DE3709959A1 - METHOD AND DEVICE FOR PRODUCING ENZYMS WITH A RECOMBINANT PLASMIDE-CONTAINING BACTERIUM - Google Patents

METHOD AND DEVICE FOR PRODUCING ENZYMS WITH A RECOMBINANT PLASMIDE-CONTAINING BACTERIUM

Info

Publication number
DE3709959A1
DE3709959A1 DE19873709959 DE3709959A DE3709959A1 DE 3709959 A1 DE3709959 A1 DE 3709959A1 DE 19873709959 DE19873709959 DE 19873709959 DE 3709959 A DE3709959 A DE 3709959A DE 3709959 A1 DE3709959 A1 DE 3709959A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
repressor
filter
enzyme
culture medium
fermenter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19873709959
Other languages
German (de)
Other versions
DE3709959C2 (en
Inventor
Takeshi Kobayashi
Shinji Iijima
Masayuki Taniguchi
Shunji Yasuda
Yoshihisa Kato
Takeshi Ogawa
Syuji Kawai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Coorstek KK
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Toshiba Ceramics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp, Toshiba Ceramics Co Ltd filed Critical Kao Corp
Priority to DE19873744928 priority Critical patent/DE3744928C2/en
Publication of DE3709959A1 publication Critical patent/DE3709959A1/en
Application granted granted Critical
Publication of DE3709959C2 publication Critical patent/DE3709959C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/14—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Abstract

The process comprises culturing a host bacterium into which enzyme genes and a control gene having an apo-repressor have been introduced, so that formation of enzyme is repressed while the bacterium grows in a culture medium containing a co-repressor, removing the co-repressor from the culture solution and subsequently allowing the host bacterium to produce the enzyme in the culture medium containing no co-repressor. An apparatus for producing an enzyme includes a fermentor 1 a cylindrical filter 11 for removing the co-repressor from circulating culture solution from the fermentor, and a culture medium reservoir 26 for feeding fresh culture medium containing no co-repressor into the fermentor 1. <IMAGE>

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Enzym mit einem rekombinante Plasmide aufnehmenden bzw. beherbergenden Bakterium und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Enzymproduktion in großen Mengen. The present invention relates to a method for Production of enzyme with a recombinant plasmid or host bacterium and a device to carry out the procedure. The invention relates in particular to a method and a device for enzyme production in large amounts.  

In den letzten Jahren ist die Herstellung von brauchbaren Substanzen mit Hilfe eines rekombinante Plasmide enthaltenden Bakteriums in den Vordergrund getreten. Die Herstellung solcher wertvoller Substanzen verbleibt jedoch weitgehend im experimentellen Stadium und hat nicht das Stadium der Massenproduktion erreicht.In recent years, the manufacture has been viable Substances using a recombinant containing plasmids Bacteria came to the fore. The production such valuable substances remain largely in the experimental stage and does not have the stage of mass production reached.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen in großen Mengen mit Hilfe eines rekombinante Plasmide aufnehmenden bzw. berherbergenden Bakteriums und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen.It is therefore the object of the invention to produce a method of enzymes in large quantities using a recombinant Bacteria receiving or harboring plasmids and an apparatus for performing the method create.

Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit Hilfe eines rekombinante Plasmide enthaltenden Bakteriums das Kultivieren eines Wirtsbakteriums, in welches Enzym-Gene und ein Steuer-Gen, welches einen Apo-Repressor bildet, eingeführt sind, und zwar in einem Zustand, in dem die Bildung des Enzyms reprimiert ist, indem ein Kulturmedium verwendet wird, das einen Co-Repressor enthält, sowie das Entfernen des Co-Repressors aus dem erhaltenen Kulturmedium und das anschließende Kultivieren des Wirtsbakteriums zur Herstellung des Enzyms unter Verwendung eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums.According to one embodiment of the invention, a method comprises to produce an enzyme using a recombinant Bacteria containing plasmids cultivating a Host bacterium, in which enzyme genes and a control gene, which forms an apo repressor, and in a state in which the formation of the enzyme represses is by using a culture medium that has a Contains co-repressor, as well as removing the co-repressor from the culture medium obtained and the subsequent cultivation of the host bacterium to produce the enzyme Use of a culture medium containing no co-repressor.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist eine Vorrichtung zur Herstellung des Enzyms einen Fermenter zur Kultivierung eines Wirtsbakteriums auf, in das Enzym-Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Steuer-Gen eingeführt sind, unter Anwendung eines einen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums, ferner einen zylindrischen Filter zur Entfernung des Co-Repressors durch Hindurchleiten einer im Fermenter enthaltenden Kulturlösung, eine Zirkuliereinrichtung zum Umwälzen der Kulturlösung aus dem Fermenter durch den Filter und ein Kulturmedium-Reservoir zum Zuführen eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums in den Fermenter.According to a further embodiment of the invention, a Device for producing the enzyme a fermenter for Cultivation of a host bacterium in which enzyme genes and introduced a control gene forming an apo repressor are using a containing a co-repressor Culture medium, also a cylindrical filter for removal of the co-repressor by passing one in the fermenter containing culture solution, a circulating device for  Circulating the culture solution from the fermenter through the filter and a culture medium reservoir for supplying none Culture medium containing co-repressor in the fermenter.

