DE3880434T2

DE3880434T2 - Diagnostische probe zum nachweis von praedisposition fuer diabetes typ 1.

Info

Publication number: DE3880434T2
Application number: DE8888310163T
Authority: DE
Inventors: Gerald T Nepom
Original assignee: Benaroya Research Institute at Virginia Mason BRI
Current assignee: Benaroya Research Institute at Virginia Mason BRI
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2008-10-29
Also published as: JP2975023B2; CA1299506C; JPH02500A; ATE88507T1; AU2410988A; DE3880434D1; EP0314500A2; US5039606A; AU612418B2; EP0314500B1; EP0314500A3

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein die Gentechnologie und insbesondere DNA- und RNA-Sonden, die nützlich bei der Diagnose einer Prädisposition für Krankheitszustände, besonders Typ-I-Diabetes, sind.
Genetisches Absuchen auf Erbkrankheiten, basierend auf der Verwendung spezifischer Gensonden, ist eine vielversprechende Technologie, die sowohl die Breite als auch die Genauigkeit genetischer diagnostischer Tests erhöhen wird. Schätzungsweise gibt es ungefähr 3000 bekannte Erbkrankheiten, die sich aus einer einzigen Genmutation ergeben, und für die die Anwendung spezifischer Gensonden von direktem Wert ist. Zusätzlich gibt es jedoch eine Vielzahl von allgemeinen Krankheiten, wie rheumatoide Arthritis (RA) und Typ I-Diabetes (oder insulinabhängiger Diabetes mellitus, IDDM, nachstehend "Diabetes" genannt), die nicht auf eine einzige Genmutation, sondern auf eine Kombination von genetischen und möglicherweise Umweltfaktoren zurückzuführen sind. In solchen Fällen bestimmt die genetische Vererbung die Prädisposition oder das Krankheitsrisiko, die mit einem großen Teil klinischer Erkrankung einhergehen. So sollte das genetische Testen auf Diabetes als das Auffinden einer Prädisposition angesehen werden, im Unterschied zu dem üblicheren Begriff eines einzelnen Gendefekts, der zu einer spezifischen Erbkrankheit führt.
Die Identifizierung eines speziellen Gens, das mit der Prädisposition für Diabetes assoziiert ist, kann aus zwei verschiedenen Perspektiven betrachtet werden. Einerseits kann das Gen, das nachgewiesen wird, auf dem Chromosom an andere Gene gekoppelt sein, die tatsächlich die Anfälligkeit für die Krankheit verleihen, in welchem Fall das Gen, das getestet wird, als ein Markierungsgen wirken würde. Andererseits kann das Gen, das identifiziert wird, selbst direkt zur Krankheit beitragen, aber nur, wenn andere genetische Elemente oder entsprechende Umwelteinflüsse vorliegen. Beide Konzepte sind zum Verständnis der genetischen Prädisposition für Diabetes wichtig.
Der hauptsächliche genetische Beitrag sowohl für Diabetes als auch für rheumatoide Arthritis wird auf einem Teil von Chromosom 6, der als major histocompatibility complex bekannt ist, codiert. Innerhalb dieses Genkomplexes macht eine Serie von 14 verbundenen Genen den HLA- Klasse II-Gen-Cluster aus. Produkte dieser Klasse-II-Gene sind bei der normalen Immunantwort wichtig, um die Aktivierungsschritte, die zur Immunität führen, auszulösen. Selbst wenn das Immunsystem unangemessen aktiviert wird und normales Gewebe angreift und dadurch Autoimmunität verursacht, spielen diese Klasse-II-Moleküle eine wesentliche Rolle in der Immunaktivierung, die zur Krankheit führt. Dies hat zu dem Konzept geführt, daß die Rolle von HLA-Klasse-II-Genen bei Autoimmunkrankheiten, wie dem Typ-I-Diabetes, darin liegt, als permissives molekulares Signal, wie ein "grünes Licht", zu wirken, das dem Immunsystem signalisiert, mit einem Angriff auf ein spezielles Ziel fortzufahren. Beim Typ-I-Diabetes nimmt man an, daß das Ziel zelluläre Komponenten sind, die mit den insulinsezernierenden Zellen des Pankreas in Verbindung stehen. So ist in vielerlei Hinsicht die Frage nach der genetischen Prädisposition bei Diabetes ein Problem der Identifizierung , welche Gene der HLA-Klasse II für abweichende Signale bei der Aktivierung der Autoimmunantwort verantwortlich sind.
