DE3853832T2 - Htlv-i-peptid-antigen und testverfahren. - Google Patents

Description

1. Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das humane T-Zell-Leukämie-Virus Typ I (HTLV-I) und genauer ein rekombinantes Peptidantigen, welches gegenüber einem anti-HTLV-I-Antikörper, welcher in mit HTLV-I infizierten Individuen auftritt, immunreaktiv ist, und Nachweisverfahren unter Verwendung des Antigens.
2. Referenzliteratur
• Huynh, T.V., et al., in "DNA Cloning, Volume 1", Hrsg. D.M. Glover, Washington D.C.: IRL Press, 1985 (Kapitel 2)
• Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)
• Matsushita, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83: 2672 (1986)
• Miyoshi, I., et al., Nature, 294: 770 (1981)
• Poiesz, B.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77: 7415 (1980)
• Popovic, M., et al., Science, 219: 856 (1983)
• Seiki, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80: 3618 (1983)
3. Hintergrund der Erfindung
• Die humane T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV) stellen eine Familie von T-Zell- Retroviren mit drei bekannten Mitgliedern dar. HTLV Typ I (HTLV-I) besitzt eine transformierende Wirkung in vitro und wird ätiologisch mit adulter T-Zell-Leukämie in Beziehung gebracht, welche bekanntennaßen in verschiedenen Teilen der Welt endemisch ist. HTLV-II ist ein anderes Retrovirus mit transformierendem Potential in vitro und wurde aus einem Patienten mit einer T-Zell-Variante einer Haarzell-Leukämie isoliert. HTLV-III, das auch als Lymphadenopathie-assoziiertes Virus bezeichnet worden war und jetzt als das humane Immundefizienz-Virus (HIV) bekannt ist, besitzt lytische Aktivität für spezielle Arten von T-Zellen und wurde mit der Ätiologie des erworbenen Immundefizienz-Syndroms (AIDS) in Verbindung gebracht. Anders als die HTLV-I- und -II-Viren besitzt HTLV-III keine bekannte transformierende Wirkung in vitro.
• Über einen monoklonalen Antikörper (Mab), welcher gegenüber HTLV-I reaktiv ist, ist berichtet worden (Matsushita). Der Antikörper, bezeichnet als 0.5α, ist ein IgG&sub1;Mab, welcher an die Zellmembran von mit HTLV-I infizierten T-Zellen bindet, wodurch eine Zellyse in Gegenwart von Komplement hervorgerufen wird. Elektroblotstudien legen nahe, daß der Mab mit dem hauptsächlichen Hüllprotein des HTLV-I reagiert (Matsushita). Dieses als gp46 bezeichnete Protein ist der äußere Membranbestandteil des env-Genprodukts. Ein provirales HTLV-I-Genom ist isoliert und vollständig sequenziert worden (seiki). Unter Verwendung eines kompetitiven Inhibitionsbindungsnachweises wurde beobachtet, daß 15 von 15 Patienten mit adulter T-Zell-Leukämie Antikörper aufwiesen, die das Binden des Mab an aufgebrochene HTLV-I-Virionen blockierten (Matsushita). Offensichtlich bindet der Antikörper weder an HTLV-II- noch an HTLV-III-Virionen noch an infizierte Zellen.
• Obwohl die vorstehend diskutierten Studien die Möglichkeit nahelegen, einen anti-HTLV-I Antikörper für eine Diagnose einer HTLV-I-Infektion zu verwenden, hat diese Strategie zwei hauptsächliche Nachteile. Zunächst ist das Nachweissystem relativ umständlich, da es sowohl eine Quelle für HTLV-I-Virionen, infizierte Zellen, oder fraktioniertes gp46-Protein als auch anti- HTLV-I Mabs erfordert, welche zu einem Testsystem für einen kompetitiven Bindungsnachweis kombiniert werden. Zum anderen ist es möglich, daß ganze Virionen oder sogar fraktionierte Proteine derselben mit mehr als einem Epitop-spezifischen anti-HTLV-I Antikörper reagieren, wodurch sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität des Tests herabgesetzt wird.
4. Zusammenfassung der Erfindung
• Dementsprechend wäre es nützlich, für eine Diagnose einer HTLV-I-Infektion ein oder mehrere HTLV-I-Peptidantigen(e) bereitzustellen, welche immunreaktiv gegenüber Antikörpern sind, die bekanntermaßen in sämtlichen mit HTLV-I infizierten Patienten, einschließlich jenen mit T-Zell-Leukämie, auftreten, und welche spezifisch für eine Diagnose bestimmter Stadien einer HTLV-I-Infektion eingesetzt werden können. Ein solches Antigen oder solche Antigene könnten entweder in einem einfachen Festphasen- oder einem homogenen Antikörperbindungsnachweis verwendet werden für eine schnelle Bestimmung von Antikörpern, welche eine Nachweisqualität für HTLV-I-Infektion haben. Es ist eine allgemeine Aufgabe der Erfindung, ein HTLV-I-Peptidantigen zur Verfügung zu stellen, welches für einen anti-HTLV-I Antikörper spezifisch ist, welcher in Patienten mit HTLV-I-verursachter T-Zell-Leukämie auftritt.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, einen einfachen, schnellen, relativ preiswerten Immunachweis bereitzustellen, welcher ein solches Antigen verwendet.
• Die vorliegende Erfindung umfaßt ein rekombinantes Peptidantigen, welches (a) vom HTLV-I-Hüllprotein gp46 abgeleitet ist und (b) immunreaktiv ist gegenüber dem anti-HTLV-I Antikörper, welcher in Individuen mit T-Zell- Leukämie auftritt. Das Antigen ist nicht glykosyliert und umfaßt vorzugsweise die Aminosäuresequenz: Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile- Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu- Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser.
• Unter einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung ist das Antigen vorzugsweise gegenüber einem Antikörper immunreaktiv, welcher im Serum HTLV-I-infizierter Individuen, einschließlich Individuen mit T-Zell-Leukämie, auftritt.
• Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein System und ein Verfahren zum Nachweis einer HTLV-I-Infektion in einem Testindividuum. Bei der Ausfühnng des Verfahrens läßt man ein Antigen des beshriebenen Typs mit Serum eines Testindividuums reagieren und untersucht dann auf das Vorliegen von gebundenem Antikörper. Das Nachweissystem kann ein Festphasentyp sein, in welchem das Antigen auf einem festen Trägermaterial getragen wird, oder ein homogenes System, in welchem das Antigen mit einem Reportermolekül verbunden ist, wobei das Binden des Antikörpers an das Antigen das Reportersignal, das detektiert wird, verändert.
• Unter noch einem anderen Gesichtspunkt umfaßt die Erfindung einen Impfstoff zum Immunisieren eines Individuums gegen T-Zell-Leukämie. Der Impfstoff umfaßt ein rekombinantes Peptid des beschriebenen Typs in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
