DE3783773T2

DE3783773T2 - Vorrichtung zur feststellung der lebensfaehigkeit von nematoden und verfahren zu ihrer verwendung.

Info

Publication number: DE3783773T2
Application number: DE8787907379T
Authority: DE
Inventors: P Chang; Arnold Horwitz
Original assignee: Xoma Corp
Current assignee: Xoma Corp
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1993-05-19
Anticipated expiration: 2007-10-14
Also published as: EP0327578B1; CA1318231C; JPH02501109A; WO1988002772A1; DE3783773D1; EP0327578A1; US5023173A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf eine Vorrichtung zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Nematoden als ein Maß der Effizienz möglicher nematodizider und nematostatischer Mittel gerichtet.
Die Testvorrichtung umfaßt einen festen Träger, der mit einem gelierbaren Polymer, das mit bestimmten, zur Stabilisierung des Versuchs dienenenden Chemikalien intensiv gemischt wurde, beschichtet ist. In der Vorrichtung sind mit einer bestimmten Chemikalie, einem Lockstoff für Nematoden imprägnierte Scheiben enthalten. Die Erfindung umfaßt Verfahren zur Verwendung der vorstehend erwähnten Vorrichtung in Chemotaxis- Tests, wobei solche Tests zur Bestimmung der Wirksamkeit bestimmter Verbindungen als nematodizide oder nematostatische Mittel verwendbar sind.

Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Der Befall von Pflanzenwurzeln mit parasitären Nematoden führt zur Zerstörung der Pflanze. Dies stellt für die Landwirtschaft weltweit ein ernstes Problem dar. Die Gattung Meloidogyne kann z.B. mehr als 2000 verschiedene Arten von Pflanzen befallen; R.S. Hussey, Advanced Treatise on Meloidogyne, Bd.1, North Carolina State Univ./Graphics, Raleigh, N.C., 1985.
Es ist bekannt, daß vor dem Befall von Wirtszellen eine Anhäufung von pflanzenparasitären Nematoden um die Pflanzenwurzeln stattfindet; H.B. Jansson et al., J. Gen. Microbiol. 112:89 (1979). Es ist seit langem bekannt, daß eine Methode, den Befall von Pflanzenwurzeln durch Nematoden zu verhindern, darin besteht, den Mechanismus dieser Anhäufung zu unterbrechen.
Es ist bekannt, daß pflanzenparasitäre Nematoden spezifische Erkennungsmechanismen benutzen, um ihre Wirte und Beute zu finden. Die allgemeine Meinung ist, daß in Nematoden die primären Mechanismen zur Nahrungsauffindung mittels chemotaktischer, vom Wirt herrührender Faktoren gesteuert werden. Dieser Vorgang, der Chemotaxis genannt wird, vermittelt Bewegung auf chemische Gradienten zu oder von ihnen weg. In keinen den Erfindern bekannten Fällen wurden die von den Pflanzen oder Mikroorganismen herrührenden chemischen Lockstoffe isoliert und identifiziert. Es wird angenommen, daß andere Stimuli, wie thermische, Vibrations- oder Tast-Stimuli, wenn überhaupt, nur untergeordnete Rollen in dem Verhalten zur Nahrungsfindung spielen; N.A. Croll, et al., in The Behavior of Nematodes: Their Activity, Census, and Responses, Edward Arnold, Herausgeber, London, 1970; B.M. Zuckerman, et al., Ann. Rev. Phytopathol. 22:95-113 (1984).
Es gibt keinen direkten Beweis für die Art und Weise, wie die Aufnahme der chemotaktischen Signale zu einer gerichteten Reaktion führt, aber in einer kürzlich aufgestellten Hypothese über Chemorezeption von Nematoden wird vermutet, daß Kohlenhydrate, die durch chemosensorische Sensilli abgegeben werden, an die cuticuläre Glycocalyx binden und danach mit chemotaktischen Faktoren in Wechselwirkung treten, und somit eine Rolle in der Chemorezeption spielen; B.M. Zuckerman, 1984 a.a.O.. In einer anderen Hypothese wird angenommen, daß nach Binden der chemischen Lockstoffe der Pflanzen an Rezeptoren während des sensorischen Prozesses ein Einströmen von Natrium- und Calciumionen durch Ionenpumpen vonstatten geht, wobei Aktionspotentiale erzeugt werden; K.A. Wright, J. Nematol. 15:151-158 (1983).
Parasitäre Nematoden werden zur Zeit mit chemischen Mitteln, die nematodizide und nematostatische Eigenschaften aufweisen, bekämpft, um den Befall von Pflanzenwurzeln durch sie zu verhindern. Die gewöhnlich verwendeten Verbindungen sind nicht nur gegenüber den pflanzenparasitären Nematoden sondern auch gegenüber Tieren (einschließlich Menschen) toxisch.
Beispielsweise ist Aldicarb (Temik 10G Union Carbide), eines der o-(methylcarbamoyl)-Oxime, zur Verwendung an einigen Getreidesorten zur Bekämpfung von Insekten- und Nematodenschädlingen eingetragen. Die nematodiziden Eigenschaften von Aldicarb gegen den Wurzelknoten-Nematoden M. incognita wurden zuerst von Spurr et al., Plant Dis. Rep. 50: 424-5 (1966) beschrieben.
Die nematodiziden Mittel Carbofuran (C.P. Disanzo, Nematol 5:22-7 (1973)) und Carbaryl (D.W. Fenwick, Tropic Agric. Trinidad 25:125-6 (1968)) scheinen die zum Überleben der pflanzenparasitären Nematoden wichtige Orientierung zu beeinträchtigen.
Die Möglichkeit, in die Erkennung chemotaktischer Signale der Wirte durch Nematoden einzugreifen, bietet attraktive Möglichkeiten für eine neue und für die Umwelt nicht schädliche Bekämpfung von pflanzenparasitären Nematoden. Die Entwicklung solcher Bekämpfungsverfahren, wie auch die Entdeckung neuer nematodizider und nematostatischer Mittel, die für Nematoden in höherem Maß selektiv toxisch sind, erfordert schnelle Absuch- Verfahren, um die Beurteilung einer großen Anzahl möglicher nematodizider oder nematostatischer Verbindungen zu ermöglichen. Feldversuche sind für solche Massen-Absuch-Programme nicht geeignet, da sie beschwerlich, teuer und möglicherweise gefährlich sind. Demzufolge besteht ein Bedarf an einem schnellen, reproduzierbaren, billigen und sicheren in vitro-Testverfahren, um die Auswirkungen einer großen Vielfalt von Substanzen auf die Lebensfähigkeit von Nematoden zu untersuchen.
Viele Wissenschaftler verwendeten die Bewegung von Nematoden als ein Kriterium zum in vitro-Absuchen nematodizider und nematostatischer Verbindungen. Einem Gift ausgesetzte Nematoden werden entweder als beweglich oder unbeweglich eingestuft. Das Fehlen von Beweglichkeit wird oft mit der Unfähigkeit zu infizieren oder mit Tod gleichgesetzt, und die Wirksamkeit einer möglichen Verbindung wird in Hinblick darauf bewertet; A. Hough et al., J. Nematol. 7:221-229 (1975).
Eine Schwierigkeit solcher Tests ist es, daß sich unter Laborbedingungen Nematoden, die geringen Konzentrationen eines Giftstoffes ausgesetzt waren, erholen und aktiv werden können, nachdem der Giftstoff entfernt wurde. Beispielsweise kann die in vitro-Bewertung verschiedener nicht-fumiganter nematodizider Mittel mit Cholinesterase-inhibierenden Eigenschaften irreführend sein, wenn ihre Wirkung mittels Nematoden-Beweglicheitstests, die die Entfernung des Giftstoffes vor dem Versuch beinhalten, bestimmt wird. Weiterhin zeigen Cholinesterase- inhibierende Giftstoffe eine reversible Reaktion mit dem Substrat, und die behandelten Nematoden erholen sich oftmals vollständig, nachdem der Giftstoff entfernt wurde; C.C. Yu et al., J. Agric. Food Chem. 25:537-540 (1972).
Eine zusätzliche Schwierigkeit für in vitro-Versuche ist es, daß viele Organophosphate und Carbamate erst bei hohen Dosierungen töten. Es wird angenommen, daß die Art der Wirkung subletaler Dosen dieser Verbindungen nematostatisch ist, und es ist bekannt, daß eine Vergiftung mit Carbamat-Nematodiziden bei subletalen Dosen reversibel ist; A. Hough, 1975, a.a.O.
Demzufolge gibt es einen Bedarf für ein reproduzierbares in vitro-Testverfahren, das ausreichend schnell ist, um die Schwierigkeiten der Reversibilität der toxischen Wirkungen einiger nematodizider und nematostatischer Mittel zu beseitigen.
