DE3789884T2

DE3789884T2 - Verfahren zur Bestimmung des intrazellularen Mineralgehaltes.

Info

Publication number: DE3789884T2
Application number: DE3789884T
Authority: DE
Inventors: Burton B Silver
Original assignee: Spectro Scan Inc
Current assignee: Spectro Scan Inc
Priority date: 1986-06-26
Filing date: 1987-06-22
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2007-06-23
Also published as: US4717826A; DE3789884D1; JPS6325536A; DK323287A; JPH083468B2; DK165931C; EP0254864B1; DK165931B; DK323287D0; EP0254864A3; EP0254864A2; ATE106144T1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein energiedispersive Analysen von intrazellulären Mineralkonzentrationen, und insbesondere Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Mineralstoffen mit niedrigem Molekulargewicht in relativ kleinen Gewebeproben und die Herstellung einer Beziehung zwischen derartigen Konzentrationen und einer Erkrankung sowie dem metabolischen Status.
Eine Vielzahl von Mineralstoffen mit niedrigem Molekulargewicht wie Kalzium, Phosphor, Kalium, Magnesium, Natrium und Chlor sind für ein ordentliches Wachstum, die Entwicklung und die Funktionsfähigkeit des Gewebes wichtig. Bisher hat die Forschung versucht, Serumspiegel dieser Mineralstoffe in Beziehung zu der Erkrankung und dem metabolischen Status von Patienten zu setzen. Serumspiegel der Mineralstoffe sind jedoch nicht notwendigerweise ein Maß für die intrazellulären Konzentrationen der Mineralstoffe zu jeder gegebenen Zeit. Tatsächlich wurde unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung beobachtet, daß die intrazellulären Mineralspiegel viel eher auf Erkrankungsbedingungen und andere Streßfaktoren reagieren als die Serumspiegel dieser Mineralstoffe.
Die Bestimmung von intrazellulären Mineralkonzentrationen ist jedoch problematisch. Vorbekannte Methoden wie die Atomabsorption erfordern relativ große Gewebeproben, damit die gewünschte Information erhalten werden kann. Während derartige Proben durch chirurgische Methoden erhalten werden können, ist dieser Ansatz für Routineüberwachungen von asymptomatischen Patienten kaum erwünscht. Einige Forscher haben versucht, dieses Problem dadurch zu umgehen, daß sie Lymphocyten als zelluläre Quelle verwenden. Die Verwendung von Lymphocyten ist jedoch unglücklicherweise nicht allgemein von Nutzen, da ihre intrazellulären Mineralkonzentrationen nicht notwendigerweise denjenigen im Körpergewebe entsprechen, und sie weisen ein großes Verhältnis von Kern zu Cytoplasma auf. Weiterhin wird der Status der Lymphocyten stark durch das Vorhandensein einer Infektion und dem Status der Immunreaktion beeinflußt. Weiterhin scheinen die Methoden zur Isolierung von Lymphocyten eine Auswirkung auf die gemessenen Spiegel der intrazellulären Mineralien zu haben.
Aus diesen Gründen wäre es erwünscht, wenn verbesserte Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von intrazellulären Mineralien zur Verfügung stünden, und zwar aus relativ kleinen Gewebeproben, die durch nicht-invasive Methoden erhalten werden können. Es wäre weiterhin erwünscht, daß diese Methoden Messungen der intrazellulären Konzentration sämtlicher interessierender Mineralstoffe mit hoher Genauigkeit ermöglichen, weiterhin Messungen eines absoluten Konzentrationswertes und nicht eines Verhältnisses von Mineralwerten, und zudem Informationen darüber liefern, die mit der Krankheit und dem metabolischen Status des untersuchten Patienten korreliert werden können.
Intrazelluläre Mineralkonzentrationen sind mit einer Anzahl von Erkrankungen in Beziehung gesetzt worden. Magnesium und andere Minerale sind in Beziehung zu einer kardiovaskulären Erkrankung, Ischämie, kardialer Nekrose und einer Empfindlichkeit gegenüber kardiotoxischen Agentien gesetzt worden und sollen eine Wirkung auf die Koronarblutströmung, die Blutgerinnung und die Artherogenese haben. Seelig und Heggtveit (1974), Amer. J. Clin. Nutrition 27: 59-79. Die kardiovaskuläre Erkrankung und die Beziehung zu durch Serum-, Blut- und Gewebeanalyse identifizierten Minerale sind von vielen Forschern beschrieben worden. Vgl. z. B. Abraham (1977), N. Engl.
J. Med. 296: 862-863; Dyckner (1979) A. Heart J. 97: 12-18; Whang (1981) Acta. Med. Scand. 647: 139-144; Levine (1984) N. Engl. J. Med. 310: 1253-1254 und Levin (1985) Cardiovascular Med., Oktober: 37-42. Hook et al. (1985) J. Am. Coll. Nutrition 4 : 332, Abstract 52, 26th Annual Meeting of the American College of Nutrition and the Fourth International Symposium on Magnesium beschreiben den Einsatz einer Mikroanalyse mit Elektrodensonden für die Bestimmung von Magnesium in mononuklearen Zellen des peripheren Blutes.
Die Bestimmung von intrazellulären Magnesium/Kalzium- Verhältnissen und die Beziehung derartiger Verhältnisse zu Patienten mit diagnostizierten kardiovaskulären Erkrankungen wurde zuerst von dem Erfinder in Federation Proceedings, Bd. 42, März 1983, und bei dem "International Symposium on Magnesium and its Relationship to Cardiovascular, Renal and Metabolic Disorders", Los Angeles, Kalifornien, im Februar 1985 beschrieben. In dem Vortrag wurden auch die Veränderungen der Kalzium- und Magnesiumspiegel bei Athleten vor und nach sportlichen Wettkämpfen diskutiert. Eine Veröffentlichung auf der Grundlage des früheren Vortrages wurde anschließend in Magnesium: Experimental and Clinical Research, 2: 210-211, November 1985, gedruckt.