Die Assoziation der Gene der HLA-Klasse II mit Diabetes und rheumatoider Arthritis wird seit einiger Zeit vermutet. Die Produkte der HLA-Gene tragen die HLA-typisierenden Spezifitäten, die gewöhnlich gemessen werden, indem man serologische Reaktivitäten verwendet. Diese typisierenden Spezifitäten sind teilweise ein maß für die genetischen Polymorphismen innerhalb des HLA-Gen-Komplexes. Einer dieser serologischen Polymorphismen, bekannt als HLA-DR4, liegt bei ungefähr 70-75% der Patienten mit entweder Typ-I-Diabetes oder klassischer rheumatoider Arthritis vor. Der Nutzen dieses serologischen Markers für die Analyse einer Prädisposition für die Krankheit ist jedoch durch die Tatsache behindert, daß ungefähr 35% der Normalbevölkerung auch als HLA-DR4 typisiert werden.
In der Forschung, die nachstehend beschrieben ist, wurden verschiedene Gensonden entwickelt, die nicht nur zwischen verschiedenen Genen der Klasse II in DR4-positiven Haplotypen unterscheiden, sondern auch zwischen mehreren polymorphen Allelen für mehrere dieser verbundenen Loci. Bei Gebrauch dieser Sonden wurden folgende Entdeckungen gemacht: Verschiedene Muster verbundener Gene liegen auf verschiedenen Individuen vor, die alle als HLA - DR4 typisiert werden. Verschiedene verbundene Gene belegen die Anfälligkeit von DR4-Individuen für Typ I-Diabetes im Vergleich zu rheumatoider Arthritis, selbst wenn sie beide als HLA- DR4 typisiert werden. Ganz besonders ist eine spezifische polymorphe Variante einer dieser verbundenen Gene für mehr als 95% des DR4-assoziierten Typ I-Diabetes verantwortlich. So können spezifische Gensonden basierend auf individuellen Genseqenzen für das Oligonucleotidtypisieren verwendet werden, um Individuen mit der polymorphen Variante, die mit der genetischen Anfälligkeit für Diabetes assoziiert ist, zu identifizieren. Die Erfindung liefert solch eine Oligonucleotidsonde zur Diagnose der Prädisposition oder Anfälligkeit für Typ I-Diabetes in Form eines Oligonucleotids, das in der Lage ist, speziell mit der Gensequenz
3'-GCGGGCRARGRGGGGGRGCAG-5'
oder
5'-CGCCCGATACACCCCCACGTC-3'
zu hybridisieren, wobei
A Adenin, C Cytosin, G Guanin, T Thymin und R Thymin oder Uracil bedeuten.
Die Sonde umfaßt vorzugsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nu cleotide, ausgewählt aus der Sequenz
5'-GCCCGATACACCCCCACGT-3'
oder
3'-CGGGCRARGRGGGGGRGCA-5'.
In der bevorzugtesten Ausführungsform umfaßt die Oligonucleotidsonde mindestens
5'-CCGATACACCCCCAC-3'
oder
3'-GGCRARGRGGGGGRG-5'.
Die Sonde kann mit einem nachweisbaren Marker, wie einem Enzym oder Biotin, markiert werden und wird typischerweise in einem diagnostischen Kit in Kombination mit einem Substrat, das in der Lage ist, DNA oder Zellen zu adsorbieren, einem Restriktionsenzym und/oder einem Detergens, das vorzugsweise in der Lage ist, Zellmembranen durchlässig zu machen, wie Octoxynol, geliefert.
Figur 1 beschreibt die Genorganisation der Klasse-II-Region des HLA- Komplexes auf dem menschlichen Chromosom 6;
Figur 2 stellt schematisch die mit HLA-DR4 assoziierten DR- und DQ- Spezifitäten dar, organisiert durch Haplotypen;
Figur 3 beschreibt einige Verschiedenheiten der Restriktionsenzyme, die die DQ3.1- und DQ3.2-Allele des DQβ-Gens unterscheiden;
Figur 4 vergleicht Verteilungen der DQ3.1- und DQ3.2-Allele unter normalen und diabetischen DRQ-positiven Individuen; und
Figur 5 faßt die Prävalenz von DQ3.2 bei Patienten mit Typ-I-Diabetes gegenüber Kontrollen zusammen.