In einem Wirtsbakterium, in welches Enzym-Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Steuer- bzw. Kontroll-Gen eingeführt sind, wird der Apo-Repressor vom Kontroll-Gen gebildet. Da das Wirtsbakterium erfindungsgemäß im Anfangsstadium unter Verwendung eines einen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums kultiviert wird, vereinigt sich der vom Kontroll-Gen gebildete Apo-Repressor mit dem Co-Repressor unter Bildung eines Repressors. Dieser Repressor vereinigt sich mit den Operatorteilen der Enzym-Gene, so daß die Transkiption reprimiert wird. Dementsprechend wächst das Bakterium und die Bakterienzahl steigt in einem Stadium an, in dem die Herstellung des Enzyms unterdrückt ist. Wenn dann der Co-Repressor aus der Kulturlösung entfernt und der Wirtsbazillus unter Verwendung eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums kultiviert wird, wird das Enzym vom Wirtsbakterium produziert. Auf diese Weise kann Enzym hergestellt werden, nachdem die Bakterienzahl angewachsen ist, wodurch Enzyme in großen Mengen hergestellt werden können.In a host bacterium, in which enzyme genes and one Apo repressor-forming control or control gene introduced the apo repressor is formed by the control gene. There the host bacterium according to the invention in the initial stage Use of a culture medium containing a co-repressor is cultivated, that of the control gene unites formed apo repressor with the co repressor under formation of a repressor. This repressor unites with the Operator parts of the enzyme genes so that the transcription is repressed becomes. Accordingly, the bacterium and the Bacteria count rises at a stage when manufacturing of the enzyme is suppressed. Then if the co-repressor removed from the culture solution and the host bacillus using a culture medium containing no co-repressor is cultivated, the enzyme is from the host bacterium produced. This way enzyme can be made after the bacteria count has increased, causing enzymes can be produced in large quantities.

Die Vorrichtung zur Herstellung des Enzyms gemäß der Erfindung umfaßt einen Fermenter, einen zylindrischen Filter zur Entfernung des Co-Repressors aus der Kulturlösung, eine Zirkulationseinrichtung zum Umwälzen der Kulturlösung und ein Kulturmedium-Reservoir zum Zuführen von Kulturmedium in den Fermenter, das frei von Co-Repressor ist. Im zylindrischen Filter wird der Co-Repressor schnell durch Querstrom-Filtration aus der Kulturlösung entfernt. Das Verfahren zur Herstellung des Enzyms ist leicht durchführbar, wodurch es möglich ist, die Herstellung des Enzyms und seine Massenproduktion zu steuern. The device for producing the enzyme according to the invention comprises a fermenter, a cylindrical filter for Removal of the co-repressor from the culture solution, a circulation device to circulate the culture solution and a Culture medium reservoir for feeding culture medium into the Fermenter that is free of co-repressor. In the cylindrical The co-repressor is quickly filtered by cross-flow filtration removed from the culture solution. The manufacturing process of the enzyme is easy to do, which makes it possible is the production of the enzyme and its mass production to control.  

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und der Zeichnung. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich alleine oder zu mehreren bei einer Ausführungsform der Erfindung verwirklicht sein.Further features of the invention result from the following Description of preferred embodiments in Connection with the subclaims and the drawing. Here can do the individual features individually or more in one embodiment of the invention be realized.

In der Zeichnung zeigt:The drawing shows:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Aufbaus einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Herstellung von Enzym; Figure 1 is a schematic representation of the structure of an embodiment of the device for producing enzyme.

Fig. 2 eine teilweise aufgebrochene perspektivische Darstellung eines bei der Vorrichtung nach Fig. 1 verwendeten Filters; Fig. 2 is a partially broken perspective view of a filter used in the device of Fig. 1;

Fig. 3 bzw. 4 Darstellungen eines Plasmids, das in ein E.coli, entsprechend einem Beispiel der Erfindung eingeführt ist; Fig. 3 and 4 representations of a plasmid, which is introduced into an E. coli, according to an example of the invention;

Fig. 5 eine charakteristische Darstellung des Verhältnisses zwischen der Kultivationsdauer und der Tryptophan-Konzentration, der Trübung der Kulturbrühe und der totalen und spezifischen Aktivität des Enzyms bei einer Ausführungsform der Erfindung; Figure 5 is a characteristic showing the relationship between the culture time and the tryptophan concentration, the turbidity of the culture broth, and the total and specific activity of the enzyme in one embodiment of the invention.

Fig. 6 eine charakteristische Darstellung des Verhältnisses zwischen der Filtratmenge und der Konzentration an Tryptophan bei einer Ausführungsform der Erfindung; Figure 6 is a characteristic showing the relationship between the amount of filtrate and the concentration of tryptophan in an embodiment of the invention.