• Diese und weitere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden vollständiger verstanden werden, wenn die folgende, detaillierte Beschreibung der Erfindung gelesen wird in Verbindung mit der begleitenden Figur, welche in A einen Abschnitt eines HTLV-I-Genoms, in B Erstreckungsbereiche innerhalb des Genoms entsprechend solchen Nukleotidsequenzen, welche für drei Peptidantigene der Erfindung kodieren, und in C die Gensequenz und entsprechende Aminosäuresequenz der drei Peptidantigene zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung 1. Herstellung von HTLV-I-Peptidantigenen
• Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von HTLV-I-Peptidantigenen, welche gegenüber anti-HTLV-I Antikörpern immunreaktiv sind, die in Individuen mit HTLV-I-verursachter T-Zell-Leukämie gefunden werden. Die Antigene werden unter Verwendung statistischer HTLV-I-Gensequenzen von 100-300 Basenpaaren Länge, die in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert wurden, hergestellt und dann mit einem Antikörper hinsichtlich der Expression von immunreaktivem Peptid selektioniert.
A. Genomische HTLV-I-Banken
• Genomische Banken von HTLV-I werden auf herkömmliche Weise aus zellulärer DNA, welche ein provirales HTLV-I-Genom enthält, hergestellt. Doppelsträngige DNA kann hergestellt werden aus HTLV-I-infizierten Zellen, einschließlich T-Zellen, die aus Patienten, welche bekanntermaßen mit HTLV-I-Virus infiziert sind, isoliert wurden, oder bekannten Zellinien, wie HUT 102-B2 (Poiesz), Mt-2 (Miyoshi) und MJ-Tumorzellen (Popovic), wobei nachgewiesen wurde, daß sämtliche dieser Zellen HTLV-I-Virus produzieren. Das virale Genom ist in diesen Zellen in die Wirts-DNA integriert. Verfahren zum Herstellen von Zellinien, welche das HTLV-I-Genom enthalten, sind in den vorstehend genannten Referenzen detailliert beschrieben.
• Die gesamte genomische Wirts-DNA aus der vorstehend genannten Zellinie wird teilweise mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym, wie HaeIII oder AluI, unter Bedingungen verdaut, welche teilweise verdaute Fragmente im Größenbereich von 15-20 kBasen Länge erzeugen, und das verdaute Material wird fraktioniert, beispielsweise durch Zentrifugation in einem Sucrosegradienten, um die 15-20 kBasen-Fragmente zu isolieren. Die Fragmente werden dann in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert, und vorzugsweise in einen Phagenklonierungsvektor, welcher effizient eine zu integrierende Sequenz von 15-20 kBasen Länge aufnehmen kann. In einem bevorzugten Verfahren werden die isolierten Fragmente mit EcoRI-Methylase behandelt, EcoRI-Linker werden an deren Enden unter Stardardbedingungen (Maniatis) ligiert und die Fragmente werden dann in einen Phagenvektor, wie lambda- Charon 4a, mit einer einzigen EcoRI-Insertionsstelle kloniert.
• Die klonierten genomischen Fragmente werden mit einer Sonde durchmustert, welche komplementär zu einer ausgewählten Sequenz der vollständigen Kopie des HTLV-I-Genoms ist. HTLV-I-Sequenzen sind bekannt (Seiki) wie auch Verfahren zur Herstellung radioaktiv markierter synthetischer Oligonukleotidsonden für ausgewählte Sequenzen. Zusätzlich können synthetische Oligo nukleotide mit bestimmten Sequenzen durch gewerbliche Servicebetriebe, wie von Synthetic Genetics, Inc. (San Diego, CA) zur Verfügung gestellt, hergestellt werden. Unter Verwendung einer solchen Oligonukleotidsonde werden molekulare Klone, die HTLV-I-Sequenzen enthalten, aus der genomischen Bank durch Standardhybridisierungsverfahren (Maniatis, S. 322) isoliert. Die Klone können zuerst durch Restriktionsstellenanalyse analysiert werden, um zu bestätigen, daß die vollständige virale genomische Sequenz vorliegt, was durch das Vorliegen von direkten langen, terminalen, sich wiederholenden Sequenzen (long terminal repeats), die das integrierte virale Genom flankieren, angezeigt wird. Der identifizierte molekulare Klon wird mit einer geeigneten Endonuklease verdaut, um die vollständige Kopie des viralen Genoms freizusetzen. Eine für diesen Zweck bevorzugte Endonuklease ist SacI, welche das virale Genom in den langen, terminalen, sich wiederholenden Sequenzen (long terminal repeats, LTR) an beiden Enden der viralen kodierenden Sequenzen schneidet, jedoch keine internen Schnitte erzeugt. Ist das klonale HTLV-I-Genom eine Variante mit einer dritten, internen SacI-Schnittstelle, wird ein geeignetes Restriktionsenzym ausgewählt, um das Genom in voller Länge zu isolieren. Die gereinigte, vollständig kopierte Sequenz ist ein Fragment von ungefähr 9,5 kBasen Länge. Alternativ kann ein Genomfragment, welches allein die env-Gensequenzen darstellt, gereinigt werden, um die Expressionsgenbank herzustellen.
• Alternativ wurden Klonierungsvektoren, welche die doppelsträngige HTLV- I-DNA in vollständiger Kopie enthalten, veröffentlicht (Seiki) und können direkt von den Wissenschaftlern, wie in Beispiel 1 aufgeführt, erhalten werden.
• Um die gewünschte genomische HTLV-I-Genbank herzustellen, wird die integrierte Sequenz mit vollständiger HTLV-I-Kopie aus dem vorstehend genannten Klonierungsvektor ausgeschnitten, wie durch vollständigen Verdau mit SacI, und als 9, 5 kBasen-Fragment isoliert, wie in Beispiel I beschrieben. Das isolierte Fragment mit der vollständigen Kopie wird verdaut, um DNA-Fragmente, und vorzugsweise statistische Fragmente mit Größen von uberwiegend ungefähr 100-300 Basenpaaren, herzustellen. Beispiel I beshreibt die Herstellung solcher Fragmente durch DNAse-Verdau. Da es gewünscht ist, Peptidantigene mit ungefähr 30-100 Aminosäuren zu erhalten, werden die Fragmente aus dem Verdau vorzugsweise nach ihrer Größe fraktioniert, beispielsweise durch Gelelektrophorese, um diejenigen im Größenbereich von annähernd 100-300 Basenpaaren auszuwählen.
• Die genomischen Fragmente aus dem Verdau werden in einen geeigneten Klonierungsvektor, und vorzugsweise einen Expressionsvektor, welcher eine Expression des kodierten Peptids in einem geeigneten Wirt erlaubt, integriert. Ein bevorzugter Expressionsvektor ist lambda-gt11, welcher eine einzige EcoRI-Insertionsstelle 53 Basenpaare stromautwärts vom Translationsterminationskodon des β-Galaktosidasegens enthält. Dementsprechend wird die integrierte Sequenz als ein β-Dalaktosidase-Fusionsprotein exprimiert, welches den größten Teil des N-terminalen Bereichs des β-Galaktosidasegens, das heterologe Peptid und mindestens einen Abschnitt des C-terminalen Bereichs des β-Galaktosidasegens enthält. Dieser Vektor erzeugt ebenfalls einen temperaturempfindlichen Repressor (cI857), welcher virale Lysogenie bei permissiven Temperaturen, z.B. 32ºC, hervorruft und zu einer viralen Lyse bei erhöhten Temperaturen, z.B. 42ºC, führt. Vorteile dieses Vektors umfassen: (1) hocheffiziente Erzeugung von Rekombinanten, (2) Möglichkeit, lysogenisierte Wirtszellen auf Basis von Wirtszellwachstum bei permissiven, aber nicht bei nicht-permissiven Temperaturen zu selektionieren, und (3) hohe Niveaus einer Produktion rekombinanter Fusionsproteine. Da ferner ein Phage, welcher eine heterologe integrierte Sequenz enthält, ein inaktives β-Galaktosidase-Enzym erzeugt, kann ein Phage mit integrierten Sequenzen leicht durch eine Reaktion eines Substrats, welches durch β-Galaktosidase- Wirkung gefärbt wird, identifiziert werden.