Figur 1 erläutert die Gene auf Chromosom 6, die den genetischen Komplex der HLA-Klasse-II ausmachen. Mehrere dieser Gene sind im hohen Maße polymorph; d.h. sie liegen bei der Normalbevölkerung in zahlreichen allelen Formen vor. Zum Beispiel mindestens 50 Allele des DRβ1- Locus und ein Dutzend oder so Allele des DQ und DQβ-Locus sind bekannt. In der Figur kennzeichnen Sternchen die Gene, von denen man weiß, daß sie exprimiert werden: die DR- und Dw-allelen Serien, einschließlich der Dw4(DR4)- und Dw14(DR4)-Gene, die Allele des DRBI-Locus darstellen. Die DQβ3.1 (DQw3)- und DQβ3.2(DQw3)-Gene stellen Allele des DQβ1-Locus dar. Proteinprodukte der mit einem Sternchen markierten Gene sind auf der Oberfläche von lymphoiden Zellen identifiziert worden, wo sie an Aktivierungsereignissen, die die Immunantwort auslösen, beteiligt sind. So codieren diese Gene die Strukturproteine, die bei der Auslösung der Aktivierung des Immunsystems bei Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Die Spezifität von HLA-DR4 wird durch Produkte des DRβ1-Locus getragen. Mindestens fünf verschiedene DRβ1- Allele tragen alle die serologische Spezifität für HLA-DR4 und andere Allele tun es nicht, tragen aber stattdessen HLA-Spezifitäten, die als DR1, DR2 etc. bekannt sind.
Wie in Abbildung 2 gezeigt ist jedem der fünf Allele der DRβ1-Gene auf DR4-positiven Haplotypen ein anderer Name gegeben worden, wie Dw4, Dw14, Dw10, Dw13, Dw15 (nicht gezeigt). Jedes dieser verschiedenen DRβ1-Allele ist mit einem polymorphen DQβ-Allel verbunden. Die DQβ- Allele werden DQ3.1, DQ3.2 oder DQx (nicht gezeigt) genannt. Ein Individuum, das bei Gebrauch der üblichen Methodik als HLA- DR4 typisiert wird, kann im Prinzip jeden der in Figur 2 dargestellten Haplotypen tragen. Mit anderen Worten können bis zu fünf verschiedene Allele von DRß und drei verschiedene Allele von DQβ mit den gezeigten Bindungsmustern dargestellt werden. Um die spezifischen individuellen Gene, die die Verbindung von HLA-DR4 mit dem Typ I-Diabetes belegen, zu analysieren, war es notwendig, Techniken zu entwerfen, die unter all diesen unterschiedlichen DR- und DQ-Allelen unterscheiden.
Alle verschiedenen DR4-positiven DRβ1-Allele sind sehr eng verwandt. Sie unterscheiden sich voneinander durch nur eine Aminosäure oder durch bis zu fünf Aminosäuren. Bei dieser begrenzten Divergenz werden die Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme unter diesen verschiedenen Allelen beibehalten. Mit anderen Worten unterscheiden Polymorphismen, die mit dem Restriktionsfragment verbunden sind (RFLP), nicht unter den verschiedenen DR4-positiven DRβ1-Allelen.
Mit Bezug auf Figur 2 werden zwei verschiedene Allele des DQβ-Gens auf DR4-positiven Haplotypen gefunden. Diese zwei Allele sind ziemlich verschieden voneinander und können entweder durch Restriktionsenzympolymorphismen (RFLP) oder spezifische Oligonucleotidsonden unterschieden werden. Figur 3 unterstreicht einige der Verschiedenheiten der Restriktionsenzyme , die die DQ3.1- und die DQ3.2-Allele unterscheiden. Die Analyse der Patienten des Typ I-Diabetes und normaler Kontrollen weist darauf hin, daß mehr als 95% der DR4-positiven Patienten das DQ3.2-Allel am DQβ-Gen tragen. Dies ist das am stärksten assoziierte HLA-Gen bei dieser Krankheit und ist offensichtlich für die Assoziation der DR4-typisierenden Spezifität verantwortlich, die vorher erwähnt wurde. Wie in Figur 2 erläutert, findet man das DQ3.2-Gen an mehrere verschiedene DRß-Gene gebunden. Mit anderen Worten, das Gen der HLA-Klasse II, das am meisten mit DR4-positivem Diabetes assoziiert 20 ist, ist nicht das DRβ1-Gen, sondern das DQβ-Gen, und besonders sein DQ3.2-Allel.