Fig. 7 eine charakteristische Darstellung des Verhältnisses zwischen der Kultivationsdauer und dem Filtratfluß bei einer Ausführungsform nach der Erfindung; und Figure 7 is a characteristic showing the relationship between the culture time and the filtrate in an embodiment according to the invention. and

Fig. 8 eine vergrößerte Schnittdarstellung eines Teils des Filters nach Fig. 2. Fig. 8 is an enlarged sectional view of a portion of the filter of FIG. 2.

Beispielexample

Bei der in diesem Beispiel beschriebenen Ausführungsform wird die Herstellung von β-Galactosidase unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.In the embodiment described in this example, the production of β- galactosidase is described with reference to the accompanying drawings.

Zunächst wurde ein Plasmid pMCT98 hergestellt, indem ein EcoRI-Fragment, das einen trp-Promoter trägt, aus pOCT3 gereinigt wurde und in die EcoRI-Stelle von pMC1403 eingesetzt wurde, welche ein β-Galactosidase-Gen Lac Z, ein β-Glactosidopermease- Gen Lac Y und ein Galactosidotransacetylase- Gen Lac A, wie in Fig. 3 gezeigt, enthielt, wobei eine Gen- Rekombinationstechnik angewendet wurde. Eine Promoterregion, eine Operatorregion und eine Attenuatorregion sind in einem Teil von trp (dargestellt durch einen schwarzen Pfeil) vorhanden.A plasmid pMCT98 was first prepared by purifying an EcoRI fragment carrying a trp promoter from pOCT3 and inserting it into the EcoRI site of pMC1403, which contains a β- galactosidase gene Lac Z, a β- lactosidopermease gene Lac Y gene and a galactosidotransacetylase gene Lac A, as shown in Fig. 3, using a gene recombination technique. A promoter region, an operator region and an attenuator region are present in part of trp (represented by a black arrow).

Danach wurden das pMCT98 und ein pRLK13 mit einem Apo-Repressor trp R, wie in Fig. 4 dargestellt, in Gegenwart von Metall-Ionen in Escherichia coli C600 eingeführt, um E.coli C600 zu transformieren.The pMCT98 and a pRLK13 with an apo repressor trp R, as shown in FIG. 4, were then introduced into Escherichia coli C600 in the presence of metal ions in order to transform E. coli C600.

Wenn ein Co-Repressor Tryptophan vorhanden ist, dann kombiniert das Tryptophan in diesem transformierten E.coli C600 mit dem im trp R-Teil des Plasmids pRLK13 gebildeten Apo-Repressor unter Bildung eines Repressors. Dieser Repressor kombiniert mit dem Operator im trp-Teil des Plasmids pMCT98 und unterdrückt die Transkription. In Abwesenheit von Tryptophan wird demgegenüber die Transkription iniziiert.If a co-repressor tryptophan is present, then combined the tryptophan in this transformed E.coli C600 with the apo repressor formed in the trp R part of the plasmid pRLK13 forming a repressor. This repressor  combined with the operator in the trp part of the plasmid pMCT98 and suppresses transcription. In the absence of tryptophan on the other hand, the transcription is initiated.

Die nachfolgende Tabelle zeigt das Verhältnis zwischen der Konzentration von Typtophan und der spezifischen Aktivität von β-Galactosidase, wenn ein in der obigen Weise erhaltener E.coli-Bazillus C600 kultiviert wird. Es ist aus der Tabelle ersichtlich, daß die spezifische Aktivität abnimmt mit ansteigender Tryptophan-Konzentration.The table below shows the relationship between the concentration of typtophan and the specific activity of β- galactosidase when an E. coli bacillus C600 obtained in the above manner is cultivated. It can be seen from the table that the specific activity decreases with increasing tryptophan concentration.

Unter Verwendung von E.coli C600 wird β-Galactosidase mit Hilfe einer Vorrichtung zur Herstellung von Enzymen, wie sie in Fig. 1 schematisch dargestellt ist, produziert.Using E.coli C600, β- galactosidase is produced with the aid of a device for producing enzymes, as is shown schematically in FIG. 1.

In Fig. 1 enthält ein Fermenter 1 eine Kulturlösung 2 eines gen-rekombinierendens E.coli C600, welches in der obigen Weise erhalten werden kann. Die Kulturlösung 2 wird durch Wasser mit konstanter Temperatur, das aus einem Bad 3 konstanter Temperatur zirkuliert, auf einer konstanten Temperatur gehalten. Zur Durchführung eienr Querstrom-Filtration wird die Kulturlösung 2 dann durch eine Leitung 4, eine Pumpe 5, eine mit einem Kugelventil 6 ausgerüstete Leitung 7, einen Durchflußmesser 8 und ein Einlaßrohr 9 zu einem keramischen Filter 11 geführt, der vorzugsweise wie in 2 dargestellt, ausgebildet ist. Der Filter 11 ist in einem Filtergehäuse 10 installiert. Das Filtrat 12 gelangt durch den keramischen Filter 11 und wird dann über eine mit einem Solenoid-Ventil 13 ausgerüstete Filtratleitung 14 einem Filtratbad 15 zugeführt.In Fig. 1, a fermenter 1 contains a culture solution 2 of a gene recombining E.coli C600, which can be obtained in the above manner. The culture solution 2 is kept at a constant temperature by constant temperature water circulating from a constant temperature bath 3 . To carry out eienr cross-flow filtration, the culture solution 2 is then fed through a line 4, a pump 5, an equipped with a ball valve 6 line 7, a flow meter 8 and an inlet pipe 9 to a ceramic filter 11, preferably as shown in Figure 2, is trained. The filter 11 is installed in a filter housing 10 . The filtrate 12 passes through the ceramic filter 11 and is then fed to a filtrate bath 15 via a filtrate line 14 equipped with a solenoid valve 13 .

