, kein zusätzliches Elutionsmittel. Die in Fig. 2
dargestellte Zellseparationsvorrichtung 22 stellt als Raumform
eine optimierte Ausführungs-Variante dar. Lediglich konstruktive
Abänderungen des Dargestellten liegen im Rahmen der vorliegenden
Erfindung, soweit die Reihenfolge im Verfahrensablauf unter Beibe
haltung der essentiellen Merkmale: Zellulosegemisch-Zellseparation
und Nachfiltrierung mittels Spezialfilter(n) eingehalten wird.
Claims (23)
1. Automatisiertes "in vivo"-Mikrokerntest-Verfahren bei
Säugern, insbesondere beim Menschen sowie bei Ratten und Mäusen,
gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrens
schritte:
- (a) Abtrennung der zellkernhaltigen hämatopoetischen Zellen aus
Proben des Knochenmarks bzw. des peripheren Bluts durch
Säulenfiltration, wobei
- (a₁) eine Suspension der jeweiligen Probe, enthaltend eine Trägerflüssigkeit, beispielsweise eine isotonische Lösung oder ein fötales Kälberserum, auf ein in einer Säule befindliches Zellulose-Gemisch, bestehend aus α-Zellulose und mikrokristalliner Zellulose, gegeben wird,
- (a₂) die Suspension das Zellulose-Gemisch durchtränkt und anschließend mit einer isotonischen Lösung eluiert wird,
- (a₃) der durchtretende Teil der Probensuspension sodann auf eine in der Säule befindliche Schicht aus Filterpapier auftrifft und von dort
- (a₄) einer gezielten Endfilterung mit einer Filtermaschenweite zwischen 5 und 20 µm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 µm, unterzogen wird und
- (a₅) die derart separierten Zellen, die aus den zu untersuchenden unreifen und reifen Erythrozyten bestehen, in einem Auffanggefäß angesammelt werden;
- (b) Anwendung von Schrittgradientenverfahren zur Reinigung
bzw. Anreicherung der nach dem Teilschritt (a5) erhaltenen
Zellmenge, wobei
- (b₁) die Verfahrensstufe der Reinigung im Falle der Separie rung von Knochenmark-Zellen von Ratten und
- (b₂) die Verfahrensstufe der Anreicherung im Falle der Separierung von Retikulozyten aus peripherem Blut von Säugern durchzuführen ist;
- (c) Filtration der nach den vorhergehenden Verfahrensstufen erhaltenen Zellmengen unter Verwendung von Filtermembranen mit Maschenweiten zwischen 5 und 20 µm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 µm;
- (d) Präparation der zu untersuchenden Zellen auf Objektträgern mittels Zytozentrifugation zur Abflachung der Zellen;
- (e) Standard-Färbung der Präparate nach May-Grünwald/Giemsa bzw. mit Fluoreszenzfarbstoffen, vorzugsweise mit Acridin- Orange;
- (f) automatische, quantitativ-mikroskopische Bildanalyse der separierten, mikroskopiergerecht präparierten und farblich gekennzeichneten Blutzellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Gemisch aus α-Zellulose und mikrokri
stalliner Zellulose im Gewichts-Verhältnis zwischen 1,5:1 und
1:1,5, vorzugsweise jedoch im Verhältnis 1:1, vorliegt.
3. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch
aus mikrokristallinen Zellulose-Partikeln und α-Zellulose-Fasern
besteht und innig durchmischt und sodann in eine Säule, beispiels
weise eine 20 ml-Einweg-Spritze, gegeben wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Masse des
in die Säule eingegebenen Zellulose-Gemisches bei Verwendung einer
20 ml-Spritze mit einem Durchmesser von ca. 18 mm in Abhängigkeit
von den jeweils zu präparierenden Säugerspezies-Blutzellen zwi
schen 1,0-2,0 g beträgt, so daß ein vertikaler Durchdringungsweg
zwischen 1 und 2 cm resultiert.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Verfahrensstufe der Reinigung (b₁)
nach einem "Percoll"-Schrittgradientenverfahren abläuft, wobei in
ein Röhrchen, beispielsweise in ein 5 ml-Einweg-Zentrifugier
röhrchen, 1,5 ml einer 80%igen Percoll-Lösung eingegeben werden,
sodann 1,5 ml einer 30%igen Percoll-Lösung aufgeschichtet und zu
oberst 0,5 ml des nach dem Teilschritt (a5) erhaltenen Zellge
misches, das die unreife und die reife Erythrozyten-Population
enthält, zugegeben werden und das Ganze sodann mit 700 bis 900 g
(g=Erdbeschleunigung), vorzugsweise mit 800 g, zentrifugiert
wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Verfahrensstufe der Anreicherung der
polychromatophilen Erythrozyten nach einem "Percoll"-Schrittgra
dientenverfahren abläuft, wobei in ein Röhrchen, beispielsweise in
ein 5 ml-Einweg-Zentrifugierröhrchen, eine 55-65%ige Percoll-
Lösung eingegeben wird, sodann 1,5 ml einer 30%igen Percoll-
Lösung aufgeschichtet und zuoberst 0,5 ml des nach dem Teilschritt
(a5) erhaltenen Zellgemisches, das die unreifen und die reifen
Erythrozyten-Populationen enthält, zugegeben werden und das Ganze
sodann mit 700 bis 900 g (g=Erdbeschleunigung), vorzugsweise
während 10 Minuten mit 800 g, zentrifugiert wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es bei Anwen
dung einer kompakten Zellseparationsvorrichtung (22) ohne den im
Teilmerkmal (a2) des Hauptanspruchs angegebenen Verfahrens-Teil
schritt des Eluierens mittels einer isotonischen Lösung abläuft.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß die auf Objektträgern präparierten Blut
zellen auf dem Objekttisch eines automatisierten Mikroskops abge
scannt und sodann über eine adaptierte Videokamera an ein Bildver
arbeitungs-System übergeben werden, das eine kontinuierliche und
parallele Verarbeitung der von der Kamera gelieferten Bilder
durchführt, wobei die drei Programmteile: Dateneingabe, automa
tische Detektion und Ergebnisanalyse durchlaufen werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß mittels der Dateneingabe die Einstellung
allgemeiner Suchparameter sowie problemabhängiger Parameter er
folgt, wie zum Beispiel die Eingabe von Vorgabewerten für die
Suchbereiche auf den Objektträgern, die Einstellung der Fokusebene
des Startfeldes und die Angabe der Anzahl der auszuwertenden
Zellen.
10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, dadurch ge
kennzeichnet, daß der Objektträger während der auto
matischen Detektion unter Benutzung der Eingabedaten vollautoma
tisch Bildfeld für Bildfeld nach mikrokernhaltigen Zellen durch
mustert wird, wobei einerseits ein problemunabhängiger Detektions
rahmen für die exakte Ansteuerung und Justierung der Bildfelder
zuständig ist und andererseits ein problemspezifischer Detektions
kern die Extraktion der gewünschten Bildinformationen sicher
stellt.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß alle im auto
matischen Suchlauf gewonnenen Daten, insbesondere die Positionen
der detektierten mikrokernhaltigen Zellen - wie auch zuvor die
Eingabedaten - in einer speziellen Datenbank abgelegt werden.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß der die Er
gebnisanalyse betreffende Programmteil die Auswertung und Analyse
der automatisch detektierten mikrokernhaltigen Zellen umfaßt, wo
bei dessen allgemeiner Teil eine schnelle Wiedervorführung der
detektierten Zellen erlaubt und dessen spezieller Teil der pro
blemspezifischen Analyse der erzeugten Daten dient, also alle
Daten derart aufbereitet und formatiert, daß sie auch von
kommerziell verfügbaren PC-Programmen weiterbearbeitet werden
können.