• Fur die Insertion in den Expressionsvektor können die viralen Fragmente aus dem Verdau, soweit erforderlich, entsprechend herkömmlichen Verfahren modifiziert werden, damit sie ausgewählte Restriktionsstellen-Linker, wie EcoRI-Linker, enthalten. Beispiel I verdeutlicht Verfahren zum Klonieren der Fragmente aus dem Verdau in lambda-gt11, was die Schritte umfaßt, die Fragmente mit glatten Enden zu versehen, EcoRI-Linker anzufügen und die Fragmente mit EcoRI-geschnittenem lambda-gt11 zu ligieren. Die resultierende virale genomische Bank kann überprüft werden, um sicherzustellen, daß eine relativ große (repräsentative) Genbank hergestellt worden ist. Dies kann im Falle des lambda-gt11-Vektors vorgenommen werden, indem ein geeigneter bakterieller Wirt infiziert wird, die Bakterien ausplattiert werden und die Plaques auf den Verlust ihrer β-Galaktosidase-Aktivitat untersucht werden. Unter Verwendng der in Beispiel I beseriebenen Verfahren zeigten ungefähr 60% der Plaques einen Verlust der enzymatischen Aktivität. Die Menge von Phagen als Hintergrund, die einen Verlust der enzymatischen Aktivität zeigen, ist relativ gering, wie aus Beispiel I ersehen werden kann.
B. Peptidantigen-Expression
• Die vorstehend angelegte genomische Bank wird hinsichtlich einer Produktion von Peptidantigen (exprimiert als Fusionsprotein) durchmustert, welches gegenüber dem interessierenden humanen anti-HTLV-I Antikörper immunreaktiv ist. Ein Antikörper von besonderem Interesse für eine Diagnose einer HTLV- I-Infektion ist der 0.5α-Antikörper, welcher, wie vorstehend festgestellt, in Patienten mit T-Zell-Leukämie, die von einer HTLV-I-Infektion verursacht ist, auftritt. Der Antikörper wird von der EBV-transformierten B-Lymphozyten-Zellinie mit der ATCC Hinterlegungsnr. HB8755 (siehe Beispiel II) hergestellt und reagiert nachweislich mit dem gp46-Hüllprotein von HTLV-I (Matsushita). Diese Zellinie ist ein humaner B-Zellklon, der von einem Patienten mit einer HTLV-I-Infektion gewonnen wurde und mit dem Epstein- Barr-Virus immortalisiert wurde. Die Zellinie wurde in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852, hinterlegt und ist in US-A-4722888 offenbart.
• In eine bevorzugten Durchmusterverfahren werden mit Phagenbankvektoren infizierte Wirtszellen, wie vorstehend beschrieben, ausplattiert und die Platte mittels eines Nitrocellulosefilters geblottet, um von den Zellen produzierte rekombinante Antigene auf das Filter zu übertragen. Man läßt das Filter dann mit dem anti-HTLV-I Antikörper reagieren, das Filter wird gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen, und man läßt das Filter mit eine mit einen Reportermolekül markierten, anti-human Antikörper reagieren, welcher in Sandwich-Weise durch den anti-HTLV-I Antikörper an das Filter gebunden wird.
• Typischerweise werden die Phagenplaques, die aufgrund ihrer Produktion von interessierendem rekombinantem Antigen identifiziert werden, nochmals in relativ geringer Dichte auf eine Produktion von gegenüber Antikörper reaktivem Fusionsprotein untersucht. Dies verdeutlichen die in Beispiel 2 beschriebenen Durchmusterverfahren. Verschiedene rekombinante Phagenklone, die ein immunreaktives rekombinantes Antigen produzierten, wurden in den Verfahren identifiziert.
• Der oder die inehreren, wie vorstehend identifizierte(n) annvektor(en) werden vorzugsweise durch Basenpaarsequenzierung analysiert, um die Lage der peptidkodierenden Bereiche innerhalb des HILV-I-Genoms zu bestimmen. Verfahren zum Ausschneiden der heterologen integrierten Sequenz (einschließlich benachbarter kodierender Sequenzen des Fusionsproteins, sofern gewünscht) aus den ausgewählten Genbankvektoren und für eine Reinigung und Sequenzierung der ausgeschnittenen Fragmente folgen im allgemeinen bekannten Verfahren, wie in Beispiel III ausgeführt. Die kodierenden Sequenzen von drei Peptiden, die nachweislich immunreaktiv gegenüber dem 0.5 α-Antikörper sind, sind in der Figur gezeigt. Die drei heterologen Sequenzen wurden mit der bekannten Sequenz von HTLV-I (Seiki) verglichen. Wie ausführlicher in Beispiel III diskutiert, liegen sämtliche Sequenzen innerhalb des Bereichs zwischen den Basenpaaren 5565 und 5895 des HTLV-I-Genoms, innerhalb des für das HTLV-I-Hüllprotein gp46 kodierenden Gens (Figur, Teil A) und haben eine überlappende kodierende Sequenz (definiert durch die zwei Pfeile in der Figur) zwischen den Basenpaaren 5664 und 5790 (Figur, Teil B). Wie aus der Figur, Teil C, zu ersehen, kodiert die überlappende Sequenz für ein Peptidantigen von 41 Aminosäuren mit der folgenden minosäuresequenz:
• Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser- Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-ser-Asn-Leu-His-Ile-Leu- Glu-Pro-Ser.
• Allgemeiner sind die Peptide der Erfindung (a) vom HTLV-I-Hüllprotein gp46 abgeleitet und (b) gegenüber einem anti-HTLV-I Antiköiper, welcher in Individuen mit T-Zell-Leukämie auftritt, immunreaktiv. Hier bedeutet der Begriff "abgeleitet von", daß die Synthese des rekombinanten Peptids von einer kodierenden Sequenz bestimmt wird, welche in ihrer Kodonsequenz im wesentlichen identisch ist mit einem hauptsächlichen Bereich des kodierenden Bereichs des HTLV-I-Hüllproteins gp46 zwischen den Basenpaaren 5664 und 5790, wie hier identifiziert.
• Die ausgewählten Klone werden für eine Produktion in größerem Maßstab für Zwecke einer Reinigung von rekombinantem Protein verwendet. Eine Produktion in größerem Maßstab wird unter Verwendung eines einer Mehrzahl veröffentlichter Verfahren für (a) eine Lysogenisierung eines geeigneten Wirts, wie E.coli, mit einer ausgewählten lambda-gt11-Rekombinanten, (b) ein Kultivieren der transduzierten Zellen unter Bedingungen, welche hohe Konzentrationen an dem heterologen Peptid ergeben, und (c) ein Reinigen des rekombinanten Antigens von den lysierten Zellen ausgeführt.
• In einem bevorzugten Verfahren unter Einsatz des vorstehend genannten lambda-gt11-Klonierungsvektors wird ein stark produzierender E.coli-Wirtsstamm, BNN103, mit dem ausgewählten Genbgen infiziert und eine Replikaplattierung auf zwei Platten vorgenommen. Eine der Platten wird bei 32ºC inkubiert, bei welcher eine virale Lysogenie auftreten kann, und die andere bei 42ºC, bei welcher der infizierende Phage in einem lytischen Stadium ist und aus diesem Grunde ein Zellwachstum verhindert. Aus diesem Grunde werden Zellen, die bei der niedrigeren Temperatur, äber nicht bei der höheren Temperatur wachsen, als erfolgreich lysogenisiert angesehen.