Tests, die in Untersuchungen chemotaktischer Mittel angewendet werden, sind möglicherweise zur schnellen in vitro- Bestimmung der Wirksamkeit möglicher nematodizider und nematostatischer Mittel geeignet. Nematoden-Chemotaxis-Tests und -Vorrichtungen werden durch S.W. Ward (Proc. Natl. Acad. Sci. 70:817-21 (1973)), J. Balan et al. (Nematologica 22:306-11 (1976)), J.-C. Prot (Rev. Nematol. 1:21-6, 135-142 (1978); Rev. Nematol. 2:11-21 (1979)), H.-B. Jansson et al. (J. Gen. Microbiol. 112:89-93 (1979)) und J. Schmidt et al. (Environ. Entomol. 7:605-7 (1978)) beschrieben und durch D.B. Dusenbery (J. Nematol 15:168-173 (1983)) zusammengefaßt. Alle Vorrichtungen, außer der von Prot, a.a.O., umfassen Petri-Schalen, die mit einer Schicht aus Agar, Agarose oder Sephadex beschichtet sind, wobei das Beschichtungsmaterial anfänglich entweder in sterilem Wasser oder in auf Wasser basierendem, ein Detergens enthaltendem HEPES-Puffer suspendiert wurde. Generell wird der chemische Lockstoff in einem geeigneten Lösungsmittel auf eine vorgeschriebene Stelle auf der Oberfläche der Beschichtung, aufgebracht. Die Stelle der Aufbringung des chemischen Lockstoffes wird im allgemeinen mit einer Papierscheibe oder Agar bedeckt. Während einer Diffusionszeit von 24 bis 48 Stunden werden Gradienten des chemischen Lockstoffes in der Beschichtung gebildet. Eine Kontrolle, bestehend aus Wasser oder Puffer, wird auf eine andere Stelle der Beschichtung aufgebracht. Danach wird eine Suspension von Nematoden auf eine geeignete Stelle auf der Platte aufgebracht und die Bewegung der Nematoden auf den Lockstoff hin verfolgt.
Die Vorrichtung von Prot, a.a.O., umfaßt eine U-förmige Röhre, die in beiden Armen eine kontinuierliche Säule aus Agar enthält. Das Verfahren umfaßt die Zugabe eines chemischen Lockstoffes auf einen Arm der Röhre und die Bildung eines Gradienten während einer 48-stündigen Diffusionsperiode; als Kontrolle wird dem anderen Arm Wasser zugegeben. Danach werden Nematoden in den Boden im Zentrum der Agar-Säule eingeführt und die Zahl der Nematoden, die sich auf den chemischen Lockstoff hin bewegen, wird bestimmt und mit der Anzahl, die sich auf die Kontrolle hin bewegt, verglichen.
Trotz dieser Verfahren und Vorrichtungen wäre es immer noch nützlich, verbesserte Vorrichtungen und Verfahren zu deren Verwendung zur Verfügung zu stellen, die bei der schnellen Bestimmung der Wirksamkeit einer großen Anzahl möglicher nematodizider und nematostatischer Mittel in Beweglichkeits- Testsystemen auf der Basis von beschichteten Platten helfen, die auf dem Prinzip der Chemotaxis beruhen. Weiterhin kann die Identifizierung und Verwendung spezifischer chemischer Lockstoffe für Nematoden in solchen Testsystemen die Entdeckung oder Entwicklung neuer Verbindungen erlauben, die eine größere Selektivität für pflanzenparasitäre Nematoden und gleichzeitig eine geringere Toxizität für nützliche Insekten, wie auch für Tiere und Menschen, aufweisen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf einen beschichteten festen Träger zur Untersuchung der Lebensfähigkeit und Beweglichkeit von Nematoden gerichtet. Die vorliegende Erfindung ist ferner auf in vitro-Verfahren zur Verwendung der zuvor genannten Vorrichtung gerichtet, um die Wirksamkeit von Chemikalien als nematodizide oder nematostatische Mittel zu bestimmen. Der in vitro-Versuch ist verglichen mit Felduntersuchungen mit Pflanzen schnell, er ist in hohem Maße reproduzierbar, einfach aufzubauen und ausbaufähig. Das Einbeziehen von versuchsstabilsierenden (z.B. anti-reversiblen) Wirkstoffen in das Material, mit dem der feste Träger beschichtet wird, macht den Test äußerst zuverlässig.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt einen festen mit einem gelierbaren Polymer beschichteten Träger, einschließlich Petrischalen aus Glas oder Kunststoff ohne auf diese beschränkt zu sein. Gelierbare Polymere schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Agar, Agarose und Dextrane ein. Die gelierbaren Polymere werden innig mit den Chemikalien, welche die bestimmten, den Versuch stabilisierenden Wirkstoffe darstellen, vermischt.
Die innig mit den bestimmten chemischen Lockstoffe vermischten Agarblöcke oder -scheiben werden auf geeignete Stellen auf den beschichteten festen Trägern aufgebracht. Die Vorrichtung wird sodann für eine genügend lange Zeit inkubiert, um einen Gradienten von chemischen Lockstoffen um den Agarblock oder die Agarscheibe herum auszubilden.
Verfahren zur Anwendung der obengenannten Vorrichtung zur Bestimmung der Wirksamkeit möglicher nematodizider und nematostatischer Mittel umfassen, das In-Kontakt-Bringen einer Suspension von Nematoden mit einer Lösung des obengenannten Mittels unter geeigneten Zeit-, Temperatur- und Schüttelbedingungen, anschließend das Aufbringen eines kleinen Aliquots der Suspension der behandelten Nematoden auf den obengenannten beschichteten Träger in geeigneter Entfernung von den Gradienten aus chemischen Lockstoffen. Nach Trocknen der Flüssigkeit wird die Bewegung der Nematoden auf die Gradienten aus chemischen Lockstoffen hin qualitativ und quantitativ verfolgt.
Diese Aspekte der Erfindung stellen Mehrschrittverfahren zur Verfügung, die auf alle möglichen nematodiziden oder nematostatischen Mittel, ungeachtet ihrer chemischen Natur, anwendbar sind, und haben daher den Vorteil, einheitliche Materialien für jeden erwünschten Versuch zu bieten. Die Verfahren sind generell mit nur kleinen Änderungen oder Anpassungen, die für ein bestimmtes Anti-Nematoden-Mittel oder irgendeine bestimmte Nematodengattung benötigt werden, anwendbar. Die relativen Wirksamkeiten verschiedener Mittel auf verschiedene Nematodengattungen können somit verläßlich verglichen werden.
Die verwendeten, den Versuch stabilisierenden Wirkstoffe besitzen den Vorteil, den Versuch hinsichtlich Beweglichkeit und Lebensfähigkeit von behandelten Nematoden sehr verläßlich und reproduzierbar zu machen. Diese versuchsstabilisierenden Wirkstoffe sind vorteilhafterweise geeignet für die Verwendung mit einer Vielzahl von Lockstoff-(chemisch anziehenden) Salzen, wie sie in der die Pflanzenwurzel umgebenden Erde gefunden werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 stellt eine Aufsicht auf eine Vorrichtung für einen Agarplatten-Chemotaxis-Test auf Beweglichkeit und Lebensfähigkeit von Nematoden dar.
Figur 2 stellt eine Photographie der Bewegung von Nematoden in einem Agarplatten-Chemotaxis-Test auf einen chemischen Lockstoff (CaCl&sub2;) hin dar.
Figur 3 stellt ein Diagramm dar, das die Anzahl von Nematoden, die sich unter einem Block mit CaCl&sub2; als chemischem Lockstoff sammeln, als Funktion der Zeit aufzeigt.
Figur 4 stellt ein Diagramm dar, das die Konzentration von Calciumionen in verschiedenen Entfernungen von der Stelle, auf die CaCl&sub2; auf eine Agar-Chemotaxis-Testplatte aufgebracht wurde, zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Der erfindungsgemäße Ansatz, der eine wirksame Vorrichtung und ein wirksames Protokoll zur in vitro-Erprobung möglicher nematodizider und nematostatischer Mittel zur Verfügung stellt, umfaßt die Behandlung von Nematoden mit solchen Mitteln und die Bestimmung der Auswirkungen dieser Mittel auf die Lebensfähigkeit der Organismen, wobei eine Chemotaxis-Testvorrichtung verwendet wird.