Trotz der hohen Assoziation des DQ3.2-Allels mit Diabetes, ist es wichtig zu betonen, daß dieses Gen, ebenso wie andere HLA-Gene, die mit der Autoimmunkrankheit assoziiert sind, den Träger für die Erbkrankheit prädisponiert, aber nicht allein dafür verantwortlich ist. Dieser Punkt wird in Figur 4 betont, die zeigt, daß, obwohl das DQ3.2-Gen für die meisten der DR4-positiven IDDM-Haplotypen verantwortlich ist, dieses Gen auch in einer großen Zahl von nicht-betroffenen Individuen vorliegt. Diese Daten bestätigen, was in Studien von identischen Zwillingen beobachtet worden war: daß Krankheiten wie Diabetes nicht einfach Einzel-Gen-Erkrankungen sind. Multiple Faktoren, die möglicherweise mehr als ein Gen umfassen und wahrscheinlich einige Wechselwirkungen mit der Umwelt einschließen, wirken vermutlich zusammen und führen so zu dem voll-ausgebildeten Krankheitssyndrom. In diesem Zusammenhang spielt das spezielle Prädispositionsgen eine Schlüsselrolle, reicht aber selbst nicht zur Krankheitsexpression aus. Nichtsdestoweniger ist die Identifizierung von Individuen, die das DQ3.2-Allel haben, von direktem diagnostischem Wert zur Bewertung der Prädisposition für Typ I-Diabetes. Die Erfindung stellt so eine Gensonde bereit, die nützlich ist, um die Prädisposition für Typ I-Diabetes zu diagnostizieren, in der Form eines Oligonucleotids, das in der Lage ist, spezifisch mit der folgenden unterscheidenden DQ3.2-Gensequenz zu hybridisieren:
3'-GCGGGCTATGTGGGGGTGCAG-5'
oder
5'-CGCCCGATACACCCCCACGTC-3'.
Da das DQ3.2-Allel z. B. in Monocyten und B-Zellen exprimiert wird, werden auch RNA-Sonden bereitgestellt , die in der Lage sind, spezifisch mit der folgenden RNA-Sequenz zu hybridisieren:
3'-GCGGGCUAUGUGGGGGUGCAG-5'.
Mit dem hier verwendeten Begriff "Spezifisches Hybridisieren" ist gemeint, daß die Sonden in der Lage sind, entweder mit dem sense- oder Antisense-Strang des DQ3.2-Allels oder mit der RNA, die daraus transkribiert wird, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, bei denen bei Vorliegen einer einzigen fehlerhaften Paarung einer Base nicht hybridisiert wird. Die Fachleute werden erkennen, daB die Stringenz-Bedingungen für verschiedene Hybridisierungstesttypen von der Konstellation von Temperatur, Ionenkonzentration und pH-Wert abhängen. Im all gemeinen steht die Temperatur für die optimale DNA:DNA- oder RNA: RNA-Hybridisierung in umgekehrter Beziehung zu der Salzkonzentration; der pH-Wert sollte zum Beispiel für 15-Nuc leotidsequenzen ("15mer") im Bereich von ungefähr 6,8 bis ungefähr 7,4 gehalten werden. Für die RNA: DNA-Hybrdisierungen gelten ähnliche Testbedingungen, aber geringere Temperaturen (begleitet von höheren Salzkonzentrationen) als für die DNA:DNA-Hybrdisierungen werden im allgemeinen angewendet.
Mit anderen Worten, die Sonde sollte exakt komplementär zu den gesamten oder einem Teil der Oligonucleotidsequenzen (1), (2), oder (3) sein. Vorzugsweise sind die Basen, die komplementär zu den Terminalsequenzen von (1), (2) und (3) sind, nicht in der Struktur der Sonde eingeschlossen, um die Hybridisierungseffizienz zu steigern. Entsprechend werden die Sonden im allgemeinen sequentielle Nucleotide enthalten, ausgewählt aus den folgenden Sequenzen:
5'-GCCCGATACACCCCCACGT-3'
oder
3'-CGGGCTATGTGGGGGTGCA-5'
oder
3'-CGGGCUAUGUCGGGGUGCA-5'.
Die erforderliche Spezifität in Bezug auf das menschliche Genom kann erreicht werden, indem man die Sonde mit irgendeiner 15-Nucleotid-Sequenz aus (4), (5) oder (6) herstellt. Vorzugsweise sollte die Sonde ein 16 mer sein, das als optimal für kommerzielle diagnostische Anwendungen bei Raumtemperatur angesehen wird. Für höhere Signalspezifität können längere Oligonucleotidsequenzen einschließlich der 21-Basen-Sequenzen, die komplementär zu (1), (2) oder (3) sind, ausgewählt werden, besonders für klinische Laboranwendungen, wo Hilfsgeräte zum Erreichen höherer Hybridisierungstemperaturen verfügbar sind.