• Man läßt die lysogenisierten Wirtszellen dann unter Flüssigkulturbedingungen wachsen, die eine intensive Produktion des fusionierten Proteins, welches die integrierte virale Sequenz enthält, begünstigen, und lysiert diese durch rasches Abkühlen, um das gewünschte Fusionsprotein freizusetzen. Diese Verfahren werden in den Beispielen IV und V unten detailliert beschrieben.
C. Peptidreinigung
• Das rekombinante Peptid wird durch Standardproteinreinigungsverfahren gereinigt, welche differenzielle Präzipitation, Molekularsiebchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrische Fokussierung, Gelelektrophorese und Affinitätschromatographie umfassen können. Im Falle eines fusionierten Prateins, wie dem wie vorstehend hergestellten, mit β-Galaktosidase fusionierten Protein, können die verwendeten Proteinisolierungsverfahren von jenen, welche zur Isolierung des nativen Proteins verwendet werden, abgeleitet werden. Dementsprechend kann für eine Isolierung eines β-Galaktosidase-Fusionsproteins das Protein leicht durch einfache Affinitätschromatographie isoliert werden, indem das Material aus der Zellyse über ein festes Trägermaterial mit einem an dessen Oberfläche gebundenen anti-β- laktosidase Antikörper geleitet wird. Diese Strategie wird in Beispiel VI für eine Reinigung des MTA4/β-Galaktosidase-Fusionsproteins, dessen virale Peptidsequenz in der Figur gezeigt ist, eingesetzt.
II. Verwendung
• Dieser Abschnitt beschreibt Verwendngen des antigenen Peptids der Erfindung für eine Diagnose einer HTLV-I-Infektion und als einen potentiellen Impfstoff gegen eine HTLV-I-Infektion.
A. Diagnostische Anwendungen
• Drei Grundtypen diagnostischer Anendngen des Peptidantigens werden beschrieben. Die erste basiert auf einer Hemmung einer komplementvermittelten, antikörperabhängigen Zytolyse durch das Peptid. In diesem Verfahren wird Serum eines Testindividuums mit HTLV-I-infizierten T-Zellklonen in Anwesenheit von Komplement umgesetzt. Die Anwesenheit von anti-HTLV-I Antikörper wird durch eine Zellyse angezeigt, wie beispielsweise durch einen Trypanblau-Farbstoffausschluß bestimmt. Wo eine Zellyse beobachtet wird, wird die Spezifität des anti-FfTLV-I Antikörpers für das IfILV-I-Peptid durch eine erste etzung des Serums mit überschüssigem Peptid und nachfolgendes Mischen des Serums mit Zellen in Anwesenheit von Komplement gezeigt. Die Antikörperspezifität wird durch eine substantielle Abnahme der Zellyse angezeigt. Dieses Verfahren wird in Beispiel VII beschrieben. Das Verfahren kann auch verwendet werden, um den Antikörpertiter in dem zu analysierenden Serum zu quantifizieren, indem das Serum mit ansteigenden Mengen des Peptids titriert und die Peptidkonzentration bestimmt wir, bei welcher eine beobachtbare Wirkung auf das Ausmaß der Zellyse zum ersten Mal festgestellt wird.
• Der zweite allgemeine Nachweistyp ist ein Festphasenimmunnachweis. In diesem Verfahren wird ein Festphasenreagens mit einem an dessen Oberfläche gebundenen Peptid mit einem zu analysierenden Serum umgesetzt unter Bedingungen, welche ein Binden von Antikörper an das Peptid auf dem Reagens erlauben. Nach einem Waschen des Reagens, um ungebundene Serumbestandteile zu entfernen, wird das Reagens mit einem mit einem Reportermolekul markierten, anti-human Antikörper umgesetzt, um Reportermolekule an das Reagens in einem Verhältnis zu der Menge von an das feste Trägermaterial gebundenem anti-HTLV-I Antikörper zu binden. Das Reagens wird erneut gewaschen, um ungebundenen markierten Antikörper zu entfernen, und die Menge an Reportermolekülen, welche mit dem Reagens assoziiert sind, wird bestimmt. Typischerweise, wie in dem in Beispiel VIII beschriebenen System, ist das Reportermolekül ein Enzym, welches nachgewiesen wird, indem das feste Reagens in Anwesenheit eines geeigneten fluorometrischen oder colorimetrischen Substrats inkubiert wird.
• Das feste Oberflächenreagens im vorstehend genannten Nachweisverfahren wird durch bekannte Verfahren zum Anheften von Proteinmaterial an ein festes Trägermaterial, wie polyinere Körnchen, Eintauchstreifen oder Filtermaterial, hergestellt. Diese Anheftverfahren umfassen im allgemeinen eine nicht spezifische Adsorption des Proteins an das Trägermaterial (wie bei dem in Beispiel VIII beschriebenen Filterträger) oder eine kovalente Anheftung des Proteins, typischerweise durch eine freie Aminogruppe, an eine chemisch reaktive Gruppe auf dem festen Trägermaterial, wie eine aktivierte Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aldehydgruppe.
• Der dritte allgemeine Nachweistyp ist ein homogenes Nachweisverfahren, in welchem ein Binden von Antikörper an einen festen Träger irgendeine Änderung im Reaktionsmedium hervorruft, welche direkt im Medium nachgewiesen werden kann. Bekannte allgemeine Typen homogener Nachweisverfahren, die bisher vorgeschlagen wurden, umfassen (a) Spin-markierte Reportersubstanzen, bei welchen ein Binden von Antikörper an das Antigen nachgewiesen wird durch eine Änderung in der Beweglichkeit der Reportersubstanz (Verbreiterung der Spinaufspaltungspeaks), (b) fluoreszierende Reportersubstanzen, bei welchen ein Binden durch eine Änderung in der Fluoreszenzausbeute nachgewiesen wird, (c) enzymatische Reportersubstanzen, bei welchen ein Binden von Antikörper Enzym-Substrat-Wechselwirkungen beeinflußt, und (d) Liposom-gebundene Reportersubstanzen, bei welchen ein Binden zu einer Lysis der Liposomen und einer Freisetzung von in diesen eingeschlossener Reportersubstanz führt. Die Anpassung dieser Verfahren an das Peptid der vorliegenden Erfindung folgt herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Reagentien für homogene Nachweisverfahren.
• Bei jedem der drei allgemeinen, vorstehend beschriebenen Nachweistypen umfaßt das Nachweisverfahren ein Umsetzen des Serums eines Testindividuums mit dem Antigen und ein Überprüfen des Antigens auf die Anwesenheit von gebundenem Antikörper. In dem ersten Nachweisverfahren wird die tberprufung vorgenommen, indem die Abnahme von Antikörper-vermittelter Zytolyse beobachtet wird, wenn der Antikörper an das Peptid gebunden wird. Bei dem Festphasennachweis umfaßt die Uberprüfung, einen markierten anti-human Antikörper an den zu untersuchenden Antikörper anzuheften und die Menge an an das feste Trägermaterial gebundener Reportersubstanz zu messen. Und bei dem dritten Nachweistyp wird die Überprüfung vorgenommen, indem die Wirkung einer Antikörperbindung auf ein Reagens eines homogenen Nachweisverfahrens beobachtet wird.