A. Aufbereitung von Nematoden

Parasitäre Nematoden werden von geeigneten Pflanzenwurzeln, z.B. M. incognita von Tomatenpflanzen und M. javanica und M. hapla von Auberginen, wie folgt isoliert.
Nematodeneier werden aus den Eimassen auf infizierten Wurzeln entfernt, gemäß dem Verfahren von McClure et al. Journal of Nematology 5:230 (1973), auf das hier Bezug genommen wird. Aktive Jugendformen des zweiten Stadiums werden von den Eiern geerntet und bei 10º-25ºC, vorzugsweise bei 14º-16ºC, in einer Antibiotikalösung, üblicherweise Streptomycinsulfat, gelagert.
Vor Verwendung werden die Nematoden auf Raumtemperatur aufgewärmt, isoliert und mit sterilem Wasser mittels Zentrifugation gewaschen. Danach werden Suspensionen geeigneter Dichte hergestellt, üblicherweise 15 000-60 000 Organismen pro ml.

B. Behandlung von Nematoden

Aliquots der gewaschenen Nematoden werden in geeignete Behälter, die die bestimmten nematodiziden oder nematostatischen Mittel in geeigneten Konzentrationen enthalten, gegeben. Es ist anzunehmen, daß der Durchschnittsfachmann durch Versuche Verhältnisse der Anzahl von Nematoden zu Konzentrationen der Testsubstanzen auswählt, die geeignet sind, maximale Auswirkungen solcher Mittel auf die Nematoden hervorzurufen. Üblicherweise werden etwa 25 000 bis 30 000 Nematoden mit 0 bis 1 mg des vermuteten nematodiziden oder nematostatischen Mittels in 0,5 ml Lösung in Kontakt gebracht.
Nematodizide oder nematostatische Mittel werden in den Behandlungsbehälter in beliebiger geeigneter Formulierung gegeben: als eine Lösung der Chemikalie oder in Form von Trägerteilchen, die mit einer Lösung der Chemikalie beschichtet sind.
Danach werden die Nematoden mit den chemischen Mitteln für eine geeignete Zeitspanne, üblicherweise 12-16 Stunden, bei geeigneter Temperatur, gewöhnlich Raumtemperatur, unter Schütteln in Kontakt gebracht.