Zusammenfassung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung ist auf ein nicht-invasives Verfahren für die quantitative Bestimmung von intrazellulären Mineralkonzentrationen in Gewebeproben gerichtet; sie ist weiterhin auf die Korrelation von derartigen Mineralkonzentrationen mit Krankheiten und dem metabolischen Status von Patienten gerichtet, insbesondere kardiovaskuläre Erkrankungen, Hochdruck und metabolische Knochenerkrankungen wie Osteoporose. Die intrazellulären Mineralkonzentrationen werden bestimmt, indem man eine kleine Gewebeprobe, die so wenig wie 1 bis 3 Zellen umfassen kann, einer Exzitationsbestrahlung aussetzt und eine Fluoreszenz bestimmt, d. h. eine Strahlung, die als Ergebnis der Exposition der Minerale der Exzitationsbestrahlung emittiert wird, und zwar innerhalb bestimmter, vorgewählter Energiebanden. Die Intensität der Fluoreszenz innerhalb jeder Energiebande ist proportional zu der intrazellulären Konzentration eines speziellen Minerals, und die Untersuchung von zahlreichen Personen ermöglichte die Korrelation derartiger intrazellulärer Mineralkonzentrationen mit bestimmten Erkrankungen und metabolischen Zuständen.
Das Verfahren der Erfindung umfaßt die folgenden Merkmale:
Exposition eines Gewebezellabstrichs einem Rasterelektronenstrahl mit einer Energie im Bereich von 5 bis 15 keV;
Sichtbarmachung individueller Zellen in dem Abstrich mittels eines Sekundärelektronendetektors;
Identifizierung mindestens einer lebensfähigen, individuellen Zelle auf der Basis vorher festgelegter Auswahlkriterien;
Abtasten der einen lebensfähigen Zelle mit dem Elektronenstrahl;
Messung der Intensität der von der einen lebensfähigen Zelle innerhalb mindestens einer für ein spezielles Mineral charakteristischen Energiebande emittierten Fluoreszenz; und
Bestimmung der intrazellulären Konzentration des Minerals durch Vergleich der gemessenen Intensität der Fluoreszenz mit einer Messung der Hintergrundfluoreszenz bei einer zweiten Energiebande.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den nachfolgenden Ansprüchen 2 bis 4.
In einer spezifischen Ausführungsform werden sublinguale Zellen durch einen Abstrich gewonnen und auf einem geeigneten Substrat fixiert. Die Zellen werden dann einer Exzitationsbestrahlung mit einer Energie im Bereich von etwa 8 bis 12 keV ausgesetzt, und die sich ergebende Fluoreszenz wird in einer Vielzahl von speziellen Energiebanden entsprechend den gewünschten Mineralien gemessen, typischerweise Magnesium, Kalzium, Kalium, Natrium, Chlor und Phosphor. Anschließend wird ein normalisierter Wert der Mineralkonzentration erhalten, indem man die gemessene Fluoreszenz mit einer Hintergrundfluoreszenz vergleicht, welche typischerweise erhalten wird, indem man die emittierte Strahlung bei einer Bande, die frei von zu erwartenden Fluoreszenz-Peaks ist, mißt. Der normalisierte Wert ist das Verhältnis der Fluoreszenz innerhalb der Mineralbande zu der Fluoreszenz in der Bande, von der angenommen wird, daß sie von Peaks frei ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Methoden zur Verfügung gestellt, um intrazelluläre Mineralkonzentrationen zu bestimmen, wobei die Konzentrationen Anzeichen für den kardiovaskulären und metabolischen Status darstellen. Die Verfahren gestatten die quantitative Messung von biologisch wichtigen Mineralen, einschließlich Magnesium, Kalzium, Phosphor, Kalium, Natrium und Chlor, und liefern weiterhin diagnostische Richtlinien, um diese Konzentrationen in eine Beziehung zu der Anwesenheit oder der Empfänglichkeit für eine kardiovaskuläre Erkrankung, Hochdruck, Osteoporose und periodontalen Knochenverlust zu setzen. Das Verfahren ist geeignet, um mit sehr kleinen Gewebeproben verwendet zu werden, z. B. sublinguale Gewebeabstriche; es kann jedoch mit jeder Quelle von lebenden, vorzugsweise nukleierten, aeroben Zellen oder Gewebe ausgeführt werden. Die Minerale werden bestimmt, indem man die zelluläre Probe einer Exzitationsbestrahlung aussetzt, typischerweise einem Elektronenstrahl hoher Energie, und indem man die Intensität der Fluoreszenz bei bestimmten Energiebanden, die für die interessierenden Mineralstoffe charakteristisch sind, mißt. Indem man die Messung der vorliegenden Erfindung bei Patienten mit einer kardiovaskulären Erkrankung oder einer Osteoporose oder einer periodontalen Erkrankung durchführte, und indem man die Ergebnisse mit Versuchen an einer Population von Personen ohne Symptome verglich, konnten Profile von intrazellulären Mineralen entwickelt werden, die charakteristisch für kardiovaskuläre Erkrankungen, Osteoporose und periodontalen Knochenschwund sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden individuelle Gewebezellen untersucht, die von einem Patienten erhalten wurden. Eine Vielzahl von zellulären Quellen sind geeignet, wobei das Haupterfordernis ist, daß die Zellen lebensfähig, vorzugsweise nukleiert, sind und eine Oberflächen-Ultrastruktur oder Mikrovilli zeigen. Derartige Zellen werden normalerweise mit Biopsien, Vaginalabstrichen, Sputum, sublingualen Abstrichen und dergleichen erhalten. Bevorzugt sind sublinguale Abstriche, die in leichter Weise erhalten werden können und Zellen liefern, die in hohem Ausmaß charakteristisch für den gesamten zellulären Metabolismus der Patienten sind. Das Verfahren der Erfindung kann ebenfalls eingesetzt werden, um die intrazellulären Mineralkonzentrationen in Serumproben zu bestimmen, welche Lymphocyten und Erythrocyten einschließen. Es wird jedoch angenommen, daß die Mineralkonzentrationen in diesen Proben nicht repräsentativ für die Gesamterkrankung und den metabolischen Status des Patienten sind.