B. Pepitid-Impfstoff
• Das Peptidantigen der Erfindung kann auch als Impfstoff verwendet werden, um zytotoxische anti-HTLV-I Antikörper zu induzieren. Hier ist es wichtig, festzustellen, daß der monoklonale 0.5 α-Antikörper in Gegenwart von Kapplement für mit HTLV-I-Virus infizierte T-Zellen zytotoxisch ist. Das Peptid wird mit einem geeigneten Träger/Hilfsstoff formuliert und in periodischen Zeitabschnitten injiziert, bis ein signifikanter Titer zytotoxischer anti-V-I Antikörper im Serum nachgewiesen wird. Der Impfstoff sollte aufgrund Antikörper-vermittelter Zytotoxizität einen Schutz gegen eine HTLV-I-Infektion im Frühstadium bieten.
• Aus dem Vorangegangenen kann eingeschätzt werden, wie die verschiedenen Ziele und Eigenschaften der Erfindung erzielt werden. Das Peptidantigen der Erfindung zeigt spezifisch Reaktivität gegenüber einem anti-HTLV-I Antikörper, der eine adulte T-Zell-Leukämie diagnostiziert, und kann damit verwendet werden in einem schnellen und preiswerten Nachweisverfahren für T-Zell-Leukämie. Zugleich verursacht das Peptidantigen eine zytotoxische Antikörperantwort, wie durch den vorher vorliegenden monoklonalen 0.5 α-Antikörper definiert.
• Die folgenden Beispiele verdeutlichen verschiedene Gesichtspunkte der Erfindung, sollen jedoch in keiner Weise den Rahmen der Erfindung beschränken.
Materialien
• Die in den folgenden Beispielen verwendeten Materialien waren wie folgt: Enzyme: DNAse I und alkalische Phosphatase wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals (E, Indianapolis, IN) erhalten; EcoRI, EcoRI-Methylase, DNA-Ligase und Polymerase I wurden von New England Biolabs (NEB, Beverly, MA) und RNAse von Sigma (St. Louis, MO) erhalten.
• Andere Reagenzien: EcoRI-Linker wurden von NEB erhalten; Nitroblautetrazolium (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal) und Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPIG) wurden von Sigma erhalten.
Beispiel I
• Herstellung einer genomischen HTLV-1-Bank
• Quelle des enomischen Materials: Bakteriophagen mit einer integrierten, vollständigen, vom HTLV-I-Genom abgeleiteten DNA-Sequenz wurden von Drs. R.C. Gallo und F. Wong-Staal vom Laboratory of Tumor Cell Biology, National Institute of Health (Bethesda, MD) erhalten. Der Bakteriophage wurde vollständig mit SacI verdaut, wobei die integrierte Sequenz mit dem viralen Genom freigesetzt wurde. Das verdaute Material wurde einer Elektrophorese in einem Standard-l0%-Agarosegel unterworfen und das durch Elektroelution erhaltene 9,5 kBasen-Fragment wurde mit Phenol/Chloroform vor einer Ethanol-Präzipitation extrahiert.
• DNA-Verdau: Die gereinigte genomische DNA wurde in einem Standardverdauungspuffer (0,5 M Tris HCl, pH 7,5; 1 mg/ml BSA; 10 mM MnCl&sub2;) zu einer Konzentration von ungefähr l mg/ml suspendiert und mit DNAse I bei Raumtemperatur für ungefähr 5 Minuten verdaut. Diese Reaktionsbedingungen wurden in einer vorab durchgeführten Kalibrierungsstudie bestimmt, in welcher die Inkubationszeit ermittelt wurde, welche erforderlich war, um vorwiegend Fragmente mit 100-300 Basenpaaren zu erzeugen. Das Material wurde mit Phenol/Chloroform vor einer Ethanol-Präzipitation extrahiert.
• Anfügen von EcoRI-Linkern: Die genomischen Fragmente von oben wurden mittels DNA Pol I unter Standardbedingungen (Huynh) mit glatten Enden versehen, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das mit glatten Enden versehene Material wurde mit EcoRI-Linkern unter Standardbedingungen (Maniatis, S. 396 f.) ligiert, dann mit EcoRI verdaut, um redundante Linkerenden zu entfernen. Das Material wurde dann in einem Agarosegel aufgetrennt, um nicht ligierte Linker zu entfernen und nach der Größe auf zutrennen (siehe unten).
• Auftrennung nach Größe Die resultierenden Fragmente aus dem vorhergehenden Schritt wurden durch Elektrophorese (5-10 V/cm) auf einem 1,2% Agarosegel analysiert unter Verwendung von X174/HaeIII- und lambda/HindIII- Größenständards. Die Fraktion mit 100-300 Basenpaaren wurde auf NA45-Streifen (Schleicher und Schüll) eluiert, die dann in 1,5 ml Mikroreaktionsgefäße mit Elutionslösung (1 M NaCI, 50 mM Arginin, pH 9,0) gegeben und bei 67ºC 30-60 Minuten inkubiert wurden. Die jetzt in Lösung befindliche DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 20 ul TE (0,01 M Tris HCl, pH 7,5, 0,001 M EDTA) resuspendiert.
• Ligation in lambda gt11 und In-vitro-Verpackung: lambda-gt11-Phagenvektoren (Huynh) wurden von Promega Biotec (Madison, WI) erhalten. Dieser Klonierungsvektor besitzt eine einzige EcoRI-Klonierungsstelle 53 Basenpaare stromaufwärts vom β-Galaktosidasetranslationsterationskodon. Die genomischen Fragmente von oben wurden in die EcoRI-Schnittstelle eingefügt durch Mischen von 0,5 - 1,0 ug EcoRI-geschnittenem gt11, 0,5 - 3 ul der vorstehenden genomischen HTLV-I-Fragmente, 0,5 ul 10x Ligationspuffer
• (s.o.), 0,5 ul Ligase (200 Einheiten) und destilliertem Wasser auf 5 ul. Die Mischung wurde über Nacht bei 14ºC inknbiert, gefolgt von einer Invitro-Verpackung entsprechend Standardverfahren (Maniatis, S. 256-268).
• Die verpackten Phagen wurden verwendet, um E.coli, Stamm KM392, erhalten von Dr. Kevin Moore, DNAX (Palo Alto, CA), zu infizieren. Alternativ konnte E.coli, Stamm Y1090, erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC #37197), verwendet werden. Die infizierten Bakterien wurden ausplattiert und die resultierenden Kolonien auf einen Verlust ihrer β-Galaktosidaseaktivität überprüft -- (klare Plaques) in Anwesenheit von X-gal unter Verwendung eines Standard-X-gal-Substrat-Plaquenachweisverfahrens (Maniatis). Die nachstehende Tabelle I zeigt die Anzahl von rekombinanten (klaren) Plaques, die durch eine Insertion der HTLV-I-Fragmente mit EcoRI-Enden erhalten worden sind (Reihe 1). Eine Kontrolle mit EcoRI-Linker (Reihe 2) und eine Kontrolle ohne Hintergrund (Reihe 3) wurden ebenfalls untersucht. Wie ersehen werden kann, zeigten ungefähr 50% der Phagenplaques einen Enzymverlust (Rekombination). Die Hintergrundsniveaus entweder in An- oder Abwesenheit von EcoRI-Linkern waren geringer als 15%. Ungefähr 60% der Plaques zeigten einen Verlust von Enzymaktivität. Das Phagenmaterial enthielt ungefähr 106 Plaque-bildende Einheiten (pfu) /ml. TABELLE 1 Integrierte Sequenz Vektor klar/total % Rekombination Integrierte Sequenz aus SacI-Verdau 3,25 ul EcoRI-Linker 3,25 ul Kontrolle
Beispiel II Durchmustern nach für gp46 kodierenden integrierten Sequenzen