C. Chemotaxis-Testvorrichtung

1. Herstellung der Quelle des chemischen Lockstoffes

Chemische Lockstoffe werden innig mit 0,5-3%, vorzugsweise 1,5%, abgekühltem geschmolzenem Agar, der mit doppelt destilliertem Wasser hergestellt wurde, vermischt und die geschmolzene Masse in Petrischalen von gewöhnlich 10x100 mm, wobei andere Größen ebenso geeignet sein können, gegossen. Die Konzentration solcher chemischer Lockstoffe in dem Agar wird je nach Art der Nematoden ausgewählt; üblicherweise können Konzentrationen von Lockstoff-Salzen von 5-50 mM verwendet werden. Sobald der Agar sich verfestigt hat, werden runde Blöcke (gewöhnlich 10 mm Durchmesser, andere Größen können jedoch geeignet sein) ausgeschnitten und gelagert.
Die bevorzugten chemischen Lockstoffe sind Salze der Erdalkalimetalle. Am meisten bevorzugt sind Calciumchlorid und Calciumsulfat, obwohl die Chlorid- und Sulfatsalze von Magnesium-, Mangan- und Kobalt-Kationen ebenfalls geeignet sind.
Alternativ werden dicke Filterpapiere (Whatman Nr. 3 MM) mit den chemischen Lockstoffen in geeigneten Konzentrationen gesättigt. Danach wird das Papier luftgetrocknet und Scheiben in geeignetem Durchmesser ausgeschnitten und für die Verwendung gelagert.

2. Herstellung von beschichteten festen Trägern

Feste Träger werden mit einer dünnen Schicht eines gelierbaren polymeren Substrates beschichtet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Petrischalen dünn (üblicherweise 1-5 mm, vorzugsweise 3 mm dick) mit 2%-igem Bacto-Agar beschichtet. Andere polymere Substrate sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Galactan, quervernetztes Dextran, Allyl-Dextran, hydroxypropyliertes Dextran oder Silikagel.
Ein wichtiger Gesichtspunkt der Erfindung ist, daß die obenerwähnte Beschichtung einen chemischen Wirkstoff enthält, der den Test stabilisiert. Der Ausdruck "stabilisiert" soll bedeuten, daß eine Umkehr der Nematodenbewegung, der chemischen Anziehung folgend, verhindert wird, was ein Problem in Chemotaxis-Tests, in denen bestimmte Lockstoff-Salze verwendet werden, darstellen kann.
Stabilisierungswirkstoffe umfassen Chlorid- und Sulfat- Salze der einwertigen Alkalimetalle. Die bevorzugten einwertigen Alkalimetalle sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Natrium-, Kalium- und Lithiumkationen, obwohl Cäsium- und Rubidiumionen ebenso geeignet sind. Die Anionen des stabilisierenden Salzes werden je nach Art des verwendeten Lockstoff- Salzes ausgewählt. Das Anion sollte in beiden Fällen dasselbe sein.
Die Konzentration des stabilisierenden Salzes richtet sich nach der Konzentration des Gradienten des Lockstoff-Salzes in der Chemotaxis-Testplatte. Beispielsweise ist, an der Stelle wo die Konzentration an CaCl&sub2; in dem obengenannten Block mit dem Lockstoff vor der Gradientenbildung 25 mM beträgt (siehe nachstehend), die maximale Konzentration der Calciumionen im Agar direkt neben dem Block nach Ausbildung des Gradienten etwa 2,5 mM und die der Chloridionen etwa 5,0 mM (siehe Figur 4). Unter diesen Bedingungen sollte die Konzentration von NaCl als stabilisierendem Wirkstoff in der Beschichtung wenigstens gleich der durch den Gradienten geschaffenen Konzentration der Anionen sein (hier Chlorid), d.h. 5,0 mM, aber als am meisten bevorzugt wird eine doppelt so hohe Konzentration empfohlen. Es wird angenommen, wobei die Erfinder nicht an diese Hypothese gebunden sein wollen, daß diese NaCl-Konzentrationen Chloridionen- Konzentrationen bereitstellen, die wirksam dem durch das Calciumchlorid im Lockstoff-Block hergestellten Chloridionen- Gradienten entgegenwirken. Es sollte daran erinnert werden, daß Chloridionen-Gradienten selbst als Phobiermittel für M. javanica (Prot, a.a.O.) wirken. Dies erklärt, warum in die obengenannte Beschichtung, in der die maximale Konzentration an Chloridionen neben dem Block, der das chemisch anziehende Mittel enthält, 5 mM beträgt, nur 5-10 mM Natriumchlorid eingebracht werden müssen.