Sublinguale Abstriche werden in bequemer Weise erhalten, indem man kräftig die mucösen Membranen am Grund des Mundes in der Nähe des Frenulums schabt, um kürzlich ersetzte, nukleierte Epithelzellen zu erhalten. Vor dem Schaben sollte die Mundhöhle mehrere Male mit destilliertem Wasser gespült werden, und der Patient sollte innerhalb einer Stunde vor dem Test nicht gegessen haben. Der für das Schaben verwendete Spatel muß frei von Spurenelementen und anderen Materialien sein, die die Elektronenfluoreszenz stören, welche zur Messung der interessierenden Mineralien verwendet wird (wie im folgenden eingehend beschrieben wird). Der Spatel sollte kräftig geführt werden, um die erforderliche Zellprobe zu ergeben, jedoch nicht in dem Ausmaß, daß Schmerz oder eine Blutung entsteht.
Die Zellen auf dem Spatel werden auf ein Betrachtungssubstrat (wie im folgenden eingehend erläutert wird) übertragen, und es wird eine Ausstrichbewegung verwendet, um die Zellen über eine vorbestimmte Fläche gleichmäßig zu verteilen. Während der Ausstrich noch frisch ist, wird ein mildes Fixativ auf die Zellen getropft, und man läßt es trocknen. Geeignete Fixative sollten frei von Substanzen sein, die unter Elektronenbeschuß fluoreszieren und den Versuch stören könnten. Ein geeignetes Fixativ ist 95% Ethylalkohol und 2,5% Carbowax, erhältlich von der Medical Packaging Corporation, Panorama City, Kalifornien, unter der Handelsbezeichnung Cytology Fixative. Ein weiteres geeignetes Fixativ besteht aus 84,2% Isopropylalkohol und 6,4% Polyethylenglykol, wobei der Rest ein Spraytreibmittel ist. Dieses Fixativ wird unter dem Warenzeichen Spray-Cyte von Clay Adams, Division of Becton-Dickenson, Parsippany, New Jersey, vertrieben. Sobald der Ausstrich lufttrocken ist, kann er gelagert oder zu einem zentralen Laboratorium für die Untersuchung transportiert werden; er kann auch augenblicklich untersucht werden.
Die Betrachtungssubstrate müssen leitfähig und frei von Materialien sein, die die zu erwartenden Fluoreszenzmuster aus den zellulären Mineralien stören könnten. Insbesondere geeignet sind Objektträger oder Planchetten aus hochreinem Kohlenstoff, die typischerweise Abmessungen von 1 · 2 Zoll haben. Die Objektträger können aus GTA Grade Grafoil R hergestellt werden, das von der Union Carbide Corp., Danbury, Connecticut, erhältlich ist. Gewöhnlich wird eine kleine Betrachtungsfläche auf dem Objektträger aufgedruckt oder in anderer Weise aus gebildet werden, um eine geeignete Plazierung der Gewebeprobe zu zeigen. Die Betrachtungssubstrate können auch aus anderen Materialien hergestellt werden, z. B. aus Glas oder Kunststoff; es wird jedoch erforderlich sein, auf der Oberfläche eine leitfähige Schicht abzusetzen, damit das
Rasterelektronen-Mikroskop in der im folgenden beschriebenen Weise betätigt werden kann.
Die Messung der intrazellulären Mineralkonzentrationen hängt von dem Beschuß der zellulären Probe mit hochenergetischer Bestrahlung, typischerweise Elektronen- oder Röntgenstrahlen, ab. Die Energie dieser Strahlung wird teilweise auf die Atome der Probe einschließlich der interessierenden Minerale übertragen, und in einem Teil der Wechselwirkungen führt die übertragene Energie zu einer Fluoreszenz einer Sekundärstrahlung, typischerweise Röntgenstrahlen. Die Röntgenstrahlen- Energielinien oder -Banden der Fluoreszenz von einem speziellen Atom oder Element sind in einzigartiger Weise charakteristisch für das spezielle Atom oder Element. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Messung der Fluoreszenz innerhalb dieser charakteristischen Röntgenstrahlen-Banden, damit die Konzentration der in den Zellen vorhandenen Minerale bestimmt werden kann.
Die Energiequelle muß ausreichend Energie aufweisen, um die interessierenden biologischen Minerale anzuregen; sie muß auch fokussierbar sein, da es erwünscht ist, einzelne Zellen ohne Anregung der umgebenden Zellen anzuregen. Die Verwendung einer Elektronen- oder Röntgenstrahlung erfüllt im allgemeinen diese Anforderungen.
Eine weitere Anforderung gemäß der vorliegenden Erfindung ist diejenige, daß die Zellen während der Untersuchung sichtbar sind. Eine derartige Sichtbarmachung ermöglicht es, daß die einzelnen Zellen abgetastet werden können, so daß lebensfähige unbeschädigte Zellen für die Anregung ausgewählt werden können. Wegen des Erfordernisses der Sichtbarmachung hat es sich als besonders geeignet erwiesen, handelsübliche Rasterelektronen-Mikroskope zu verwenden, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Derartige Mikroskope liefern Elektronenstrahlen mit Energien in dem interessierenden Bereich von 8 bis 12 keV, und ermöglichen die Fokussierung der Elektronenstrahlen und die Sichtbarmachung der zellulären Probe bei einer Vielzahl von Vergrößerungen.