• Monoklonale Antikörper: Gereinigter, von einer humanen Zellinie (A HB8755) abgeleiteter 0.5 α-Antikörper wurde von Dr. Samuel Broder vom National Cancer Institute, National Institute of Health (Bethesda, MD), zur Verfügung gestellt. Kovalent mit alkalischer Phosphatase derivatisierte Maus-anti-humen IgG-Antikörper wurden von Promega Biotec (Madison, WI) erhalten.
• Identifizierung von rekombinantem gp46: Ein Rasen von mit ungefähr 10&sup4; pfu der Phagenstammlösung aus Beispiel I infizierten KM392-Zellen wurde auf einer 150 mm-Platte hergestellt und umgekehrt 5-8 Stunden bei 37ºC inkubiert. Der Rasen wurde mit einem Nitrocelluloseblatt überschichtet, was einen Transfer von sezerniertem rekombinantem HTLV-I-Protein von den Plaques auf das Papier verursachte. Die Platte und das Filter wurden mit Markierungen versehen, um entsprechende Platten- und Filterpositionen zur Deckung bringen zu können.
• Das Filter wurde zweimal in TBST-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gewaschen, mit MB blockiert (TBST-Puffer mit 1% Gelatine), nochmals in TBST gewaschen und über Nacht nach Zugabe von monoklonalem 0.5 -Antikörper (verdünnt auf 1-2 /ml in MB, 12-15 ml/Platte) inkubiert. Das Blatt wurde zweimal in TBST gewaschen und dann mit Enzymmarkiertem anti-human Antikörper in Kontakt gebracht, um den markierten Antikörper an Stellen auf dem Filter, welche von dem 0,5 u-Antikörper erkanntes Antigen enthielten, anzuheften. Nach einem abcschließenden Waschen wurde das Filter in einem Substratmedium entwickelt, welches 33 ul NBT (50 mg/ml Stammlösung bei 5ºC) gemischt mit 16 ul BCIP (50 mg/ml Stammlösung bei 5ºC) in 5 ml Puffer für alkalische Phosphatase (100 mM Tris, 9,5, 100 mM NaCl, 5 mMgCl&sub2;) enthielt. Eine purpurne Farbe erschien an Stellen einer Antigenproduktion, wie durch den 0.5 α-Antikörper erkannt.
• Zweites Ausplattieren: Die im vorangegangenen Schritt bestimmten Bereiche einer Antigenproduktion wurden erneut in einer Konzentration von ungefähr 100-200 pfu auf einer 82 un-Platte ausplattiert. Die vorstehend beschriebenen Schritte, beginnend mit einer 5-8 stündigen Inkubätion, bis zur Entwicklung mittels NBT/BCIP wurden wiederholt, um Plaques zu identifizieren, die ein Antigen sezernierten, welches mit dem 0.5 α-Antikörper reagieren konnte. Die identifizierten Plaques wurden mit einem sterilen Zahnstocher aufgenommen und in Phagenpuffer (Maniatis, S. 443) eluiert. Drei der rekombinanten Phagenplaques, die ein gegenüber dem Antikörper reaktives Peptid sezernierten, wurden für eine Sequenzanalyse ausgewählt entsprechend den Verfahren in Beispiel III. Die entsprechenden infektiösen Phagen wurden als MTA4, MTA1 und MTA5 bezeichnet.
Beispiel III Phagenreinigung und DNA-Extraktion
• Die Phagen MTA4, MTA1 und MTA5 wurden von Plattenkulturen von infizierten E.coli Y1088-Bakterien isoliert. Diese Zellen sind erhältlich von der ATCC (ATCC #31195). Das Plattenmaterial wurde vom bakteriellen Abfall durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gereinigt und der Überstand in SW27-Röhrchen gegossen. RNase und DNAse wurden jeweils in einer Konzentration von 1 ug/m1 aus Stammlösungen von jeweils 1 mg/ml zugegeben. Die Probe wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und ein gleiches Volumen einer Polyethylenglykol (PEG)-Lösung, die 20% PEG mit Molekulargewicht 8000, 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 1 M Tris Cl, pH 7,5, und 2% Gelatine enthielt, zugegeben. Die Probe wurde für 1 h in ein Eisbad gegeben, um die Phagenpartikel zu präzipitieren, die dann durch Zentrifugation bei 10 k für ungefähr 20 Minuten bei 4ºC isoliert wurden.
• Der Überstand wurde dekantiert, das Pellet in 0,6 ml PDB-Puffer (5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 50 ml 1 M Tris Cl, pH 7,5, und 5 ml 2% Gelatine) resuspendiert und in 1,5 ml Polypropylen-Mikroreaktionsgefäße überführt. 5 ul 10% SDS, 5 ul 0,5 M EDTA und 2,5 ul Proteinase K (20 mg/ml) wurden zugegeben und die Proben bei 50ºC 15 Minuten inkubiert.
• Das mit Detergens und Enzym behandelte Material wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol/chloroform extrahiert und zentrifugiert, um die Trennung der Phasen sicherzustellen. Die wäßrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Extraktions-Zentrifugationsverfahren wiederholt mit einer Mischung aus chloroform und Isoamylalkohol. Ein gleiches Volumen Isopropanol wurde zugegeben, die Probe mehmals umgewendet, um zu mischen, und 20 Minuten auf -70ºC gekühlt. Die Probe wurde 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde in 70% Ethanol gewaschen, kurz in einem Heizblock bei 37ºC getrocknet und in 100 ul TE-Puffer, pH 7,5, resuspendiert.
• Die isolierte Phagen-DNA wurde mit KpnI und SacI verdaut und dann mit einem mit KpnI/SacI geschnittenen Plasmidvektor pGEM-3 (Promega Biotec) zusamengegeben, um ein hinsichtlich der interessierenden zu integrierenden Sequenz rekombinantes Plasmid zu isolieren. Die integrierte HTLV-I-Sequenz wurde dann unter Verwendung des Standard-Dideoxy-Sequenzierungsverfahrens und vorwäts und rückwärts orientierter Starter-Oligonukleotide für die lambdagt11-Sequenzen, die die EcoRI-Insertionsstelle flankieren, sequenziert.
• Die Figur zeigt die kodierende Sequenz und entsprechende Aminosäuresequenz eines Abschnitts des durch die vorstehenden Verfahren hergestellten fusionierten Proteins für jedes der drei untersuchten fusionierten Peptide. Eine terminale G-Base des β-gal-Gens und die benachbarten CC-Basen des env-Gens trugen zu jeder der drei erhaltenen integrierten Sequenzen ein GCC (Ala)- Kodon bei, wodurch das 8er-Kodon, welches normalerweise an dieser Kodon- position sämtlicher drei integrierter HTLV-I-env-Sequenzen auftritt, ersetzt wird. Wie gezeigt, umfaßt die integrierte Sequenz im MTA4 eine Sequenz mit 225 Basenpaaren, die sich von der Base 5565 bis zur Base 5790 des kodierenden Bereichs des HTLV-I erstreckt, entsprechend den Aminosäuren 129 bis 203 (74 Aminosäuren) der gp46-Sequenz. Die integrierte Sequenz des MTA1 umfaßt eine Sequenz mit 143 Basenpaaren, die sich von der Base 5664 bis zur Base 5807 des kodierenden Bereichs des HTLV-I erstrecct, entsprechend den Aminosäuren 162 bis 209 (47 Aminosäuren) der gp46-Sequenz. Die integrierte Sequenz des MTA5-Phagen beginnt ebenfalls bei der Base 5664 und erstreckt sich bis zur Base 5895. Diese 231 Basenpaar-Sequenz beinhaltet die minosäuren 162 bis 239 (77 minosäuren) des gp46-Proteins.