3. Erstellen eines Gradienten des chemischen Lockstoffes

Ein ringförmiger Block oder eine ringförmige Scheibe, die den chemischen Lockstoff enthält, wird an eine geeignete Stelle auf der Oberfläche des obengenannten beschichteten festen Trägers plaziert. "Geeignete Stelle", wie hier verwendet, soll einen Punkt bedeuten, der ausreichend nahe an der Stelle liegt, auf die die Nematoden aufgebracht werden, so daß der Gradient des chemischen Lockstoffes (siehe untenstehend) mit der Nematoden-Aufbringungsstelle überlappt. Gewöhnlich wird eine Scheibe oder ein Block von 1 cm etwa 1,5 cm von dem Zentrum einer beschichteten Platte mit 10 cm Durchmesser (siehe Figur 1) plaziert. Obwohl mehr als ein Block mit chemischem Lockstoff auf eine beschichtete Platte aufgebracht werden kann, ist es bevorzugt, einen einzigen Block mit dem chemischen Lockstoff zu verwenden, um Anziehung von Nematoden durch konkurrierende Gradienten, die unklare Ergebnisse liefern können, zu verhindern.
Der Block mit dem chemischen Lockstoff wird mit der beschichteten Platte unter zur Erstellung eines Gradienten des chemischen Lockstoff geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht. Vorzugsweise wird der Kontakt 18 bis 24 Stunden, vorzugsweise 20 Stunden, bei Raumtemperatur durchgeführt. Wie aus Figur 4 nachfolgend, ersichtlich ist, werden, ausgehend von einer anfänglichen CaCl&sub2;-Konzentration in dem Block mit dem chemischen Lockstoff von 1 bis 25 mM lineare Gradienten innerhalb von 20 Stunden ausgebildet.

4. Chemotaxis-Test

Ein kleines Aliquot einer Suspension behandelter oder unbehandelter Nematoden, üblicherweise 20 ul, mit 10-10000, vorzugsweise 500-1000 Nematoden, wird auf die vorhergenannte (3., siehe oben) Nematoden-Auftragsstelle auf der Testplatte gegeben.
Nach dem Verdampfen der Flüssigkeit werden die Platten bei Raumtemperatur inkubiert, vorzugsweise im Dunkeln, um mögliche Einflüsse der Lichtanziehung zu vermeiden. Die Bewegung der Nematoden wird in Intervallen über einen Zeitraum von 2 bis 8 Stunden, vorzugsweise 4 bis 6 Stunden, geprüft.
Die Lebensfähigkeit von behandelten Nematoden wird vorzugsweise einfach durch (1) Prüfen der allgemeinen Verlagerung der Population relativ zu der Stelle der Auftragung der Nematoden und (2) durch Zählen der unter dem Block mit dem chemischen Lockstoff befindlichen Nematoden bestimmt. Eine Vielzahl von Mitteln ist zur Bestimmung der Nematodenbewegung verfügbar, und die Erfindung ist auf keine dieser Methoden beschränkt. Beispiele geeigneter Methoden schließen die Beobachtung mit dem bloßen Auge oder mit optischen Mitteln ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Nachdem die Erfindung nun im allgemeinen beschrieben wurde, wird diese durch folgende Beispiele leichter verständlich, von denen keines die Erfindung einschränken soll, außes dies ist besonders erwähnt.
Beispiel I betrifft den Aspekt der Erfindung, der den Chemotaxis-Test selbst umfaßt.
Beispiel II betrifft den Aspekt der Erfindung, der die Behandlung von Nematoden mit mutmaßlichen nematodiziden oder nematostatischen Mitteln, und der anschließenden Bestimmung der Lebensfähigkeit mittels des chemotaktischen Tests umfaßt.
Beispiel III betrifft den Aspekt der Erfindung, der einen Test zur Bildung des chemisch anziehenden CaCl&sub2; Gradienten in beschichteten Platten nach Anwendung der Scheibe oder des Blocks, der den chemischen Lockstoff enthält, umfaßt.
Alle in diesen Beispielen zitierten Literaturstellen wurden in die Anmeldung durch Bezug aufgenommen.