Auf der anderen Seite wird eine konzentrierte bakterienhaltige Lösung dem Fermenter 1 durch eine mit einem Kugelventil 16 ausgerüstete Auslaßleitung 17 zurückgeführt. Daneben ist parallel zur Pumpe 5 zwischen den Leitungen 4 und 7 eine mit einem Kugelventil 18 versehene Bypass-Leitung 19 vorgesehen. Weiterhin sind die Einlaßleitung 9 und die Auslaßleitung 17 mit Druckmeßeinrichtungen 20 bzw. 21 versehen. Ein Gaszuführungsrohr 23 zum Rückspülen ist mit einem Solenoid-Ventil 22 versehen und mit der Filtratleitung 14 verbunden. Zusätzlich ist das Kultivierungsbad 2 bzw. Fermenter 1 mit einem Niveau-Meßgerät 24 ausgerüstet. Mit Hilfe einer mit dem Niveau- Meßgerät 24 zusammenarbeitenden Pumpe 25 wird eine neue Kulturlösung in den Fermenter 1 aus einem Kulturmedium-Reservoir 26 zum Ausgleich der abgeführten Filtratmenge zugeführt.On the other hand, a concentrated solution containing bacteria is returned to the fermenter 1 through an outlet line 17 equipped with a ball valve 16 . In addition, a bypass line 19 provided with a ball valve 18 is provided parallel to the pump 5 between the lines 4 and 7 . Furthermore, the inlet line 9 and the outlet line 17 are provided with pressure measuring devices 20 and 21 , respectively. A gas supply pipe 23 for backwashing is provided with a solenoid valve 22 and connected to the filtrate line 14 . In addition, the cultivation bath 2 or fermenter 1 is equipped with a level measuring device 24 . With the aid of a pump 25 working together with the level measuring device 24 , a new culture solution is fed into the fermenter 1 from a culture medium reservoir 26 to compensate for the amount of filtrate discharged.

Eine bevorzugte Ausführungsform des oben erwähnten keramischen Filters 11 ist in 2 dargestellt und mit der Bezugsziffer 31 versehen. Dieser Filter 31 hat eine Gesamtlänge von 750 mm und besitzt einen Filterkörper 32 aus Aluminiumoxid in der Gestalt einer hexagonalen Säule. Beide Enden des Filterkörpers 32 sind mit keramischen Dichtungen 33 versehen. Der Filterkörper 32 und die keramischen Dichtungen 33 besitzen im Innern neunzehn Durchgangsporen bzw. -kanäle 34 mit einem Durchmesser von 4 mm, die sich in Längsrichtung erstrecken. Die verfügbare Filterfläche ist 0,16-2,0 m² groß. Der erwähnte Filterkörper 32 besitzt vorzugsweise eine Verbundstruktur in der Weise, daß der Porendurchmesser der für die Querstrom-Filtration dienenden Poren um die Durchgangsporen bzw. -kanäle 34 herum allmählich größer wird. Eine bevorzugte Ausführungsform für den Filtratkörper ist unter der Bezeichnung "Cerabel Ceramic Filter" von Toshiba Ceramics Co., Ltd., Japan, erhältlich. Wie in Fig. 8 dargestellt, besitzt der Filterkörper vorzugsweise eine an jeder Innenseite der Durchgangsporen bzw. -kanäle 34 vorgesehene Filterschicht 32 a, eine Zwischenschicht 32 b und eine Stützschicht 32 c. Die Stärke t 1 der Filterschicht 32 a beträgt ungefähr 20 µm. Die Stärke t 2 der Zwischenschicht 32 b beträgt ca. 20 µm. Die Stärke t 3 der Stützschicht 32 c beträgt ca. 1,4-2 mm. Der Porendurchmesser des Aluminiumoxids der Filterschicht 32 a beträgt vorzugsweise 0,2-10 µm, wobei mit 0,2-3 µm beste Ergebnisse erhalten werden.A preferred embodiment of the above-mentioned ceramic filter 11 is shown in FIG. 2 and provided with the reference number 31 . This filter 31 has a total length of 750 mm and has a filter body 32 made of aluminum oxide in the shape of a hexagonal column. Both ends of the filter body 32 are provided with ceramic seals 33 . The filter body 32 and the ceramic seals 33 have nineteen through pores or channels 34 with a diameter of 4 mm inside, which extend in the longitudinal direction. The available filter area is 0.16-2.0 m². The filter body 32 mentioned preferably has a composite structure in such a way that the pore diameter of the pores used for cross-flow filtration around the through pores or channels 34 gradually increases. A preferred embodiment for the filtrate body is available under the name "Cerabel Ceramic Filter" from Toshiba Ceramics Co., Ltd., Japan. As shown in FIG. 8, the filter body preferably has a filter layer 32 a provided on each inner side of the through pores or channels 34 , an intermediate layer 32 b and a support layer 32 c. The thickness t 1 of the filter layer 32 a is approximately 20 μm. The thickness t 2 of the intermediate layer 32 b is approximately 20 μm. The thickness t 3 of the support layer 32 c is approximately 1.4-2 mm. The pore diameter of the aluminum oxide of the filter layer 32 a is preferably 0.2-10 μm, with best results being obtained with 0.2-3 μm.