13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekenn
zeichnet, daß als Säulenfiltrations-Gehäuse ein in
Wirkstellung vertikales Glas- oder Kunststoffrohr, vorzugsweise
eine 20 ml-Einwegspritze (7) mit zentraler Ausgangsöffnung (9),
vorgesehen ist, die in ihrem inneren Basisbereich mindestens eine
Lage Filterpapier (8), beispielsweise Linsenreinigungspapier, auf
weist; darüber befindet sich das Zellulose-Gemisch (2); oberhalb
des Zellulose-Gemisches (2) befindet sich ein Freiraum (1) zur
Eingabe der zu separierenden Blutzellensuspension (13); unterhalb
des sich verjüngenden Röhrchenteils (3) befindet sich im Bereich
der Kanüle (9) ein Filterreservoir (4 a) mit einem oder mehreren
Filtern (4) der Maschenweiten zwischen 5 und 20 µm, vorzugsweise
zwischen 10 und 12 µm.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekenn
zeichnet, daß das in die Spritze (7) eingepreßte Zellu
lose-Gemisch (2) mittels eines bei Gebrauch der Vorrichtung ent
fernbaren Deckels (11) nach oben hin abgegrenzt und als Einweg-Set
ausgebildet ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 und 14,
dadurch gekennzeichnet, daß ein vorzugs
weise auf die Einweg-Spritze (7) aufschiebbarer und mit Luft
durchtrittsöffnungen (10) versehener Auffangbehälter (5) für das
Eluat (6) vorgesehen ist.
16. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß als
Säulenfiltrations-Gehäuse eine kompakte Zellseparationsvorrichtung
(22) aus Glas oder Kunststoff vorgesehen ist, welche die folgenden
Konstruktions- und Funktionsmerkmale aufweist:
- (a) die vorzugsweise rotationssymmetrische Vorrichtung weist unterhalb ihrer als Stutzen ausgebildeten Eingangsöff nung (14) einen Hauptraum auf, der das Zellulose- Gemisch (2) enthält, wobei das Gemisch aus α- und mikrokristalliner Zellulose mit einem bevorzugten Mischungsverhältnis 1:1 und einem Gewicht von ca. 0,1-0 5 g besteht;
- (b) der Hauptraum wird von einer oberen Abdichtung (15) und einer unteren Abdichtung (16) derart umgrenzt, daß ein Austreten des Zellulose-Gemisches (2) in benachbarte Räume ausgeschlossen ist, daß aber gleichzeitig ein Durchtritt der Probensuspension ermöglicht wird;
- (c) unter einem als Einschnürungsbereich ausgebildeten Ver bindungsteil (17), der in seinem zentralen Öffnungsbe reich die untere Abdichtung (16) aufnimmt, befindet sich eine Kammer, die eine Filterauflage (20) sowie mindestens ein darauf liegendes Spezialfilter (18) auf weist;
- (d) der konisch verlaufende Unterteil der Vorrichtung (22) mündet in eine Ausgangsöffnung (21), die beispielsweise mit einem Auffanggefäß funktionell verbunden werden kann.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn
zeichnet, daß die obere Abdichtung (15) als entfernbarer
Deckel ausgebildet ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Abdichtungen (15, 16) sowie die Filter
auflage (20) jeweils als zelldurchlässiges Kunststoffgitter ausge
bildet sind.
19. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Eingangsöffnung (14) und die Ausgangs
öffnung (21) hinsichtlich ihrer Dimensionierungen derart ausgebil
det sind, daß sie den genormten Luer- oder Record-Maßen
entsprechen.
20. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn
zeichnet, daß der das Zellulose-Gemisch (2) aufnehmende
Innenraum und die die Filterauflage (20) sowie den bzw. die
Spezialfilter (18) umschließende Filterkammer jeweils doppel
konisch zulaufende Ober- und Unterbegrenzungen aufweisen.
21. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß sie einen
Außendurchmesser a zwischen 10 und 12 mm und eine Höhe b
- unter Ausschluß der Eingangsöffnung (14) - zwischen 13 und 15 mm
aufweist und als Einweg-Set ausgebildet ist.
22. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den
Ansprüchen 1 und 8 bis 12, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Bildanalyse gemäß Teilmerkmal (f) des
Hauptanspruchs unter Verwendung eines Mikroskops und unter Einsatz
eines Bildverarbeitungssystems erfolgt, wobei das Mikroskop einen
motorisch verstellbaren Scanning-Tisch, der bis zu sechzehn Ob
jektträger aufnehmen kann, einen motorisch angetriebenen
Fokustrieb, eine Lampenregelung und einen motorisch einstellbaren
Objektivrevolver enthält und das Bildverarbeitungssystem als
modulares, bus-orientiertes System großer Flexibilität ausgebildet
ist, wobei die Module Bildspeicher und spezielle Bildprozessoren
zur schnellen Verarbeitung von Grau- und Binärbildern umfassen.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekenn
zeichnet, daß als Mikroskop das automatisierte Mikroskop
MEDILUX und als Bildverarbeitungssystem das MIAMED eingesetzt
werden.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19893934625 DE3934625A1 (de) | 1988-10-19 | 1989-10-17 | Automatisiertes "in vivo"-mikrokerntest-verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung desselben |
EP19890911362 EP0394404A1 (de) | 1988-10-19 | 1989-10-18 | Automatisiertes in-vivo-testverfahren für mikrokerne und anordnung zur durchführung dieses verfahrens |
JP51059189A JPH03502736A (ja) | 1988-10-19 | 1989-10-18 | “生体内”小核試験の自動化方法及びこの方法を実施するための装置 |
PCT/DE1989/000663 WO1990004784A1 (de) | 1988-10-19 | 1989-10-18 | Automatisiertes ''in vivo''-mikrokerntest-verfahren und vorrichtung zur durchführung desselben |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3835654 | 1988-10-19 | ||
DE19893934625 DE3934625A1 (de) | 1988-10-19 | 1989-10-17 | Automatisiertes "in vivo"-mikrokerntest-verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung desselben |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3934625A1 true DE3934625A1 (de) | 1990-04-26 |
Family
ID=25873411
Family Applications (1)
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---|---|---|---|
DE19893934625 Withdrawn DE3934625A1 (de) | 1988-10-19 | 1989-10-17 | Automatisiertes "in vivo"-mikrokerntest-verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung desselben |
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Country | Link |
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EP (1) | EP0394404A1 (de) |
JP (1) | JPH03502736A (de) |
DE (1) | DE3934625A1 (de) |
WO (1) | WO1990004784A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104198262B (zh) * | 2014-09-10 | 2017-02-15 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 多功能水体放射性核素现场快速富集处理器 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5240856A (en) * | 1991-10-23 | 1993-08-31 | Cellpro Incorporated | Apparatus for cell separation |
US5672481A (en) * | 1991-10-23 | 1997-09-30 | Cellpro, Incorporated | Apparatus and method for particle separation in a closed field |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2903855A1 (de) * | 1979-02-01 | 1980-08-14 | Bloss Werner H Prof Dr Ing | Verfahren zum automatischen markieren von zellen und bestimmung der merkmale von zellen aus zytologischen abstrichpraeparaten |
-
1989
- 1989-10-17 DE DE19893934625 patent/DE3934625A1/de not_active Withdrawn
- 1989-10-18 EP EP19890911362 patent/EP0394404A1/de not_active Ceased
- 1989-10-18 WO PCT/DE1989/000663 patent/WO1990004784A1/de not_active Application Discontinuation
- 1989-10-18 JP JP51059189A patent/JPH03502736A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104198262B (zh) * | 2014-09-10 | 2017-02-15 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 多功能水体放射性核素现场快速富集处理器 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH03502736A (ja) | 1991-06-20 |
EP0394404A1 (de) | 1990-10-31 |
WO1990004784A1 (de) | 1990-05-03 |
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8181 | Inventor (new situation) |
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