Die vorliegende Erfindung erfordert auch ein System für die Bestimmung der Fluoreszenz, die von den Gewebezellen emittiert wird, wenn diese mit der Elektronenanregungsbestrahlung bombardiert werden. Das Meßsystem sollte eine Unterscheidung innerhalb der interessierenden Energiebanden ermöglichen, typischerweise zwischen etwa 500 bis 5000 KeV. Geeignete Detektoren schließen Silizium-Lithium-Detektorröhren ein, die im Handel von einer Anzahl von Lieferanten erhältlich sind, einschließlich Princeton Gamma Tech, Princeton, New Jersey.
Die beobachteten Emissionsbanden fallen allgemein in den Bereich von etwa 500 bis 5000 KeV, wobei die besonderen ausgewählten Banden frei von der Interferenz anderer Quellen sind. Emissionsbanden, die den 6 interessierenden Mineralen entsprechen, zusammen mit 2 Hintergrundemissionsbanden, die ausgewählt wurden, weil sie frei von Emissionen unter den Bedingungen des vorliegenden Tests sind, werden in Tabelle 1 aufgeführt. Im allgemeinen erfordert das Verfahren der vorliegenden Erfindung, daß Emissionszählungen von den Gewebeproben in jeder der gewünschten Emissionsbanden für eine vorbestimmte Zeitspanne integriert werden. Derartige Emissionen im Vergleich zu den Hintergrundemissionen, wie im folgenden eingehender beschrieben wird, können direkt in Beziehung zu den absoluten Mineralkonzentrationen in einer einzelnen Zelle gesetzt werden. Gewöhnlich wird eine Anzahl von einzelnen Zellen getestet, und die zellulären Konzentrationen werden als Durchschnitt ermittelt. Tabelle 1 Element Bandengrenze breit eng Hintergrund Magnesium Phosphor Natrium Chlor Kalium Kalzium Hintergrund
Nachdem die gewünschte Gewebeprobe auf den Kohlenstoffträger aufgebracht und fixiert wurde, kann der Kohlenstoffträger in den Probenhalter des Elektronenraster-Mikroskops gesetzt werden, und es kann ein Arbeitsvakuum in der Probenkammer erzeugt werden. Es wurde gefunden, daß der relative Winkel der Probe zu dem Elektronenstrahl eine Auswirkung auf die Sichtbarmachung und Exzitation der einzelnen Zellen hat. Es ist bevorzugt, daß der Einfallswinkel zwischen dem Elektronenstrahl und dem Kohlenstoffträger auf unterhalb etwa 600 verringert wird, vorzugsweise unterhalb etwa 500, insbesondere bevorzugt unterhalb etwa 300. Ein kleinerer Einfallswinkel scheint die Emission von Sekundärelektronen zu verbessern, welche sowohl das visuelle Bild liefern als auch die Röntgenstrahlenfluoreszenz induzieren. Weiterhin scheint der Winkel die Penetration der Elektronen durch die gesamte Zelle zu maximieren, wodurch gewährleistet wird, daß die gesamte Mineralkonzentration beobachtet wird. Unter Verwendung eines üblichen Elektronenmikroskops mit einem vertikalen Elektronenstrahl kann der Einfallswinkel verringert werden, indem man den Probenhalter nach oben aus der Horizontalen kippt.
Wenn der die zelluläre Probe haltende Träger an Ort und Stelle und das Vakuum angelegt ist, wird das Mikroskop eingeschaltet, und zwar mit einer Vergrößerung im Bereich von etwa 250 bis 300-fach; dies zeigt gewöhnlich etwa mehrere hundert individuelle Zellen. Der Benutzer sollte Zellen auswählen, die nukleiert und unbeschädigt sind und Mikrovilli oder diskrete Ultrastrukturen der Membran zeigen. Nach dem Auswählen einer derartigen Zelle wird die Vergrößerung gesteigert, bis nur diese Zelle auf dem Bildschirm des Mikroskops erscheint. Wegen der Natur des Mikroskops ist die Meßfläche des Elektronenstrahls auf diese einzelne Zelle verringert worden, und die einfallende Strahlung trifft nicht auf andere Zellen auf dem Träger.
Wenn die einzelne Zelle eingestellt worden ist, wird der Röntgenstrahlen-Fluoreszenzdetektor eingeschaltet, und das emittierte Bestrahlungsmuster wird für eine vorgewählte Vergrößerungszeit beobachtet, typischerweise etwa 100 Sekunden. Der Detektor ist mit einem Zähler verbunden, typischerweise ein durch einen Computer kontrollierter Zähler, der die Strahlungszählungen in jeder interessierenden Energiebande aufzeichnet. Nach der vorgewählten Meßzeit erfolgt somit eine Messung der gesamten Emission in jeder Bande. Dieses Verfahren wird für eine gewünschte Anzahl von Zellen wiederholt, typischerweise im Bereich von 10 bis 100, insbesondere im Bereich von 15 bis 25. Wenn die gesamten Daten gesammelt worden sind, werden die Durchschnitte für die Energieemissionen pro Zelle berechnet. Nach dem Erhalt der durchschnittlichen Energieemission jeder interessierenden Energiebande einschließlich der Hintergrund-Energiebanden ist es erforderlich, die Mineralkonzentrationen innerhalb der Zellen zu berechnen.