β-Galactosidase wird mit Hilfe der beschriebenen Herstellungsvorrichtung für Enzyme in der folgenden Weise produziert. β- galactosidase is produced in the following manner using the enzyme manufacturing apparatus described.

Unter Verwendung einer Charge eines Kulturmediums, welches mit den benötigten Aminosäuren ergänzt ist, von denen Glukose als Kohlenstoffquelle dient und Tryptophan in einer Konzentration von 100-200 µg/ml vorliegt, wird eine chargenweise Kultivierung von E.coli C600 während 5 Stunden bei 37°C und einem pH-Wert von 7 durchgeführt.Using a batch of culture medium which is supplemented with the required amino acids, one of which is glucose serves as a carbon source and tryptophan in one Concentration of 100-200 µg / ml is present, is a batch Cultivation of E.coli C600 for 5 hours 37 ° C and a pH of 7 performed.

Danach wird - unter gleichzeitigem Zuführen eines Kulturmediums derselben Zusammensetzung, das jedoch kein Tryptophan enthält, aus einem Kulturmedium-Reservoir 26 - die Kulturlösung 2 des Fermenters 1 mit Hilfe der Pumpe 6 durch den Filter 11 geführt, um Tryptophan aus der Kulturlösung zu entfernen und die konzentrierte, die Bakterien enthaltende Lösung dem Fermenter 1 wieder zurückzuführen.Then - with simultaneous supply of a culture medium of the same composition, but which contains no tryptophan, from a culture medium reservoir 26 - the culture solution 2 of the fermenter 1 is passed through the filter 11 with the aid of the pump 6 in order to remove tryptophan from the culture solution and Concentrated solution containing the bacteria is returned to the fermenter 1 .

Fig. 5 zeigt das Verhältnis zwischen der Kultivierungsdauer und der Konzentration des Tryptophans, der Trübung der Kulturbrühe und der Gesamtaktivität und der spezifischen Aktivität von β-Galactosidase. In Fig. 5 zeigt die gestrichelte Linie den Zeitpunkt, an dem die Filtration eingeleitet wird. Fig. 6 zeigt das Verhältnis zwischen der Filtratmenge und der Tryptophan-Konzentration. Fig. 7 zeigt das Verhältnis zwischen der Kultivierungsdauer und dem Filtrationsfluß. Fig. 5 shows the relationship between the cultivation period and the concentration of the tryptophan, the turbidity of the culture broth and the total activity and the specific activity of β- galactosidase. In Fig. 5, the dashed line shows the time at which the filtration is started. Fig. 6 shows the relationship between the amount of the filtrate and the tryptophan concentration. Fig. 7 shows the relationship between the cultivation period and the filtration flow.

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß die Konzentration des Tryptophans in der Kulturlösung nach Filtrationsbeginn schnell abnimmt. Wie in Fig. 6 gezeigt, nimmt die Konzentration von Tryptophan nach Beginn der Filtration mit zunehmender Filtratmenge ab. Es wurde somit gefunden, daß das Tryptophan sehr schnell aus der Kulturlösung entfernt werden kann.From Fig. 3 it can be seen that the concentration of tryptophan in the culture solution decreases rapidly after the start of filtration. As shown in Fig. 6, after the start of the filtration, the concentration of tryptophan decreases with increasing amount of the filtrate. It was thus found that the tryptophan can be removed from the culture solution very quickly.

