DE3742049A1 - Herstellung und anwendung von impfstoffen und diagnostika fuer virus- und krebserkrankungen - Google Patents

Herstellung und anwendung von impfstoffen und diagnostika fuer virus- und krebserkrankungen

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Description

Die Erfindung hat die Aufgabe, in Massenproduktion Impfstoffe zu gewinnen, die eine Vermehrung von Viren (RNS oder DNS- Viren) oder die Amplifikation von proto-onkogener und onkogener DNS verhindert, indem sie ohne nachteilige Nebenwirkungen das Virusgenom oder Onkogene blockieren und inaktivieren. Besonders bei den Erregern der AIDS-Erkrankung, den human T-cell lymphotropic viren (HTLV) und den Onkogenen war dies bisher nicht möglich.
Es werden dabei die jeweiligen Virusnucleinsäuren bzw. Proto­ onkogene und Onkogene oder Anteile von diesen, die für die Vermehrung und Pathogenität verantwortlich sind, isoliert und deren Nucleotid-Sequenz identifiziert. Zum Teil ist diese Nucleotid-Sequenz bekannt, so z. B. für den Transaktivator Gen- Abschnitt "tat" des HTLV. In solchen Fällen kann künstlich eine in der Nucleotid-Sequenz rückläufige spiegelbildliche RNS oder ein Abschnitt aus dieser synthetisiert werden. Es kann jedoch auch die RNS auf DNS in Art einer Copy DNS umge­ schrieben und diese durch Austausch von Thymin in Uracil der RNS angepaßt werden. Diese modifizierte DNS unterscheidet sich weiterhin von der RNS durch ihre Desoxyribosebrücken. Sie verhält sich aber bezüglich der Bindungsfähigkeit wie Anti-Sense-RNS.
Die großtechnische Gewinnung von Anti-Sense-RNS oder Ab­ schnitte derselben bzw. modifizierter cDNS erfolgt enzymatisch im zellfreien Synthesesystem analog dem Verfahren, wie es D. Jachertz für die Vermehrung von iRNS oder iDNS zur antigen­ freien Immunisierung angegeben hat (Z. med. Mikrobiol. Immunol. 152, 112 (1966): drs.: Flow of information and gene-activation during antibody synthesis: Ann. N.Y. Acad. Si. 207, 122-144 (1973).
Es werden dabei Mischungen der erforderlichen Nucleoside und RNS- bzw. DNS-abhängige Replikasen sowie als Synthesemuster die jeweilige, vorher präparierte, i. RNS oder DNS verwendet. Erfindungsgemäß wird hier jedoch als Muster für die enzyma­ tische Vermehrung Anti-Sense RNS oder modifizierte cDNS gegen RNS-Viren bzw. Anti-Sense-DNS oder modifizierte mRNS zusammen mit den erforderlichen Nucleosiden und Replikasen verwendet.
Die Aufklärung der ursprünglichen Nucleotid-Sequenz der RNS bzw. DNS aus gezüchteten Viren bzw. aus Tumorzellen ermöglicht jeweils die Herstellung einer rückläufigen spiegelbildlichen Anti- Sense-RNS bzw. mc DNS. Das Verfahren der Vermehrung unterschei­ det sich gegenüber dem von Jachertz angegebenen Verfahren durch die Verwendung bestimmter Ausgangsstoffe, den Anti- Sense-Nucleinsäuren bzw. von modifizierten Copy-DNS bzw. RNS-Molekülen. Diese können diagnostisch wie auch thera­ peutisch und prophylaktisch verwendet werden. Für die diag­ nostische Anwendung sollten diese Moleküle mit einem Tracer- Molekül, z. B. Radionuclide oder chemische Reagenzien bzw. Enzymen konjugiert werden. Diese können dann zum Nachweis der nativen Nucleinsäuren in Viren oder von Onkogenen ver­ wendet werden. Die Methoden für die Konjugation sind heute Bestand der Wissenschaft. Auch hier handelt es sich jedoch um die Verwendung besonderer Ausgangsstoffe.
Für die therapeutische und prophylaktische Anwendung kann es nützlich sein, die erfindungsgemäß gewonnenen Anti-Sense-Nuc­ leinsäuren chemisch zu modifizieren, um ihre intrazelluläre Ver­ mehrung zu hemmen oder zu stimulieren, insbesondere sind Maß­ nahmen zur Verbesserung der Permeabilität in Zellen zweckmäßig, obwohl von den iRNS und iDNS bekannt ist, daß diese auch in unveränderter Form in die Zellen eindringen. Eine Applikation, inkorporiert in Liposomen, hat jedoch den Vorteil, daß bei der systematischen Anwendung eine Verdünnung unterbleibt und die volle Konzentration auf die jeweiligen Zellen einwirkt.