Aufgrund der Natur des Systems ist es möglich, direkt Konzentrationen in üblichen Einheiten zu berechnen, z. B. in Meq/L. Unter Verwendung von geeichten, individuellen Vergleichsstandards ist es möglich, direkt Konzentrationen zu berechnen, und zwar unter Verwendung der gleichen Bedingungen während der Messung, z. B. Masse pro Zelle oder Volumen, gemäß der folgenden Gleichung:
C = SP/STD (Meq(STD))
wobei:
C = unbekannte Mineralkonzentration
SP = Probenzählungen
STD = Standardzählungen
Meq(STD) = Standardmineralkonzentrationen
bedeuten.
* nach der Normalisierung des Standards gegen Unbekannt durch Abzug des Hintergundes
Alternativ kann die vorliegende Erfindung willkürliche Konzentrationseinheiten verwenden, die als Fluoreszenzzählungen pro Einheitsvolumen definiert sind, wobei das Einheitsvolumen als das Volumen einer einzelnen Zelle gesetzt wird, etwa 800 um³.
Die. Spannungskontrolle der Elektronenkanone in dem Elektronenmikroskop erfolgt in dem Bereich von etwa 5 bis 15 keV, vorzugsweise etwa 8 bis 12 keV, was dem Exzitationsbereich des interessierenden biologischen Minerals entspricht. Höhere Spannungen können leicht Röntgenstrahlen von schwereren Elementen stimulieren, und sie können nicht die leichteren Elemente in wirksamer Weise stimulieren, z. B. Natrium und Magnesium. Spannungen unterhalb von 5 keV können nicht in ausreichendem Maße die schwereren biologischen Minerale anregen. Üblicherweise wird eine Anregungsspannung von 12 keV gewählt. Es ist zu beachten, daß die Veränderung der Anregungsspannung eine erneute Eichung des Systems erfordert.
Bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung sollte der Detektor für die emittierte Energie so nahe wie möglich bei dem Zellausstrich auf dem Objektträger für das Gewebe angeordnet werden, damit ein Anteil der emittierten Röntgenstrahlung eingefangen wird, der so groß wie möglich ist. Der Detektor ist vorzugsweise innerhalb von 50 nm von der Probe angeordnet, vorzugsweise innerhalb von 20 nm von der Probe und insbesondere innerhalb von 10 nm oder weniger von der Probe. Der Winkel des Detektors relativ zu der Ebene des Trägers ist nicht kritisch, wobei ein Winkel von etwa 60º als geeignet gefunden wurde, und wobei 90º bevorzugt ist. Es ist zu beachten, daß das System rekalibriert werden muß, wenn einer dieser Parameter verändert wird. Insbesondere beziehen sich die Daten für den kardiovaskulären und metabolischen Status gemäß dem folgendem auflediglich ein spezielles System mit einer speziellen Konfiguration. Wenn das System einmal in irgendeiner wesentlichen Weise verändert wird, müssen die Daten korrigiert werden, um derartige Veränderungen zu berücksichtigen.
Unter Verwendung des soeben beschriebenen Verfahrens der vorliegenden Erfindung wurden große Gruppen von Patienten untersucht, die an kardiovaskulären Erkrankungen und Osteoporose leiden, um die intrazellulären Konzentrationen an Magnesium, Kalzium, Kalium, Natrium, Chlor und Phosphor zu bestimmen. Durch Vergleich der beobachteten Konzentrationen bei erkrankten Patienten mit solchen, die bei einer entsprechend großen Anzahl von anscheinend gesunden Kontrollpersonen ohne Symptome gefunden wurden, wurden Bereiche von optimalen und suboptimalen Mineralkonzentrationen erstellt. Derartige Bereiche sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Mineral optimaler Bereich* suboptimaler Bereich* Magnesium Kalzium Kalium Natrium Chlor Phosphor
* Einheiten der Floureszenzintensität (Peak/Hintergrund) /Zellvolumen (800 u³)
Die in Tabelle 2 zusammengefaßten Einheiten sind selbstverständlich spezifisch für die Ausrüstung, die bei der Bestimmung der Patienten und Kontrollpersonen verwendet wurde. Das Muster der Identifizierung von verringerten Magnesium- und Kaliumspiegeln sowie erhöhte Spiegel an Kalzium, Natrium, Chlor und Phosphor zur Korrelation dieser zwei speziellen Erkrankungszustände ist jedoch allgemein gültig und trifft bei jedem verwendeten System zu. Besondere Krankheitsbeziehungen, die bisher gefunden wurden, sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3 Krankheit kardiovaskuläre Erkrankung Hochdruck Osteoporose/periodontaler Knochenschwund
D - herabgesetzt
E - erhöht
N - normal
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere nützlich als Bestimmungsmethode zur Identifizierung von Patienten, die gegenüber kardiovaskulären Krankheiten und/oder Osteoporose empfindlich sind. Unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung können zelluläre Mineralprofile für den Patienten erhalten und mit den Angaben der Tabelle 3 verglichen werden; es können auch zukünftige Korrelationen unter Verwendung der Mineralanalysetechnik erstellt werden. Wenn gefunden wird, daß der Patient Risikofaktoren bezüglich einer jeden der Mineralkonzentrationen aufweist, insbesondere bei den Magnesium-, Kalzium-, Kalium- und Phosphorkonzentrationen, können weitere diagnostische Maßnahmen ergriffen werden, um herauszufinden, ob für den Patienten tatsächlich ein Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen, Hochdruck, Osteoporose und/oder periodontalen Knochenschwund besteht.
Die folgenden Versuchsergebnisse werden lediglich zur Erläuterung gegeben und sind nicht im Sinne einer Einschränkung zu verstehen.