Die Trübungskurve in Fig. 5 für die Kulturbrühe zeigt, daß das Bakterium ständig wächst, abgesehen vom Zeitpunkt direkt nach Filtrationsbeginn. Die Wachstumsrate der Bakterien ist jedoch vor Filtrationsbeginn größer als nach Filtrationsbeginn. Dies wird so erklärt, daß vor dem Filtrationsbeginn Enzym nicht gebildet wird und nur das Wachstum der Bakterien stattfindet, wogegen nach Filtrationsbeginn die Tryptophanabnahme das Bakterium veranlaßt, das Enzym zu bilden und zu wachsen. Dies ist aus der Tatsache ersichtlich, daß die Kurven für die Gesamtaktivität und die b-Galactosidase-Aktivität in Fig. 5 vor Filtrationsbeginn sehr niedrige Werte zeigen, jedoch rasch ansteigende Werte nach Filtrationsbeginn. Auf diese Weise kann die Bildung des Enzyms gesteuert werden, was die Massenproduktion von Enzym möglich macht.The turbidity curve in Fig. 5 for the culture broth shows that the bacterium grows continuously, apart from the point in time immediately after the start of filtration. However, the growth rate of the bacteria is greater before the start of filtration than after the start of filtration. This is explained by the fact that before the start of filtration, enzyme is not formed and only the growth of the bacteria takes place, whereas after the start of filtration the decrease in tryptophan causes the bacterium to form and grow the enzyme. This is evident from the fact that the curves for the total activity and the b -galactosidase activity in FIG. 5 show very low values before the start of the filtration, but rapidly increasing values after the start of the filtration. In this way, the formation of the enzyme can be controlled, which enables the mass production of the enzyme.

Wie in Fig. 7 dargestellt, nimmt der Filtratfluß bzw. die Filtratmenge im Laufe der Zeit allmählich ab, der Filtrationsfluß kann jedoch durch kontrollierte Rückspül-Intervalle und Rückspüldruck in gewissem Maße regeneriert werden (vgl. Pfeil in Fig. 7).As shown in Fig. 7, the filtrate flow or the amount of filtrate gradually decreases over time, but the filtration flow can be regenerated to a certain extent by controlled backwashing intervals and backwashing pressure (see arrow in Fig. 7).

Im oben beschriebenen Beispiel wird zur Durchführung der Querstrom-Filtration ein Aluminiumoxid-Keramikfilter mit neunzehn Durchgangsporen bzw. -kanälen, wie in Fig. 2 dargestellt, verwendet. Es können jedoch auch andere Filter aus anderen Materialien, wie Metallen, Kunstharzen u. dgl. verwendet werden, wenn sie die richtigen Porengrößen besitzen. Der Filter kann einen oder eine Vielzahl von Durchgangskanälen besitzen.In the example described above, an aluminum oxide ceramic filter with nineteen through-pores or channels, as shown in FIG. 2, is used to carry out the cross-flow filtration. However, other filters made of other materials such as metals, synthetic resins and the like can also be used. Like. Are used if they have the correct pore sizes. The filter can have one or a plurality of through channels.