Für maximale Wirksamkeit enthält die Sonde eine Nucleotidsequenz aus 25 der zentralen Region von (4), (5) oder (6). So werden die Sonden in der bevorzugtesten Ausführungsform die folgenden Sequenzen enthalten oder umfassen:
5'-CCGATACACCCCCAC-3'
oder
3'-GGCTATGTGGGGGTG-5'
oder
3'-GGCUAUGUGGGGGUG-5'.
Solche Oligonucleotide können leicht mit bekannten Techniken und verfügbaren Reagenzien und Geräten synthetisiert werden. Die Sonden können unter verschiedenen Testbedingungen in einer Anzahl von herkömmlichen Art und Weisen nachgewiesen werden oder nachweisbar gemacht werden. Zum Beispiel kann ein Radioisotop während der Oligonucleotidsynthese in die Sonde eingebaut werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Enzym, wie alkalische; Phosphatase, vor dem Test mit der Sonde konjugiert werden, oder eine biotinylierte Sonde kann in dem Test verwendet werden und Hybride anschließend mit einem an Avidin gekoppelten Enzym, zum Beispiel Streptavidin-alkalische Phosphatase, nachgewiesen werden. Luciferine sind auch geeignet, um das Oligonucleotid zu markieren und eine Sonde herzustellen und die Liste von gegenwärtig verfügbaren nachweisbaren Markern umfaßt auch Fluorophore und andere Luminophore, Enzyminhibitoren, ebenso wie Coenzyme, paramagnetische Metalle und andere Spinmarkierungen.
Die DNA- und RNA-Sonden können in einer großen Vielfalt von bestehenden diagnostischen Hybrdisierungstests verwendet werden, zu denen im allgemeinen die Schritte gehören, daß man die Patienten-spezifischen Nucleinsäuren, entweder DNA oder RNA oder beide, mit einer Oligonucleotidsonde, die in der Lage ist,spezifisch mit einer Krankheits-assoziierten Polynucleotidsequenz zu hybrdisieren, in Kontakt bringt, und danach die Anwesenheit oder Abwesenheit der Krankheits-assoziierten DNA oder RNA in der Patienten-spezifischen Probe durch Nachweis von DNA:DNA-, RNA:RNA-, DNA:RNA- oder RNA:DNA-Hybriden aus der Sonde und den Patienten- spezifischen Polynucleotiden bestimmt. In solchen Tests kann die Hybridisierung entweder mit isolierten Nucleinsäuren oder in situ stattfinden, z. B. innerhalb patientenspezifischer Leucocyten, indem man verfügbare Vorschriften verwendet, in denen die Nuklear- und/oder Plasmamembranen der Patientenzellen mit Detergenzien wie Octoxynole (besonders Triton X-100) vor der Inkubation mit der Probe durchlässig gemacht werden. Die Sonde wird typischerweise in Diagnostiktestkits in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Reagentien bereitgestellt. Ein Substrat, das in der Lage ist, DNA und/oder RNA zu adsorbieren oder anderweitig zu binden, wird oft zusammen mit der Probe geliefert. Verfügbare Substrate für diesen Zweck umfassen Membranen aus Nitrocellulose, Nylon oder derivatisiertem Nylon, die im allgemeinen dadurch charakterisiert sind, daß sie eine Reihe von positiv geladenen Substituenten tragen. Eines oder mehrere Restriktionsenzyme, wie Tag I, können in dem Kit geliefert werden, ebenso wie nicht-menschliche Polynucleotide, wie Kalbsthymus- oder Lachssperma-DNA. Für die in-situ-Hybridisierung kann ein Detergens wie Triton -X-100 bereitgestellt werden, zusammen mit einem Substrat, wie einem durchsichtigen Mikroskop-Objektträger, um die Zellen während der Permeabilisierung , der Sondeninkubation und der Hybridisierung und der Nachweis-Schritte des Tests zu binden.
Die Erfindung wird weiterhin durch das folgende spezifische Beispiel erläutert.