Versuchsteil.

Materialien und Methoden.

Sublinguale Zellabstriche wurden von Menschen erhalten, nachdem das sublinguale Gebiet mit destilliertem Wasser gründlich gespült wurde. Es wurde ein chemisch reiner Holzspatel verwendet, um in kräftiger Weise die Zellen abzukratzen und sie auf einem Trägersubstrat aus reinem Kohlenstoff aus zustreichen. Die Ausstriche wurden noch im nassen Zustand fixiert, und zwar unter Verwendung entweder eines flüssigen Fixativs für die Cytologie aus einem Einmalbehälter oder einem Sprayfixativ für die Cytologie, wie oben beschrieben. Man ließ die Träger an der Luft trocknen und untersuchte sie dann in einem Rasterelektronenmikroskop (International Scientific Instruments, Santa Clara, California, Model IIIA) bezüglich der Größe, Verteilung und zellulärer Merkmale, d. h. Kern, Elemente der Zellmembran, flache Position und Überlappung. Der Einfallswinkel des Elektronenstrahls betrug 55º, und die fluoreszierenden Röntgenstrahlen wurden unter Verwendung eines energiedispersiven Röntgenstrahlenanalysators gemessen (Princeton Gamma Tech, System III, Model 3000T). Berechnungen der Röntgenstrahlenintensität für jedes Element pro Zellvolumen erfolgten auf der Basis des Verhältnisses von Peak- zu Hintergrundstrahlung, gemessen für jedes Element in zuvor definierten Energiebanden, wie oben beschrieben. Derartige Werte von Peak zu Hintergrund wurden anschließend mit normalen und abnormalen Bedingungen korreliert, und zwar durch Bestimmung bei großen Populationen von Menschen mit und ohne Symptome.
Drei gesunde Vergleichsgruppen ohne Symptome wurden untersucht. Die erste Gruppe umfaßte 11 Triathleten gleichen Alters. Die zweite Gruppe bestand aus 10 gemischten Individuen Individuen ohne manifeste Krankheitssymptome. Die dritte Gruppe bestand aus 4 gemischten Individuen ohne manifeste Krankheitssymptome, die weiterhin keine Symptome einer Erkrankung der Koronararterien (CAD) zeigten, und zwar bei der Untersuchung durch intravenöse Angiographie.
Weiterhin wurden auch vier Gruppen von Patienten mit Symptomen untersucht. Die erste Gruppe bestand aus 11 Patienten, die sich einer kardialen Bypass-Operation unterzogen, bei denen mittels intravenöser Angiographie diagnostiziert wurde, daß sie eine kardiovaskuläre Erkrankung hatten. Die zweite Gruppe bestand aus 34 Patienten mit diagnostizierter arteriosklerotischer Herzerkrankung (ASHD), peripherer vaskulärer Erkrankung und Hochdruck mit oder ohne Kaliumrepletion. Die dritte Gruppe bestand aus 10 Patienten mit atrialer Fibrillation (AF). Die vierte Gruppe bestand aus 16 Patienten mit diagnostizierter Osteoporose und/oder periodontalem Knochenschwund.