Wie im einzelnen beschrieben, kann somit gemäß der Erfindung die Herstellung eines Enzyms gesteuert werden, wodurch die Massenproduktion des Enzyms ermöglicht ist.As described in detail, can thus according to the invention to control the production of an enzyme, thereby Mass production of the enzyme is made possible.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung von Enzymen mit einem rekombinante Plasmide enthaltenden Bakterium, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Wirtsbakterium, in das Enzym-Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Kontroll-Gen eingeführt sind, in einem Zustand kultiviert, in dem die Bildung des Enzyms reprimiert ist, wobei ein einen Co- Repressor enthaltendes Kulturmedium verwendet wird, der Co-Repressor aus der erhaltenen Kulturlösung entfernt wird und danach das Wirtsbakterium zur Herstellung des Enzyms unter Verwendung eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums kultiviert wird.1. A process for producing enzymes with a bacterium containing recombinant plasmids, characterized in that a host bacterium, into which enzyme genes and a control gene forming an apo-repressor are introduced, cultivated in a state in which the formation of the Enzyme is repressed using a culture medium containing a co-repressor, the co-repressor is removed from the culture solution obtained, and then the host bacterium for producing the enzyme is cultivated using a culture medium containing no co-repressor. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plasmid pMCT98 hergestellt wird, indem ein EcoRI- Fragment, das einen trp-Promoter trägt, aus pOCT3 gereinigt wird und durch Gen-Rekombinationstechnik in die EcoRI-Stelle von pMCT1403 eingesetzt wird, welche ein β-Galactosidase-Gen Lac Z, ein β-Galactosidopermease- Gen Lac Y und ein Galactosidotransacetylase-Gen Lac A enthält.2. The method according to claim 1, characterized in that a plasmid pMCT98 is produced by an EcoRI fragment, which carries a trp promoter, is purified from pOCT3 and is inserted by gene recombination technology into the EcoRI site of pMCT1403, which contains a β- galactosidase gene Lac Z, a β- galactosidopermease gene Lac Y and a galactosidotransacetylase gene Lac A. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das pMCT98 und ein pRLK13 mit einem Apo-Repressor trp R in Escherichia coli C600 in Gegenwart von Metallionen eingeführt werden, um das E.coli C600 zu transformieren.3. The method according to claim 2, characterized in that the pMCT98 and a pRLK13 with an apo repressor trp R in Escherichia coli C600 in the presence of metal ions be introduced to transform the E.coli C600. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man im E.coli C600 in Gegenwart von Tryptophan als Co- Repressor das Tryptophan mit dem im trp R-Teil des Plasmids pRLK13 gebildeten Apo-Repressors unter Bildung eines Repressors kombiniert, welcher sich seinerseits mit dem Operator in dem trp-Teil des Plasmids pMCT98 unter Repression der Transkription vereinigt, und daß man durch Abwesenheit von Tryptophan die Transkription iniziiert.4. The method according to claim 3, characterized in that in the E.coli C600 in the presence of tryptophan as a co- Repressor the tryptophan with that in the trp R part of the plasmid pRLK13 formed apo repressor under formation of a repressor, which in turn with the operator in the trp part of the plasmid pMCT98 united under repression of transcription, and that the absence of tryptophan leads to transcription initiated. 5. Vorrichtung zur Herstellung eines Enzyms, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Fermenter zur Kultivierung eines Wirtsbakteriums, in welches Enzym- Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Steuer-Gen eingeführt sind, unter Verwendung eines einen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums;
einen zylindrischen Filter zur Entfernung des Co-Repressors durch Hindurchleiten einer im Fermenter enthaltenen Kulturlösung;
eine Zirkulationseinrichtung für das Zirkulieren der Kulturlösung aus dem Fermenter durch den Filter; und
ein Kulturmedium-Reservoir zum Zuführen eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums zum Fermenter.5. Device for producing an enzyme, in particular for carrying out the method according to one of the preceding claims, characterized by a fermenter for the cultivation of a host bacterium, into which enzyme genes and a control gene forming an apo-repressor are introduced, using a Culture medium containing co-repressor;
a cylindrical filter for removing the co-repressor by passing a culture solution contained in the fermenter;
a circulation device for circulating the culture solution from the fermenter through the filter; and
a culture medium reservoir for supplying a culture medium containing no co-repressor to the fermenter. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter aus keramischem Material besteht.6. The device according to claim 5, characterized in that the filter is made of ceramic material. 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter einen Filterkörper aus Aluminiumoxid in der Gestalt einer hexagonalen Säule und an beiden Enden des Filterkörpers angebrachte keramische Dichtungen aufweist, wobei der Filterkörper und die keramischen Dichtungen eine Vielzahl von in Längsrichtung verlaufenden Durchgangsporen besitzt.7. The device according to claim 6, characterized in that the filter has a filter body made of aluminum oxide in the Shape of a hexagonal column and at both ends of the Has ceramic seals attached to the filter body, with the filter body and the ceramic seals a variety of lengthways Has through pores. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Filterkörper eine Verbundstruktur in der Weise besitzt, daß der Porendurchmesser um die Durchgangsporen herum graduell zunimmt.8. The device according to claim 7, characterized in that the filter body has a composite structure in such a way that the pore diameter around the through pores gradually increases around. 9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Fermenter eine Kulturlösung von E.coli C600 enthält, welches rekombinante Plasmide beherbergt, wobei die Kultivierung durch Hindurchleiten von Wasser mit konstanter Temperatur aus einem Temperierbad auf einer konstanten Temperatur gehalten wird.9. Device according to one of claims 5 to 8, characterized characterized in that the fermenter is a culture solution of E.coli C600, which houses recombinant plasmids, the cultivation by passing it through of constant temperature water from a bath is kept at a constant temperature. 10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturlösung zur Durchführung einer Querstrom-Filtration durch eine Leitung, eine Pumpe, ein Kugelventil, einen Durchflußmesser und ein Einlaßrohr in den Filter geleitet wird. 10. The device according to claim 9, characterized in that the culture solution for carrying out cross-flow filtration through a pipe, a pump, a ball valve, a flow meter and an inlet pipe into the filter is directed.   11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter in einem Filtergehäuse angeordnet ist.11. The device according to one of claims 5 to 10, characterized characterized in that the filter in a filter housing is arranged. 12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß Filtrat durch den Filter geleitet und dann durch eine mit einem Solenoid-Ventil ausgerüstete Filtratleitung in ein Filtratbad gelassen wird.12. The device according to one of claims 5 to 11, characterized characterized in that filtrate passed through the filter and then one equipped with a solenoid valve Filtrate line is left in a filtrate bath. 13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Bakterien enthaltende konzentrierte Lösung durch ein mit einem Kugelventil ausgerüstetes Auslaßrohr in den Fermenter zurückgeführt wird.13. Device according to one of claims 5 to 12, characterized characterized in that a concentrated containing the bacteria Solution with a ball valve Outlet pipe is returned to the fermenter. 14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Einlaßrohr und das Auslaßrohr jeweils mit einem Druckmesser versehen sind und ein Gaszuführungsrohr für das Rückwaschen mit einem Solenoid- Ventil ausgerüstet und mit einer Filtratleitung verbunden ist, der Fermenter mit einem Niveaumesser (24) und einer mit dem Niveaumesser zusammenwirkenden Pumpe versehen ist, so daß eine neue Kulturlösung aus einem Kulturmedium- Reservoir zur Kompensation der Filtratmenge zuführbar ist.14. Device according to one of claims 10 to 13, characterized in that the inlet pipe and the outlet pipe are each provided with a pressure gauge and a gas supply pipe for backwashing is equipped with a solenoid valve and is connected to a filtrate line, the fermenter with a level meter ( 24 ) and a pump which interacts with the level meter, so that a new culture solution can be fed from a culture medium reservoir to compensate for the amount of filtrate.
DE19873709959 1986-03-26 1987-03-26 METHOD AND DEVICE FOR PRODUCING ENZYMS WITH A RECOMBINANT PLASMIDE-CONTAINING BACTERIUM Granted DE3709959A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873744928 DE3744928C2 (en) 1986-03-26 1987-03-26 Enzyme prodn. using bacterium contg. recombinant plasmids - using a host contg. enzyme genes and a control gene forming an apo-repressor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP61067907A JPH0775536B2 (en) 1986-03-26 1986-03-26 Enzyme production equipment using genetically modified bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3709959A1 true DE3709959A1 (en) 1987-10-08
DE3709959C2 DE3709959C2 (en) 1991-04-25