BEISPIEL

Patientenauswahl und Kriterien:

Typ I -Diabetes (IDMM)-Patienten wurden ausgewählt, die die Kriterien für den juvenilen insulin-abhängigen Diabetes erfüllten. 3l kaukasische DR4+-Patienten waren für diese Studie verfügbar. Alle der DR4+-Haplotypen waren positiv für HLA-DQw3. In 20 fünf Fällen berichtete der Patient von einem Geschwisterteil, der von IDDM betroffen ist. DNA aller Mitglieder dieser fünf Familien wurde auch erhalten. Kontroll-DNA wurde aus 34 klinisch normalen DR4+ -Freiwilligen erhalten.

Herstellung von genomischer DNA:

Periphere Blutleucocyten wurden 2x in Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, auf 10&sup8; Zellen pro ml in TE (10 mM Tris, 1 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 7,6)resuspendiert und mit 10 Volumen Lysepuffer (10 mM Tris, ph 8,0, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl und 1% Natriumdodecylsulfat (SDS)), der 200 ug/ml Proteinase K enthielt, l8 Stunden bei 37ºC lysiert. Nach Extraktion mit Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1) wurde Ammoniumacetat bis zu einer Konzentration von 2,0 M hinzugefügt und die DNA wurde durch Hinzufügung von absolutem Ethanol präzipitiert. Detaillierte Verfahren sind in Holbeck, S. L. et al., J. Immunol. 135 (1)(1985):637-641 beschrieben, hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen.
Vor der Gelelektrophorese wurde die DNA mit der Restriktionsendonuclease Taq I (Bethesda Res. Labs.) in einer Konzentration von 2 u/ug DNA vier Stunden bei 60ºC verdaut. Die v9rdaute DNA wurde mittels Elektrophorese auf 1%igen Agarosegelen sortiert, denaturiert und neutralisiert, dann auf Whatman 3MM-Papier getrocknet, wie in Holbeck, S. L.und G. T. Nepom, Immunogenetics 24 (1986) :251- 258 und Nepom, G. T., et. al., The Lancet ii(8514) (1986):1002-1005 beschrieben, beide sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Proben, die durch Slot-Blot-Hybridisierung (siehe nachstehend) analysiert wurden, wurden direkt, ohne Verdauung oder Elektrophorese, nach Adsorption auf Nitrocellulosepapier getestet

Allel-spezifische Oligonucleotidsonden und Hybridisierung:

Detaillierte Verfahren für die Analyse genomischer DNA unter Verwendung von Allel-spezifischen Sonden sind in Nepom et al., (1986) ibid., beschrieben. In Kürze, Gele oder Nitrocellulose-Slot-Blots, die Verdauungsprodukte genomischer DNA enthielten, wurden drei Stunden bei 55ºCin 6X NET (NaCl- EDTA- Tris), 10% Dextransulfat, 5X Denhardt's Stammlösung, 5 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,05% NP-40 (Nonidet P-40), 250 ug/ml tRNA, und 10&sup7; CPM/ml der Oligonucleotidsonde, die mit y³²P-dATP und T4-Polynucleotidkinase endmarkiert worden war, um eine spezifische Aktivität von 10&sup9; CPM/ug herzustellen, hybridisiert.
Die Proben wurden mit 5X SSC (Natriumcitrat-Stammlösung), 0,5% SDS, zweimal 10 Minuten bei Raumtemperatur und zweimal 30 Minuten bei 55ºC gewaschen, und anschließend bei 61ºC mit 3,2 Mol Tetramethylammoniumchlorid (TMACl), das 0,5% SDS enthielt, gewaschen und dann 1-7 Tage bei -70º einem XAR 5-Film mit Cronex Lightening Plus intensifying screens ausgesetzt. Die Sonden DQβ3.1A25 und DQβ3.2A43 wurden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers von Applied Biosystems durch Phosphoramidit-analoge Chemie synthetisiert, wie von M. H. Carruthers in Methods of DNA und RNA-Sequencing, S. 1-22, Weismann, S. M., Hrsg., Praeger Publishers, N. Y., 1983 beschrieben, hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen. Ihre Sequenzen waren 5'-TCTGGTCACATAACGCACGCG-3' (DQβ3.1A25) und 5'-CGCCCGATACACCCCCACGTC-3' (DQβ3.2A43).