Ergebnisse.

In Tabelle 4 sind die beobachteten intrazellulären Mineralkonzentrationen für die verschiedenen Untersuchungs- und Kontrollgruppen zusammengefaßt, wobei die Konzentrationseinheiten als Fluoreszenz (Peak/Hintergrund) /Zellvolumen (800 u³). angegeben sind. Tabelle 4 Mineralkonzentration Kontroll- oder Patientengruppe Triathleten asymptomatisch gemischt gemischt* Bypass-Angiogramm-Patienten** ASHD und HTN-Patienten= atriale Fibrillation-Patienten== Osteoporose- und periodontaler Knochenschwund-Patienten
* bestätigt als frei von CVD duch Angiographie
** bei intravenösem Kalium während und nach dem Test
= Patienten mit Kaliumsupplementen wiesen eine mittlere Kaliumkonzentration von 176,9±18,9 auf
== ein Patient hatte ein intrazelluläres Kalium von 620,5
Patienten, die sich einer Bypass-Operation unterzogen, wurden ebenfalls beurteilt, und zwar unter Analyse von gefriergetrocknetem Biopsiematerial aus dem rechten atrialen Anhang, der Aortastanzung und der saphenösen Vene, das während der Operation entnommen und eingefroren wurde. Bei der Beurteilung der Biopsieproben wurde die gleiche Methodik verwendet wie die bei den sublingualen Abstrichen. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Korrelation zwischen intrazellulären Ionenspiegeln in den sublingualen Zellen und derartigen Spiegeln in den chirurgischen Proben. Die Magnesiumspiegel bei 11 Proben waren 708,8 im Vergleich zu Kontrollwerten von 806,6 in den sublingualen Zellen. Kalzium war sowohl bei den sublingualen Zellen und dem atrialen Gewebe als auch dem Aortagewebe erhöht. Die saphenösen Venen wiesen Kontrollspiegel sowohl an Kalzium als auch Magnesium auf. Die Patienten hatten intravenöses Kalium erhalten, und das sublinguale Kalium und Chlorid bewegten sich innerhalb der Kontrollbereiche wie oben beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein genauer und empfindlicher Assay zur Verfügung gestellt, um die intrazellulären Konzentrationen an Kalzium, Magnesium, Phosphor, Kalium, Natrium und Chlor zu bestimmen. Derartige Konzentrationen erwiesen sich als von diagnostischem Wert für Knochenerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen und damit verbundene Störungen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der intrazellulären Konzentration eines Minerals mit den Schritten:

Exposition eines Gewebezellabstrichs einem Rasterelektronenstrahl mit einer Energie im Bereich von 5 bis 15 keV;

Sichtbarmachung individueller Zellen in dem Abstrich mittels eines Sekundärelektronendetektors;

Identifizierung mindestens einer lebensfähigen, individuellen Zelle auf der Basis vorher festgelegter Auswahlkriterien;

Abtasten der einen lebensfähigen Zelle mit dem Elektronenstrahl;

Messung der Intensität der von der einen lebensfähigen Zelle innerhalb mindestens einer für ein spezielles Mineral charakteristischen Energiebande emittierten Fluoreszenz; und

Bestimmung der intrazellulären Konzentration des Minerals durch Vergleich der gemessenen Intensität der Fluoreszenz mit einer Messung der Hintergrundfluoreszenz bei einer zweiten Energiebande.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Energie des Rasterelektronenstrahls im Bereich von 8 bis 12 keV liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die eine lebensfähige, individuelle Zelle auf Basis der Anwesenheit von einem Nucleus, Mikrovilli und einer Membranultrastruktur ausgewählt wird.

4. Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Fluoreszenzcharakteristik eines Minerals mittels eines zur Messung von Strahlung mit einer Energie im Bereich von etwa 500 bis 5.000 keV geeigneten Röntgenstrahlendetektors gemessen wird.