Family

ID=13358439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19873709959 Granted DE3709959A1 (en) 1986-03-26 1987-03-26 METHOD AND DEVICE FOR PRODUCING ENZYMS WITH A RECOMBINANT PLASMIDE-CONTAINING BACTERIUM

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPH0775536B2 (en)
AU (1) AU600710B2 (en)
DE (1) DE3709959A1 (en)
GB (2) GB2188324B (en)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01148318A (en) * 1987-12-04 1989-06-09 Toshiba Ceramics Co Ltd Solid-liquid separation device
NO305845B1 (en) 1997-12-09 1999-08-02 Kongsberg Offshore As Anchoring mechanism for a guide post
EP2900804B1 (en) * 2012-09-27 2019-09-18 GE Healthcare Bio-Sciences AB Tangential flow perfusion system
CN106497765B (en) * 2016-11-24 2019-02-19 涡阳县华夏气体有限公司 A kind of refined filtration equipment of industrial enzyme preparation

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
JPS58141796A (en) * 1982-02-18 1983-08-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of peptide
CA1338664C (en) * 1985-04-10 1996-10-22 Cetus Oncology Corporation Recombinant hosts

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Also Published As

Publication number Publication date
DE3709959C2 (en) 1991-04-25
AU600710B2 (en) 1990-08-23
JPH0775536B2 (en) 1995-08-16
GB2188324A (en) 1987-09-30
JPS62224286A (en) 1987-10-02
GB2188324B (en) 1990-12-05
GB8929030D0 (en) 1990-02-28
GB2225789A (en) 1990-06-13
GB2225789B (en) 1990-09-12
GB8707130D0 (en) 1987-04-29
AU7065987A (en) 1987-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0021247A1 (en) Method and apparatus for reducing the alcohol content of fermented beverages by dialysis
DE4204708A1 (en) FILTRATION SYSTEM
EP0282474A1 (en) Process for the continuous fermentation of media containing carboxyhydrates with the aid of bacteria
DE3936798C1 (en)
DE3809163A1 (en) Aeration device for culturing mammalian cells
DE2711072A1 (en) PROCESS FOR THE REMOVAL OF COLORED BODIES FROM WASTE WATER FROM PAPER AND PULP PRODUCTION
DE2300127C3 (en) Method and device for obtaining undiluted or slightly diluted amniotic fluid and starch from root crops
DE3709959C2 (en)
DE1265128B (en) Process for concentrating solutions by crystallization
EP0213220A1 (en) Process for the production of alcohol-free beverages
EP0164608A2 (en) Apparatus for the separation of products from a product-substrate mixture
DE3809945A1 (en) METHOD FOR FILTERING BAZILLUS SUBTILIS
DE4239605A1 (en) Process for the production of non-alcoholic beer and device for carrying out this process
DE2320885C2 (en) Cell culture system and its uses
DE202009013389U1 (en) Apparatus for processing thin stillage
EP0189378B1 (en) Process and apparatus for the production of vinegar by continuous submerged fermentation
DE659333C (en) Method and device for obtaining alcohol and / or yeast by fermenting carbohydrate-containing liquids
DE1517814C3 (en) Method and device for the continuous treatment of liquids with enzyme-producing microorganisms
DE2413236A1 (en) Concentrating grape juice - by reverse osmosis pref using membrane having greater permeability for organic acids than for sugar
DE1517814A1 (en) Method and device for the continuous treatment of liquids with enzyme carriers
DE534108C (en) Process for the production of yeast
AT402635B (en) Plant and process for the microbiological treatment of liquid media
DE1959609C3 (en) Process for increasing the exchange of substances through semipermeable cell membranes of microorganisms and for biosynthesis
DE1932767C (en) Method and device for concentrating grape mash before wine production
DE2000292A1 (en) Enzymes for alcoholic fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8172 Supplementary division/partition in:

Ref country code: DE

Ref document number: 3744928

Format of ref document f/p: P

Q171 Divided out to:

Ref document number: 3744928

Ref country code: DE

AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3744928

Format of ref document f/p: P

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3744928

Format of ref document f/p: P

8339 Ceased/non-payment of the annual fee