• Der überlappende Bereich der integrierten Sequenzen von 5664 bis 5790 umfaßt die 41 Aminosäuren-Sequenz der Aminosäuren 161 bis 203 des nativen gp46-Proteins. Die Anzahl der Aminosäuren der drei Peptide wird berechnet unter Einbeziehung des unterbrochenen Ser-Kodons am 5'-Ende, welches durch ein Ala-Kodon in der transkribierten rekombinanten kodierenden Sequenz ersetzt wird, nicht jedoch unter Einbeziehung des unterbrochenen Kodons am 3'-Ende (welches im rekombinanten Peptid nicht translatiert wird). Aus diesem Grund haben die hier beschriebenen Peptide (a) weniger als ungefähr 80 Aminosäuren Länge und enthalten (b) den immunogenen Bereich, der durch die Amihosäuresequenz Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp- Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro- His-Ser-Asn-LeuAsp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser gebildet wird, welcher gegenüber dem von der durch die ATCC-Nr. HB8755 charakterisierten Zellinie produzierten anti-HTLV-I Antikörper iinmreaktiv ist.
Beispiel IV Konstruktion lysogener Zellen
• Der E.coli Stamm C600 wurde von Dr. R. Davis, Stanford Uiversitv (Stanford, CA) erhalten. Alternativ können E.coli Y1089 (ATCC #37196) verwendet werden. Eine gesättigte 1 ml Übernachtkultur der Zellen wurde mit einem der drei Phagen aus Beispiel III infiziert, indem 10 ul der eluierten Phagenstammlösung in 50 ul der bakteriellen Übernachtkultur aufgenommen wurden. Die infizierten Bakterien wurden auf LB-Agar-Platten (Maniatis, S. 440) ausgebreitet und bei 32ºC inkubiert. Die individuellen Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und auf entsprechende Rasterpositionen auf zwei getrennten Platten übertragen. Eine der Platten wurde bei 32ºC inkubiert und die andere bei 42ºC. Zellen, die bei der niedrigeren Temperatur wuchsen (was ein lysogenes Stadium anzeigt, welches durch die Anwesenheit des Phagenrepressorproteins hervorgerufen wird), aber nicht bei der höheren Temperatur (aufgrund einer Zellyse) wurde als lysogen angesehen. Viele lysogene Kolonien wurden von jedem der drei Phagentypen gefunden. Beispiel V Induktion von rekombinantem Antigen in lvsoenen Zellen
• Dieses Beispiel bechreibt die Induktion eines rekombinanten Proteins, welches das HTLV-I-Epitop enthält, in den in Beispiel IV mit dem MTA4-Phagen hergestellten, lambda-gt11-lysogenen Zellen. Wie vorstehend angesprochen, wird das Antigen in Form eines β-Galaktosidasefusionsproteins gebildet, welches auch einen N-terminalen Bereich des β-gal-Proteins des Phagen enthält.
• Eine Superbrühe wurde hergestellt, welche 35 g Baktotrypton, 2 g Baktohefeextrakt, 5 g NaCl und 5 ml 1N NaOH in 1 l destilliertem Wasser enthielt. 500 ml Superbrühe wurden im Verhältnis 1:100 mit einer gesättigten Übernachtkultur der lambda-gt11-lysogenen E.coli-Zellen, welche im vorangegangenen Beispiel hergestellt worden waren, angeimpft. Die Kultur wurde bis zu A&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 0,4 - 0,5 unter intensiver Belüftung inkubiert.
• Um die Proteinproduktion zu maximieren, wurde die Temperatur der Kultur auf 43-44 ºC erhöht, wodurch das temperaturempfindliche β-Galaktosidaserepressorgen inaktiviert wurde. Die Temperatur wurde bei 43ºC mittels eines Wasserbades mit einer Temperatur von 65ºC für 15 Minuten gehalten unter Belüftung. IPTG, welches die β-Galaktosidaseexpression induziert, indem es kom-petitiv an den β-gal-Repressor bindet, wurde zu der Brühe in einer Konzentration von 10 mM zugegeben, um die Proteinproduktion weiter zu steigern. Die Kultur wurde für ungefähr eine Stunde in den 38ºC-Schüttler zurückgegeben. Die Zellen wurden dann bei 6000 g 15 Minuten bei 37ºC pelletiert, in Lysispuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 2% Triton(R) X-100, 1% Aprotinin und 50 ug PMSF) resuspendiert und sofort in flüssigen N&sub2; getaucht. Die Lyse wurde im Zuge des Auftauens der gefrorenen Proben vervollständigt.
Beispiel VI Reinigung des Fusionsproteins
• Das im vorangegangenen Beispiel erhaltene Zellysat wurde aufgetaut und auf 37ºC erwärmt. 10 ul DNAse (1 ug/ml) wurden zugegeben und die Mischung inkubiert, bis die Viskosität abnahm. Das Lysat wurde auf Eis rasch abgekühlt, bei 4ºC 5 Minuten in einer Mikrofuge geklärt und auf eine 6 ml Säule mit anti-β-Galaktosidase, gekoppelt an Sepharose(R) 4B (Phaamacia), aufgetragen. Man ließ die Säule 1-2 h äquilibrieren und wusch mit 7 Volumina (Säulenvolumina) TX-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 2% Triton(R) X-100, 50 ug/ml PMSF), gefolgt von 2 Volumina 5 mM 3,5-Diiodsalicylsäure in TX-Puffer. Das Fusionsprotein wurde dann von der Säule mit 35mM 3,5-Diiodsalicylsäure in D-Puffer eluiert. Die Hauptmenge des Proteins wurde in den ersten 3-4 Volumina eluiert und die Entfernung war im wesentlichen nach 7 Volumina vollständig.
• Die eluierten Proben wurden unter Verwendung von Amicon-Filtern (Danvers, MA) entsalzt und konzentriert.
Beispiel VII Inhibition einer Konplement-vermittelten Zytolyse
• HUT 102-B2-Zellen wurden von Dr. R.C. Gallo, LTCB, NIH, erhalten. Dies ist eine über lange Zeit kultivierte T-Zellinie, von der bekannt ist, daß sie HTLV-I produziert.
• 0.5 α-Antikörper (ungefähr 5 ug/ml IgG) oder ein human IgG mit einem mit diesem übereinstimmenden Isotyp wurden mit MTA4-rekombinantem Peptid oder einem irrelevanten rekombinanten Peptid 30 Minuten bei Raumtemperatur präinkubiert. 50 ul dieser Mischungen wurden dann zu 5 x 10&sup5; HUT 102-B2- Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. 30 ul Kaninchen-Komplement wurden pro Vertiefung zugegeben und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch mikroskopische Überprüfung bestimmt. Die Zellyse wurde sichtbar durch die Zugabe des MTA4-Peptidantigens gehemmt, jedoch nicht durch eine Präinkubation mit dem irrelevanten rekombinanten Peptidantigen. Human IgG mit übereinstimmendem Isotyp hatte nach Präinkubation mit entweder dem rekombinanten Antigen oder dem irrelevanten rekombinanten Peptidantigen keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der HUT 102-B2-Zellen.
Beispiel VIII Festphasennachweisverfahren
• Gereinigtes MTA-Peptidantigen wurde wie in Beispiel IV hergestellt und in Punktform auf Nitrocellulosefilter geblottet, die dann in einem Festphseennachweisverfahren zur Bestimmnng von Serumantikörpern in Patienten mit T-Zell-Leukämie (6 Patienten mit HTLV-I-Infektion) verwendet wurden. In jedem Fall wurden 0,1 ml verschiedener Serumverdünnungen von dem Testindividuum, im Bereich von 1:100 bis 1:50000, zu dem Filter gegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten umgesetzt. Das Filter wurde dann zweimal mit TBST-Puffer (Beispiel II) gewaschen und wie in Beispiel II mit mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-human Antikörper inkubiert. Die Anwesenheit von Antikörper wurde durch Farbentwicklung mittels NBT und BCIP, ebenfalls wie in Beispiel II, nachgewiesen.