Charakterisierung der Sonden für einzelne HLA-DQ-Gene:

Eine DQβ- Gensonde, die mit einer konservierten Nucleotidsequenz, die in allen DQβ-Genen vorliegt, hybridisiert, wird in Holbeck und Nepom, 1986, supra, beschrieben. Diese Sonde identifiziert ein Gen pro Haplotyp, das DQβ-Gen, und kann so für die "HLA DQ-Typ"- genomische DNA, die durch Restriktionsenzymverdauungen wie jene, die in Figur 3 gezeigt sind, analysiert ist, verwendet werden. Die Ergebnisse solchen Typisierens sind erläutert, in dem die genomische DNA aus einer Vielzahl von homozygoten Zellen mit dem Restriktionsenzym Taq I verdaut, elektrophoretisiert, und mit der DQβ-Locus-spezifischen Sonde hybridisiert worden ist. Verschiedene Allele, die die DQw1, DQw2, DQ3.1 und DQ3.2- Gene darstellen, wurden durch verschieden große Fragmente unterschieden, entsprechend der Variation in den Tag I- Erkennungssequenzen, die auf diesen verschiedenen Genen vorliegen. Die Verwendung der Allel- spezifischen Oligonucleotidprobe wird erläutert wobei der gleiche DNA-Blot mit der DQ3.2-spezifischen Sonde rehybridisiert wurde. Es ist zu beachten, daB nur die DQ3.2-Gene identifiziert wurden. Das Fehlen eines Hybridisierungssignals in genomischer DNA aus Nicht-DQ3.2-Haplotypen bestätigte, daß die DQß3.2A43-Sonde spezifisch für eine DNA-Sequenz ist, die nur im DQ3.2ß-Gen gefunden wurde.
Durch Verwendung solcher Allel-spezifischer Proben wurde es möglich, die DNA auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einzelner DQβ-Gene durch "Slot-blot"-Hybridisierungsanalyse einer Serie von DNA aus verschiedenen Individuen, die mit der DQ3.1-spezifischen Oligonucleotidprobe hybridisiert war, schnell zu analysieren. In diesem Verfahren wurde genomische DNA, die aus peripheren Blutleucocyten oder Zelllinien hergestellt worden war, direkt auf das Nitrocellulosepapier ohne Verdauung und ohne Verstärkung aufgebracht. Die radiomarkierte Sonde DQ3.1A25 wurde dann hinzugefügt wobei Hybridisierung die Anwesenheit des spezifischen DQß3.1-Gens anzeigt. Eine S lot-Blot-Hybridisierung wurde auch mit der DQ3.2-spezifischen Sonde ausgeführt.

DQ3.2-Assoziation mit IDDM auf multiplen DR4+-Haplotypen:

DNA aus einunddreißig HLA-DR4-IDDM-Patienten, die dreiundzwanzig nicht-verwandte Nachkommen darstellten, wurden mit den DQ-Oligonucleotid- Sonden analysiert: alle einunddreißig trugen das DQ3.2Gen. Drei Individuen trugen auch das DQ3.1-Gen; alle drei dieser Patienten waren homozygot für DR4, und heterozygot für DQ3.2 und DQ3.1.
Wie in Figur 2 dargestellt, liegt das DQ3.2-Gen auf mehereren verschiedenen DR4-positiven Haplotypen vor. Um genau abzuschätzen, welche Haplotypen in der IDDM-Population getragen werden, wurden dann die verbundenen DRβ-Allele in jedem Fall analysiert. Allel-spezifische Oligonucleotidsonden, die zwischen verschiedenen DR4+ - DR-Genen, Dw4, Dw14 und Dw10 genannt, unterschieden, wurden zur Hybridisierungsanalyse der Eco RI- verdauten genomischen DNA verwendet, wie in Nepom et al., supra, (1986) beschrieben. Von den dreiundzwanzig getrennten nicht-verwandten untersuchten DR4+-Haplotypen in der IDDM-Population trugen siebzehn (74%) ein Dw4-Gen (Haplotyp B in Figur 2), vier trugen ein Dw14-Gen (Haplotyp C) und zwei trugen andere DRβ-Gene (D,E). Mit anderen Worten, mehrere verschiedene DR4+-Haplotypen liegen in der IDDM-Bevölkerung vor, aber alle Patienten trugen ein DQ3.2 DQβ- Allel.
Vierunddreißig nicht- diabetische DR4+-Individuen wurden auch analysiert, indem man Allel-spezifische DR- und DQ-DNA-Sonden verwendete. DQ3.2 war bei 22 (65%) und DQ3.1 bei 12 (35%) vorhanden. Figur 5 faßt die Prävalenz von DQ3.2 bei Patienten gegenüber den Kontrollen zusammen und zeigt die hohe Sensitivität, aber geringe Spezifität dieses Genmarkers unter DR4-IDDM-Patienten.
Haplotyp A (Figur 2) ist ein üblicher DR4+-Haplotyp, mit einem DR-Gen, das identisch dem Haplotyp B ist, aber bei DQ differiert. Dieser Haplotyp trägt ein DQ3.1-Allel und wurde nur in DR4-homozygoten Patienten gefunden, wenn der andere Haplotyp des Patienten ein DQ3.2-Gen trug.
Deswegen und weil die Inzidenz von DQβ3.1 bei Patienten geringer als bei Kontrollen ist, wird der Haplotyp A als DR4+-Haplotyp angesehen, der nicht mit IDDM assoziiert ist. Für anfällige DR4+-Haplotypen, die mit IDDM assoziiert sind, kann das verbundene DRß-Allel variieren, so lange wie das DQ3.2-Gen vorliegt. Fünf Familien, die multiple betroffene IDDM-Geschwisterpaare enthalten, wurden auch mittels der DNA-Sonden -Methodik analysiert. In allen fünf Familien zeigte ein DR4-positiver Haplotyp kein IDDM. Eine Gesamtheit von dreizehn betroffenen Kindern in den fünf Familien wurde analysiert; alle dreizehn trugen das DQ3.2- Gen. Interessanterweise war in zwei dieser Familien das DQ3.2-Gen an ein Dw4-Gen (Haplotyp B) gebunden, und in den anderen drei Familien war das DQ3.2-Gen an ein Dw14-Gen (Haplotyp C) gebunden. (Whatman 3MM, Triton X-100, Nonidet P-40, Cronex und XAR -5 sind alle eingetragene Warenzeichen).

Claims

1. Sonde, umfassend ein Oligonucleotid mit der Fähigkeit zur spezifischen Hybridisierung mit der Gensequenz

3'-GCGGGCRARGRGGGGGRGCAG-5'

oder

5'-CGCCCGATACACCCCCACGTC-3',

wobei

A Adenin ist,

C Cytosin ist,

G Guanin ist,

T Thymin ist, und

R Thymin oder Uracil ist.

2. Sonde nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid 16 Nucleotide umfaßt.

3. Sonde nach Anspruch 1 oder 2, umfassend ein Oligonucleotid, das wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide umfaßt ausgewählt aus der Sequenz

5'-GCCCGATACACCCCCACGT-3',

oder

3'-CGGGCRARGRGGGGGRGCA-5',

wobei

A Adenin ist,

C Cytosin ist,

G Guanin ist,

T Thymin ist und

R Thymin oder Uracil ist.

4. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oligonucleotid die Sequenz

5'-CCGATACACCCCCAC-3'

oder

3'-GGCRARGRGGGGGRG-5'

umfaßt.

5. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die mit einer nachweisbaren Marker markiert ist.

6. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5, markiert mit einem Enzym, Biotin, Radionuclid, Fluorophor, Luminophor, Enzyminhibitor, Coenzym, Luciferin, paramagnetischem Metall oder einer Spinmarkierung.

7. Diagnostischer Kit, umfassend eine Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und ein Substrat mit der Fähigkeit zur Adsorption von DNA.

8. Diagnostischer Kit nach Anspruch 7 mit einer Restriktionsendonuclease.

9. Diagnostischer Kit nach Anspruch 7 oder 8 mit einer Restriktionsendonuclease, die StuI, HindIII, SstI, PvuII, TagI, XbaI oder BamHI ist.

10. Verwendung einer Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Diagnosemitteis für eine Erbkrankheit.

11. Verfahren zum Nachweis einer Disposition oder Empfänglichkeit für eine Krankheit, umfassend das Inkontaktbringen von Nucleinsäuren eines Patienten mit einer Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die in der Lage ist, mit einer mit der Krankheit in Verbindung stehenden Polynucleotidsequenz spezifisch zu hybridisieren, und Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der mit der Krankheit in Verbindung stehenden Sequenz in den Nucleinsäuren des Patienten.