Beispiel 1
Es sollen Impfstoffe gegen Krebserkrankungen gewonnen werden. Dazu werden Proto-Onkogene bzw. Onkogene aus Krebszellen iso­ liert und ihre Nucleotid-Sequenz analysiert. Für verschiedene Onkogene ist diese bereits bekannt. Es werden nun nach bekann­ ten Methoden der Polynucleotidsynthese Anti-Sense-Nucleinsäuren mit rückläufiger spiegelbildlicher Nucleotid-Sequenz ähnlich dem Anticodon von Transfer-RNA künstlich synthetisiert und als Syn­ thesemuster für die Massenvermehrung im zellfreien Synthese­ system benutzt. Dieses enthält zusätzlich die vier Nucleosid-Tri­ phosphate sowie DNA-Polymerase bzw. Replikasen (vgl. D. Jachertz). Vorteilhaft ist die Anfügung eines Start- und eines Stopsignals am Anfang bzw. am Ende der zu vermehrenden Anti-Sense-Moleküle. Die gewonnenen Moleküle werden diagnostisch zum Nachweis von Onkogenen bzw. Prä-Onkogenen verwendet, ebenso aber auch therapeutisch zur Blockierung und Inaktivierung solcher Krebs-erzeugender Faktoren.
Beispiel 2
Es sollen Impfstoffe gegen RNS-Viren hergestellt werden. Dazu wird die Nucleotid-Sequenz der Viren oder von Anteilen, die für die Vermehrung oder Pathogenität verantwortlich sind, wie z. B. beim HTLV der Transaktivator-Gen-Abschnitt "tat", rück­ läufig spiegelbildlich als ein komplementärer RNS-Polynucleotid­ strang synthetisiert und dieses Molekül als Synthesemuster in einem zellfreien Synthesesystem vermehrt. Auch hier ist es, wie in Beispiel 1, möglich, ein Start- und Stopsignal an dem Anti-Sense-Molekül anzubringen. Es ist auch möglich, eine Copy- DNS zu verwenden. Diese muß jedoch modifiziert werden durch Austausch von Thymin in Uracil-Molekülen, bevor die Vermehrung erfolgen kann, um eine Infektiosität zu verhindern. Auch hier ist die Anfügung eines Start- bzw. Stopsignals vorteilhaft.
Beispiel 3
Es sollen Impfstoffe gegen DNS-Viren hergestellt werden. Auch hier wird die Nucleotid-Sequenz der Viren oder von Anteilen, die für die Vermehrung oder Pathogenität verantwortlich sind, rückläufig spiegelbildlich als eine komplementäre DNS oder ein DNS-Polynukleotid chemisch synthetisiert und ggfs. mit einem Start- und Stopsignal versehen, in einem zellfreien Synthesesystem mit Hilfe von DNS-Polymerasen und den vier Nucleosid-Triphosphaten vermehrt. Es ist auch möglich, die zur Virus-DNS komplementäre Messenger mRNS durch Austausch oder chemischen Umbau von Uracil in Thymin zu modifizieren und dieses Molekül als Anti-Sense-RNS zur Blockierung der Virus-DNS im zellfreien Synthesesystem zu vermehren.
Beispiel 4
Zu diagnostischen Zwecken werden die Anti-Sense-Moleküle mit Tracer-Molekülen in Form von Radionucliden, Enzymen oder chemischen Stoffen konjugiert.
Beispiel 5
Für prophylaktische und therapeutische Zwecke werden die Anti-Sense-Moleküle zur Verbesserung der Permeabilität in Zellen chemisch modifiziert und/oder in Liposomen inkor­ poriert.

Claims (4)

1. Herstellung und Anwendung von Impfstoffen gegen Virus- und Krebserkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß be­ züglich des Virusgenoms bzw. von isolierten Onkogenen (DNS oder RNS) oder Anteilen von diesen, die für die Virus­ vermehrung oder Pathogenität verantwortlich sind, rück­ läufige spiegelbildliche Anti-Sense-Nucleinsäuren ent­ sprechend den jeweiligen ursprünglichen DNS oder RNS, die durch biologische Methoden oder künstlich durch Total­ synthese gewonnen und in einem zellfreien Synthesesystem enzymatisch vermehrt und diagnostisch, prophylaktisch und therapeutisch verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sense-Nucleinsäuren für diagnostische Zwecke mit einem Tracerstoff markiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sense-Nucleinsäuren für die prophylaktische und therapeutische Anwendung chemisch modifiziert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Applikation inkorporiert in Liposomen erfolgt.
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