Claims (8)

1. Ein rekombinantes Peptid-Antigen, welches

a) vom HTLV-I-Hüllprotein gp46 abgeleitet ist und den immunogenen Bereich, welcher durch die Aminosäuresequenz Leu-Leu-Val- Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro- Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn- Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser gebildet wird, umfaßt, und

b) gegenüber einem anti-HTLV-I-Antikörper, welcher von der durch die ATCC-Nummer HB8755 charakterisierten Zellinie hergestellt wird, immunreaktiv ist.

2. Das rekombinante Peptid-Antigen des Anspruchs 1, welches ein nicht glykosyliertes Fusionsprotein mit β-Galaktosidase ist.

3. Das rekombinante Peptid-Antigen des Anspruchs 1, welches die 41 Aminosäuren der genannten Aminosäuresequenz umfaßt.

4. Verfahren zum Nachweis einer HTLV-I-Infektion in einem Testindividuum, welches umfaßt

(i) Serum des Testindividuums mit einem Antigen reagieren zu lassen, welches

(a) ein rekombinantes Peptid ist, welches vom HTLV-I-Hüllprotein gp46 abgeleitet ist und den immunogenen Bereich, welcher durch die Aminosäuresequenz Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly- Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro- Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu- Glu-Pro-Ser gebildet wird, umfaßt, und

b) gegenüber einem anti-HTLV-I-Antikörper, welcher von der durch die ATCC-Nummer HB8755 charakterisierten Zellinie hergestellt wird, immunreaktiv ist, und

(ii) das Antigen auf das Vorliegen von gebundenem Antikörper zu untersuchen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem das bereitgestellte Antigen an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Reagierenlassen ein Inkontaktbringen eines solchen Serums mit dem Träger umfaßt und das Untersuchen ein Reagierenlassen des Trägers und des gebundenen Antikörpers mit einem anti-humanen, mit einem Reportermolekül markierten Antikörper umfaßt.

6. Ein Kit zum Sicherstellen eines Vorliegens von Antikörpern gegen HTLV-I, umfassend

(i) einen festen Träger mit einem an dessen Oberfläche gebundenen Peptid-Antigen, welches

(a) vom HTLV-I-Hüllprotein gp46 abgeleitet ist und den immunogenen Bereich, welcher durch die Aminosäuresequenz Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn- Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro- His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser gebildet wird, umfaßt, und

b) gegenüber einem anti-HTLV-I-Antikörper, welcher von der durch die ATCC-Nummer HB8755 charakterisierten Zellinie hergestellt wird, immunreaktiv ist, und

(ii) einen anti-humanen, mit einem Reportermolekül markierten Antikörper.

7. Ein Kit nach Anspruch 6, wobei das oberflächengebundene Peptid-Antigen wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist.

8. Ein Impfstoff zur Immunisierung eines Individuums gegen T-Zell-Leukämie, welches in einem pharmakologisch geeigneten Hilfsstoff ein rekombinantes Peptid umfaßt, welches

(a) vom HTLV-I-Hüllprotein gp46 abgeleitet ist und den immunogenen Bereich, welcher durch die Aminosäuresequenz Leu-Leu-Val- Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro- Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn- Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser gebildet wird, umfaßt, und

b) gegenüber einem anti-HTLV-I-Antikörper, welcher von der durch die ATCC-Nummer HB8755 charakterisierten Zellinie hergestellt wird, immunreaktiv ist.