Beispiel I

Der Chemotaxis-Test

M. incognita wurde aus Tomatenpflanzen, und M. javanica und M. hapla aus Auberginen isoliert. Eier wurden von der Ei-masse an infizierten Wurzeln entfernt, wobei die Methode von McClure verwendet wurde (a.a.O.). Jugendformen im zweiten Stadium wurden erhalten, indem die Eier auf ein Drahtnetz gelegt wurden, das sechs Schichten Kimwipes enthielt, und in einer Petrischale, die eine Lösung von 1% (Gew./Vol.) Streptomycinsulfat enthielt, inkubiert wurden. Jugendformen wurden alle zwei Tage geerntet und nochmals, wie oben beschrieben, durch Kimwipes filtriert. Die Nematoden wurden bei 15ºC in einer 1% Streptomycinsulphat enthaltenden Lösung aufbewahrt. Vor Verwendung im Chemotaxis- Test wurden die Nematoden auf Raumtemperatur erwärmt und mittels Zentrifugation (2000 x g für 5 min) isoliert. Nach einmaligem Waschen der Organismen mit sterilem destilliertem Wasser wurde deren Konzentration auf etwa 25000 Nematoden pro ml eingestellt.
Der Chemotaxis-Test wurde wie folgt angesetzt. 25 mM CaCl&sub2; wurde mit 25 ml geschmolzenem, abgekühltem (44ºC), 1,5%igem mit destilliertem Wasser angesetztem Noble-Agar vermischt, und das Gemisch in eine 15 x 100 mm Petrischale gegossen. Sobald der Agar sich verfestigte, wurden 1,0 cm Scheiben oder Blöcke ausgeschnitten und auf eine 15 x 100 mm Petrischale, die 20 ml Bacto-Agar (Difco) enthielt, wobei dieser so hergestellt wurde, daß er 5-10 mM NaCl enthielt, wie in Fig. 1 gezeigt. Jede Bacto- Agar Platte enthielt einen Kontroll-Agarblock mit Wasser und einen Block mit dem chemischen Lockstoff,wobei sich jeder 1,5 cm von der Mittellinie der Platte entfernt befand. Die Platte wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden lang inkubiert, um die Ausbildung eines chemischen Gradienten zu ermöglichen (siehe Beispiel 2 und Fig. 4, nachfolgend). Der Chemotaxis-Test wurde durch Aufbringen von etwa 500 Nematoden in 20 ul entlang der Mittellinie der Testplatte gestartet (Fig. 1). Die Tests wurden jeweils dreifach durchgeführt.
Nachdem die Flüssigkeit verdampft war, wurden die Platten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert und die Bewegung der Nematoden über sechs Stunden hinweg gemessen. Sowohl die chemische Lockwirkung als auch die Lebensfähigkeit wurden durch (1) Prüfen der allgemeinen Bewegung der Population relativ zu der Mittellinie und zu dem Agar-Block mit dem chemischen Lockstoff und zu dem Kontrollwasser-Agar-Block (Fig. 2) und (2) durch Zählen der Anzahl von Nematoden unter dem Block mit dem chemischen Lockstoff und dem Kontroll-Agar-Block bestimmt.

Beispiel II

Auswirkung einer Vorbehandlung der Nematoden mit nematodiziden Mitteln auf den Chemotaxis-Test

Aldicarb (450 ug des aktiven Bestandteils von TEMIK 15G , Union Carbide, in einem Gipsträger (15% Aldicarb plus 85% inerter Träger)) wurde in 1,5 ml Eppendorf-Zentrifugenröhrchen verteilt. Ein Kontroll-Röhrchen enthielt Gipsgranulate ohne Aldicarb.
Oxamyl (von 0 bis 5 ul einer 23 ug/ml Lösung von Vydate L , DuPont, in Wasser) wurde in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen verteilt. Zu jedem Röhrchen wurden 25 000 bis 30 000 Nematoden, die in 0,5 ml Wasser suspendiert waren, zugegeben. Die Röhrchen wurden sodann 16 Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Rotator inkubiert.
In 10 mM NaCl hergestellte Bacto-Agar-Platten (2%) mit Blöcken mit 25 mM CaCl&sub2; als Lockstoff wurden wie in Beispiel I (a.a.O.) hergestellt. Gradienten bildeten sich während 20 Stunden aus. Aliquots (20 ul) der behandelten Nematoden- Suspension wurden auf die Chemotaxis-Testplatten, in dreifacher Ausführung, gegeben, wie in Beispiel I a.a.O. Die Platten wurden im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert und die Bewegung der Nematoden nach 2, 4 und 6 Stunden bestimmt. Die Egebnisse sind in Tabelle I gezeigt.
Es ist aus den in Tabelle I gezeigten Ergebnissen ersichtlich, daß in den Wasser- und Gips-Kontrollen eine rasche Bewegung einer großen Anzahl von Nematoden durch die CaCl&sub2;-Gradienten, mit dem Höhepunkt bei 4 Stunden, stattfand. Im Gegensatz dazu zeigten die mit Aldicarb oder Oxamyl behandelten Nematoden im wesentlichen keine signifikante Beweglichkeit, nicht einmal nach 6 Stunden. Tabelle I Chemotaxis-Test von Nematoden nach Behandlung mit Aldicarb und Oxamyl* Behandlung . Wasser-Kontrolle Gips-Kontrolle Aldicarb Oxamyl * Die Werte repräsentieren die ungefähre Anzahl der Organismen unter den Blöcken mit den chemischen Lockstoffen ** Die Werte in Klammern stellen die Wasser-Agar-Kontrollblöcke dar.

Beispiel III

Calcium Diffusions-Test

Agar-Blöcke (1,0 cm Durchmesser), die verschiedene Konzentrationen von CaCl&sub2; enthielten und denen &sup4;&sup5;CaCl&sub2; (New England Nuclear Corporation) mit bekannter spezifischer Aktivität zugesetzt worden war, wurden auf eine Standard-Chemotaxis-Agarplatte gesetzt, die 10 mM NaCl enthielt, wie in Beispiel I und Fig. 1 gezeigt. Die Platten wurden 20 Stunden unter Standardbedingungen inkubiert, um den CaCl&sub2;-Gradienten auszubilden.
Agarstücke wurden von verschiedenen Positionen auf der Agarplatte entfernt und in eine Szintillationsflüssigkeit (Aquasol) gelegt, um die Menge an Radioaktivität zu bestimmen. Die Calciumkonzentration an jeder Stelle der Platte wurde bestimmt, indem die gezählten Zerfälle in den Agarstücken von einer bestimmten Position auf der Platte durch die gezählten Zerfälle eines Agarstücks gleichen Volumens des CaCl&sub2;-Blocks, der auf die Platte gesetzt worden war, dividiert wurde. Dieses Verhältnis wurde durch die spezifische Aktivität des radioaktiven CaCl&sub2; geteilt, um die molare Konzentration an CaCl&sub2; an jeder Stelle der Agarplatte zu erhalten. Die molaren Konzentrationen der Chloridionen sind natürlich doppelt so hoch wie die des CaCl&sub2;.
Die in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse zeigen die Linearität des CaCl&sub2;-Gradienten der von dem Block mit dem chemischen Lockstoff herrührt und der die Mittellinie der Platte, d.h. die Auftragungsstelle der Nematoden, umfaßt.
Demzufolge treffen die Nematoden, beginnend mit dem Moment ihrer Auftragung auf die Chemotaxis-Testplatte, zu jeder Zeit auf die Chloridionen des chemischen Lockstoffs.
Die minimale Wirkkonzentration an CaCl&sub2;, um Meloidogyne- Nematoden anzuziehen, betrug anfänglich 5 mM in dem Block mit dem chemischen Lockstoff. Nach 20 Stunden Gradientenausbildung betrug die Ca²&spplus;-Konzentration in der Mitte der Platte, wo die Nematoden aufgetragen wurden, etwa 15 uM (siehe Fig. 4). Demzufolge scheint der Schwellenwert der Anziehung von Meloidogyne zu Calcium etwa 15 uM zu betragen.

Claims

1. Vorrichtung zum Nachweis der Lebensfähigkeit von Nematoden, umfassend:

(a) eine mit einer innigen Mischung eines gelierbaren polymeren Substrates und eines Versuch-stabilisierenden Salzes durchgehend beschichtete feste Oberfläche;

(b) wobei die Beschichtung an bestimmten Stellen, ebenso Konzentrationsgradienten eines chemisch anziehenden anorganischen Salzes enthält; wobei das Versuch-stabilisierende Salz ein einwertiges, von dem Kation des chemisch anziehenden anorganischen Salzes verschiedenes Kation umfaßt, das mit einem Anion verbunden ist, das mit dem Anion des chemisch anziehen den anorganischen Salzes identisch ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die feste Oberfläche eine Petrischale oder eine Platte umfaßt, wobei diese aus Glas oder einem Plastikmaterial bestehen können.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das gelierbare polymere Substrat Agar, Galactan, quervernetztes Dextran, hydroxypropyliertes Dextran oder Silikagel umfaßt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das stabilisierende Salz ausgewählt ist aus den Chlorid- und Sulfatsalzen von Kalium, Lithium, Rubidium, Cäsium und, vorzugsweise, Natrium.

5. Vorrichtung nach einem der Anspüche 1 bis 4, wobei das chemisch anziehende anorganische Salz ein Erdalkalimetall salz umfaßt.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das chemisch anziehende Salz ein zweiwertiges Kation umfaßt, das an ein Anion gebunden ist, das mit dem Anion des Ver- Versuch-stabilisierenden Salzes identisch ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das chemisch anziehende Salz ausgewählt ist aus den Chlorid- und Sulfatsalzen von zweiwertigen Kationen, ausgewählt aus Beryllium, Magnesium, Strontium, Barium, Kobalt, Mangan und, vorzugsweise, Calcium.

8. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit nematodizider und nematostatischer Mittel, umfassend:

(a) in Kontakt bringen einer Suspension von Nematoden mit den Mitteln unter geeigneten Suspensionsmediums-, Konzentrations-, Zeit-, Temperatur- und physikalischen Orientierungsbedingungen;

(b) Überführen der behandelten Nematoden auf geeignete Stellen auf der Oberfläche einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7;

(c) Nachweis der Anzahl von zur chemischen Lockstoff- Quelle wandernden Nematoden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Mittel mit den Nematoden in fester und/oder flüssiger Form in Kontakt gebracht werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei sich die Konzentration der Mittel im Kontakt mit den Nematoden von Null bis zur Sättigung erstreckt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, 9 oder 10, wobei die behandelten Nematoden auf Stellen auf der Oberfläche der Vorrichtung innerhalb der äußeren Grenzen des Gradienten des chemischen Lockstoffes überführt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Nachweis durch Zählen der Nematoden, z.B mittels optischer Mittel und/oder durch Beobachtung der Massenbewegung von Nematoden geführt wird.